ЖИВОТНЫЕ С ГУМАНИЗИРОВАННЫМИ IL-4 И IL-4Rα Российский патент 2019 года по МПК A01K67/27 C07K14/54 C07K14/715 G01N33/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/989757, поданной 7 мая 2014 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0002] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 16 KB под названием 31260_SEQ.txt, созданного 7 мая 2015 г. и поданного в Ведомство США по патентам и товарным знакам через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] В данном документе раскрыты отличные от человека животные, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки IL-4 и/или IL-4Rα, содержащие последовательности от человека. В данном документе также раскрыты трансгенные отличные от человека животные, которые содержат ген IL-4 и/или IL-4Rα, являющийся полностью или частично человеческим. Также раскрыты отличные от человека животные, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα. Кроме того, раскрыты способы получения и применения отличных от человека животных, содержащих последовательности нуклеиновых кислот человеческих или гуманизированных IL-4 и/или IL-4Rα.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] IL-4 и IL-4Rα являются терапевтическими мишенями для лечения различных заболеваний, нарушений и состояний у человека, которые ассоциированы с аномальными клетками Т-хелперами 2 типа (Th2). Оценку фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) терапевтических молекул, которые целенаправленно воздействуют на белки IL-4 человека или IL-4Rα человека, обычно проводят на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах. Однако PD таких терапевтических молекул невозможно определить надлежащим образом на конкретных отличных от человека животных, поскольку эти терапевтические молекулы не воздействуют целенаправленно на эндогенные белки IL-4 или IL-4Rα.

[0005] Более того, оценка терапевтической эффективности антагонистов, специфичных к человеческим белкам IL-4 и IL-4Rα, с применением различных отличных от человека животных в качестве моделей заболеваний, ассоциированных с аномальными Th2-клетками, является проблематичной на отличных от человека животных, у которых такие видоспецифичные антагонисты не взаимодействуют с эндогенными белками IL-4 или IL-4Rα.

[0006] Соответственно, существует потребность в отличных от человека животных, например, грызунах, например, животных подсемейства мышиные, как, например, мыши или крысы, у которых гены IL-4 и/или IL-4Rα отличного от человека животного являются полностью или частично гуманизированными или заменены (например, по эндогенным отличным от человеческих локусам) генами IL-4 и/или IL-4Rα человека, содержащими последовательности, кодирующие человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα соответственно.

[0007] Также существует потребность в отличных от человека животных, содержащих гены IL-4 и/или IL-4Rα (например, гуманизированные или человеческие), у которых гены IL-4 и/или IL-4R находятся под контролем отличных от человеческих регуляторных элементов (например, эндогенных регуляторных элементов).

[0008] Также существует потребность в отличных от человека животных с гуманизированными последовательностями, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 в крови, плазме крови или сыворотке крови в концентрации, аналогичной концентрации белка IL-4, присутствующего в крови, плазме крови или сыворотке крови отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный белок IL-4, но не содержит человеческих или гуманизированных генов IL-4, и/или экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, экспрессируемого на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный белок IL-4Rα, но не содержащего человеческого или гуманизированного гена IL-4Rα.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Предложены отличные от человека животные, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки IL-4 и/или IL-4Rα, которые содержат последовательность от человека.

[0010] Предложены трансгенные отличные от человека животные, содержащие гены IL-4 и/или IL-4Rα, которые полностью или частично являются человеческими.

[0011] Предложены отличные от человека животные, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα.

[0012] Предложены отличные от человека животные, имеющие замену (полную или частичную) эндогенных генов IL-4 и/или IL-4Rα отличного от человека животного.

[0013] Предложены отличные от человека животные с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα (полностью или частично) по локусам отличных от человеческих эндогенных IL-4 и/или IL-4Rα.

[0014] Предложены отличные от человека животные, имеющие человеческий или гуманизированный ген IL-4, причем отличные от человека животные не экспрессируют эндогенный белок IL-4, и при этом отличные от человека животные экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 в крови, плазме крови или сыворотке крови в концентрации, аналогичной концентрации белка IL-4, присутствующего в крови, плазме крови или сыворотке крови отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержит человеческий или гуманизированный ген IL-4.

[0015] Предложены отличные от человека животные, имеющие человеческий или гуманизированный ген IL-4Rα, причем отличные от человека животные не экспрессируют эндогенный белок IL-4Rα, а экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, у отличного от человека животного соответствующей возрастной группы, которое экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не содержит человеческий или гуманизированный ген IL-4Rα.

[0016] В одном аспекте предложены отличные от человека животные, содержащие последовательность нуклеиновых кислоты человеческого или гуманизированного IL-4 и/или IL-4Rα.

[0017] В одном аспекте предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, которые характеризуются заменой по эндогенному локусу гена IL-4 и/или IL-4Rα, кодирующего эндогенные IL-4 и/или IL-4Rα, геном, кодирующим человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα. Предложены грызуны, например, мыши или крысы, которые характеризуются заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 грызуна человеческим геном IL-4 и/или характеризуются заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна человеческим геном IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0018] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, характеризующиеся гуманизацией эндогенного гена IL-4 грызуна, при этом гуманизация предусматривает замену по эндогенному локусу IL-4 грызуна нуклеиновой кислоты грызуна, содержащей по меньшей мере один экзон гена IL-4 грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна.

[0019] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0020] В одном варианте осуществления модифицированный ген IL-4 кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 и содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого гена IL-4.

[0021] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок IL-4 мыши.

[0022] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок IL-4Rα мыши, кодируемый эндогенным геном IL-4Rα мыши.

[0023] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.

[0024] В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα.

[0025] В одном варианте осуществления гуманизированный белок IL-4Rα содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα мыши.

[0026] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая характеризуется заменой по эндогенному локусу IL-4Rα мыши нуклеиновой кислоты мыши, содержащей по меньшей мере один экзон гена IL-4Rα мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.

[0027] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, где непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-4 мыши, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 IL-4 мыши, заменен непрерывным геномным фрагментом последовательности человеческого IL-4, содержащим участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого IL-4.

[0028] В одном варианте осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.

[0029] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, характеризующиеся гуманизацией эндогенного гена IL-4Rα грызуна, при этом гуманизация предусматривает замену по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислоты грызуна, содержащей экзон гена IL-4Rα грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного (т.е. гуманизированного) гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного, гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.

[0030] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0031] В одном варианте осуществления модифицированный ген IL-4Rα кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα и содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα.

[0032] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.

[0033] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется белок IL-4 мыши, кодируемый эндогенным геном IL-4 мыши.

[0034] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4.

[0035] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая характеризуется заменой по эндогенному локусу IL-4 мыши нуклеиновой кислоты мыши, содержащей экзон гена IL-4 мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов мыши в эндогенном локусе IL-4 мыши.

[0036] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, и при этом непрерывный геномный фрагмент последовательности IL-4Rα мыши, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 IL-4Rα, заменен непрерывным геномным фрагментом последовательности человеческого IL-4Rα, содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого IL-4Rα.

[0037] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0038] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют белок IL-4, кодируемый человеческим или гуманизированным геном IL-4, при этом человеческий или гуманизированный белок IL-4 у грызуна экспрессируется в его сыворотке крови. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0039] В одном варианте осуществления сыворотка крови грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4, характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4, что и у грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4, например, мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0040] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%о, 140%о, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от уровня белка IL-4, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 мыши человеческим геном IL-4.

[0041] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации от приблизительно 10% до приблизительно 200%, от приблизительно 20% до приблизительно 150% или от приблизительно 30% до приблизительно 100% от уровня белка IL-4 мыши, присутствующего в сыворотке крови мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 мыши человеческим геном IL-4.

[0042] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, при этом грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, на уровне, аналогичном уровню белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0043] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мышь или крыса, которые экспрессируют белок IL-4Rα, кодируемый человеческим геном IL-4Rα, при этом грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0044] В одном варианте осуществления иммунные клетки, например, В- и Т-клетки, грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, характеризуются примерно таким же уровнем белка IL-4Rα, что и иммунные клетки, например, В- и Т-клетки, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα, например, мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0045] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, в количестве по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от количества белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα.

[0046] В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, в количестве от приблизительно 10% до приблизительно 200%, от приблизительно 20% до приблизительно 150% или от приблизительно 30% до приблизительно 100% от количества белка IL-4Rα мыши, присутствующего на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках, мыши соответствующей возрастной группы, экспрессирующей функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующейся заменой эндогенного гена IL-4Rα по эндогенному локусу IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα.

[0047] В одном аспекте предложен генетически модифицированный грызун, содержащий гуманизированный ген IL-4Rα, содержащий замену последовательности, кодирующей эктодомен IL-4Rα грызуна, последовательностью, кодирующей эктодомен человеческого IL-4Rα, при этом гуманизированный ген IL-4Rα содержит трансмембранную последовательность IL-4Rα грызуна и цитоплазматическую последовательность IL-4Rα грызуна, при этом гуманизированный ген IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα, и при этом грызун дополнительно содержит гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, где гуманизированный ген IL-4 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4 грызуна в эндогенном локусе IL-4.

[0048] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0049] В одном варианте осуществления мышь не способна экспрессировать белок IL-4 мыши и не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.

[0050] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна и/или локусе IL-4Rα грызуна получены от мыши или крысы.

[0051] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4 грызуна и/или локусе IL-4Rα грызуна.

[0052] В одном аспекте предложено отличное от человека животное, например, грызун, например, мышь или крыса, которое экспрессирует человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rα, при этом отличное от человека животное экспрессирует человеческие или гуманизированные белки IL-4 и/или IL-4Rαc отличного от человеческого эндогенного локуса IL-4Rα и/или отличного от человеческого эндогенного локуса IL-4Rα. В варианте осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0053] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4 с эндогенного локуса IL-4 мыши, при этом эндогенный ген IL-4 мыши был полностью или частично заменен человеческим геном IL-4.

[0054] В одном варианте осуществления непрерывную геномную последовательность нуклеиновой кислоты мыши длиной приблизительно 6,3 т.п.о. из эндогенного локуса IL-4 мыши, включающую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4 длиной приблизительно 8,8 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4 из ВАС RP11-17K19, содержащего человеческий ген. В конкретном варианте осуществления модифицированный ген IL-4 содержит 5'-регуляторные элементы из IL-4 мыши и участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 человеческого IL-4, т.е. последовательности, кодирующие белок IL-4.

[0055] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, полностью или частично заменяет эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный белок IL-4 мыши.

[0056] В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, у которой экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα с эндогенного локуса IL-4Rα мыши, при этом эндогенный ген IL-4Rα мыши был полностью или частично заменен человеческим геном IL-4Rα.

[0057] В одном варианте осуществления непрерывную геномную последовательность нуклеиновой кислоты мыши длиной приблизительно 7,1 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4Rα мыши, включающую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα длиной приблизительно 15,6 т.п.о., содержащую участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4α, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4α из ВАС RP11-16E24, содержащего человеческий ген. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая геномную нуклеиновую кислоту мыши, содержит полную последовательность, кодирующую эктодомен человеческого IL-4Rα.

[0058] В одном аспекте предложен способ получения грызуна с гуманизированным IL-4, включающий замену последовательности гена IL-4 грызуна, кодирующую белок IL-4 грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, содержащей один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4, с образованием модифицированного гуманизированного гена IL-4, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, при этом замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 грызуна, и последовательность гуманизированного гена IL-4, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4 и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанной с регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 грызуна.

[0059] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0060] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от мыши. В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от крысы.

[0061] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4 грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0062] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 экзона последовательности человеческого гена IL-4. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, содержит все 4 экзоны последовательности человеческого гена IL-4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0063] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4, замещающая последовательность гена IL-4 грызуна, кодирует белок, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен человеческому IL-4 (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000589.3s).

[0064] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4 и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанной с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 грызуна.

[0065] В одном аспекте предложен способ получения мыши с гуманизированным IL-4, включающий замену последовательности гена IL-4 мыши, кодирующей белок IL-4 мыши, последовательностью человеческого гена IL-4 с образованием модифицированного, гуманизированного гена IL-4, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4.

[0066] В одном варианте замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 мыши, и при этом полученный гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанным с регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 мыши.

[0067] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4 мыши, и при этом гуманизированный ген IL-4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, является функционально связанным с эндогенными регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4 мыши.

[0068] В одном аспекте предложен способ получения грызуна с гуманизированным IL-4Rα, включающий замену последовательности гена IL-4Rα грызуна, кодирующей белок IL-4Rα грызуна, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, содержащей один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα, с образованием модифицированного гуманизированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, при этом замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4Rα, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанной с регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.

[0069] В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0070] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от мыши. В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна получены от крысы.

[0071] В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0072] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4Rα. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит все 9 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0073] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, кодирует белок, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен человеческому IL-4Rα (например, человеческому белку IL-4Rα, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3).

[0074] В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере один экзон последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит по меньшей мере 2, 3 или 4 экзона последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, содержит все 5 экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα, кодирующей эктодомен человеческого белка IL-4Rα. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0075] В одном варианте осуществления последовательность человеческого гена или гуманизированного IL-4Rα, замещающая последовательность гена IL-4Rα грызуна, кодирует эктодомен белка IL-4Rα, который на приблизительно 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на приблизительно 99% идентичен эктодомену человеческого белка IL-4Rα (например, человеческого белка IL-4Rα, кодируемого нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3).

[0076] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна и последовательность гуманизированного гена IL-4Rα, содержащая один или более экзонов последовательности человеческого гена IL-4Rα и кодирующая человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанной с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями грызуна (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.

[0077] В одном аспекте предложен способ получения мыши с гуманизированным IL-4Rα, включающий замену последовательности гена IL-4Rα мыши, кодирующей белок IL-4Rα мыши, последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα, кодирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.

[0078] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα мыши и гуманизированный ген IL-4Rα, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является функционально связанным с регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.

[0079] В одном варианте осуществления замену осуществляют по эндогенному локусу IL-4Rα мыши и гуманизированный ген IL-4Rα, кодирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Ra, является функционально связанным с эндогенными регуляторными элементами мыши или последовательностями (например, 5'- и/или 3'-регуляторными элементами) в эндогенном локусе IL-4Rα мыши.

[0080] В различных аспектах описанные в данном документе генетически модифицированные отличные от человека животные, например, грызуны, например, мыши или крысы, несут генетические модификации в их зародышевой линии.

[0081] В одном аспекте предложен эмбрион отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, содержащий генетическую модификацию, описанную в данном документе.

[0082] В одном аспекте предложен эмбрион-хозяин отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, который содержит донорную клетку, содержащую генетическую модификацию, описанную в данном документе.

[0083] В одном аспекте предложена плюрипотентная или тотипотентная клетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, содержащая генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку мыши. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ES-клетку мыши.

[0084] В одном аспекте предложена яйцеклетка отличного от человека животного, например, грызуна, например, мыши или крысы, при этом яйцеклетка отличного от человека животного содержит эктопическую хромосому отличного от человека животного, где эктопическая хромосома отличного от человека животного содержит генетическую модификацию, описанную в данном документе. В одном варианте осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

[0085] В одном аспекте эмбрион, яйцеклетка или клетка мыши, которые генетически модифицируют с тем, чтобы они содержали ген человеческого IL-4 или ген человеческого IL-4Rα, принадлежит мыши, которая является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии 129, выбранной из группы, состоящей из линий, представляющих собой 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь является гибридом вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь является гибридом вышеуказанных линий 129 или гибридом вышеуказанных линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 в гибриде представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например, линии BALB/c. В еще одном варианте осуществления мышь представляет собой гибрид линии BALB и другой вышеуказанной линии. В одном варианте осуществления мышь представляет собой мышь Swiss или Swiss Webster.

[0086] В различных аспектах отличные от человека животные, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты человеческих или гуманизированных IL-4R и/или IL-4, выбраны из млекопитающих и птиц. В одном варианте осуществления отличные от человека животные представляют собой млекопитающих. В одном варианте осуществления млекопитающие представляют собой подсемейство мышиных.

[0087] В одном аспекте предложен способ скрининга в отношении антагониста, специфичного к IL-4 или IL-4Rα человека. Способ является применимым для идентификации терапевтических кандидатов и оценки терапевтической эффективности. Способ включает введение средства генетически модифицированному грызуну, у которого гуманизированы две последовательности IL-4 и IL-4Rα, как описано в данном документе, определение эффекта средства по отношению к биологической функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, и идентификацию средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, если оно проявляет антагонизм по отношению к функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, у генетически модифицированного грызуна.

[0088] В одном варианте осуществления средство содержит вариабельный домен иммуноглобулина, который связывает IL-4 или IL-4Rα. В одном варианте осуществления средство специфически связывает человеческий IL-4 или IL-4Rα, но не IL-4 или IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело. В конкретном варианте осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывает человеческий IL-4Rα, но не IL-4Rα грызуна.

[0089] В одном варианте осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 мыши или IL-4Rα мыши.

[0090] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает стадии индуцирования у описанного в данном документе грызуна с двумя гуманизированными последовательностями заболевания, ассоциированного с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, введения средства грызуну, определения того, уменьшает ли средство тяжесть заболевания, и идентифицирования средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, подходящего для лечения заболевания, если данное средство уменьшает тяжесть заболевания.

[0091] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой воспаление дыхательных путей, которое может быть индуцировано у грызуна путем интраназального введения аллергена (например, экстракта клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, снижается ли степень воспаления дыхательных путей (что отражается, например, по накоплению слизи, клеточному инфильтрату в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и/или уровням общего IgE в кровотоке) в результате введения средства.

[0092] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой кожное воспаление или атопический дерматит, которые могут быть индуцированы у грызуна путем создания кожного повреждения и воздействия на поврежденную кожу аллергеном (например, бактериальным токсином или экстрактом клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, уменьшается ли кожное воспаление в результате введения средства.

[0093] В дополнительном аспекте отличное от человека животное с тремя гуманизированными генами IL-4, IL-4Rα и IL-33, описанное в данном документе, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности соединения или комбинации соединений.

[0094] Каждый из описанных в данном документе аспектов и вариантов осуществления можно использовать совместно, если это явно не исключается или очевидно из контекста варианта осуществления или аспекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0095] На фигуре 1 представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, передачи сигнала рецепторами для IL-4 и IL-13 и механизм действия дупилумаба, нейтрализующего полностью человеческое моноклональное антитело, который специфически связывается с α-цепью рецептора человеческого IL-4 (IL-4Rα).

[0096] На фигурах 2А-2В представлена иллюстрация, без соблюдения масштаба, стратегий гуманизации локусов IL-4 (Il4) и IL-4Rα (Il4ra). (2А) Ген IL-4 мыши (вверху), охватывающий кодирующий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4, подвергали делеции и заменяли кодирующим участком от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и частью 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4 (внизу) вместе с фланкированной loxP кассетой с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, как указано. (2В) Ген IL-4Rα мыши (вверху), охватывающий кодирующий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 подвергали делеции и заменяли кодирующим участком от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и частью интрона 5 человеческого гена IL-4Rα (внизу) и фланкированной loxP кассетой с селектируемым маркером устойчивости к неомицину, как указано.

[0097] На фигуре 3 показана экспрессия гуманизированного белка IL-4Rα на В- и Т-клетках от мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4/IL-4Rα (Il4^hu/hu/Il4ra^hu/hu).

[0098] На фигуре 4 показаны характеристики специфичности к лигандам IL-4 и IL-13 и функциональные свойства рецепторов с использованием первичных клеток, полученных от мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4ra^hu/hu).

[0099] На фигуре 5 показано зависимое от IL-4 продуцирование IgE in vivo у мышей дикого типа, но не у мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00100] На фигуре 6 показано, что зависимая от дозы IL-4 индукция продуцирования mIgE ex vivo в В-клетках мыши (левая панель) блокируется дупилумабом в зависимости от его дозы (правая панель).

[00101] На фигуре 7 показано, что дупилумаб в зависимости от его дозы предупреждает развитию IL-25-индуцированных патологий в легких in vivo у мышей с гуманизированной последовательностью IL4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00102] На фигуре 8 показана схема эксперимента по оценке терапевтической эффективности дупилумаба на модели с воспалением легких, индуцированным экстрактом клещей домашней пыли (HDM), с использованием мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4 и IL-4Rα (IL-4^hu/hu/IL-4R^hu/hu). «REGN668» относится к человеческому моноклональному антителу к человеческому IL-4Rα, также известному как дупилумаб. «REGN129» означает раствор IL-13Rα-2-Fc мыши, который представляет собой белок слияния из эктодомена IL-13R2α мыши и Fc.

[00103] На фигуре 9 показана схема эксперимента по оценке терапевтической эффективности дупилумаба на модели с воспалением легких, индуцированным с помощью HDM, с использованием мышей с двумя гуманизированными последовательностями IL-4 и IL-4Rα (IL-4^hu/hu/IL-4R^hu/hu) и антитела в качестве изотипического контроля.

[00104] На фигурах 10А-10С проиллюстрированы стратегии гуманизации локуса IL-33 мыши. На фигуре 10А проиллюстрировано, что ген IL-33 мыши (вверху), охватывающий кодирующий участок от экзона 2, начинающегося участком со стартового кодона ATG, до стоп-кодона экзона 8, подвергают делеции и заменяют кодирующим участком от экзона 2, начинающегося кодоном ATG, до экзона 8 (включая 3'-нетранслируемый участок) человеческого гена IL-33 (внизу). На фигуре 10В показан аллель гуманизированного IL-33 в клоне MAID 7060 ES-клетки мыши, который содержит фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину. На фигуре 10С показан аллель гуманизированного IL-33 в клоне MAID 7061 ES-клетки мыши, в котором кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину подвергли делеции, при этом сайты loxP и сайты клонирования (77 п.о.) оставались ниже последовательности человеческого IL-33, а 3'-UTR мыши оставалась ниже loxP-сайта.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

IL-4 и IL-4Rα в качестве терапевтических мишеней

[00105] Аллергические заболевания представляют собой спектр заболеваний, которые возникают с возрастающими темпами, особенно в развитых странах. Атопический дерматит, астма и аллергический ринит являются наиболее распространенными воспалительными состояниями среди пациентов с аллергическими заболеваниями; при этом данные пациенты часто испытывают проявление нескольких клинических симптомов. Патогенез аллергии связан с аномальными иммунными ответами на экзогенные антигены (см. Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250).

[00106] Избыточное продуцирование антигенспецифических IgE является важной составляющей в инициировании аллергического воспаления. Поляризация аномальных клеток Т-хелперов 2 типа (Th2) приводит к усиленным IgE-опосредованным ответам.

[00107] Интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), впервые идентифицированные в активированных Т-клетках, являются основными цитокинами Th2, которые играют ведущую роль в инициировании и поддержании иммунных и воспалительных реакций при аллергических заболеваниях.

[00108] Передача сигналов IL-4 и IL-13 опосредуется двумя разными рецепторными комплексами с общей субъединицей, альфа-рецептор IL-4 (IL-4Rα), что может способствовать пересечению биологических ответов между этими двумя цитокинами. См. фигуру 1.

[00109] Передача сигналов рецепторами интерлейкинов-4/13 и механизм действия дупилумаба. IL-4Rα образует два разных гетеродимерных рецепторных комплекса для опосредования биологических функций IL-4 и IL-13 тканеспецифическим и реакционно-специфическим образом. Рецептор I типа, состоящий из IL-4Rα и общей гамма-цепи цитокиновых рецепторов (γC), является уникальным для IL-4. Рецептор II типа, образующийся из IL-4Rα и IL-13Rα1, является основным рецептором для IL-13, но он также функционален для IL-4. Кроме того, IL-13 будет связываться со вторым высокоаффинным рецептором IL-13Rα2, который обычно определяют как рецептор-ловушка или как характеризующийся возможным профибротическим эффектом в полноразмерной форме.

[00110] Дупилумаб представляет собой антагонистическое моноклональное антитело к IL-4Rα человека, которое подавляет индуцированные IL-4 и IL-13 виды биологической активности. Дупилумаб блокирует передачу сигнала IL-4 за счет предотвращения его связывания с субъединицами рецепторов, тогда как ингибирующее действие в отношении передачи сигнала IL-13 по всей видимости опосредовано благодаря препятствию взаимодействия с димерным рецептором.

[00111] Дупилумаб, полностью человеческое моноклональное антитело к общей субъединице IL-4Rα, был разработан в Regeneron Pharmaceuticals, Inc. с использованием мышей VelocImmune^®. Дупилумаб проходит клинические испытания в качестве средства для лечения астмы со степенью тяжести от умеренной до тяжелой и для лечения атопического дерматита со степенью тяжести от умеренной до тяжелой.

[00112] Оценка эффективности дупилумаба на мышиных моделях сопряжена со многими трудностями: (a) дупилумаб не распознает когнатный рецептор IL-4 мыши; и (b) существует недостаток функционального взаимодействия между белком IL-4 и рецептором человеческого IL-4.

Ген и белок IL-4

[00113] Ген IL-4 кодирует секретируемый белок IL-4, который играет важную роль в активации В-клеток, а также других типов клеток (см. Фигуру 1).

[00114] Человеческий IL-4. ID гена в NCBI: 3565; первоисточник: HGNC:6014; транскрипт эталонной последовательности: NM_000589.3; ID в UniProt: Р05112; геномная сборка: GRCh37; локализация: chr5:132009743-132018576 + нить.

[00115] Ген человеческого IL-4 локализован на хромосоме 5 в участке 5q31.1. Ген человеческого IL-4 содержит 4 экзона и кодирует полипептид-предшественник длиной 153 аминокислоты, включающих в себя 24 аминокислоты сигнального пептида и 129 аминокислот зрелого белка IL-4.

[00116] IL-4 мыши. ID гена в NCBI: 16189; первоисточник: MGI:96556; транскрипт эталонной последовательности: NM_021283.2; ID в UniProt: Р07750; геномная сборка: GRCm38; локализация: chr11:53612350-53618606 - нить.

[00117] Ген IL-4 мыши локализован на хромосоме 11 в участке 11, 31,97 сМ. Ген IL-4 мыши содержит 4 экзона и кодирует полипептид-предшественник длиной 140 аминокислот, включающих в себя 20 аминокислоты сигнального пептида и 120 аминокислот зрелого белка IL-4.

Ген и белок IL-4Rα

[00118] Ген IL-4Rα кодирует трансмембранный рецепторный белок IL-4Rα, который экспрессируется в основном на В- и Т-клетках и является рецептором для белков IL-4 и IL-13 (см. фигуру 1).

[00119] Человеческий IL-4Rα. ID гена в NCBI: 3566; первоисточник: MGI:6015; транскрипт эталонной последовательности: NM_000418.3; ID в UniProt: Р24394; геномная сборка: GRCh37; локализация: chr16:27351525-27367111 + нить.

[00120] Ген человеческого IL-4Rα локализован на хромосоме 16 в участке 16р12.1-р11.2. Ген человеческого IL-4Rα содержит 9 кодирующих экзонов и кодирует полипептид-предшественник из 825 аминокислот, включающих в себя 25 аминокислот сигнального пептида и 800 аминокислот зрелого белка IL-4Rα, при этом первые 207 аминокислотных остатков зрелого белка составляют внеклеточный домен. Внеклеточный домен (т.е. эктодомен) человеческого белка IL-4Rα кодируется кодирующими экзонами 1-5 человеческого гена IL-4Rα.

[00121] IL-4Rα мыши. ID гена в NCBI: 16190; первоисточник: MGI:105367; транскрипт эталонной последовательности: NM_001008700.3; ID в UniProt: Р16382; геномная сборка: GRCm38; локализация: chr11:125565655-125572745 + нить.

[00122] Ген IL-4Rα мыши локализован на хромосоме 7 в участке 7, 68,94 сМ. Ген IL-4Rα мыши содержит 9 кодирующих экзонов и кодирует полипептид-предшественник из 810 аминокислот, включающих в себя 25 аминокислот сигнального пептида и 785 аминокислот зрелого белка IL-4Rα, при этом первые 208 аминокислотных остатков зрелого белка составляют внеклеточный домен. Внеклеточный домен (т.е. эктодомен) белка IL-4Rα мыши кодируется кодирующими экзонами 1-5 гена IL-4Rα мыши.

Видоспецифичность белков IL-4 и IL-4Rα

[00123] Как показано в данном документе, IL-4 мыши, а не человеческий, является функциональным у мышей дикого типа, и наоборот, человеческий IL-4, а не мыши, является функциональным у мышей с гуманизированными последовательностями IL-4Rα (Il4ra^hu/hu). (См. также, например, Andrews et al. (2001) Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse В cells: demonstration of species specificity, J Immunol. 166:1716-1722).

Видоспецифичность ингибиторов человеческих IL-4 и IL-4Rα

[00124] Кандидатные терапевтические молекулы, целенаправленно воздействующие на белки IL-4 или IL-4Rα, как правило, оценивают в отношении фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах. Такие терапевтические молекулы также тестируют в отношении терапевтической эффективности in vivo на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, в качестве моделей заболеваний, нарушений и состояний у человека, ассоциированных с аномальными Th2-клетками.

[00125] Однако терапевтические молекулы, специфичные к человеческим белкам IL-4 или IL-4Rα, например, ингибиторы, специфичные к человеческим IL-4 или IL-4Rα, невозможно оценить с достаточной точностью в отношении PD или терапевтической эффективности in vivo на грызунах, в частности мышах, поскольку мишени для этих терапевтических молекул у них отсутствуют. Эта проблема не устраняется путем применения трансгенных отличных от человека животных, например, грызунов, например, мышей или крыс, экспрессирующих человеческие белки IL-4 или IL-4Rα, из-за вышеуказанной видоспецифичности белка IL-4.

[00126] Соответственно, в различных вариантах осуществления для оценки PD и терапевтической эффективности in vivo антагонистов или ингибиторов, специфичных к человеческим белкам IL-4 или IL-4Rα, на отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, желательно заменить эндогенные белки IL-4 и/или IL-4Rα человеческими белками IL-4 и/или IL-4Rα.

[00127] Кроме того, в различных вариантах осуществления во избежание потенциальных проблем сверхэкспресии или недостаточной экспрессии человеческих белков IL-4 и/или IL-4Rα, необходимо встроить гены человеческих IL-4 и/или IL-4Rα в геном отличных от человека животных, например, грызунов, например, мышей или крыс, по эндогенным локусам генов IL-4 и/или IL-4Rα и поместить экспрессию человеческих белков IL-4 и/или IL-4Rα в отличных от человека животных, например, грызунах, например, мышах или крысах, под контроль по меньшей мере частично эндогенных регуляторных элементов IL-4 и/или IL-4Rα.

Генетически модифицированные отличные от человека животные

[00128] В данном документе предложены генетически модифицированные отличные от человека животные, у которых эндогенные гены IL-4 и/или гены IL-4Rα полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4 и/или локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и/или нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα с образованием модифицированного гена IL-4 и/или модифицированного гена IL-4Rα, которые кодируют человеческий или гуманизированный белок IL-4 и/или человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.

[00129] Используемая в данном документе фраза «отличное от человека животное» относится к любому позвоночному организму, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. В конкретных вариантах осуществления отличное от человека животное представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[00130] В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4 грызуна полностью или частично заменен по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой, кодирующей человеческий IL-4.

[00131] Замена включает замену по меньшей мере одного экзона, т.е. одного или более экзонов, в гене IL-4 грызуна последовательностью человеческой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4. В некоторых вариантах осуществления непрерывный геномный фрагмент грызуна, который включает участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 гена IL-4 грызуна, заменен непрерывным геномным фрагментом человека, включающим участок от экзона 1, начинающийся стартовым кодоном ATG, до экзона 4 человеческого гена IL-4. В конкретном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, при этом непрерывный геномный фрагмент мыши длиной приблизительно 6,3 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4 мыши, включающий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4 длиной приблизительно 8,8 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4.

[00132] В некоторых вариантах осуществления результатом замены является модифицированный гуманизированный ген IL-4 в эндогенном локусе гена IL-4, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов в эндогенном локусе IL-4. Используемое в данном документе выражение «регуляторные элементы» относится к последовательностям, регулирующим транскрипцию, в том числе как к 5'-концевым последовательностям, регулирующим транскрипцию, таким как промотор, энхансер и элементы, подавляющие транскрипцию, так и к 3'-концевым последовательностям, регулирующим транскрипцию, таким как последовательность терминации транскрипции. В некоторых вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 5'-концевых регуляторных элементов. В других вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 3'-концевых регуляторных элементов. В определенных вариантах осуществления экспрессия модифицированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных 5'-концевых и 3'-концевых регуляторных элементов.

[00133] Модифицированный гуманизированный ген IL-4, образовавшийся в эндогенном локусе IL-4, кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4. Выражение «гуманизированный» относится к нуклеиновым кислотам или белкам, которые содержат части или последовательности гена или белка, встречающиеся у отличного от человека животного (например, грызуна, такого как мышь или крыса), а также содержат части или последовательности, которые отличаются от таковых, встречающихся у отличного от человека животного, но вместо этого соответствуют (являются идентичными) частям или последовательностям аналогов человеческих гена или белка. Модифицированный гуманизированный ген IL-4 может кодировать белок IL-4, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен человеческому белку IL-4 или является на 100% идентичным ему (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000589.3).

[00134] Генетически модифицированный грызун с полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 может быть гомозиготным или гетерозиготным по замене. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по замене, т.е. только одну из двух копий эндогенного гена IL-4 грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4. В других вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гомозиготным по замене, т.е. обе копии эндогенного гена IL-4 грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.

[00135] У генетически модифицированного грызуна человеческий или гуманизированный белок IL-4 экспрессируется в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-4 грызуна. В одном варианте осуществления сыворотка крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4, что и у грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, например, грызуна дикого типа (например, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержащего полную или частичную замену эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4). Под выражением «примерно такой же уровень» подразумевают уровень, который находится в пределах 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или менее в любую сторону (т.е. более или менее) от уровня у грызуна дикого типа. В других вариантах осуществления грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови в концентрации по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от уровня белка IL-4, присутствующего в сыворотке крови грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4, но не содержащего полную или частичную замену эндогенного гена IL-4 по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.

[00136] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4 в сыворотке крови, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4 и не характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4.

[00137] В дополнительных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4, также характеризуется полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и вследствие этого также экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα.

[00138] В другом аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4Rα грызуна был полностью или частично заменен по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.

[00139] Замена предусматривает замену по меньшей мере одного экзона, т.е. одного или более экзонов, в гене IL-4Rα грызуна последовательностью человеческой нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один экзон человеческого гена IL-4Rα. В некоторых вариантах осуществления замена предусматривает замену по меньшей мере одного из экзонов гена IL-4Rα грызуна, кодирующего эктодомен грызуна, по меньшей мере одним из экзонов человеческого гена IL-4Rα, кодирующего эктодомен человека. В некоторых вариантах осуществления замена предусматривает замену человеческой последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 2, 3 или 4 из 5 экзонов, кодирующих эктодомен, человеческого гена IL-4Rα. В других вариантах осуществления непрерывный геномный фрагмент грызуна, который включает участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 от гена IL-4Rα грызуна, заменили геномным фрагментом, включающим участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα. В конкретном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, при этом непрерывный геномный фрагмент мыши длиной приблизительно 7,1 т.п.о. в эндогенном локусе IL-4Rα мыши, включающий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5, подвергают делеции и заменяют последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого IL-4Rα длиной приблизительно 15,6 т.п.о., содержащей участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα.

[00140] В некоторых вариантах осуществления результатом замены является модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα в эндогенном локусе гена IL-4Rα, при этом экспрессия модифицированного гена IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных элементов в эндогенном локусе IL-4Rα.

[00141] Модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα, полученный в эндогенном локусе IL-4Rα, кодирует человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα. В некоторых вариантах осуществления модифицированный гуманизированный ген IL-4Rα кодирует белок IL-4Rα, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичен человеческому белку IL-4Rα или является на 100% идентичным ему (например, человеческому белку IL-4, кодируемому нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3). В других вариантах осуществления модифицированный ген IL-4Rα кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, который содержит эктодомен, который по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или на 99% идентичен эктодомену человеческого белка IL-4Rα или является на 100% идентичным ему (например, человеческого белка IL-4, кодируемого нуклеиновой кислотой, изложенной в GenBank под № доступа NM_000418.3). В конкретных вариантах осуществления трансмембранный и цитоплазматический домены гуманизированного белка IL-4Rα являются идентичными трансмембранному и цитоплазматическому доменам эндогенного белка IL-4Rα грызуна.

[00142] Генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα, может быть гомозиготным или гетерозиготным по замене. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по замене, т.е. только одну из двух копий эндогенного гена IL-4Rα грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. В других вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гомозиготным по замене, т.е. обе копии эндогенного гена IL-4Rα грызуна заменили нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.

[00143] У генетически модифицированного грызуна, раскрытого в данном документе, человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα экспрессируется на иммунных клетках, например, В- и Т-клетках. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун не экспрессирует эндогенный белок IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления иммунные клетки грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, характеризуются примерно таким же уровнем белка IL-4Rα на иммунных клетках, что и у грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα на иммунных клетках, такого как грызуна дикого типа, экспрессирующего функциональный, эндогенный белок IL-4Rα и не экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα. В других вариантах осуществления у грызуна экспрессируется человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα на иммунных клетках в количестве по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от количества белка IL-4Rα, присутствующего на иммунных клетках грызуна соответствующей возрастной группы, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα, но не характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα.

[00144] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, имеет нормальную иммунную систему, т.е. количество иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, является аналогичным количеству иммунных клеток, например, В- и Т-клеток, в крови, плазме крови или сыворотке крови грызуна дикого типа (например, грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок IL-4Rα и не характеризующегося полной или частичной замены эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα).

[00145] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, способен опосредовать зависимую от IL-4 передачу сигнала и зависимую от IL-13 передачу сигнала и имеет функциональные свойства к этому. Например, гуманизированный белок IL-4Rα с эктодоменом человеческого белка IL-4Rα, экспрессируемый на иммунных клетках генетически модифицированного грызуна, взаимодействует с человеческим IL-4 и опосредует зависимую от человеческого IL-4 передачу сигнала посредством образования рецептора I типа (см. фигуру 1). Такой гуманизированный белок IL-4Rα с эктодоменом человеческого белка IL-4Rα также взаимодействует с человеческим и IL-13 мыши и опосредует зависимую от человеческого IL-13 передачу сигналов посредством образования рецептора II типа (см. фигуру 1). Функциональные свойства гуманизированного белка IL-4Rα, экспрессируемого у генетически модифицированного грызуна, можно оценить с помощью различных анализов, известных из уровня техники, в том числе конкретно описанных в примерах, приведенных в данном документе ниже, таких как анализ, в котором измеряют IL-4-индуцированное переключение на синтез класса IgE с использованием первичных В-клеток, полученных от генетически модифицированного грызуна.

[00146] В дополнительных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, характеризующийся полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα и экспрессирующий человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα, также характеризуется полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4 и вследствие этого также экспрессирует человеческий или гуманизированный IL-4.

[00147] В дополнительном аспекте предусмотрены грызуны с двумя гуманизированными последовательностями, например, мыши или крысы, у которых эндогенный ген IL-4 грызуна полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4 нуклеиновой кислотой человеческого IL-4, и у которых эндогенный ген IL-4Rα грызуна также полностью или частично заменили по эндогенному локусу IL-4Rα нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. Такие грызуны с двумя гуманизированными последовательностями могут быть гомозиготными или гетерозиготными по каждой замене, приводящей к гуманизации. В конкретном варианте осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями является гомозиготным как по гуманизированному IL-4, так и по гуманизированному IL-4Rα.

[00148] Генетическая модификация эндогенного гена IL-4 грызуна у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями включает такие модификации или замены, как описаны в данном документе выше для генетически модифицированного грызуна, характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4 грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4. Подобным образом, генетическая модификация эндогенного гена IL-4Rα грызуна у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями включает такие модификации или замены, которые описаны в данном документе выше для генетически модифицированного грызуна, характеризующегося полной или частичной заменой эндогенного гена IL-4Rα грызуна нуклеиновой кислотой человеческого IL-4Rα. Таким образом, признаки, раскрытые в данном документе относительно гуманизации гена IL-4 грызуна и относительно гуманизации гена грызуна соответственно, конкретно включены в данный документ по отношению к грызуну с двумя гуманизированными последовательностями.

[00149] В конкретных вариантах осуществления предложен грызун с двумя гуманизированными последовательностями, например, мышь или крыса, экспрессирующая человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα и содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного белка IL-4Rα грызуна. В конкретных вариантах осуществления экспрессия человеческого белка IL-4 и гуманизированного белка IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных последовательностей грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна и локусе IL-4Rα грызуна соответственно.

[00150] В некоторых вариантах осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями имеет нормальную иммунную систему (т.е. количество иммунных клеток является примерно таким же, как у грызуна дикого типа), характеризуется примерно таким же уровнем белка IL-4 в сыворотке крови и экспрессирует примерно такое же количество белка IL-4Rα на иммунных клетках, как и грызун дикого типа, при этом грызун дикого типа представляет собой грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок IL-4 и белок IL-4Rα и не экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4 или белок IL-4Rα.

[00151] В конкретных вариантах осуществления грызун с двумя гуманизированными последовательностями характеризуется функциональным путем передачи сигнала IL-4. Под «функциональным путем передачи сигнала IL-4» подразумевают, что как человеческий или гуманизированный белок IL-4, так и человеческий или гуманизированный белок IL-4Rα экспрессируются у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями и взаимодействуют друг с другом у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями с тем, чтобы эффективно опосредовать нисходящую передачу сигнала и осуществлять виды биологической активности нормального пути передачи сигнала IL-4. Биологические активности нормального пути передачи сигнала IL-4 описаны в данном документе выше и проиллюстрированы на фигуре 1, включая таковые активности, которые опосредованы рецептором I типа, такие как инициация и поддержка дифференцировки Th2, активация и рост В-клеток, переключение синтеза между классами IgE и IgG4, и такие активности, которые опосредованы передачей сигнала рецептором II типа, такие как гиперплазия бокаловидных клеток, субэпителиальный фиброз и тканевое ремоделирование. Например, функциональный путь передачи сигнала IL-4 у грызуна с двумя гуманизированными последовательностями проявляется воспалительным фенотипом, характеризующимся, например, повышенным уровнем IgE в кровотоке, воспалением дыхательных путей и/или эозинофильным клеточным инфильтратом в ответ на введение экстракта клещей домашней пыли, при этом фенотип также наблюдают у грызунов дикого типа без двух гуманизированных последовательностей.

Способы получения генетически модифицированного отличного от человека животного

[00152] Генетически модифицированное отличное от человека животное, такое как грызун, можно получить с помощью способов, известных из уровня техники. Например, можно получить целенаправленно воздействующий вектор, который содержит человеческую нуклеиновую кислоту (такую как человеческий ген IL-4 или IL-4Rα, полностью или частично), фланкированную ниже и выше гомологичными участками отличного от человека животного. Целенаправленно воздействующая конструкция также может содержать кассету с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству (например, фланкированная loxP кассета с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, которую можно затем удалить транзиентным Cre-экспрессирующим вектором), которую размещают относительно 3'-конца человеческой нуклеиновой кислоты. Целенаправленно воздействующий вектор можно ввести в геном клетки отличного от человека животного, например, эмбриональной стволовой (ES) клетки (такой как ES-клетки мыши), например, посредством электропорации. Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию клоны ES-клеток можно затем вводить в эмбрион на ранней стадии (например, эмбрион мыши на стадии 8 клеток). Отличные от человека животные, полностью происходящие от подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток, идентифицируют на основе, например, анализа аллелей. Для отличных от человека животных, для которых подходящие генетически модифицируемые ES-клетки являются труднодоступными, можно использовать другие способы с получением отличного от человека животного, содержащего генетические модификации, описанные в данном документе. Такие способы включают, например, модифицирование генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки) и использование переноса ядер для перемещения модифицированного генома в подходящую клетку, например, ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) в отличном от человека животном в подходящих условиях с образованием эмбриона.

Способы использования генетически модифицированного отличного от человека животного

[00153] В одном аспекте генетически модифицированных по IL-4 и/или IL-4Rα отличных от человека животных, раскрытых в данном документе, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или к IL-4Rα (например, дупилумаба), на различных моделях заболеваний, дополнительно проиллюстрированных в примерах ниже.

[00154] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении антагониста, специфичного к IL-4 или IL-4Rα человека, с использованием мышей с двумя гуманизированных генами IL-4 и IL-4Rα, раскрытыми в данном документе.

[00155] Под «антагонистами IL-4 или IL-4Rα» подразумевают молекулы (например, антитела), которые блокируют, подавляют или ингибируют одну или более биологических функций, опосредованных IL-4 или IL-4Rα.. «Антагонисты, специфичные к человеческим IL-4 или IL-4Rα» относятся к антагонистам, которые являются специфичными к человеческим IL-4 или IL-4Rα, и практически не воздействуют на IL-4 или IL-4Rα грызуна.

[00156] В конкретных вариантах осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 или IL-4Rα мыши.

[00157] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, включает введение средства генетически модифицированному грызуну с двумя гуманизированными генами IL-4 и IL-4Rα, как описано в данном документе, определение эффекта средства по отношению к биологической функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, и идентифицирование средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, если оно вызывает антагонизм функции, опосредованной сигнальным путем IL-4/IL-4Rα, у генетически модифицированного грызуна.

[00158] В одном варианте осуществления средство содержит вариабельный домен иммуноглобулина, который связывает IL-4 или IL-4Rα. В одном варианте осуществления средство специфически связывает человеческий IL-4 или IL-4Rα, но не IL-4 или IL-4Rα грызуна. В одном варианте осуществления средство представляет собой антитело. В конкретном варианте осуществления средство представляет собой антитело, которое специфически связывает человеческий IL-4Rα, но не IL-4Rα грызуна.

[00159] В одном варианте осуществления в способе скрининга используют мышь с двумя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4 и гуманизированный белок IL-4Rα, где гуманизированный белок IL-4Rα содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами эндогенного белка IL-4Rα мыши, и где мышь не экспрессирует IL-4 мыши или IL-4Rα мыши.

[00160] В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает стадии индуцирования у описанного в данном документе грызуна с двумя гуманизированными последовательностями заболевания, ассоциированного с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, введения средства грызуну, определения того, уменьшает ли средство тяжесть заболевания, и идентифицирования средства в качестве антагониста, специфичного к человеческим IL-4 или IL-4Rα, подходящего для лечения заболевания, если данное средство уменьшает тяжесть заболевания.

[00161] Под «заболеванием, связанным с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα» подразумевают заболевание, при котором вовлечена биологическая функция, опосредованная передачей сигналов IL-4/IL-4Rα. Примеры заболеваний, ассоциированных с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, включают, например, воспалительные заболевания или нарушения, такие как астма, атопический дерматит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (которое может возникать по меньшей мере частично от сигаретного дыма), воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артрит, аллергический ринит, эозинофильный эзофагит и псориаз. Астма может представлять собой эозинофильную или неэозинофильную астму и стероид-чувствительную или стероид-резистентную астму.

[00162] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой воспаление дыхательных путей, которое может быть индуцировано у грызуна путем интраназального введения аллергена (например, экстракта клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, снижается ли степень воспаления дыхательных путей (что выражается, например, по накоплением слизи, эозинофильным клеточным инфильтратом в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, уровнями общего IgE в кровотоке и/или изменением профиля экспрессии, измеряемому посредством анализа экспрессии на микрочипе) вследствие введения средства. Аллерген, используемый для индуцирования воспаления дыхательных путей, и тестируемое средство можно вводить одновременно или в разные моменты времени. В некоторых вариантах осуществления аллерген вводят грызуну в одной или более дозах, а тестируемое средство вводят грызуну после того, как грызуну ввели по меньшей мере одну дозу аллергена.

[00163] В некоторых вариантах осуществления заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα, представляет собой кожное воспаление или атопический дерматит, которые могут быть индуцированы у грызуна путем создания кожного повреждения и воздействия на поврежденную кожу аллергеном (например, бактериальным токсином или экстрактом клещей домашней пыли) в одной или более дозах в течение определенного периода времени. Эффект средства можно определить путем измерения того, уменьшается ли кожное воспаление как результат введения средства.

[00164] В дополнительном аспекте отличные от человека животных с тремя гуманизированными последовательностями, т.е. отличных от человека животные, гены IL-4, IL-4Rα и IL-33 которых гуманизировали, используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности кандитатных соединений, таких как, например, антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, и антагонистов, специфичных к человеческому IL-33.

[00165] Под «антагонистами IL-33» подразумевают молекулы (например, антитела), которые блокируют, подавляют или ингибируют одну или более биологических функций или передачу сигналов, опосредованных IL-33.. «Антагонисты, специфичные к человеческому IL-33», относятся к антагонистам, которые являются специфичными к IL-33, и практически не воздействуют на IL-33 грызуна. Известно, что IL-33 стимулирует передачу сигнала через ST2 и RAcP IL-1, которая ослабляется в присутствии антагониста, такого как антитела к IL-33. Ингибирование передачи сигнала IL-33 через ST2 и RAcP IL-1 можно определить путем анализа передачи сигнала IL-33 в анализах in vitro или in vivo, как, например, таких анализах, которые описаны в опубликованной заявке на патент США 2014/0271658 А1, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки. Например, анализ, как, например, такой, который описан в опубликованной заявке на патент США 2014/0271658 А1, можно использовать для оценки эффекта антитела к IL-33 по отношению к воспалению легких у аллерген-чувствительных животных, которые являются гомозиготными по экспрессии человеческого IL-33. Антитело к IL-33, эффективное в качестве антагониста IL-33, должно проявлять тенденцию к снижению количества воспалительных клеток в легком, а также тенденцию к снижению количества цитокинов, таких как IL-4 и IL-5.

[00166] В конкретных вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют согласно данному документу для оценки кандидатных соединений, при этом животное с тремя гуманизированными последовательностями представляет собой мышь с тремя гуманизированными последовательностями, у которой экспрессируется человеческий белок IL-4, гуманизированный белок IL-4Rα, который содержит эктодомен человеческого белка IL-4Rα, связанный с трансмембранным и цитоплазматическим доменами белка IL-4Rα мыши, и человеческий белок IL-33, при этом мышь не экспрессирует IL-4 мыши, IL-4Rα мыши или IL-33 мыши.

[00167] В некоторых вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют для оценки фармакодинамики (PD) и терапевтической эффективности кандидатного соединения, такого как, например, антагониста, специфичного к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, или антагониста, специфичного к человеческому IL-33. Например, антитело, специфичное к человеческому IL-4, антитело, специфичное к человеческому IL-4Rα, и антитело, специфичное к человеческому IL-33, можно тестировать по отдельности на животном с тремя гуманизированными последовательностями (таком как грызун, например, мышь или крыса), после чего можно оценить и сравнить их PD-профили и терапевтические эффективности.

[00168] В других вариантах осуществления отличное от человека животное с тремя гуманизированными последовательностями используют для оценки эффективности комбинации соединений, например, комбинации антитела-антагониста, специфичного к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, с антителом-антагонистом, специфичным к человеческому IL-33, по сравнению с эффективностью данных соединений при использовании их отдельно для определения, например, проявляет ли комбинация соединений синергический терапевтический эффект. В конкретных вариантах осуществления комбинацию антитела, специфичного к человеческому IL-4, и антитела, специфичного к человеческому IL-33, тестируют на отличном от человека животном с тремя гуманизированными последовательностями. В других конкретных вариантах осуществления комбинацию антитела, специфичного к человеческому IL-4Rα, и антитела, специфичного к человеческому IL-33, тестируют на отличном от человека животном с тремя гуманизированными последовательностями.

[00169] Для оценки кандидатного соединения или комбинации соединений у животного с тремя гуманизированными последовательностями можно индуцировать заболевание, ассоциированное с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα и передачей сигналов IL-33. Примеры заболеваний, ассоциированных с передачей сигналов IL-4/IL-4Rα и передачей сигналов IL-33, включают, например, воспалительные заболевания или нарушения, такие как астма, атопический дерматит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) (которое может возникать по меньшей мере частично от сигаретного дыма), воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артрит, аллергический ринит, эозинофильный эзофагит и псориаз. Астма может представлять собой эозинофильную или неэозинофильную астму и стероид-чувствительную или стероид-резистентную астму. Эффект соединения или комбинации соединений можно оценить подобным образом, как и для животного, характеризующегося двойной гуманизацией по IL-4/IL-4Rα, как описано в данном документе выше.

[00170] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.

Пример 1

Замена эндогенного гена IL-4 мыши человеческим геном IL-4

[00171] Геном человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о., содержащий кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетраслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4 человеческого гена IL-4, заменяли локус гена IL-4 мыши длиной 6,3 т.п.о., охватывающий кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 4 (включая 3'-нетраслируемый участок) и часть 3'-участка ниже экзона 4. См. фигуру 2А.

[00172] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-4 мыши человеческим в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генно-инженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-4 мыши и человеческого IL-4 получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) bMQ-41A12 и RP11-17K19 соответственно. Вкратце, SbfI-линеаризованную целенаправленно воздействующую конструкцию, полученную путем клонирования с репарацией гэпов, и содержащую IL-4 мыши выше и ниже гомологичных участков, фланкирующих последовательность человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о., простирающуюся от кодона ATG в экзоне 1 до экзона 4 (включая 3'-нетранслируемый участок), и часть 3'-участка ниже экзона 4 (геномные координаты: GRCh37: chr5:132 009 743-132 018 576 (+ нить)), и фланкированную кассету с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, вводили посредством электропорации в эмбриональные стволовые (ES) клетки мыши F1H4 (гибрид F1 C57BL/6 × 129). Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 879) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 1553), вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(l):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки), несущие гуманизированный ген IL-4, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)).

[00173] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-4 определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-4 мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер выше целевого участка, (SEQ ID NO: 1); обратный праймер выше целевого участка, (SEQ ID NO: 2); зонд выше целевого участка, (SEQ ID NO: 3); прямой праймер ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 4); обратный праймер ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 5); зонд ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 6); при этом FAM относится к флуоресцентному зонду 5-карбоксифлуоресцеину, a BHQ относится к гасителю флуоресценции типа «черная дыра» (Biosearch Technologies). ДНК, выделенную из клонов ES-клеток, которую они поглотили в составе целенаправленно воздействующего вектора и она встроилась в их геномы, объединяли с мастер-миксом TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) согласно инструкциям производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (оптический 384-луночный реакционный планшет MicroAmp™, Life Technologies) и выполняли циклы в Prism 7900НТ от Applied Biosystems, которая собирала данные о флуоресценции в ходе циклов ПЦР и определяла пороговый цикл (Ct), дробный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигала предварительно установленного порога. QPCR со специфическими праймерами выше и ниже IL-4 и две qPCR для не подвергшихся целенаправленному воздействию эталонных генов проводили для каждого образца ДНК. Рассчитывали разницы значений Ct (ΔCt) между каждой IL-4-специфической qPCR и каждой qPCR для эталонного гена, а затем рассчитывали разницу между каждым ΔCt и медианным ΔCt для всех анализируемых образцов с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена IL-4 в каждом образце рассчитывали с учетом следующей формулы: количество копий = 2×2^-ΔΔCt. Клон, подвергшийся точному целенаправленному воздействию, утративший одну из его нативных копий будет характеризоваться количеством копий гена IL-4, равным одному. Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-4 заменила подвергнутую делеции последовательность гена IL-4 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 7); обратный праймер, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 8); зонд, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 9). Для доказательства того, что кассета с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину встроилась с последовательностью человеческого гена IL-4 в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к гену устойчивости к гигромицину, (SEQ ID NO: 10); обратный праймер, специфический к гену устойчивости к гигромицину, (SEQ ID NO: 11); зонд, специфический к гену устойчивости к гигромицину, (SEQ ID NO: 12).

[00174] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-4 и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-4 передался в зародышевой линии. Два потомка, гетерозиготные по замене, скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-4 мыши человеческим геном IL-4. Потомков, гомозиготных по замене, использовали для фенотипирования.

[00175] Верхний участок соединения локуса IL-4 мыши и последовательности, содержащей ген человеческого IL-4, сконструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 13), где последовательности человеческого IL-4 выделены курсивом, а последовательности, кодирующие IL-4, взяты в скобки. Нижний участок соединения последовательности, содержащей ген человеческого IL-4, и фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину, конструировали так, что бы он находился в пределе (SEQ ID NO: 14), где последовательности человеческого IL-4 выделены курсивом, а последовательности, кодирующие IL-4, взяты в скобки. Нижний участок соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к гигромицину и локуса IL-4 мыши конструировали так, что бы он находился в пределе (SEQ ID NO: 15), где последовательности кассеты, обеспечивающей устойчивость к гигромицину, выделены курсивом.

Пример 2

Замена последовательности гена эктодомена эндогенного IL-4Rα мыши последовательностью гена эктодомена человеческого IL-4Rα

[00176] Ген человеческого IL-4Rα длиной 15,6 т.п.о., содержащий участок от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5 человеческого гена IL-4Rα, заменяли локусом гена IL-4Rα мыши длиной 7,1 т.п.о., охватывающим кодирующую часть от экзона 1, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 5 и часть интрона 5. Экзоны 6-9 мыши сохраняли; при этом гуманизировали только экзоны 1-5 (т.е. эктодомены). См. фигуру 2В.

[00177] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-4Rα мыши человеческим в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генно-инженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). ДНК IL-4Rα мыши и человеческого IL-4Rα получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RP23-136G14 и RP11-166E24 соответственно. Вкратце, NotI-линеаризованную целенаправленно воздействующую конструкцию, полученную путем клонирования с репарацией гэпов и содержащую ген IL-4Ra мыши выше и ниже гомологичных участков, фланкирующих последовательность человеческого IL-4Rα длиной 15,6 т.п.о., простирающуюся от кодона ATG в экзоне 1 до экзона 5, и часть интрона 5 (геномные координаты: GRCh37: chr16:27351525-27367111 (+ нить)), и фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину, вводили посредством электропорации в эмбриональные стволовые (ES) клетки F1H4 мыши (гибрид F1 C57BL/6 × 129). Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 803) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству. Клоны подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 1444), вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки) с гуманизированным геном IL-4Rα идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)).

[00178] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-4Rα определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-4Rα мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер выше целевого участка, (SEQ ID NO: 16); обратный праймер выше целевого участка, (SEQ ID NO: 17); зонд выше целевого участка, (SEQ ID NO: 18); прямой праймер ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 19); обратный праймер ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 20); зонд ниже целевого участка, (SEQ ID NO: 21); при этом FAM относится к флуоресцентному зонду 5-карбоксифлуоресцеину, а BHQ относится к гасителю флуоресценции типа «черная дыра» (Biosearch Technologies). ДНК, выделенную из клонов ES-клеток, которую они поглотили в составе целенаправленно воздействующего вектора и она встроилась в их геномы, объединяли с мастер-миксом TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) согласно инструкциям производителя в 384-луночном планшете для ПЦР (оптический 384-луночный реакционный планшет MicroAmp™, Life Technologies) и выполняли циклы в Prism 7900НТ от Applied Biosystems, которая собирала данные о флуоресценции в ходе циклов ПЦР и определяла пороговый цикл (Ct), дробный цикл ПЦР, при котором накопленная флуоресценция достигала предварительно установленного порога. QPCR со специфическими праймерами выше и ниже IL-4Rα и две qPCR для не подвергшихся целенаправленному воздействию эталонных генов проводили для каждого образца ДНК. Рассчитывали разницы значений Ct (ΔCt) между каждой IL-4Rα-специфической qPCR и каждой qPCR для эталонного гена, а затем рассчитывали разницу между каждым ΔCt и медианным ΔCt для каждого анализируемого образца с получением значений ΔΔCt для каждого образца. Количество копий гена IL-4Rα в каждом образце рассчитывали с учетом следующей формулы: количество копий = 2×2^-ΔΔCt. Клон, подвергшийся точному целенаправленному воздействию, утративший одну из его нативных копий будет характеризоваться количеством копий гена IL-4Rα, равным одному. Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-4Rα заменила подвергнутую делеции последовательность гена IL-4Rα мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 22); обратный праймер, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 23); зонд, специфический к человеческому гену, (SEQ ID NO: 24). Для доказательства того, что кассета с селектируемым маркером устойчивости к неомицину встроилась с последовательностью человеческого гена IL-4Rα в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца): прямой праймер, специфический к гену устойчивости к неомицину, (SEQ ID NO: 25); обратный праймер, специфический к гену устойчивости к неомицину, (SEQ ID NO: 26); зонд, специфический к гену устойчивости к неомицину, (SEQ ID NO: 27).

[00179] Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-4Ra и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-4Ra передался в зародышевой линии. Два потомка, гетерозиготные по замене, скрещивали с получением мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-4Rα мыши человеческим геном IL-4Rα. Потомков, гомозиготных по замене, использовали для фенотипирования.

[00180] Верхний участок соединения локуса IL-4Rα мыши и последовательности, содержащей человеческий ген IL-4Rα, конструировали так, что бы он находился в пределе (SEQ ID NO: 28), где последовательности человеческого IL-4Rα выделены курсивом, а последовательности, кодирующие IL-4Rα, подчеркнуты. Нижний участок соединения последовательности, содержащей человеческий ген IL-4Rα, и фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к неомицину, сконструировали так, что бы он находился в пределе (SEQ ID NO: 29), где последовательности человеческого IL-4Rα выделены курсивом, а последовательности кассеты указаны нижним регистром. Нижний участок соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к неомицину и локуса IL-4Rα мыши сконструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 30), где последовательности, кодирующие IL-4Rα мыши, заключены в скобки, а последовательности кассеты, обеспечивающей устойчивость к неомицину, указаны нижним регистром.

Пример 3

Получение мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα

[00181] Мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα (Il4^hu/hu/Il4ra^hu/hu) получали следующим образом. Клон ES-клеток MAID 803, содержащий гуманизированный ген IL-4Rα и фланкированную loxP кассету, обеспечивающую устойчивость к неомицину, подвергали электропорации Cre-экспрессирующим вектором для удаления фланкированной loxP кассеты, обеспечивающей устойчивость к неомицину, с получением клона ES-клеток MAID 1444, содержащего гуманизированный ген IL-4Rα без кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству (см. пример 2). Такую же целенаправленно воздействующую конструкцию, которую использовали для получения клона ES-клеток MAID 879, содержащего гуманизированный ген IL-4 и фланкированную loxP кассету, обеспечивающую устойчивость к гигромицину (см. пример 1), встраивали посредством электропорации в клон ES-клеток MAID 1444 с получением ES-клеток 879 Het/1444 Het (Il4^+/hu/Il4ra^+/hu), которые впоследствии подвергали электропорации Cre-экспрессирующим вектором для удаления фланкированной loxP кассеты, обеспечивающей устойчивость к гигромицину, с получением клона ES-клеток (MAID 1553/1444), содержащего гуманизированные гены IL-4 и IL-4Rα. Клон ES-клеток MAID 1553/1444, не содержащий кассету, обеспечивающую устойчивость к лекарственному средству, вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с получением мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα.

Пример 4

Оценка эффективности дупилумаба, полностью человеческого mAb к IL-4Rα, на мышах с заменами генов человеческими IL-4 и IL4Rα

Способы

[00182] Полученных при помощи генно-инженерной методики мышей создали с использованием технологии VelociGene® для замены как полноразмерного локуса IL-4 мыши геномными последовательностями человеческого IL-4 длиной 8,8 т.п.о. (см. пример 1 и фигуру 2А), так и гена внеклеточного домена (т.е. эктодомена) IL-4Rα мыши (CD124) фрагментом длиной 15,6 т.п.о. соответствующей геномной ДНК человеческого IL-4Rα (см. пример 2 и фигуру 2В).

[00183] Мышей с гуманизированным геном IL-4Rα в гомозиготном состоянии валидировали в отношении экспрессии и функционирования человеческого гена. Для определения экспрессии человеческого IL-4Rα гуманизированными мышами отбирали спленоциты от мышей дикого типа и мышей с гуманизированными последовательностями и обрабатывали их меченными флуоресцирующими антителами к CD3 мыши, CD19 мыши, CD124 человека и CD124 мыши для проведения анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). (См, например, Blaeser et al. (2003) Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med 198(8):1189-1200).

[00184] Для демонстрации специфичностей к лигандам и функциональных свойств рецепторов использовали первичные клетки, полученные от мышей с гуманизированным IL-4Rα. Макрофаги, полученные из костного мозга, культивировали с использованием клеток костного мозга из бедренной кости мышей дикого типа и мышей с гуманизированным IL-4Rα, в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 20% кондиционированной среды с L-клетками, на протяжении 7 дней.

[00185] Затем клетки отдельно обрабатывали 20 нг/мл IL-4 мыши, IL-13 мыши, человеческого IL-4, человеческого IL-13 или растворителя, разбавленных в культуральной среде, на протяжении 20 часов. Образцы в четырех повторностях от каждого условия отбирали для анализа экспрессии генов.

[00186] Общую РНК из этих образцов экстрагировали и амплифицировали до кРНК путем введения Cy3-СТР. Cy3-меченные кРНК из каждого образца затем гибридизировали на созданном по индивидуальному заказу чипе от Agilent, содержащему 43538 олигонуклеотидных последовательностей длиной 60 нуклеотидов, покрывающих транскриптомы мыши. Данные считывали с отсканированных изображений чипа с использованием программного обеспечения Feature Extraction 9.5 от Agilent.

[00187] Дифференциально экспрессируемые гены среди экспериментальных групп идентифицировали с использованием t-критерия Стьюдента (p<0,05, кратность изменения ≥1,5). Кластер этих генов по экспрессии получали с использованием алгоритма кластеризации по коэффициенту корреляции Пирсона из GeneSpring GX7.3.

[00188] Нейтрализующий эффект дупилумаба в отношении IL-4 оценивали с использованием анализа переключения синтеза с класса IgE in vitro на первичных В-клетках, выделенных от мышей с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00189] Мышам дикого типа (WT) и мышам с гуманизированным IL-4Ra (Il4ra^hu/hu) вводили (гидродинамически) большой объем раствора «голой» плазмидной ДНК, управляющей доставкой гена для экспрессии IL-25 мыши in vivo. (См., например, Liu et al. (1999) Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA, Gene Therapy 6:1258-1266.) Через 8 дней отбирали периферическую кровь для измерения уровней IgE (mIgE) мыши в сыворотке крови с использованием коммерческого набора для проведения ELISA (R&D systems, Миннесота).

[00190] Первичные В-клетки, очищенные от спленоцитов мыши с гуманизированной последовательностью, активировали бактериальным LPS и смешивали с возрастающими количествами рекомбинантного человеческого IL-4 в 7-дневной культуре для индуцирования переключения синтеза между классами иммуноглобулинов. Для эксперимента по блокирующим свойствам антитела очищенные В-клетки инкубировали с возрастающими дозами дупилумаба на протяжении 30 минут перед добавлением 0,167 нМ рекомбинантного человеческого IL-4, и культивировали на протяжении 7 дней. Продуцирование IgE в отсутствии IL-4 или с mAb изотипического контроля обозначена и соответственно. Уровни IgE мыши в надосадочных жидкостях культуры клеток измеряли с использованием коммерческого набора для ELISA. (См, например, Moon et al. (1989) Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse В cells, Scand I Immunol 30:355-361.)

[00191] Интерлейкин-25 (IL-25) представляет собой цитокин, продуцируемый Th2-клетками, основные виды активности которого опосредуются благодаря продуцированию IL-4 и IL-13, что приводит к индуцированию тканеспецифичных патологий, таких как повышенное продуцирование слизи в легких и гиперплазия бокаловидных клеток. (См. Fort et al. (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995.)

[00192] Отсутствие IL-13 обеспечивает защиту животных от индуцированных IL-25 патологий в органе-мишени. Таким образом, модель воспаления легких, обусловленную IL-25, использовали для оценки фармакодинамических (PD) свойств дупилумаба in vivo на мышах, содержащих гуманизированные гены IL-4 и/или IL-4Rα.

[00193] PD-свойства откликов рецепторов II типа на воздействие дупилумабом характеризовали с использованием способа индуцирования воспаления с помощью IL-25 путем измерения накопления слизи в легких мышей с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00194] В день 0 мышам WT и с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu) вводили с помощью гидродинамической доставки вектор экспрессии IL-25 мыши, а затем с помощью инъекции дупилумаб или mAb изотипического контроля в указанных дозах. Дополнительные дозы антител вводили через день в общем количестве 4 дозы. В день 8 собирали образцы тканей легкого от эвтаназированных мышей и обработанные срезы легкого окрашивали перйодной кислотой-реактивом Шиффа перед их оценкой «при заслеплении» в отношении патологических изменений.

Результаты

[00195] Мышей с гуманизированным IL-4Rα охарактеризовали как демонстрирующие: (а) экспрессию человеческого IL-4Rα на первичных клетках от мышей с двумя гуманизированными IL-4/IL-4Rα (Il4^hu/huIL4ra^hu/hu) (см. фигуру 3); (b) изменение специфичностей к лиганду IL-4 у мышей с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu) (см. фигуру 4); и (с) функциональные способности в отношении сигнального пути IL-13 у гуманизированных по IL-4Rα (Il4ra^hu/hu) мышей (см. фигуру 4).

[00196] Как показано на фигуре 3, на которой изображены отмеченные профили IL-4Rα (CD124) на гейтированных популяциях В- и Т-клеток и распределение соответствующей популяции неокрашенных клеток, изображенное заштрихованной областью, мыши дикого типа и мыши с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu) экспрессировали аналогичные количества белка IL-4Rα на поверхности В-(CD19⁺, CD3^-) и Т-(CD19^-, CD3⁺) клеток.

[00197] Как показано на фигуре 4 (слева), мыши дикого типа (Il4ra^+/+) отвечали на IL-4 мыши, но не на человеческий, и отвечали как на IL-13 мыши, так и на человеческий. Как показано на фигуре 4 (справа), гуманизированные по IL-4Rα (Il4ra^hu/hu) мыши отвечали на человеческий IL-4, но не на IL-4 мыши, и отвечали как на IL-13 мыши, так и на человеческий IL-13.

[00198] Эти данные показывают, что IL-4, но не IL-13, характеризуется видоспецифичностью у мышей дикого типа и у мышей с гуманнизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00199] Как показано на фигуре 5, роль IL-4 в качестве основного фактора, опосредующего переключение синтеза с класса IgE, подкреплялась отсутствием повышенных уровней IgE в кровотоке после доставки гена IL-25 мыши мышам с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00200] Моноклональное антитело дупилумаб исследовали in vitro и in vivo.

[00201] Как показано на фигуре 6, дупилумаб предотвращал выработку IgE, индуцированную человеческим IL-4, в культурах первичных В-клеток, полученных от мышей с гуманизированным IL-4Rα (Il4ra^hu/hu).

[00202] Как показано на фигуре 7, дупилумаб дозозависимо уменьшал индуцированные IL-25 легочные патологии в дозе 10 мг/кг и выше (доза 25 мг/кг снижала патологию, ассоциированную с накоплением слизи).

Выводы

[00203] Данные результаты демонстрируют фармакологическую активность дупилумаба, являющегося полностью человеческого моноклонального антитела к человеческому IL-4Rα, на генетически модифицированный мышах в качестве модели воспаления, индуцированной цитокинами.

[00204] Получение генетически модифицированных мышей с заменами человеческих генов IL-4 и/или IL-4Rα обеспечивает мощный инструмент для оценки функционирования ортологов генов и эффективности антител-кандидатов in vivo с ограниченной межвидовой реактивностью.

Пример 5

Модель воспаления легких, индуцированная экстрактом клещей домашней пыли (HDM)

[00205] Хроническое воспаление дыхательных путей у мышей с гуманизированными IL-4 и IL-R4α индуцировали путем интраназального введения экстракта клещей домашней пыли (HDM) (Greer laboratories). Вкратце, мышей сначала сенсибилизировали путем интраназальной инсталляции суспензии HDM (20 мкл при концентрации 2,5 мкг/мл) на протяжении 10 дней. После двухнедельного интервала купирования процесса мышей повторно подвергали воздействию аллергена путем интраназального введения HDM 3 раза в неделю в период с 5 по 12 неделю. Обработку дупилумабом (антителом к IL4Rα) начинали с 7-ой недели с периодичностью два раза в неделю путем подкожных инъекций до завершения эксперимента на 12 неделе. Образцы тканей отбирали для последующих анализов. План эксперимента изображен на фигуре 8.

Демонстрация терапевтической эффективности дупилумаба на HDM-индуцированной модели воспаления дыхательных путей с использованием мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4Rα

[00206] Заболевание дыхательных путей индуцировали у мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4Rα (IL-4^hu/hu/IL-4R^hu/hu) с использованием описанного выше протокола. Гистологический анализ ткани легкого показал, что интраназальная инстилляция HDM приводила к повышенному продуцированию слизи в дыхательных путях. Обработка дупилумабом снижала накопление слизи у мышей, подверженных воздействию аллергена HDM. Анализ клеточного инфильтрата в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) указывает на то, что количество эозинофилов увеличивалось при инсталляции HDM и снижалось при обработке дупилумабом. Общий IgE в кровотоке гуманизированных мышей повышался при обработке HDM, что свидетельствует о компетентном пути передачи сигнала IL-4. Применение дупилумаба обеспечивало возможность снижения уровня IgE. В отличие от этого, молекула сравнения, IL13R2α-Fc, которая вызывала антагонизм только по отношению к IL-13 без вмешательства в передачу сигнала IL-4, характеризовалась сопоставимыми видами активности касательно снижения накопления слизи и предупреждения эозинофильной инфильтрации. Тем не менее, дифференциальный эффект обнаруживали в отношении уровня IgE в кровотоке между дупилумабом и антагонистом IL-13, IL13R2α-Fc. Блокирование только пути IL-13 было недостаточным для снижения HDM-индуцированного уровня IgE; тогда как дупилумаб снижал продуцирование IgE, основного патологического медиатора аллергии, посредством блокирования как пути IL-4, так и пути IL-13.

[00207] В отдельной серии экспериментов заболевание дыхательных путей индуцировали у мышей с двумя гуманизированными IL-4 и IL-4Rα (IL-4^hu/hu/IL-4R^hu/hu) с использованием такого же протокола, описанного выше, за исключением того, что использовали разный контроль. В этих экспериментах использовали антитело изотипического контроля того же изотипа IgG, что и дупилумаб. План эксперимента изображен на фигуре 9. МРНК очищали от общей РНК с использованием набора для выделения Dynabeads mRNA kit (Life Tech), а библиотеку со специфическими нитями для РНК-секвенирования получали из мРНК с использованием набора для получения библиотек РНК Scriptseq (Illumina). Библиотеку секвенировали с помощью HiSeq 2000 (Illumina) при длине прочтения 33 п.о. и данные об уровнях экспрессии гена экстрагировали из необработанных ридов с помощью системы управления РНК-секвенирования Clcbio (Qiagen). Дифференциально экспрессируемые гены среди экспериментальных групп идентифицировали с использованием t-критерия Стьюдента (p<0,05, кратность изменения ≥1,5). Кластер этих генов по экспрессии получали с использованием алгоритма кластеризации по коэффициенту корреляции Пирсона из GeneSpring GX7.3. Было обнаружено, что HDM индуцирует изменение экспрессии генов в легких у дважды гуманизированных по IL-4 и IL-4Rα мышей и такое изменение блокировалось с помощью дупилумаба. Образцы сыворотки крови отбирали у подверженных эвтаназии мышей в конце периода обработки. Уровни IgE мыши в сыворотке крови измеряли с использованием коммерческого набора для ELISA (R & D systems). Статистический анализ проводили с помощью общепринятого способа однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).

Пример 6

Модель кожного воспаления, индуцированная антигеном

[00208] Хроническое кожное воспаление у мышей с двумя гуманизированными Il-4 и IL-4Rα можно индуцировать с помощью следующей процедуры. Шерсть на спине мышей с гуманизированной последовательностью состригали с помощью электростригальной машины, а затем обдирали при помощи липкой ленты для создания незначительных повреждений и трещин кожного барьера. Марлевую повязку, смоченную раствором аллергена (такого как яичный альбумин с бактериальным токсином или экстракт клещей домашней пыли) накладывали на кожу на одну неделю с последующими двумя неделями периода купирования процесса. Процедуру повторяли три раза на протяжении в общей сложности 7 недель с индуцированием в результате кожных повреждений наподобие атопического дерматита. Обработанные мыши характеризуются повышенными уровнями IgE, пруритом, утолщением слоя эпидермиса, типичными симптомами атопического дерматита.

Пример 7

Характеристика РК профилей антител к человеческому IL-4Rα у мышей, экспрессирующих гуманизированный IL-4Rα

[00209] В этом примере описаны эксперименты, проводимые для оценки PK профилей REGN 668 (человеческого моноклонального антитела к человеческому IL-4Rα, также известного как «дупилумаб») и контрольного антитела REGN646 (суррогат обезьяны, несвязывающее контрольное антитело к mfIL-4R).

[00210] Мыши, используемые в этих экспериментах, представляли собой MAID 1444 (гомозиготные по гуманизированному IL-4Rα, или «IL-4Rα HumIn», в котором эктодомен IL-4Rα человеческого происхождения, а трансмембранный и цитоплазматические участки мыши) и мышей дикого типа («WT») соответствующей линии (75% C57BL/6/25%129Sv) возрастом 20-23 недель. Исследуемая группа состояла в общей сложности из 40 мышей, самцов и самок, при этом размер когорты из расчета на одно лекарственное средство на одну дозу составлял 5 гомозиготных и 5 WT соответствующей линии. Антитела (в PBS буфере) вводили мышам посредством подкожной инъекции в количестве 10 мг/кг. Образцы крови отбирали для анализа в день инъекции (момент времени «0» или день 0), через 6 ч после инъекции и в день 1, день 3, день 7, день 10, день 14, день 21 и день 30 соответственно.

[00211] Уровни лекарственных средств (т.е. REGN668 или REGN646) в кровотоке определяли путем анализа общих человеческих антител с использованием иммуноанализа ELISA. Вкратце, козьим поликлональным антителом к человеческому IgG (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) покрывали 96-луночные планшеты для захвата тестируемых человеческих антител в сыворотке крови, а затем антитела, связанные с подложкой планшета, выявляли с помощью козьего поликлонального антитела к человеческому IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098), и субстрата ТМВ (BD Pharmingen). Образцы сыворотки крови представляли собой шестикратные серийные разведения дозы из расчета на один образец, варьирующие в диапазоне 1:100- 1:243000, а эталонные стандарты соответствующих антител представляли собой 12-кратные серийные разведения дозы. Концентрации лекарственного антитела в сыворотке крови рассчитывали на основе калибровочной кривой, построенной с использованием программного обеспечения Graphpad Prism.

[00212] Было обнаружено, что период полувыведения REGN 668 сокращен у мышей с IL-4Rα HumIn по сравнению с мышами дикого типа, у которых продуцировался только белок IL-4Rα мыши. Это различие в PK профилях можно объяснить взаимодействием, опосредуемым мишенью, и клиренсом между моноклональными антителами и рецептором к человеческому IL-4α. Таким образом, мыши, экспрессирующие человеческий или гуманизированный IL-4Rα, обеспечивают подходящую имитационную среду для характеристики PK свойств антител к человеческому IL-4Rα (например, дупилумаба) на доклинической мышиной модели.

Применения мышей с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα

[00213] Мыши с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα являться применимыми для оценки фармакодинамики (PD) антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или к IL-4Rα, например, дупилумаба.

[00214] Анализы фармакокинетики (PK) и PD на гуманизированных по IL-4 и/или IL-4Rα мышах проводили согласно стандартным процедурам, известным из уровня техники.

[00215] Мыши с гуманизированными IL-4 и/или IL-4Rα являются применимыми для тестирования терапевтической эффективности in vivo антагонистов, специфичных к человеческим IL-4 и/или IL-4Rα, например, нейтрализующих антител к IL-4 и/или IL-4Rα, например, дупилумаба, на различных моделях заболеваний, известных из уровня техники, как, например, показанных в данном документе выше.

Пример 8

Замена эндогенного гена IL-33 мыши человеческим геном IL-33

[00216] Ген IL-33 мыши (ID гена в NCBI: 77125, первоисточник: MGI:1924375; транскрипт эталонной последовательности: NM_001164724.1; ID в UniProt: Q8BVZ5; геномная сборка: NCBI37/mm9; локализация: chr19:29999604-30035205 + нить) содержит 8 экзонов и кодирует белок из 266 аминокислот (№ доступа в GenBank NP_001158196.1).

[00217] Человеческий ген IL-33 (ID гена в NCBI: 90865, первоисточник: HGNC: 16028; транскрипт эталонной последовательности: NM_033439.3; ID в UniProt: 095760; геномная сборка: GRCh37/hg19; локализация: chr9:6215149-6257983 + нить) также содержит 8 экзонов и кодирует белок из 270 аминокислот (№ доступа в GenBank NP_254274.1).

[00218] Человеческим геномным сегментом длиной 16333 п.о., содержащим участок от экзона 2, начинающегося со стартового кодона ATG, до экзона 8 (включая 3'-нетранслируемый участок) человеческого гена IL-33, заменяли локус гена IL-33 мыши длиной 9381 п.о., охватывающего участок от экзона 2, начинающегося со стартового кодона ATG, до кодирующей части экзона 8, включая стоп-кодон. См. фигуру 10А.

[00219] Целенаправленно воздействующую конструкцию для замены гена IL-33 мыши геномным сегментом IL-33 человека в одной стадии целенаправленного воздействия конструировали с использованием генно-инженерной технологии VelociGene® (см. Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659) подобно процедуре, описанной в примере 1 выше, для замены гена IL-4 мыши геномным сегментом IL-4 человека, за исключением того, что ДНК IL-33 мыши и человека получали из клонов бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) bMQ-350I18 и CTD-3015M15 соответственно и что целенаправленно воздействующий вектор содержал фланкированную loxP кассету с селектируемым маркером устойчивости к неомицину (фигура 10В).

[00220] Клоны подвергшихся точному целенаправленному воздействию ES-клеток (MAID 7060) идентифицировали с помощью анализа потери нативного аллеля (LONA) (Valenzuela et al. 2003), при котором количество копий нативного немодифицированного гена IL-33 определяли посредством двух количественных полимеразных цепных реакций TaqMan™ (qPCR) со специфическими праймерами к последовательностям гена IL-33 мыши, на которые целенаправленно воздействовали для делеции. Реакционные смеси для qPCR содержали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца):

выше целевого участка («mTU»):

прямой праймер, (SEQ ID NO: 31);

обратный праймер, (SEQ ID NO: 32);

зонд (MGB), (SEQ ID NO: 33);

ниже целевого участка («mTD»):

прямой праймер, (SEQ ID NO: 34);

обратный праймер, (SEQ ID NO: 35);

зонд (MGB), (SEQ ID NO: 36).

[00221] Для доказательства того, что последовательность человеческого гена IL-33 заменила последовательность гена IL-33 мыши в гуманизированном аллеле, проводили анализ qPCR с TaqMan™, в который включали следующие наборы праймер-зонд (записано от 5'- до 3'-конца):

выше целевого участка («hTU»)

прямой праймер, (SEQ ID NO: 37);

обратный праймер, (SEQ ID NO: 38);

зонд (MGB), (SEQ ID NO: 39);

ниже целевого участка («hTD»):

прямой праймер, (SEQ ID NO: 40);

обратный праймер, (SEQ ID NO: 41);

зонд (MGB), (SEQ ID NO: 42).

[00222] Верхний участок соединения локуса IL-33 мыши и последовательности, содержащей человеческий ген IL-33 (обозначенной «I» на фигуре 10В), конструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 43), где последовательность человеческого IL-33 выделена курсивом, а старт-кодон ATG человеческого гена подчеркнут. Нижний участок соединения последовательности, содержащей геномную последовательность человеческого IL-33 и фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к неомицину (обозначенный «II» на фигуре 10В) конструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 44), где последовательность человеческого IL-33 выделена курсивом и участок соединения указан символом «/», а участок lox Р подчеркнут.Нижний участок соединения последовательности фланкированной loxP кассеты с селектируемым маркером устойчивости к неомицину и локуса IL-33 мыши (обозначенный «III» на фигуре 10С) конструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 45), где участок соединения показан символом «/», а участок loxP подчеркнут.

[00223] Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 7060) затем подвергали электропорации транзиентным Cre-экспрессирующим вектором для удаления кассеты с селектируемым маркером устойчивости к лекарственному средству и получали клоны ES-клеток без кассеты, обеспечивающей устойчивость к лекарственному средству (MAID 7061). Верхний участок соединения в этих ES-клетках MAID 7061 (обозначен «I» на фигуре 18С) являлся таким же, как и у ES-клеток MAID 7060. Нижний участок соединения (обозначенный «II» на фигуре 18С) конструировали так, чтобы он находился в пределе (SEQ ID NO: 46), где 3'-конец последовательности человеческого IL-33 выделен курсивом перед первым символом «/», а 3'-последовательность IL-33 мыши выделена курсивом после второго символа «/» и участок loxP подчеркнут.

[00224] Подвергшиеся точному целенаправленному воздействию ES-клетки (MAID 7060 или MAID 7061) вводили в эмбрион SW мыши на стадии 8 клеток с помощью способа VelociMouse® (см. патенты США №№7294754, 7576259, 7659442 и Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). VelociMice® (мыши F0, полностью произошедшие от донорной ES-клетки), несущие гуманизированный ген IL-33, идентифицировали с помощью генотипирования на предмет потери аллеля мыши и приобретения человеческого аллеля с использованием модифицированного анализа алеллей (см. Valenzuela et al. (2003)). Тот же самый анализ LONA использовали для анализа ДНК, выделенной из биоптатов, полученных из хвостов мышей, полученных из подвергшихся целенаправленному воздействию ES-клеток, для определения их генотипов по IL-33 и подтверждения того, что гуманизированный аллель IL-33 передался в зародышевой линии. Двух потомков, гетерозиготных по замене, скрещивали для получения мыши, гомозиготной по замене эндогенного гена IL-33 мыши на человеческий ген IL-33.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к грызуну для экспрессии гуманизированного белка IL-4Rα, где геном грызуна содержит замену геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα, к эмбриональной стволовой клетке и эмбриону вышеуказанного грызуна, а также к способу его получения. Также раскрыты грызун для экспрессии гуманизированного белка IL-4Rα и человеческого белка IL-4, где геном грызуна содержит гуманизированный ген IL-4Rα и гуманизированный ген IL-4, а также его использование в способе скрининга в отношении антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека. Изобретение также относится к целенаправленно воздействующему вектору для гуманизации эндогенного гена IL-4Rα у грызуна. Изобретение позволяет эффективно осуществлять скрининг в отношении антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека. 8 н. и 12 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 пр.

1. Грызун для экспрессии гуманизированного белка IL-4Rα, где геном грызуна содержит замену геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα,

где геномный фрагмент гена IL-4Rα грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 гена IL-4Rα грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα,

где гуманизированный ген IL-4Rα (i) кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα грызуна, кодируемого геном IL-4Rα грызуна, или (ii) содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα и экзоны 6-9 гена IL-4Rα грызуна,

где экспрессия гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна, и

где грызун представляет собой мышь или крысу.

2. Грызун по п. 1, где грызун представляет собой мышь, которая не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.

3. Грызун по п. 1 или 2, где грызун дополнительно экспрессирует человеческий или гуманизированный белок IL-4.

4. Грызун по п. 3, где грызун представляет собой мышь, которая не экспрессирует белок IL-4 мыши.

5. Грызун по любому из пп. 1-4, где грызун дополнительно содержит замену геномного фрагмента гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4 с образованием гуманизированного гена IL-4,

где геномный фрагмент гена IL-4 грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 гена IL-4 грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4 содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 человеческого гена IL-4, и

где экспрессия гуманизированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов IL-4 грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна.

6. Грызун по любому из пп. 1, 3 или 5, где грызун представляет собой мышь.

7. Способ получения IL-4Rα гуманизированного грызуна, включающий замену геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα,

где геномный фрагмент гена IL-4Rα грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 гена IL-4Rα грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα,

где гуманизированный ген IL-4Rα (i) кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα грызуна, кодируемого геном IL-4Rα грызуна, или (ii) содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα и экзоны 6-9 гена IL-4Rα грызуна,

где гуманизированный ген IL-4Rα является функционально связанным с регуляторными элементами IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна, и

где грызун представляет собой мышь или крысу.

8. Способ по п. 7, где грызун представляет собой мышь.

9. Грызун для экспрессии гуманизированного белка IL-4Rα и человеческого белка IL-4, где геном грызуна содержит гуманизированный ген IL-4Rα и гуманизированный ген IL-4,

(i) где гуманизированный ген IL-4Rα получают в результате замены геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα,

где геномный фрагмент гена IL-4Rα грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 гена IL-4Rα грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα,

где гуманизированный ген IL-4Rα (а) содержит последовательность, кодирующую трансмембранный домен IL-4Rα грызуна, и последовательность, кодирующую цитоплазматический домен IL-4Rα грызуна, или (b) содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα и экзоны 6-9 гена IL-4Rα грызуна, и где экспрессия гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна, и

(ii) где гуманизированный ген IL-4 получают в результате замены геномного фрагмента гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4,

где геномный фрагмент гена IL-4 грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 гена IL-4 грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4 содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 человеческого гена IL-4, и

где экспрессия гуманизированного гена IL-4 находится под контролем эндогенных регуляторных элементов IL-4 грызуна в эндогенном локусе IL-4R грызуна, и

(iii) где грызун представляет собой мышь или крысу.

10. Грызун по п. 9, где грызун представляет собой мышь.

11. Грызун по п. 10, где мышь не способна экспрессировать белок IL-4 мыши и не способна экспрессировать белок IL-4Rα мыши.

12. Способ скрининга в отношении антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека, включающий:

получение грызуна по п. 9, где грызун представляет собой мышь, воздействие на мышь аллергеном для индукции воспаления легких у мыши, введение средства мыши,

определение того, уменьшается ли воспаление легких с помощью средства, и идентификацию средства в качестве антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека, если средство уменьшает воспаление легких.

13. Способ по п. 12, где степень воспаления легких определяют путем измерения накопления слизи в дыхательных путях, эозинофильного клеточного инфильтрата в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и/или общего IgE, циркулирующего в крови.

14. Способ скрининга в отношении антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека, включающий:

получение грызуна по п. 9, где грызун представляет собой мышь, воздействие на мышь аллергеном для индукции кожного воспаления у мыши, введение средства мыши, определение того, уменьшается ли кожное воспаление с помощью средства, и идентификацию средства в качестве антагониста сигнального пути IL-4/IL-4Rα человека, если средство уменьшает кожное воспаление.

15. Эмбриональная стволовая (ES) клетка грызуна для получения IL-4Rα гуманизированного грызуна, содержащая замену геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна по эндогенному локусу IL-4Rα грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα с образованием гуманизированного гена IL-4Rα,

где геномный фрагмент гена IL-4Rα грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 гена IL-4Rα грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα,

где гуманизированный ген IL-4Rα (i) кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα грызуна, кодируемого геном IL-4Rα грызуна, или (ii) содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα и экзоны 6-9 гена IL-4Rα грызуна,

где экспрессия гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна, и

где ES-клетка грызуна представляет собой ES-клетку мыши или ES-клетку крысы.

16. Эмбриональная стволовая клетка грызуна по п. 15, где ES-клетка грызуна дополнительно содержит замену геномного фрагмента гена IL-4 грызуна по эндогенному локусу IL-4 грызуна последовательностью нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4 с образованием гуманизированного гена IL-4,

где геномный фрагмент гена IL-4 грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 гена IL-4 грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4 содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 4 человеческого гена IL-4, и

где экспрессия гуманизированного гена IL-4 находится под контролем регуляторных элементов IL-4 грызуна в эндогенном локусе IL-4 грызуна.

17. Эмбриональная стволовая клетка грызуна по п. 15 или 16, где ES-клетка грызуна представляет собой ES-клетку мыши.

18. Эмбрион грызуна для получения IL-4Rα гуманизированного грызуна, содержащий ES-клетку грызуна по любому из пп. 15-17, где эмбрион грызуна представляет собой эмбрион мыши для получения IL-4Rα гуманизированной мыши или эмбрион крысы для получения IL-4Rα гуманизированной крысы.

19. Целенаправленно воздействующий вектор для гуманизации эндогенного гена IL-4Rα у грызуна, где грызун представляет собой мышь или крысу, содержащий:

последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα, фланкированную последовательностями нуклеиновой кислоты, которые являются гомологичными последовательностям нуклеиновой кислоты в локусе IL-4Rα грызуна и опосредуют встраивание последовательности нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα в локус IL-4Rα грызуна,

где последовательность нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα,

где встраивание последовательности нуклеиновой кислоты человеческого гена IL-4Rα в локус IL-4Rα грызуна приводит к замене геномного фрагмента гена IL-4Rα грызуна с образованием гуманизированного гена IL-4Rα,

где заменяемый геномный фрагмент гена IL-4Rα грызуна содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 гена IL-4Rα грызуна,

где гуманизированный ген IL-4Rα (i) кодирует гуманизированный белок IL-4Rα, содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический домен белка IL-4Rα грызуна, кодируемого геном IL-4Rα грызуна, или (ii) содержит стартовый кодон ATG от экзона 1 до экзона 5 человеческого гена IL-4Rα и экзоны 6-9 гена IL-4Rα грызуна, и

где экспрессия гуманизированного гена IL-4Rα находится под контролем регуляторных элементов IL-4Rα грызуна в эндогенном локусе IL-4Rα грызуна.

20. Целенаправленно воздействующий вектор по п. 19, где грызун представляет собой мышь.