СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЛИЗАТА ТРОМБОЦИТОВ, СОДЕРЖАЩЕГО ФАКТОРЫ РОСТА Российский патент 2023 года по МПК A61K35/19 A61P17/02 C12N5/00 

Настоящее изобретение относится к способу получения релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, согласно ограничительной части первого пункта формулы изобретения.

Тромбоциты млекопитающих содержат множество биологически активных веществ с важными физиологическими функциями. Среди этих биологически активных веществ факторы роста представляют особый интерес из-за их роли в усилении пролиферации различных клеточных линий и регенерации тканей, и оба процесса имеют важное значение в регенеративной медицине, при заживлении ран и язв.

Концепция использования собственной богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) пациента в стоматологии, пластической хирургии и регенеративной медицине уже была разработана в начале 1990-х годов. Тромбоциты получали либо путем центрифугирования собственной цельной крови пациента с антикоагулянтом, либо с использованием специальных устройств, таких как Magellan Medtronic или SmartPrep Harvest. Однако такое использование аутологичных тромбоцитов может быть поставлено под угрозу у пациентов с анемией, или в случае необходимости использования больших количеств или в течение длительных периодов времени. Одним из наиболее важных ограничений аутологичной БоТП является необходимость наличия специального оборудования или лаборатории для подготовки концентратов тромбоцитов. Чтобы сделать их подходящими для использования, тромбоциты, в частности, активируют, чтобы инициировать высвобождение содержимого их альфа-гранул. Однако обязательно использовать БоТП в течение нескольких часов после ее выделения из организма пациента, так как в противном случае содержащиеся в нем факторы роста могут потерять значительную часть своей биологической активности.

Было описано несколько способов сохранения тромбоцитов. Добавление ДМСО и трегалозы являются двумя примерами подходящих способов более длительного сохранения тромбоцитов, как для тромбоцитов, которые были подвергнуты лиофилизации (сублимационной сушке), так и для тромбоцитов, которые не были подвергнуты лиофилизации. Криопротекторные композиции, применяемые вместе с процессами лиофилизации, касаемо сохранению тромбоцитов, привели к аналогичному результату. Недостатки этих подходов, которые просто используют консерванты и/или лиофилизацию на интактных тромбоцитах, связаны с тем фактом, что белки, рецепторы и тому подобное сохраняются на поверхности тромбоцитов или внутри тромбоцитов. Например, некоторые рецепторы тромбоцитарной мембраны остаются интактными для связывания с внеклеточными факторами в ответ на активацию тромбоцитов, например, для адгезии, агрегации тромбоцитов, и т.д.

Поэтому представляется целесообразным использовать более универсальный способ, который позволил бы превратить тромбоциты крови в препарат, подходящий для эффективного использования для широкого ряда применений, включая заживление ран, лечение кожи, лечение нарушений тканей тела (включая органы тела), таких как легочная ткань и тому подобное. Тем самым, вероятно, риск нежелательного взаимодействия такого препарата с внеклеточными факторами будет минимальным.

WO 2013113024 раскрывает способ приготовления композиции, подходящей для терапевтического применения или для применения в качестве культуральной среды, где тромбоциты концентрируют и подвергают лизису для разрушения мембраны тромбоцитов. По меньшей мере 30% тромбоцитов могут быть лизированы. Лиофилизированные лизаты тромбоцитов образуют композицию, которая также содержит высвобожденные концентраты доступных факторов роста, цитокинов и хемокинов. WO 2013113024 также раскрывает способ лечения ткани млекопитающего, который включает стадии нанесения на участок ткани млекопитающего для лечения вышеописанной композиции, содержащей лиофилизированные лизаты тромбоцитов. В одном примере лиофилизированные лизаты тромбоцитов получают из исходных тромбоцитов, где по меньшей мере 30% исходных тромбоцитов лизируют для образования лиофилизированных лизатов тромбоцитов. Однако лизат не обеднен фибриногеном, и WO 2013113024 не обнаруживает проблему вирусной или патогенной инфекции и не решает эту проблему.

ЕР 2389942 раскрывает способ получения вирус-инактивированного, содержащего факторы роста лизата тромбоцитов, обедненного тромбоцитарными факторами роста ТФР (PDGF) и факторами роста эндотелия сосудов (VEGF), причем указанный лизат подходит для клеточной культуры in vitro или ex vivo и для стимулирования пролиферации и/или дифференцировки стволовых клеток в направлении к остеобластной линии и/или хондроцитам. Способ включает стадии контактирования и инкубации концентрата тромбоцитов с от 0,2 до 5 об. % растворителя и/или детергента в течение периода от 5 минут до 6 часов, при рН от около 6,0 до около 9,0 и при температуре от 2 до 50°С, удаления растворителя и/или детергента путем масляной экстракции для получения водной белковой фазы, и инкубации водной белковой фазы с углем для удаления растворителя/детергента. Предварительная стадия может включать приготовление исходного концентрата тромбоцитов путем афереза или выделения из лейкоцитарной пленки, полученной из цельной крови, которая может быть свежей, с истекшим сроком годности и хранящейся в виде жидкости, либо с истекшим сроком годности и хранящейся в замороженном виде. В предпочтительном варианте реализации лизат тромбоцитов содержит факторы роста TGF-B, IGF, EGF и/или bFGF. Однако способ, раскрытый в ЕР 2389942, имеет несколько недостатков. Хотя лизат тромбоцитов может быть подходящим для культур клеток in vitro или ex vivo, ожидается, что он будет недостаточно эффективным для клинического применения для целей регенеративной медицины, включая заживление переломов костей, поскольку полная смесь всех факторов, полученных из тромбоцитов, в частности ТФР (PDGF) и VEGF необходима для клинического применения лизата тромбоцитов в регенеративной медицине, как и в лечении ран. Экстракция растворителем дает низкий выход тромбоцитов, часто 10-15 об. % только по отношению к исходному объему. ЕР 2389942 не включает стадию удаления фибриногена и не включает стадию лиофилизации. Инактивация вирусов растворителем/детергентом применима только к вирусам с оболочкой, но не способна инактивировать вирусы без оболочки, такие как вирус гепатита А и паровирус В19, а также обработка растворителем/детергентом не удаляет другие потенциальные возбудители заболеваний, такие как бактерии или другие микроорганизмы.

US 8734854 раскрывает способ высвобождения факторов роста из цельной крови или плазмы пациента в среде без разрушения. Факторы роста, полученные этим способом, пригодны для местного нанесения на поверхность области раны, для стимулирования заживления раны, для инъекции в мягкие ткани, такие как разорванное сухожилие, для стимулирования роста и заживления ткани. В другом способе факторы роста высвобождаются из цельной крови и высушиваются традиционным методом лиофилизации. Лиофилизированный продукт может быть восстановлен нормальным солевым раствором для лечения раны пациента или для применения в хирургической операции. Хотя US 8734854 раскрывает, что конечный продукт может быть лиофилизирован, оказалось, что одна только лиофилизация недостаточна для обеспечения надежного удаления патогенов. Более того, факторы роста, полученные по способу US 8734854, не обеднены фибриногеном.

Другие известные факторы роста, высвобождаемые тромбоцитами, включают разработанный компанией Cambium Medical Technologies аллогенный объединенный лизат человеческих тромбоцитов. Продукт еще не представлен в качестве коммерческого продукта, и хотя указано, что он обеднен фибриногеном, никоим образом не показано, что он подвергался обработке для удаления патогенов/вирусов.

Многочисленные статьи описывают роль факторов роста, высвобождаемых тромбоцитами, как заменителя фетальной бычьей сыворотки. Предложен обзор о тромбоцитарном лизате в качестве замены фетальной бычьей сыворотке в культурах мезенхимальных стромальных клеток, Transfus Med Hemother 2013; 40: 326-335.

ЕР 27757979 раскрывает способ получения лизата тромбоцитов, способного действовать в качестве коадъюванта для выделения и/или роста и/или размножения стволовых клеток, фибробластов или дендритных клеток. Способ включает стадии (а) выделения фракции лейкоцитарной пленки из смеси образцов цельной крови, полученных по меньшей мере от двух субъектов; (b) подвергание выделенной фракции лейкоцитарной пленки воздействию фотохимического агента и УФ-излучению для удаления любых присутствующих заражающих агентов; (с) подвергание фракции лейкоцитарной пленки по меньшей мере одному циклу замораживания/оттаивания для достижения лизиса содержащихся в ней тромбоцитов; (d) центрифугирование фракции и сбор жидкой фазы. Полученный таким образом лизат тромбоцитов можно использовать в качестве ко-адъюванта для культивирования, роста и/или размножения стволовых клеток, в частности мезенхимальных, из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, фибробластов и дендритных клеток. Однако лизат тромбоцитов, полученный способом, раскрытым в ЕР 27757879, не обеднен фибриногеном, сомнительно, способны ли циклы замораживания/оттаивания вызывать эффективное высвобождение факторов роста и влияют ли на действие факторов роста повторные циклы замор аживания/оттаивания, и способ использует только одну стадию удаления патогенов.

Доступны коммерческие лизаты тромбоцитов, например, от Macopharma. К сожалению, эти лизаты доступны в виде больших объемов замороженного материала, которые после размораживания необходимо разделить на аликвоты меньшего размера с потенциальным риском микробиологического загрязнения. Лизаты тромбоцитов человека от Millipore, PLTMax, и те, что предоставлены Zenbio, также доступны только в больших объемах замороженного материала; они предназначены только для исследовательских целей и не предназначены для терапевтического применения ex vivo.

Согласно T. Burnouf и др., Biomaterials 76 (2016), 371-387, факторы роста и цитокины, содержащиеся в гранулах тромбоцитов, могут высвобождаться путем прямой активации с помощью добавления раствора соли хлорида кальция, образования фибрина и дегрануляции тромбоцитов, или используя тромбин. Другие способы обеспечения высвобождения факторов роста и других биомолекул из тромбоцитов включают повторяющиеся циклы замор аживания/оттаивания, обработку ультразвуком отдельно или в сочетании с циклами замораживания/оттаивания или обработку растворителем/детергентом, которая также инактивирует вирусы, покрытые липидной оболочкой. Однако считается, что воздействие на тромбоциты повторяющихся циклов замораживания/оттаивания влияет на факторы роста. Риск передачи инфекционных агентов контролируется обязательным исследованием каждой отдельной порции сданной крови, и не использованием порции сданной крови с положительным результатом. Рекомендуется обязательное исследование для выявления ВИЧ-1/ВИЧ-2, антител, поверхностного антигена гепатита В, антител к вирусу гепатита С.

Таким образом, все еще существует потребность в способе получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, который обеспечивает оптимальный выход факторов роста и который демонстрирует минимальный риск присутствия патогенов, включая вирусы с липидной оболочкой, а также вирусы без оболочки и бактерии.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов в виде концентрата тромбоцитов млекопитающих, который позволяет достичь оптимального выхода факторов роста, который показывает минимальный риск присутствия вирусов как в оболочке, так и без оболочки, бактерий, грибков и других микроорганизмов, переносимых кровью.

В предпочтительном варианте реализации целью настоящего изобретения является создание способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, с улучшенной инактивацией не только наиболее распространенных патогенов, но также патогенов, которые не могут или вряд ли могут быть инактивированы с помощью существующих способов.

Другая предпочтительная реализация данного изобретения направлена на получение тромбоцитарного релизата, который подходит для применения в регенеративной медицине и уходе за ранами. Еще один предпочтительный вариант реализации направлен на получение релизата тромбоцитов, который можно использовать в качестве заменителя фетальной бычьей сыворотки в среде для культивирования клеток.

Задача создания способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, который обеспечивает оптимальный выход факторов роста, при котором факторы роста, полученные из тромбоцитов, демонстрируют минимальный риск присутствия патогенов, включая вирусы с липидной оболочкой и вирусы без оболочки, бактерии и другие переносимые с кровью патогенные микроорганизмы, описанные выше, могжет быть решена в соответствии с настоящим изобретением с помощью способа, который показывает технические характеристики отличительной части первого пункта формулы изобретения.

Кроме того, способ получения лизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, по данному изобретению включает последовательные стадии:

a. подвергание концентрата тромбоцитов первому этапу снижения концентрации патогенных микроорганизмов с целью разрушения как ДНК, так и РНК микроорганизмов, присутствующих в концентрате тромбоцитов, где микроорганизмы включают в себя вирусы с оболочкой, вирусы без оболочки, или бактерии, грибы и т.д.;

b. подвергание концентрата тромбоцитов стадии активации, через контакт с активирующим агентом, чтобы стимулировать высвобождение тромбоцитами по меньшей мере части альфа-гранул и факторов роста, присутствующих в них, обеспечивая тем самым получение жидкого релизата тромбоцитов;

c. подвергание жидкого релизата тромбоцитов стадии снижения концентрации фибриногена и выделение релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном; эта стадия направлена на удаление фибриногена из жидкого релизата тромбоцитов;

d подвергание жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном второй подтверждающей стадии снижения концентрации патогенов с целью разрушения вирусов с оболочкой;

е. подвергание релизата тромбоцитов стерильной фильтрации и выделение отфильтрованной жидкости, содержащей факторы роста.

Способ получения лизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, по данному изобретению включает следующие стадии:

(a) подвергание концентрата тромбоцитов первой стадии снижения концентрации патогенов. В предпочтительном варианте осуществления первая стадия снижения концентрации патогена включает стадию инкубации концентрата тромбоцитов с фотохимически активным агентом и воздействия на концентрат тромбоцитов ультрафиолетового излучения. Этот этап позволяет получить концентрат тромбоцитов с пониженным содержанием патогенных микроорганизмов вследствие инактивации или разрушения РНК и/или ДНК микроорганизмов, присутствующих в концентрате тромбоцитов. В частности, концентрат тромбоцитов становится концентратом, в котором снижена концентрация вирусов с оболочкой и без оболочки. Эта первая стадия может также позволить инактивировать другие переносимые кровью микроорганизмы, содержащиеся в концентрате тромбоцитов;

(b) подвергание обработанного таким образом концентрата тромбоцитов стадии активации путем приведения концентрата тромбоцитов в контакт с активирующим агентом для стимулирования высвобождения тромбоцитами по меньшей мере части их содержимого, в частности, по меньшей мере, части альфа-гранул, присутствующих в тромбоцитах, а также содержимого таких альфа-гранул, включая факторы роста, и обеспечения получения релизата тромбоцитов. Релизат тромбоцитов обычно принимает форму жидкой композиции, которая содержит то, что остается от активированных тромбоцитов и содержимое тромбоцитов, которое высвободилось на стадии активации. В результате этой стадии активации сверхфизиологические дозы факторов роста и цитокинов будут высвобождаться из тромбоцитов в композицию или раствор, содержащий концентрат тромбоцитов, в дополнение к фибриногену. Это важно, поскольку альфа-гранулы обычно содержат большую часть факторов роста. Активация тромбоцитов млекопитающих и их концентратов может быть достигнута путем их контакта с активатором тромбоцитов, способным вызывать разрыв тромбоцитов и вызывать высвобождение по меньшей мере части содержимого, включая надфизиологические дозы факторов роста, цитокинов и хемокинов. Подходящие активаторы включают водные растворы солей кальция, например, хлористый кальций, тромбин, коллаген, тромбоксан А2 и аденозиндифосфат (АДФ). Добавление тромбина вызывает образование огромного сгустка, который содержит практически все содержимое концентрата тромбоцитов. Инкубация при температуре около температуры тела, около 37°С в течение достаточно длительного времени, часто 3 часа или более, приводит к тому, что сгусток сжимается до незначительного размера с выжиманием всех факторов роста внутри захваченных тромбоцитов. Таким образом, настоящее изобретение позволяет достичь высвобождения такого объема факторов роста, взвешенных в плазме, который практически идентичен начальному объему концентрата тромбоцитов, (с) Подвергание жидкого релизата тромбоцитов удалению фибриногена и выделение жидкости, релизата, обедненного фибриногеном. Эта стадия фактически содержит этапы выделения фибринового сгустка, образовавшегося после взаимодействия фибриногена, высвобождаемого из тромбоцитов, с активирующим агентом, добавленным на предыдущей стадии, чтобы вызвать высвобождение содержимого тромбоцитов. Целесообразно удалить фибриноген, который высвобождается при активации тромбоцитов в максимально возможной степени из релизата, так как фибриноген может привести к образованию полутвердого геля, который может вызвать нежелательные последствия, когда плазма крови, которая была обогащена тромбоцитами (ПРП), дополнительно применяется, например, для инъекции в область поражения при травмах опорно-двигательного аппарата, включая сухожилия, связки и суставы, или при омоложения кожи лица или при любом другом лечении. Тем не менее, концентрация фибриногена в тромбоцитах ниже, чем в плазме. Способ по настоящему изобретению может дополнительно содержать этап выделения фибриногена из релизата тромбоцитов и восстановления для дальнейшего применения релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном.

(d) Подвергание релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, второй стадии снижения концентрации патогенов для разрушения или инактивации вирусов с оболочкой и выделения водной белковой фазы, содержащей факторы роста. Основной целью этой стадии является подтверждение удаления вирусов с оболочкой, таких как вирус гепатита В с липидной оболочкой, вирусы гепатита С и ВИЧ с оболочкой. Использование двух ортогональных стадий инактивации патогена (стадия а и стадия d), как это сделано в настоящем изобретении, особенно важно, так как оно позволяет достичь инактивации как вирусов без оболочки, так и вирусов с оболочкой, а также инактивации более крупных микроорганизмов, таких как бактерии и паразиты, например, простейшие. При этом способ по настоящему изобретению отвечает основному требованию современных правил биофармацевтической промышленности, касающихся продуктов, полученных из крови. Эта стадия гарантирует, что риск нежелательного взаимодействия с внеклеточными факторами будет минимизирован.

(e) Подвергание релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, стерильной фильтрации с целью удаления любых оставшихся твердых веществ и бактерий и получения жидкости, содержащей факторы роста, или жидкого фильтрата. Поскольку тромбоциты происходят из крови млекопитающих, жидкость или жидкий фильтрат представлен в основном на водной основе или в виде водного раствора, который содержит белковую фазу.

В вышеописанном способе стадии предпочтительно выполняются последовательно в описанном порядке.

В дополнение к первой стадии А, которая позволяет достичь инактивации вирусов без оболочки, присутствующих в концентрате тромбоцитов, способ по настоящему изобретению также содержит стадию, на которой инактивируют вирусы с оболочкой, обычно вирусы с липидной оболочкой, которые могут содержаться либо концентрате тромбоцитов, либо в тромбоцитах как таковых. Предпочтительный способ достижения этого заключается в том, что релизат тромбоцитов подвергают воздействию или приводят в контакт с растворителем и/или детергентом с целью растворения липидных мембран, содержащихся в релизате, и разрушения содержащихся в нем нуклеиновых кислот с последующей стадией экстракции, предпочтительно, масляной, с целью удаления растворителя и/или детергента, содержащего растворенные липидные мембраны, и стадию фильтрации для удаления любых оставшихся твердых веществ. Из-за наличия стадий экстракции и фильтрации, вирусы в липидной оболочке, а также другие патогены, такие как бактерии и паразиты, например, простейшие, могут быть инактивированы, а липиды плазмы и тромбоцитов, которые могут содержаться в исходном концентрате тромбоцитов, могут быть удалены. Стадии процесса масляной экстракции и фильтрации позволяют легко, быстро и эффективно подготовить релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, с инактвированными вирусами и бактериями, причем концентрации растворителя и детергента соответствуют пределам, утвержденным регулирующими органами для парентеральных препаратов, полученных из крови.

В настоящем изобретении авторами предложен способ приготовления релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, с помощью которого риск передачи остаточных заболеваний, передаваемых через кровь, неисчислимым фактором, особенно в случае тромбоцитарных продуктов, которые происходят из крови, которая систематически подвергалась удалению лейкоцитов, может быть сведен к минимуму. Удаление лейкоцитов, в частности, приводит к тому, что способность крови к самостоятельной стерилизации теряется в значительной степени и часто полностью теряется. Это важно, поскольку плазма представляет собой оптимальную среду для выживания или роста для широкого спектра патогенов.

Кроме того, благодаря выбранной комбинации методов инактивации патогенов может быть обеспечена абсолютная безопасность факторов роста, полученных из тромбоцитов с помощью данного изобретения. Поэтому могут быть предоставлены смеси полученных из тромбоцитов факторов роста с инактивированными вирусами, которые могут быть эффективно стандартизированы для использования в терапевтическом лечении, клеточной терапии или культивировании клеток. Двойная стадия инактивации вирусов/патогенов позволяет квалифицировать продукт, полученный по способу согласно данному изобретению, для безопасного использования в клинических исследованиях и выращивания мезенхимальных стволовых клеток для применения in vivo. В результате необходимость использования аутологичных тромбоцитов у пациента с соответствующими ограничениями устраняется. Кроме того, вместо навязывания использования аутологичных тромбоцитов настоящее изобретение открывает возможность использования релизата тромбоцитов, полученного из пула продуктов крови млекопитающих, которые происходят от нескольких субъектов, с минимальным риском передачи заболеваний, передающихся через кровь, которые могут происходить от одного или больше субъектов, от которых получены концентраты тромбоцитов.

Способ согласно настоящему изобретению подходит не только для получения факторов роста, полученных из тромбоцитов человека, но также может использоваться с минимальными корректировками для получения лошадиных факторов роста, полученных из тромбоцитов животных, например, из тромбоцитов лошади с аналогичными медицинскими применениями. Восстановленные лиофилизированные факторы роста, полученные из тромбоцитов, могут быть дополнительно использованы в качестве альтернативы фетальной бычьей сыворотке в среде для культивирования клеток и в выращивании мезенхимальных стволовых клеток.

Учитывая тот факт, что, частично из-за риска бактериального загрязнения и потери функциональной активности при гемостазе, тромбоциты обычно имеют ограниченный срок хранения 5 или 7 дней, когда клинически используются внутривенно для коррекции количественной или функциональной тромбоцитопении, большое число единиц тромбоцитов старше 5 или 7 дней обычно выбрасывают каждый год. Позволяя использовать запасы тромбоцитов с истекшим сроком годности для приготовления продуктов, полученных из тромбоцитов, таких как релизат тромбоцитов согласно данному изобретению, способ согласно изобретению демонстрирует многообещающий экономический интерес.

Данное изобретение также позволяет максимизировать количество полученного объема релизата путем выполнения этапов процесса в последовательности, описанной выше. Современные технологии, такие как система Mirasol™, позволяют подвергать большое количество концентратов тромбоцитов, собранных путем ферезиса тромбоцитов, инактивации патогенных микроорганизмов с минимальным риском уменьшения объема собранных тромбоцитов. Путем проведения стадии масляной экстракции только после того, как была проведена первая вирусная инактивация, потеря или уменьшение количества доступного релизата в результате обработок по удалению патогена могут быть сведены к минимуму.

Поскольку можно избежать использования циклов замораживания/оттаивания, настоящее изобретение представляет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что существует минимальный риск того, что содержание в основных белках факторов роста, полученных с ним, таких как альбумин и иммуноглобулины, а также концентрация факторов роста в релизате, отличные от тромбоцитарных факторов роста (PDGF) и факторов роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как TGF-B1, EGF и IGF будут испытывать неблагоприятное воздействие.

В предпочтительном варианте реализации изобретения, содержащий факторы роста релизат тромбоцитов, полученный с помощью способа согласно настоящему изобретению, можно лиофилизировать в сосудах небольшого объема, которые могут быть легко разбавлены до нужной концентрации в одну стадию путем добавления воды или солевого раствора в соответствии с фактическими потребностями. Таким образом, объем предпочтительно выбирается таким, чтобы он содержал количество факторов роста, достаточное для одной обработки. Внутри и между партиями концентрацию факторов роста на сосуд можно стандартизировать, регулируя объем высвобождаемых факторов роста, распределенных в каждом сосуде, в соответствии с начальным количеством тромбоцитов, то есть количеством тромбоцитов, которое подвергается последовательным стадиям (а)-(d), описанным выше. В предпочтительном варианте реализации жидкий фильтрат, полученный на стадии (е) выше, делится на отдельные объемы, причем каждый отдельный объем регулируется таким образом, чтобы он составлял от 2×10⁵ до 2×10⁷ тромбоцитов на см³, предпочтительно около 2×10⁶ тромбоцитов на см см³. При желании, релизат тромбоцитов может быть обогащен определенным набором факторов роста в зависимости от предполагаемого использования. Стандартизируя число факторов роста для каждого сосуда, необходимость изготовления небольших аликвот из большего стокового объема с потенциальным риском загрязнения и потери активности из-за многократных циклов оттаивания и замораживания, которому стоковый объем должен быть подвергнут, чтобы извлечь желаемую небольшую аликвоту, данный риск может быть устранен.

Указанная выше формулировка «концентрат тромбоцитов» относится к любой жидкости, биологической или искусственной, которая содержит тромбоциты. Неограничивающие примеры таких жидкостей включают различные формы цельной крови, плазмы крови, плазмы, обогащенной тромбоцитами, концентрированные тромбоциты в любой среде и т.п., полученные из млекопитающих, которые могут быть людьми или животными. Жидкость обычно представлена на водной основе. Таким образом, жидкость может быть аутологичной, или это может быть пул аллогенных жидкостей, которые происходят от нескольких различных субъектов, например, из концентратов тромбоцитов, полученных из афереза или лейкоцитарной пленки, с определенным минимальным содержанием тромбоцитов, обычно готовящихся в банках крови. Обычно производство является стандартизированным производством из аллогенных продуктов с истекшим сроком годности. Концентраты тромбоцитов, как правило, готовят с использованием метода лейкоцитарной пленки, в котором используется цельная кровь, метод БоТП или тромбоциты после афереза, которые получают из хранимых индивидуально донорских порций крови. Использование последнего является предпочтительным, в частности, когда дополнительно производят удаление лейкоцитов перед хранением. Кроме того, концентраты тромбоцитов, которые нельзя переливать из-за того, что они достигли предела хранения в пять-семь дней, могут быть заморожены, храниться и использоваться в качестве дополнения к питательной среде.

Концентрат тромбоцитов может поддерживаться в плазме или в смеси плазмы и добавочного раствора. Чтобы увеличить срок годности, концентраты тромбоцитов могут состоять из больших пулов замороженных концентратов тромбоцитов.

Термин «концентрат» или «концентрирование» может относиться к отделению тромбоцитов от массы плазмы, цельной крови или другой жидкости, в которой они присутствуют, но он также может относиться к исходному продукту как таковому, например, ко всей крови или плазме. Центрифугирование, спектрометрия, фильтрация, декантация, гравитационное осаждение или другие методы концентрирования тромбоцитов из жидкостей, содержащих тромбоциты, могут быть использованы для производства концентрата. При концентрировании тромбоцитов может быть желательным применение антикоагулянта (особенно для центрифугирования или гравитационного осаждения) вместе с источником тромбоцитов для предотвращения свертывания во время отделения тромбоцитов от других компонентов крови, плазмы или другой жидкости. Термин «антикоагулянт» относится к составам, которые ингибируют свертывание при концентрировании или сборе тромбоцитов для использования в соответствии с примерами настоящего раскрытия изобретения. Антикоагулянты обычно доступны в качестве ингибиторов синтеза фактора свертывания крови, ингибиторов тромбина или антиагрегантов. Ингибиторы синтеза факторов свертывания, которые ингибируют выработку определенных факторов свертывания в печени, включают такие составы, как варфарин (Coumadin). Ингибиторы тромбина препятствуют свертыванию крови, блокируя активность тромбина, и включают такие составы, как гепарин и лепирудин (Refludan). Антиагрегантные препараты взаимодействуют с самими тромбоцитами и включают такие препараты, как аспирин, тиклопидин (Ticlid), клопидогрел (Plavix), тирофибан (Aggrastat), эптифибатид (Integrilin) и др.

В приведенном выше описании термин «релизат тромбоцитов» относится к композиции, получаемой, когда концентрат тромбоцитов подвергают стадии активации, и содержимое, высвобождаемое тромбоцитами, выделяют, как было описано выше, на конкретной стадии b, как описано выше.

Указанное выше «подвергание концентрата тромбоцитов стадии активации или обработке активатором» означает разрушение тромбоцитов путем разрушения их клеточной мембраны для стимулирования высвобождения тромбоцитами содержимого своих гранул, в частности альфа-гранул, содержащихся в тромбоцитах. Активированные тромбоциты могут высвобождать большое количество содержащихся в них соединений, белков, клеточных микровезикул, например, микрочастиц, полученных из плазматической мембраны, экзосом, факторов роста, таких как VEGF, bFGF, PDGF, TGF-B и других цитокинов. Это может быть выполнено химически, механически, путем жидкостной гомогенизации, обработки ультразвуком или лизирования. В соответствии с данным изобретением активация предпочтительно осуществляется путем контактирования концентрата тромбоцитов с активирующим агентом, поскольку это позволяет максимизировать высвобождение содержимого тромбоцитов в жидкий релизат тромбоцитов. Подходящие лизирующие агенты включают растворы тромбина, коллагена, тромбоксана А2 или АДФ и соли кальция или смесь двух или более указанных веществ. Примером подходящей соли кальция является хлорид кальция. Однако любые другие лизирующие агенты, которые квалифицированный специалист считает подходящими, также могут быть использованы.

Механический лизис может, например, проводиться с использованием цикла замораживания-оттаивания, замораживания суспензии тромбоцитов и затем оттаивания материала до температуры выше комнатной, например, от 30°С до 45°С. Этот метод заставляет клетки набухать и разрушаться по мере образования кристаллов льда с последующим сжатием при оттаивании. В результате циклического набухания и сжатия тромбоциты открываются. В зависимости от количества циклов замораживания-оттаивания может быть достигнута различная степень цитолиза тромбоцитов, например, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 90% или до 100% цитолиза по подсчету тромбоцитов. В рамках настоящего изобретения может рассматриваться механическое лизирование, но предпочтительно обходиться без него из-за предполагаемой потери качества высвобождения.

В рамках данного изобретения «лиофилизированные релизаты тромбоцитов» включают в себя «лиофилизированные релизаты плазмы, обогащенной тромбоцитами» или «LPRRL» в качестве специфического типа лиофилизированных релизатов тромбоцитов, но не ограничиваются указанными.

В рамках настоящего изобретения «антикоагулянт» представляет собой композицию, которая ингибирует свертывание при концентрировании или сборе тромбоцитов для применения в соответствии с настоящим изобретением. Антикоагулянты, как правило, доступны в виде комплексообразующих/хелатирующих агентов с ионами кальция, ингибиторов синтеза факторов свертывания, ингибиторов тромбина или антиагрегантов. Ингибиторы синтеза факторов свертывания, которые ингибируют выработку определенных факторов свертывания в печени, включают такие составы, как варфарин (Coumadin). Ингибиторы тромбина включают такие составы, как гепарин и лепирудин (Refludan). Антиагрегантные препараты взаимодействуют с самими тромбоцитами и включают такие препараты, как аспирин, тиклопидин (Ticlid), клопидогрел (Plavix), тирофибан (Aggrastat), эптифибатид (Integrilin) и др.

Ультрафиолетовое облучение, проводимое на стадии а способа по настоящему изобретению, предпочтительно включает воздействие на релизат тромбоцитов облучения УФА, предпочтительно воздействие УФА-излучения с плотностью энергии от 1 до 10 Дж/см², более предпочтительно около 3 Дж/см². Воздействие ультрафиолетового излучения предпочтительно проводить после инкубации релизата тромбоцитов с фотохимическим агентом, в частности псораленом, в частности амотосаленом, или рибофлавином.

На стадии d способа согласно данному изобретению, где релизат тромбоцитов приводят в контакт с растворителем и/или детергентом для растворения мембраны вирусов с оболочкой или других патогенов, предпочтительно использовать растворитель для инкубации концентрата тромбоцитов, выбранный из группы ди- или триалкилфосфатов и предпочтительно представляет собой три-н-бутилфосфат.Подходящие детергенты для использования на стадии d способа по данному изобретению включают детергенты, выбранные из группы полиоксиэтиленовых производных жирных кислот, частичных сложных эфиров ангидридов сорбита, неионных детергентов, дезоксихолата натрия и сульфобетаинов, и предпочтительно представляют собой Triton Х-45, Triton Х-100 или Tween 80.

Количество масла, используемого на последующей стадии экстракции для удаления растворителя и/или детергента и растворенных в нем компонентов, может варьироваться в широком диапазоне, но предпочтительно количество масла составляет от 2 до 20 мас. %, Предпочтительно от 5 до 15 мас. %, Более предпочтительно от 5 до 10 мас. %, В расчете на общий объем смеси концентрата тромбоцитов и растворителя и/или детергента. Таким образом, предпочтительно использовать масло фармацевтического качества, например, касторовое масло. В процессе экстракции обычно к определенному объему релизата тромбоцитов добавляют определенный объем масла и встряхивают в смесителе крови в течение определенного периода времени, обычно 30, 20 или 15 минут или менее. После этого контейнер, в котором проводится экстракция, может быть установлен в перевернутом положении на определенный период времени, например, 10 минут или менее, или дольше, чтобы получить верхнюю масляную фазу и нижнюю фазу релизата тромбоцитов, которая отделена гравитацией от верхней фазы. Этот этап может повторяться один или два, или более раз, в зависимости от эффективности экстракции.

Способ согласно настоящему изобретению может включать после стадии экстракции е по меньшей мере одну стадию центрифугирования для отделения тромбоцитов от масляной и водной белковой фазы. Обычно релизат тромбоцитов подвергают центрифугированию при низкой температуре, обычно ниже 10°С, предпочтительно ниже 5°С, обычно около 4°С, предпочтительно в перевернутом положении для отделения любых остатков масла в верхней фазе и релизата тромбоцитов в нижней фазе, которая образуется под действием силы тяжести.

Способ согласно настоящему изобретению может включать в себя после стадии фильтрации е стадию лиофилизации для продления срока хранения релизата тромбоцитов. Перед осущетсвлением лиофилизации, жидкость или жидкий фильтрат, полученный на этапе е, может быть разделен на несколько объемов, причем объем регулируется таким образом, чтобы каждый объем содержал релизат заданного количества тромбоцитов на см³, например релизат примерно из 2×10⁵ до 2×10⁷ тромбоцитов, более предпочтительно релизат из около 2×10⁶ тромбоцитов на см³, но специалист может выбрать любую другую концентрацию тромбоцитов. Продукт, полученный способом согласно данному изобретению, сочетает в себе характеристики лиофилизации в разумных объемах, которые подходят для немедленного использования, не требуя дальнейшего разделения на подходящие аликвоты, с простотой хранения и восстановления и низким содержанием фибриногена.

В предпочтительном варианте реализации для достижения криозащиты факторов роста перед лиофилизацией человеческий альбумин добавляют в жидкий фильтрат, полученный на стадии е.

В рамках данного изобретения «лиофилизация» относится к процессу сушки вымораживанием или дегидратации, который часто используется для консервирования тромбоцитов. Лиофилизация, однако, может также использоваться не только в качестве консервирующего процесса, но также и в качестве воздействия для лизиса тромбоцитов, чтобы дополнительно лизировать тромбоциты после того, как проводится первоначальная заморозка-оттаивание или другой метод лизиса. Другими словами, в соответствии с примерами настоящего раскрытия изобретения, после того, как релизаты образуются, как описано здесь, лиофилизация обеспечивает дополнительное преимущество сохранения факторов роста, цитокинов, хемокинов и другого содержимого, первоначально заключенного внутри или связанного с поверхностью тромбоцитов, но которые высвобождаются, когда тромбоциты лизируются, как описано здесь, например, через заморозку-оттаивание. Процесс обычно осуществляется замораживанием материала и снижением окружающего давления, чтобы позволить замерзшей воде в материале сублимироваться непосредственно из твердой фазы в газовую фазу.

При желании концентрат тромбоцитов может быть подвергнут стадии удаления лейкоцитов перед тем, как подвергнуть тромбоциты стадии активации, чтобы стимулировать высвобождение их содержимого. Удаление лейкоцитов в основном направлено на снижение риска возникновения нежелательных осложнений, связанных с переливаемыми лейкоцитами, представленными в единицах эритроцитов и тромбоцитов.

Способ согласно настоящему изобретению предназначен для приготовления лизата тромбоцитов, обедненных фибриногеном, обогащенного факторами роста, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, который может представлять собой тромбоциты человека или животных, например, тромбоциты лошади. Релизат может быть лиофилизирован или не лиофилизирован.

Релизаты тромбоцитов, полученные способом согласно данному изобретению, можно применять для лечения ран, язв или ожогов. Релизаты тромбоцитов могут применяться в сухом виде или быть регидротированными перед применением или в виде геля. Альтернативно, даже если кожа не повреждена раной, язвой или ожогом, ее можно применять для восстановления других типов повреждений, возникающих в результате старения, фотоповреждения, патологического или дегенеративного заболевания, или тому подобного. Концентрация тромбоцитов в релизате, полученном способом согласно данному изобретению, может варьироваться в широких пределах, но предпочтительно концентрация настолько высока, насколько это возможно, для достижения максимального эффекта.

Вышеупомянутый термин «рана» относится к любому повреждению любой ткани субъекта, включая повреждение кожи, а также повреждение более глубоких тканей. Таким образом, рана может быть получена случайно или преднамеренно, или могла быть получена в следствие нормального течения патологического, болезненного или дегенеративного состояния. Например, повреждение может быть результатом травмы или операции. Неограничивающие примеры травм включают язвы, ожоги, переломы костей, проколы, порезы и царапины, рваные раны, хирургические разрезы, воспаление, инфекцию, и тому подобное.

Релизаты тромбоцитов могут быть введены с использованием способов введения, известных специалисту, включая использование жидкостей, аэрозолей, спреев, туманов, лосьонов, кремов, мазей, гелей, камедей, распыляемых капель или порошков, дозирующих флаконов, предварительно пропитанной ткани, шприцов, повязок, кожных пластырей или пластырей и т.д. В предпочтительном варианте реализации изобретения релизат тромбоцитов, полученный способом согласно данному изобретению, может храниться в стабильной форме в наборе для применения в чрезвычайных ситуациях для лечения ран. Релизат тромбоцитов может быть восстановлен для немедленного применения при необходимости. В другом аспекте настоящее изобретение относится к аэрозолю, лечебному средству, спрею, туману, лосьону, крему, мази, гелю, камеди, повязке, кожному пластырю, пластырю, содержащему релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, полученный с помощью способа согласно настоящему изобретению.

Релизаты тромбоцитов, полученные способом согласно данному изобретению, могут содержать повышенные количества факторов роста, цитокинов, хемокинов и т.д. Примеры факторов роста и других веществ, которые могут присутствовать в рилизате, включают, без ограничения, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1, IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1, IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1, KGF-2, фибринопептид А, фибриноген, альбумин, остеонектин, gro-alpha, витронектин, D-димер фибрина, фактор V, антитромбин III, макроглобулин а2, антиогенин, Fg-D и эластазу. Более подробно, факторы роста, цитокины или тому подобное, которые могут присутствовать и включают в себя, без ограничения, LIF, противоопухолевые факторы роста, такие как IGFBP3, эйкозаноиды, такие как PGs или лейкотриены, IL-1 TNF альфа, INFs, TNF-a IL-6, IL-1 (a/b), метаболиты простаноидов, компоненты комплемента, активные формы кислорода в промежуточных соединениях, метаболиты арахидоновой кислоты, факторы свертывания крови, нитраты и хемокины. Факторы роста, полученные от человека, хемокины, цитокины и гормоны могут включать альфа дефензин, альфа синуклеин, бета синуклеин, 4-1 BBL, 6Ckine, кислый FGF, активин А, активин Rib, ангиопоэтин 2, B-DNF, BAFF, ВСА-1, ВСА-1, BD-1, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-7, BMPRA1, BDNF, CNTF, CTGF, CTI_A-4Fc, CXCL1, CXCL2, кардиотрофин-1, Cripto, Cystatin С, Dkk-1, EGF AOF, EGF, EMAPII, ENA-78, EPO, Эотаксин, основной FGF AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN alpha A, IFN alpha A/D, IFN alpha D, IFN alpha a2b, IFN, beta 1A, IFN-gamma, IGF1, IGFil, IGFBP-4, IGFBP6, ILI alpha, IL-lBeta, НЛО, IL11, IL12, НЛЗ, IL15, IL17, IL17A. IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21, IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IT AC, KGF2, Калликреин 1 1, Калликреин 4, Калликреин 7, LEFTY-A, LIF, лептин, MCSF AOF, MCSF, MCP- 1, MCP2, МСРЗ, MCP4, MDC, MIG, MFP1 alpha, MIP1 beta, MIP3 alpha, MIP3 beta, MIP4, MIP5, мидкин, NAP2, NT3, NT4, Neurotactin, нейротурин, онкостатин, остеопротегрин, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, лиганд Rank, рецептор Rank, RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 alpha, SDF-1 Beta, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARO, TECK, TGF alpha, TGF1 Betal, TGF Beta2, TGF Beta3, TNF beta/лимфотоксин, TNF-alpha, TPO, TRAIL, TWEAK, и VEGF.

Релизат тромбоцитов, полученный способом согласно настоящему изобретению, имеет два основных назначения, в которых он показал значительную ценность, хотя его можно использовать и для других назначений. Первым назначением является его прменение в качестве терапевтического средства для усиления пролиферации клеток множественных линий в регенеративной медицине и в лечении незаживающих ран и резистентных язв. Использованный в этих применениях релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, получали из тромбоцитов человека или лошади. Релизат тромбоцитов, полученный способом согласно данному изобретению, может также использоваться в средах для культивирования клеток, в частности стволовых клеток, фибробластов или дендритных клеток. Вторым назначением является замена фетальной бычьей сыворотки в клеточных культуральных средах. Релизаты тромбоцитов с низким содержанием фибриногена, позволяют избежать нежелательных эффектов гелеобразования, а подвергание релизата двум стадиям удаления патогенов/вирусов обеспечивает безопасность продукта. В результате, аутологичные концентраты тромбоцитов больше не являются необходимостью, и концентрат тромбоцитов млекопитающих, который используется в способе согласно данному изобретению, может содержать пул тромбоцитов, которые происходят от различных млекопитающих субъектов.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется приведенным ниже примером.

ПРИМЕР 1

Человек был подключен к устройству для ферезиса (HaemoneticsLICS +9000а) для получения обогащенного тромбоцитами концентрата, с количеством тромбоцитов в 3-5 раз превышающим начальное количество тромбоцитов. Обогащенный тромбоцитами концентрат инкубировали с рибофлавином и облучали ультрафиолетовыми лучами с помощью системы MIRASOL™ в качестве первой стадии снижения количества патогенов. После этого, стерильный Тромбинь был добавлен в подходящей концентрации 500 единиц/м³/мин для активации тромбоцитов в указанном концентрате. Это привело к последующему высвобождению из гранул тромбоцитов надфизиологических доз факторов роста и цитокинов. Кроме того, активированные тромбоциты высвобождают содержащийся в альфа-гранулах фибриноген, который активируется тромбином с образованием нерастворимого сгустка. При центрифугировании концентрат тромбоцитов, обработанный тромбином, разделился на супернатант, содержащий прозрачную светло-красную жидкость или жидкость, которая состоит в основном из лизированных тромбоцитов, содержимое которых представляет собой сверхфизиологические дозы факторов роста, высвобождаемых из гранул тромбоцитов, и отложение нерастворимого фибринового сгустка. Супернатант переносили в новый контейнер для дальнейших этапов подготовки. Релизат тромбоцитов обрабатывали системой растворителей и детергентов (0,3% TNBPc и 1% tween 20d) в течение 1 часа при 31°С. Этот шаг способен разрушить вирусы с оболочкой (в основном, НВС, HCV и ВИЧ).После этого растворитель и детергент удаляли тремя последовательными стадиями экстракции с помощью растительного масла. Стерильное касторовое масло (7,5% от общего объема) добавляли к релизату тромбоцитов, и смесь встряхивали в смесителе крови в течение 15 минут, затем контейнер устанавливали в перевернутом положении в течение 10 минут для получения верхней масляной фазы и нижней фазы лизата тромбоцитов, которая отделена силой тяжести от верхней фазы. Этот этап повторяли еще два раза, затем релизат тромбоцитов центрифугировали в течение 20 минут при 4°С и 1500g в перевернутом положении, чтобы разделить остатки масла в верхней фазе и релизат тромбоцитов в нижней фазе, которая образуется под действием силы тяжести.

Затем релизат тромбоцитов подвергали этапу стерильной фильтрации для обеспечения удаления любых бактериальных возбудителей, а затем жидкость или жидкий фильтрат распределяли в заранее определенные объемы (регулируется в соответствии с начальным количеством тромбоцитов концентрата, чтобы обеспечить эквивалент около 1 млн тромбоциты на см³) в стеклянные сосуды и лиофилизировали такой фильтрат, который состоял в основном из факторов роста, полученных из тромбоцитов.

ПРИМЕР 2

Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, использовали для достижения омоложения лица. Одну ампулу, которая была получена из 2×10⁶ тромбоцитов, вводили с каждой стороны лица женщины в подбородок, щеку и носогубные складки. Покраснение, боль и отек были значительно уменьшены. Восстановительный эффект длился не менее 6 месяцев.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЭКСПЕРИМЕНТ

Объем, содержащий 2×10⁶ аутологичных тромбоцитов, вводили с каждой стороны лица женщины, страдающей теми же дефектами, что и в примере 2. Покраснение, боль и отек были уменьшены только в ограниченной степени.

ПРИМЕР 3

Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, использовали для облегчения боли при лечении боли в пояснице. Две ампулы, которые были получены из 2×10⁶ тромбоцитов, были введены в нижнюю часть спины. Боль могла быть значительно уменьшена. Лечение повторили через неделю, инъекцией одной ампулы. Восстановительный эффект длился несколько месяцев.

ПРИМЕР 4

Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, вводили в гидрогелевую повязку из альгината натрия коллагена и наносили на диабетические язвы, которые не заживали в течение более чем 6 месяцев. В течение нескольких дней было достигнуто значительное заживление ран.

ПРИМЕР 5

Релизат тромбоцитов готовили по методике примера 1, на этот раз с использованием крови лошади. Две ампулы, каждая из которых была получена из 2×10⁶ тромбоцитов, вводили инъекционно в поврежденную мышцу лошади. Лечение повторяли через неделю. Мышца зажила без следов травмы.

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, применению полученного релизата и составу для регенеративной медицины. Предлагается способ получения релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, из жидкого концентрата тромбоцитов млекопитающих, включающий последовательные этапы: снижения содержания патогенных микроорганизмов в концентрате тромбоцитов путем разрушения вирусов без оболочки; активации концентрата тромбоцитов с целью инициирования высвобождения тромбоцитами факторов роста и альфа-гранул; выделение жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, обработка жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, для снижения концентрации патогена и разрушения вирусов с оболочкой; стерилизующая фильтрация с выделением отфильтрованной жидкости, содержащей факторы роста с последующим разделением на порции с одинаковым содержанием тромбоцитов 2×10⁵–2×20⁷ тромбоцитов на см³. Состав для регенеративной медицины. Применение релизата тромбоцитов в регенеративной медицине. Применение релизата тромбоцитов в средах для культивирования клеток. Вышеописанный способ позволяет получить терапевтическое средство для усиления пролиферации клеток множественных линий в регенеративной медицине и при лечении незаживающих ран и резистентных язв, а также в средах для культивирования клеток. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения содержащего факторы роста релизата тромбоцитов из жидкого концентрата тромбоцитов млекопитающего, включающий последовательные стадии:

a) подвергание концентрата тромбоцитов первому этапу снижения концентрации патогена с целью разрушения как ДНК, так и РНК микроорганизмов, присутствующих в концентрате тромбоцитов;

b) подвергание концентрата тромбоцитов стадии активации путем приведения его в контакт с активирующим агентом с целью инициирования высвобождения тромбоцитами по меньшей мере части альфа-гранул и факторов роста, присутствующих в них, тем самым обеспечивая жидкий релизат тромбоцитов;

c) подвергание жидкого релизата тромбоцитов стадии снижения концентрации фибриногена и выделение жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном;

d) подвергание жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, второй стадии снижения концентрации патогена с целью разрушения вирусов в оболочке;

e) подвергание релизата тромбоцитов стерильной фильтрации и выделение со стадии фильтрации отфильтрованной жидкости, содержащей факторы роста;

f) разделение отфильтрованной жидкости на отдельные порции, причем объем каждой отдельной порции регулируют так, чтобы каждая порция содержала примерно одинаковое количество тромбоцитов;

g) подвергание отдельных порций отфильтрованной жидкости, полученных таким образом, лиофилизации,

причем жидкий фильтрат разделяют на отдельные порции, которые содержат релизат из 2 × 10⁵ - 2 × 10⁷ тромбоцитов на см³.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активирующий агент представляет собой раствор, содержащий одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из соли кальция, тромбина, коллагена, тромбоксана А2 и аденозиндифосфата (АДФ), предпочтительно раствор, содержащий тромбин.

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что первый этап снижения концентрации патогена включает инкубацию концентрата тромбоцитов с фотохимически активным агентом и воздействие ультрафиолетового излучения на концентрат тромбоцитов.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что УФ-излучение представляет собой УФА-излучение, предпочтительно УФА-излучение с плотностью энергии между 1 и 10 Дж/см², более предпочтительно УФА-излучение с плотностью энергии 3 Дж/см².

5. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что фотохимически активный агент представляет собой псорален, в частности амотосален или рибофлавин.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что вторая стадия снижения концентрации патогена включает инкубацию релизата тромбоцитов с растворителем и/или детергентом, с последующим удалением растворителя и/или детергента и выделением релизата тромбоцитов, обедненного растворителем и/или детергентом.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что растворитель для инкубации концентрата тромбоцитов выбирают из группы, состоящей из ди- или триалкилфосфатов, предпочтительно три-н-бутилфосфата.

8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что детергент выбирают из группы, включающей одно или более полиоксиэтиленовых производных жирных кислот, частичных сложных эфиров ангидридов сорбита, неионных детергентов, дезоксихолата натрия и сульфобетаинов, и предпочтительно представляет собой Triton X-45, Triton X-100 или Tween 80.

9. Способ по любому из пп. 6-8, отличающийся тем, что растворитель и/или детергент удаляют из релизата тромбоцитов путем масляной экстракции.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что масляную экстракцию проводят в присутствии количества масла, которое составляет от 2 до 20 мас.%, предпочтительно от 5 до 15 мас.%, более предпочтительно от 5 до 10 мас.%, в расчете на общий вес смеси концентрата тромбоцитов и растворителя и/или детергента.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий по меньшей мере одну стадию центрифугирования релизата тромбоцитов после удаления растворителя и/или детергента на второй стадии снижения концентрации патогена.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что жидкий фильтрат разделяют на отдельные порции, которые содержат релизат из 2 × 10⁶ тромбоцитов на см³.

13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что человеческий альбумин добавляют в отфильтрованную жидкость, полученную на стадии e), перед тем, как отфильтрованную жидкость подвергнуть лиофилизации.

14. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что перед тем, как подвергнуть концентрат тромбоцитов стадии активации b), концентрат тромбоцитов подвергают стадии инактивации лейкоцитов.

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что концентрат тромбоцитов млекопитающих обогащен факторами роста тромбоцитов человека или тромбоцитов лошади.

16. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что концентрат тромбоцитов млекопитающих содержит пул концентратов тромбоцитов, которые происходят от разных субъектов.

17. Применение релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, полученного способом по любому из пп. 1-16, в регенеративной медицине.

18. Применение по п. 17 для применения, выбранного из группы, состоящей из усиления пролиферации клеток множественных линий и стимулирования заживления ран и заживления язв.

19. Применение релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, полученного способом по любому из пп. 1-16, в одной или более средах для культивирования клеток, выбранных из стволовых клеток, фибробластов или дендритных клеток.

20. Состав для регенеративной медицины, содержащий релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, полученный способом по любому из пп. 1-16, выбранный из одного или более, представленного в группе, состоящей из аэрозоля, жидкости для обработки, спрея, миста, лосьона, крема, мази, геля, камеди, повязки, кожного пластыря, пластыря, для введения пациенту.