СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОБЪЕДИНЕННОГО ЛИЗАТА ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ОБЪЕДИНЕННЫЙ ЛИЗАТ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/19 A61P25/28 

Настоящее изобретение относится к способу получения нового объединенного лизата тромбоцитов человека, к объединенному лизату тромбоцитов человека как таковому и к его применению для лечения неврологических нарушений, таких как нейродегенеративные, нейровоспалительные нарушения, нарушения развития нервной системы и/или нейроваскулярные нарушения (т.е. инсульт), а также последствий церебральных повреждений (черепно-мозговой травмы, гипоксии).

Имеется настоятельная потребность в разработке эффективной «стратегии модификации болезни», обеспечивающей нейропротекцию, нейрорепарацию и нейрогенез для лечения нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС) и болезнь Альцгеймера (БА), с учетом огромных социальных и экономических последствий этих нарушений для пациентов и лиц, обеспечивающих уход.

Разработка эффективных способов лечения, обеспечивающих нейрорепарацию и нейрогенез для компенсации потери нейронов и последствий повреждений центральной нервной системы, таких как тяжелая гипоксия после родов или остановка сердца, или тяжелые черепно-мозговые травмы, также существенно необходима, учитывая отсутствие утвержденных методов лечения.

Существуют убедительные доказательства того, что нейротрофины, как активаторы и модуляторы нейрональных сигнальных путей, представляют собой логическую терапевтическую стратегию для неврологических нарушений¹. Применение отдельных рекомбинантных нейротрофических факторов роста дало обнадеживающие результаты для защиты и восстановления нейронов как на клеточных, так и на животных моделях.

Тромбоцитарный фактор роста-CC (PDGF-CC) оказался мощным нейропротективным фактором на нескольких животных моделях повреждения нейронов, тогда как PDGF-BB и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), введенные интрацеребровентрикулярным (ICV) путем, стимулировали нейрогенез². Кроме того, системное применение BDNF на фототромботической модели очагового инсульта позволило индуцировать нейрогенез и улучшить сенсомоторную функцию. Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) способствует развитию и выживанию дофаминергических нейронов и нейропротекции на животных моделях паркинсонизма, а также усиливает трофический эффект глиального нейротрофического фактора (GDNF) у гемипаркинсонических крыс³.

Доклинические исследования показали нейропротекцию с помощью основного фактора роста фибробластов (b-FGF) и фактора роста эндотелия сосудов-β (VEGF-β), а также стимуляцию нейропротекции и нейрорепарации с помощью GDNF⁴.

К сожалению, все рандомизированные клинические исследования, включающие ICV введение высоких доз отдельных факторов роста, не дали каких-либо существенных положительных клинических эффектов.

В настоящее время применение отдельных нейротрофинов при таких сложных и многогранных нейродегенеративных патологиях является недостаточным для получения значимых терапевтических результатов.

Таким образом, существует потребность в разработке нового подхода, объединяющего несколько рекомбинантных нейротрофинов, которые, вероятно, будут более мощными, но это является концептуальной задачей, в частности, для получения одобрения регулирующих органов, тем самым оправдывая более прагматические стратегии, основанные на других областях регенеративной медицины.

Концентраты тромбоцитов являются хорошо зарекомендовавшим себя терапевтическим продуктом, включенным в примерный перечень ВОЗ основных лекарственных средств, обычно используемых для профилактики и лечения кровотечений, возникающих в результате тромбоцитопении. Помимо своей роли в гемостазе, тромбоциты выполняют важные физиологические функции в заживлении ран и восстановлении тканей⁵.

Диапазон применения регенеративной медицины⁶ и клеточной терапии⁷, где оцениваются тромбоциты и лизаты тромбоцитов, расширяется. Терапевтическая польза тромбоцитов в заживлении тканей является многофакторной и обусловлена множеством биоактивных медиаторов, хранящихся в основном в α-гранулах и действующих синергетически. К ним относятся нейротрофические факторы роста, такие как изоформы PDGF (-AA, -AB и -BB), BDNF, VEGF, TGF-β, bFGF или фактор роста эпителия (EGF). Недавно было показано, что интракраниальная доставка лизатов тромбоцитов на животных моделях инсульта стимулирует пролиферацию эндогенных нервных стволовых клеток (eNSC) и ангиогенез в субвентрикулярной зоне и в зоне, близкой к поврежденной коре, что приводит к улучшению функциональных результатов и уменьшению повреждения, позволяя предположить нейропротективные эффекты⁸.

Документ US 2014/0176602 предлагает вирус-инактивированную биологическую смесь и ее приготовление. В частности, в этом документе описан способ приготовления экстракта тромбоцитов, безопасного в отношении вирусов, включающий следующие этапы: получение обогащенной тромбоцитами фракции более чем от одного донора, проведение сольвент-детергентной (С/Д) обработки с целью вирусной инактивации, обеспечение контакта материала, подвергнутого С/Д обработке, с нетоксичным амфифильным полимером, удаление С/Д и проведение по меньшей мере еще одной обработки материала ортогональной вирусной инактивацией. Ортогональная вирусная инактивация может представлять собой пастеризацию, которую проводят при 60°С в течение 10 часов в присутствии стабилизаторов, таких как сахароза и глицин.

Документ US 2012/0156306 описывает экстракт тромбоцитов, безопасный в отношении вирусов, причем указанный экстракт не является свертываемым. В частности, в этом документе описан способ получения экстракта тромбоцитов, безопасного в отношении вирусов, включающий по меньшей мере две обработки ортогональной вирусной инактивацией, например, обработку сольвент-детергентной вирусной инактивацией (С/Д) и тепловой инактивацией. Тепловая инактивация представляет собой пастеризацию, которую проводят при 60°С в течение 10 часов с целью уничтожения как вирусов с липидной оболочкой, так и без оболочки. К раствору добавляли сахарозу и глицин, которые служили стабилизаторами во время пастеризации.

В двух упомянутых выше документах полученные экстракты тромбоцитов, безопасные в отношении вирусов, имеют высокое содержание фибриногена благодаря присутствию стабилизаторов на стадии пастеризации. Действительно, из документа US 5116950 известно, что стабилизаторы, такие как сахароза или глицин, проявляют эффект высокой стабилизации фибриногена при нагревании жидкости. Таблица 1, в частности, показывает, что добавление сахарозы обеспечивает особенно выраженный стабилизирующий эффект.

Документ US 2016/0074481 относится к области производных тромбоцитов и, более конкретно, к области концентратов факторов роста, которые получают из тромбоцитов. В частности, раскрыт способ приготовления свертываемого концентрата факторов роста тромбоцитов. Под термином «свертываемый» подразумевается, что концентрат факторов роста тромбоцитов содержит как фибриноген, так и фактор свертывания крови XIII. В частности, концентрация фибриногена в свертываемом концентрате факторов роста тромбоцитов предпочтительно выше 1, более предпочтительно выше 1,5 и еще более предпочтительно выше 2,5 г/л концентрата.

Документ US 2013/0143810 касается экстрактов тромбоцитов человека, богатых факторами роста, для заживления ран и размножения стволовых клеток. Этот документ относится к вирус-инактивированному лизату тромбоцитов, содержащему факторы роста, обедненному PDGF и VEGF, который предпочтительно обогащен TGF, IGF и EGF. В Таблице 1 показано, что композиции концентрата тромбоцитов, подвергнутые С/Д обработке, после масляной экстракции (S/D-PC-O) и после обработки углем (S/D-PC-OC) показывают концентрацию фибриногена 4,5±0,3 мг/мл и 2,65±0,7 мг/мл, соответственно.

B. Copland et al. («The effect of platelet lysate fibrinogen on the functionality of MSCs in immunotherapy», Biomaterials 34 (2013) 7840-7850) исследовали обедненный по фибриногену лизат тромбоцитов в качестве продукта для размножения человеческих МСК для использования в иммуномодулирующей терапии. Фиг. 2с представляет собой сравнение содержания фибриногена в препаратах лизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном. В каждой серии, описанной B. Copland, содержание фибриногена составляет не менее 4 мг/мл.

В документе WO 2013/003356 описаны композиции, содержащие лизаты тромбоцитов, обедненные по фибриногену, причем указанные композиции используются в качестве среды для культивирования клеток. Истощение фибриногена из лизата тромбоцитов осуществляют с использованием гепарина и солей металлов. Кроме того, указанные композиции, обедненные фибриногеном, имеют концентрацию фибриногена около 2 или 4 мкг/мл.

Однако лизаты тромбоцитов содержат фибриноген, полученный из плазмы крови, белок, который играет ключевую роль при неврологических расстройствах как мощный индуктор воспаления и ингибитор роста нейритов⁹. Это может быть причиной, по которой пока не сообщалось о применении лизатов тромбоцитов в области нейродегенеративных нарушений у людей, таких как болезнь Паркинсона.

Изобретение основано на неожиданных данных о том, что при обработке объединенного лизата тромбоцитов человека (pHPL) в определенных условиях он способен усиливать лечение неврологических расстройств путем индукции улучшенного нейропротективного эффекта, а также восстановления нервных клеток.

Объединенный лизат тромбоцитов человека по изобретению представляет собой лизат тромбоцитов человека, полученный по меньшей мере из двух лизатов тромбоцитов от разных доноров. Предпочтительно объединенный лизат тромбоцитов человека получают по меньшей мере из 5, по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 20, по меньшей мере из 30, по меньшей мере из 50, по меньшей мере из 100, по меньшей мере из 140, по меньшей мере из 180, по меньшей мере из 200, и более конкретно, по меньшей мере из 240 различных лизатов тромбоцитов, собранных от разных доноров.

В частности, авторы изобретения обнаружили, что термическая обработка pHPL снижает общее содержание белка в лизате и способствует усилению нейропротективного и нейрорепаративного потенциала.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека, включающему стадии:

(а) обеспечения объединенного лизата тромбоцитов человека (pHPL);

(b) тепловой обработки объединенного лизата тромбоцитов человека при температуре от 55°С до 65°С в течение от 20 до 40 минут;

(с) очистки подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека со стадии (b).

Способ по изобретению приводит к получению подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека (HT_pHPL), имеющего содержание фибриногена менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1% и более предпочтительно менее 0,1% по массе от содержания фибриногена в необработанном pHPL. Концентрация фибриногена в подвергнутом тепловой обработке pHPL составляет менее 50 нг/мл, менее 40 нг/мл, менее 30 нг/мл, менее 20 нг/мл и более предпочтительно менее 15 нг/мл.

В частности, подвергнутый тепловой обработке pHPL не содержит фибриногена. Под выражением «не содержащий фибриногена» подразумевается, что концентрация фибриногена в HT_pHPL не превышает 15 нг/мл, в частности, не превышает 10 нг/мл и, более конкретно, не превышает 5 нг/мл.

Согласно изобретению, первая стадия процесса состоит в обеспечении объединенного лизата тромбоцитов человека (pHPL). Этот pHPL может быть получен в соответствии с хорошо известными способами из концентрата тромбоцитов (PC), который индуцирует высвобождение факторов роста и других активных молекул.

Например, pHPL может быть получен способом, включающим следующие стадии:

(i) обеспечения концентратов тромбоцитов;

(ii) раздельного лизиса каждого концентрата тромбоцитов со стадии (i); и

(iii) смешивания лизатов, полученных на стадии (ii), для получения объединенного лизата тромбоцитов человека.

Концентраты тромбоцитов, обеспеченные на стадии (i), могут быть получены от разных доноров и с помощью подходящих стандартных методов сбора из аллогенных источников тромбоцитов. В частности, концентрат тромбоцитов может быть получен из цельной крови с использованием методики лейкотромбоцитарного слоя или тромбоцитарно-обогащенной плазмы (PRP), или может быть собран методом афереза. Предпочтительно концентрат тромбоцитов получают из цельной крови с использованием технологии лейкотромбоцитарного слоя или (PRP)¹⁰.

В «способе PRP» обработанную антикоагулянтами цельную кровь центрифугируют с использованием мягкого центрифугирования в условиях, валидированных для отделения эритроцитов (RBC) от верхней половины, содержащей смесь тромбоцитов и плазмы, так называемого PRP. Затем тромбоциты концентрируют жестким центрифугированием с валидированными кривыми ускорения и замедления. Пакет с концентратом тромбоцитов выдерживают при комнатной температуре, а затем концентрат ресуспендируют в плазме. В способе «лейкотромбоцитарного слоя» обработанную антикоагулянтами цельную кровь центрифугируют с использованием жесткого центрифугирования с валидированными кривыми ускорения и замедления для разделения бесклеточной плазмы на верхнем слое, среднего слоя, называемого лейкоцитарным слоем (BC), и эритроцитов (RBC) в качестве нижнего слоя. Слой BC переносят в сателлитный пакет. Небольшое количество плазмы возвращают в слой BC и осторожно перемешивают, прежде чем снова подвергнуть мягкому центрифугированию с валидированными кривыми ускорения и замедления. Надосадочную жидкость PRP затем помещают в хранилище тромбоцитов и могут хранить при 22±2°C.

В способе афереза концентраты тромбоцитов могут быть получены с помощью экстракорпорального медицинского устройства, используемого для донорства крови, которое отделяет тромбоциты и возвращает донору другие порции крови.

Плазму, используемую для суспендирования концентрата в «способе PRP», плазму, возвращаемую в слой ВС в методе «лейкотромбоцитарного слоя», или плазму, собранную с тромбоцитами посредством афереза, можно заменить раствором для хранения тромбоцитов (PAS) или смесью плазмы и PAS, и предпочтительно смесью плазмы и PAS. Указанная смесь плазмы и PAS может содержать от 30 до 40 масс.% плазмы и от 70 до 60 масс.% PAS.

Концентрат тромбоцитов, обеспеченный на стадии (i), может быть подвергнут обработке с удалением лейкоцитов. Эта обработка приводит к истощению лейкоцитов, и это может быть достигнуто путем фильтрации на фильтре для удаления лейкоцитов или во время сбора тромбоцитов путем афереза.

Концентрат тромбоцитов, обеспеченный на стадии (i), может быть подвергнут этапу обработки с инактивацией вирусов/патогенов перед лизисом. Обработка с инактивацией вирусов/патогенов, применяемая к концентрату тромбоцитов, может быть выбрана из системы Intercept®Blood (от Cerus Corporation), системы Mirasol® PRT (от Terumo BCT), или THERAFLEX-UV (от Macopharma). Эти процедуры хорошо известны специалисту в данной области техники и нацелены, с добавлением или без добавления фотоактивирующего агента, на повреждение нуклеиновых кислот.

В одном варианте осуществления концентрат тромбоцитов подвергают обработке для истощения лейкоцитов и обработке с целью инактивации вирусов/патогенов. Предпочтительно обработку с целью истощения лейкоцитов проводят до обработки с целью инактивации вирусов/патогенов.

Стадия (ii) раздельного лизиса каждого концентрата тромбоцитов может быть выполнена любым способом, известным в данной области техники. Например, лизис тромбоцитов может быть достигнут одним или несколькими циклами замораживания/ размораживания, активацией тромбоцитов, вызванной добавлением тромбина или CaCl₂, обработкой ультразвуком или сольвент-детергентной обработкой (С/Д). Предпочтительно стадию (ii) лизиса концентратов тромбоцитов осуществляют одним или несколькими циклами замораживания/ размораживания, а более предпочтительно по меньшей мере тремя циклами. Когда лизис достигается одним из предшествующих способов, стадия центрифугирования и фильтрации также может быть выполнена для удаления клеточного детрита.

Затем стадия (iii) состоит в смешивании лизатов с целью получения пула HPL, также называемого pHPL. Таким образом, пул HPL получают путем смешивания лизированных концентратов тромбоцитов по меньшей мере от 2 лизатов тромбоцитов от разных доноров. Предпочтительно пул HPL получают путем смешивания по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 140, по меньшей мере 180, по меньшей мере 200, и более конкретно, по меньшей мере 240 различных лизатов тромбоцитов, собранных от разных доноров.

Подходящий объединенный лизат тромбоцитов человека (pHPL) для способа по изобретению может представлять собой любой объединенный лизат тромбоцитов человека из учреждений крови или от коммерческих поставщиков. Например, объединенный лизат тромбоцитов человека может быть получен от Macopharma (Туркуэн, Франция; MultiPL'30® лизат тромбоцитов человека), от Cook-Regentec (Индианаполис, США; Stemulate® лизат тромбоцитов человека) от Stemcell Technologies (Гренобль, Франция; лизат тромбоцитов человека) или также от Sigma-Aldrich (PLTMax® лизат тромбоцитов человека).

Вторая стадия способа по изобретению состоит в тепловой обработке pHPL. Эту стадию предпочтительно выполняют без добавления стабилизаторов, которые классически используются для поддержания биологической активности белков. Такими стабилизаторами являются, например, сахароза, сорбитол, маннитол или аминокислоты, такие как аргинин или лизин. Тепловую обработку предпочтительно можно проводить при температуре от 50°С до 70°С, предпочтительно от 52°С до 60°С, и более предпочтительно при температуре около 56°С. Наиболее многообещающие результаты с точки зрения воспроизводимости нейропротекции и нейрорепарации действительно были получены для pHPL, обработанного при температуре около 56°C.

В предпочтительном варианте осуществления продолжительность тепловой обработки составляет от около 20 до 40 минут, предпочтительно около 30 минут.

Кроме того, после тепловой обработки pHPL может быть охлажден в течение по меньшей мере 5 минут, предпочтительно до температуры примерно от 2°С до 5°C, перед стадией очистки (с).

Предпочтительно подвергнутый тепловой обработке pHPL, обеспеченный на стадии (а), может быть подвергнут перед стадией (b) обработке, которая вызывает активацию каскада коагуляции. Например, подвергнутый тепловой обработке pHPL может быть смешан со стеклянными шариками (GB) и CaCl₂ при перемешивании или с использованием только CaCl₂. Эта обработка приводит к образованию сгустка, который удаляют после центрифугирования, и, таким образом, полученный pHPL не содержит фибриногена. Не углубляясь в какую-либо теорию, авторы изобретения полагают, что такая обработка способствует снижению токсичности и улучшению нейропротективного эффекта pHPL согласно изобретению.

Третья стадия способа по изобретению состоит в очистке подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека. Эта стадия очистки может быть осуществлена любым способом, известным в данной области техники, таким как, например, центрифугирование или фильтрация.

Центрифугирование может быть предпочтительно проведено при температуре примерно от 2°С до 6°С, например, в течение по меньшей мере 10 минут при 9000 g - 11000 g.

Когда используют фильтрацию, подвергнутый тепловой обработке pHPL предпочтительно пропускают через фильтр, имеющий размер пор от 5 мкм до 0,2 мкм, предпочтительно через ряд из двух или более последовательных фильтров, имеющих уменьшающиеся размеры пор с соответствующим размером пор от 5 мкм до 0,2 мкм.

Предпочтительно очистку подвергнутого тепловой обработке лизата pHPL на стадии (с) проводят центрифугированием. Не желая углубляться в какую-либо теорию, авторы изобретения полагают, что центрифугирование при низких температурах, как описано выше, может способствовать дальнейшему удалению нерастворимых в холодной среде компонентов, таких как фибриноген, которые выпадают в осадок.

Способ по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию замораживания и хранения подвергнутого тепловой обработке pHPL, полученного на стадии (с), в диапазоне температур от -20°С до -85°С, предпочтительно от -25°С до -50°С, и более предпочтительно около -30°С. Альтернативно, подвергнутый тепловой обработке pHPL может быть лиофилизирован перед хранением.

В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению дополнительно включает после стадии (b) и перед необязательным замораживанием или лиофилизацией стадию вирусной инактивации или удаления вирусов и/или удаления прионов. Подходящие способы инактивации вирусов или удаления вирусов включают сольвент-детергентную обработку (С/Д обработку), обработку только детергентом, пастеризацию, обработку паром или пропаривание, УФ-обработку, гамма-облучение, обработку низким рН, обработку каприловой кислотой и нанофильтрацию, но не ограничиваются ими. Например, С/Д обработка может быть проведена с использованием 1% трибутилфосфата и 1% Тритона Х-100 при 31°С в течение 1 часа. Пастеризационная обработка может быть выполнена путем тепловой обработки при 60°C в течение 10 часов в присутствии стабилизаторов. Нанофильтрация может быть выполнена с использованием специальных вирусных фильтров 15, 20 или 35 нм или эквивалентных фильтров для удаления патогенов, известных в данной области техники.

Таким образом, в этом варианте осуществления полученный подвергнутый тепловой обработке pHPL является вирусологически безопасным. Термин «инактивация вирусов» относится к ситуации, когда вирусы сохраняются в лизате тромбоцитов человека, но становятся нежизнеспособными, например, путем растворения липидной оболочки или путем разрушения структуры их вириона. Термин «удаление вируса» относится к ситуации, когда вирусы, которые имеют жесткие структуры большого размера, удаляются из лизата тромбоцитов человека путем удерживания на нанофильтре, в то время как компоненты лизата тромбоцитов человека проходят через такой фильтр для удаления вируса и извлекаются для дальнейшей обработки.

Предпочтительно способ по изобретению пригоден для промышленного производства большого количества стандартизированного подвергнутого тепловой обработке pHPL (HT_pHPL). Действительно, используя объединенный лизат тромбоцитов человека в качестве исходного материала, в частности, pHPL от промышленных поставщиков, этот способ позволяет получить HT_pHPL, который обеспечивает высокий уровень стандартизации и однородности, а также соответствует принципам GMP. Таким образом, полученный HT_pHPL может быть стандартизирован, что особенно выгодно, когда HT_pHPL предназначен для использования в биотерапии, в частности, посредством введения в головной мозг.

К удивлению и неожиданно, способ по изобретению приводит к получению подвергнутого тепловой обработке pHPL, который обеспечивает улучшенную нейропротекцию по сравнению с необработанным pHPL. Анализы in vitro показали, что pHPL, полученный согласно изобретению, защищает дофаминергические клетки от гибели, вызванной нейротоксинами, и без индукции морфологического изменения. Не желая углубляться в какую-либо теорию, авторы изобретения полагают, что улучшенная нейропротективная активность HT_pHPL по изобретению является результатом пониженного содержания в нем общего белка, такого как содержание фибриногена. Действительно, считается, что тепловая обработка при температуре от 50°С до 70°С вызывает осаждение белков, что приводит к снижению белка после стадии (с), при которой, как полагают, осажденные белки удаляются, до общего содержания белка в HT_pHPL согласно изобретению, значительно ниже, чем в исходном pHPL.

В частности, также считается, что тепловая обработка приводит к значительному снижению или истощению фибриногена и протеолитических ферментов, таких как тромбин или тромбиноподобные или тромбин-генерирующие факторы свертывания крови в pHPL, и что стадия тепловой обработки осаждает и/или инактивирует потенциально токсичные, нестабильные при нагревании белки, и благоприятно изменяет баланс белков и факторов роста в pHPL. Таким образом, подвергнутый тепловой обработке pHPL, в отличие от необработанного pHPL, позволяет избежать биологического риска образования фибрина, который является токсичным для мозга. Поэтому полученный подвергнутый тепловой обработке pHPL по изобретению обеспечивает существенно более высокий запас прочности, чем стандартные лизаты тромбоцитов человека, суспендированные в плазме. Таким образом, подвергнутый тепловой обработке pHPL по изобретению является более подходящим и более эффективным для использования в биотерапии, особенно посредством введения в головной мозг.

Как указано выше, подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека (HT_pHPL) по изобретению обеспечивает улучшенную нейропротективную и нейрорепаративную активность.

Во втором аспекте изобретение относится к подвергнутому тепловой обработке объединенному лизату тромбоцитов человека (HT_pHPL), имеющему содержание фибриногена менее 5 масс.%, менее 4 масс.%, менее 3 масс.%, менее 2 масс.%, менее 1 масс.% и более предпочтительно менее 0,1 масс.% от содержания фибриногена в необработанном pHPL. Концентрация фибриногена в подвергнутом тепловой обработке pHPL составляет менее 50 нг/мл, менее 40 нг/мл, менее 30 нг/мл, менее 20 нг/мл и более предпочтительно менее 15 нг/мл. Как показано в разделе примеров, подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека по изобретению является нейропротективным.

В частности, подвергнутый тепловой обработке pHPL не содержит фибриногена. Под выражением «не содержащий фибриногена» подразумевается, что концентрация фибриногена в HT_pHPL не превышает 15 нг/мл, в частности, не превышает 10 нг/мл и, в частности, не превышает 5 нг/мл. pHPL согласно изобретению может быть получен способом, описанным выше.

В третьем аспекте изобретение относится к подвергнутому тепловой обработке объединенному лизату тромбоцитов человека в соответствии с изобретением для применения в качестве биологического лекарственного средства или «биотерапии».

Действительно, благодаря своей улучшенной нейропротективной активности и более высокой безопасности объединенный лизат тромбоцитов человека может использоваться для лечения и/или профилактики неврологического нарушения и предпочтительно нейродегенеративного нарушения. Таким образом, подвергнутые тепловой обработке объединенные лизаты тромбоцитов человека проявляют сильную нейропротективную активность и особенно полезны для лечения нарушения, при котором наблюдается потеря нейронов.

Другими словами, изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики неврологических нарушений, включающему введение терапевтически эффективного количества подвергнутого тепловой обработке объединенного pHPL по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом. Предпочтительно пациент является теплокровным животным, более предпочтительно человеком.

Неврологические нарушения в настоящем изобретении включают нейродегенеративные нарушения, нейроваскулярные нарушения, нейровоспалительные нарушения, нарушения развития нервной ткани, такие как аутизм, повреждение головного мозга, такое как тяжелая гипоксия после родов или остановки сердца, или тяжелая черепно-мозговая травма/ травматическое повреждение головного мозга, то есть так называемые тяжелые повреждения, приводящие к значительной потере нейронов, что приводит к инвалидности; но не ограничиваются ими.

Нейродегенеративные нарушения в настоящем изобретении включают рассеянный склероз (РС), болезнь Паркинсона (БП), болезнь Хантингтона (БХ), боковой амиотрофический склероз (БАС), инсульт, возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), дегенеративные заболевания сетчатки и деменцию, включающую болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, лобно-височную деменцию, семантическую деменцию и деменцию с тельцами Леви, но не ограничиваются ими. Предпочтительными нейродегенеративными заболеваниями являются рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз.

В предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное нарушение выбрано из болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза и болезни Альцгеймера. В особо предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное нарушение представляет собой болезнь Паркинсона. В другом предпочтительном варианте осуществления нейродегенеративное нарушение представляет собой боковой амиотрофический склероз.

Другими предпочтительными неврологическими нарушениями являются повреждения центральной нервной системы, такие как тяжелая гипоксия после родов или остановка сердца, или тяжелая черепно-мозговая травма, то есть серьезные повреждения, вызывающие значительную потерю нейронов, приводящую к инвалидности. Раннее лечение с использованием подвергнутого тепловой обработке pHPL после повреждения может улучшить способность к физиологической нейрорепарации и нейрогенезу.

Подвергнутой тепловой обработке pHPL может быть введен как таковой, заключен в природные или синтетические наночастицы¹¹ или микрочастицы, или заключен в фармацевтический раствор, дополнительно содержащий по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель и/или адъювант. Фармацевтический раствор может дополнительно содержать комплексы, молекулы, пептиды, соли, векторы или любое другое соединение, которое позволяет улучшать состояние или может быть полезным при лечении неврологических нарушений.

Путь введения и режим дозирования, естественно, зависят от тяжести заболевания, возраста, массы тела и пола пациента и т.д.

Подвергнутый тепловой обработке pHPL по изобретению можно использовать для лечения любого пациента, особенно теплокровного животного, такого как млекопитающее и предпочтительно человек.

Предпочтительно подвергнутый тепловой обработке pHPL по изобретению пригоден для введения в головной мозг. В частности, указанный подвергнутый тепловой обработке pHPL адаптирован для интратекального (например, для бокового амиотрофического склероза, который представляет собой патологию спинного мозга) или интрацеребровентрикулярного (ICV) введения, например, в правый боковой желудочек, предпочтительно близко к межжелудочковому отверстию, так чтобы подвергнутый тепловой обработке pHPL можно было вводить в третий желудочек. Введение в мозг может быть достигнуто способами, известными в данной области техники. Например, введение в головной мозг может быть осуществлено с помощью системы доставки лекарств, такой как программируемый насос для лекарств.

Применение подвергнутого тепловой обработке pHPL по изобретению также может быть выполнено любым другим способом, известным специалисту в данной области техники, таким как, например, интраназальное, внутримышечное или внутриглазное введение, или перфузия или инфузия органа (то есть прямая инфузия части ткани мозга).

Доза препарата, используемая для введения, может быть адаптирована в зависимости от различных параметров и, в частности, в зависимости от используемого способа введения, соответствующей патологии или необходимой продолжительности лечения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Приведенные ниже определения и пояснения относятся к терминам, используемым во всей заявке, включая описание и формулу изобретения.

Под «нейропротективной активностью» или «нейропротекцией» подразумевается сохранение нейрональной структуры и/или функции нейрональных клеток, пораженных нейротоксином, по сравнению с нейрональными клетками, на которые не влияет нейротоксин. Нейропротекция направлена на предотвращение или замедление прогрессирования заболевания и вторичных повреждений путем остановки или по меньшей мере замедления потери нейронов. Например, это относится к сохранению числа нейронов в стриатуме и/или в компактной части черной субстанции пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, по сравнению с пациентами, которые не страдают болезнью Паркинсона.

Под нейрорепарацией понимается компенсация существующих изменений и стимуляция структурного и функционального восстановления поврежденной нервной активности.

Термин «пациент» относится к теплокровному животному, более предпочтительно человеку, который ожидает или получает медицинскую помощь или является, или будет объектом медицинской процедуры.

Термин «человек» относится к субъектам обоих полов и на любой стадии развития (т.е. новорожденный, младенец, ребенок, подросток, взрослый). В одном варианте осуществления человек является подростком или взрослым, предпочтительно взрослым.

Используемые в настоящей заявке термины «лечить», «леченный» и «лечение» подразумевают облегчение или устранение состояния или заболевания, и/или сопутствующих ему симптомов.

Термины «предотвращать», «предотвращающий» и «предотвращение», используемые в данном документе, относятся к способу задержки или предотвращения возникновения состояния или заболевания и/или сопутствующих ему симптомов, профилактику развития у пациента состояния или заболевания, или снижение риска возникновения состояния или заболевания у пациента.

Термин «терапевтически эффективное количество» (или, более просто, «эффективное количество») в контексте настоящего описания обозначает количество подвергнутого тепловой обработке pHPL по изобретению, которое является достаточным для достижения необходимого терапевтического или профилактического эффекта у индивидуума, у которого его применяют.

Термин «применение» или его вариант (например, «введение») означает предоставление подвергнутого тепловой обработке pHPL по изобретению, отдельно или в виде части фармацевтически приемлемого раствора, пациенту, у которого нужно лечить или предотвращать состояние, симптом или расстройство.

Настоящее изобретение будет лучше понято со ссылкой на следующие примеры и фигуры. Эти примеры предназначены для представления конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Фигуры

Фигура 1. Морфологическое наблюдение обработанных клеток LUHMES. Примерные снимки клеток LUHMES (x10) после обработки pHPL, HT_pHPL и HT_pHPL-GB без эрастина (левая колонка) или с воздействием эрастина (правая колонка).

pHPL: объединенный лизат тромбоцитов человека.

HT_pHPL: подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека.

HT_pHPL-GB: подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека после обработки стеклянными шариками и CaCl₂.

Фигура 2. Проточная цитометрия. Жизнеспособность, измеренная анализом с применением пропидия йодида и нормализованная по отношению к контролю (необработанные клетки) ± стандартная ошибка среднего (SEM) (n = 4).

Фигура 3. Анализ с резазурином. Жизнеспособность измеряли анализом с резазурином и нормализовали по отношению к контролю (необработанные клетки) ± SEM (n = 3).

Фигура 4. Изменение массы тела самок и самцов мышей, получавших рилузол. Самцы WT: самцы дикого типа, самцы Tg: самцы FVB-Tg(Sod1* G86R), самки WT: самки дикого типа, самки Tg: самки FVB-Tg(Sod1*G86R).

Фигура 5. Изменение массы тела самцов мышей, получавших контрольный раствор и HT_pHPL. Veh: контрольный раствор; самцы WT: самцы дикого типа; самцы Tg: самцы FVB-Tg (Sod1*G86R); HT_pHPL: подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека.

Фигура 6. Кривая выживания самцов мышей, получавших контрольный раствор, рилузол и HT_pHPL. Veh: контрольный раствор; самцы Tg: самцы FVB-Tg(Sod1*G86R); HT_pHPL: подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека.

Примеры

Материалы и методы

1. Приготовление лизата тромбоцитов

pHPL: объединенный лизат тромбоцитов человека получали от Macopharma (Туркуэн, Франция) под названием MultiPL’30® Лизат тромбоцитов человека, справочный номер BC0190020.

HT_pHPL: pHPL подвергали тепловой обработке при 56°C в течение 30 минут и очищали центрифугированием (15 минут, 10000 g, 4°C).

HT_pHPL-GB: pHPL смешивали со стеклянными шариками 0,5 г/л (BEAD-002-1 кг диаметром 2 мм от Labbox) и CaCl₂ (конечная концентрация 30 мкг/мл и 23 мМ; C4901 безводный порошок хлорида кальция от Sigma-Aldrich) при перемешивании в течение 1 часа.

В течение 30 минут это приводило к образованию сгустка, который удаляли после центрифугирования (6000 g, 30 минут, 22°С). Надосадочную жидкость нагревали при 56°С в течение 30 минут и центрифугировали перед разделением на аликвоты, и хранили при -80°С для дальнейшего использования.

2. Поддержка и дифференцировка клеток LUHMES.

Клетки LUHMES были получены из лаборатории доктора Шольца (Констанцский университет, Германия) и культивированы, как описано¹².

Вкратце, недифференцированные клетки LUHMES размножали с использованием пластиковых флаконов для культивирования клеток Nunclon™ (Nunc, Роскилле, Дания) и многолуночных планшетов, которые были предварительно покрыты 50 мкг/мл поли-L-орнитина и 1 мкг/мл фибронектина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в дистиллированной воде в течение 3 ч при 37°С. После удаления раствора для нанесения покрытия культуральные флаконы промывали стерильной дистиллированной водой и сушили на воздухе.

Клетки выращивали при 37°С в увлажненной атмосфере 95% воздуха, 5% CO₂. Средой для пролиферации была среда Дульбекко в модификации Игла (Advanced DMEM)/F12, содержащая добавку 1×N-2 (Invitrogen, Карлсруэ, Германия), 2 мМ L-глутамина (Gibco, Роквилл, Мэриленд, США) и 40 нг/мл рекомбинантного bFGF (R&D Systems). При достижении приблизительно 80% слияния клетки диссоциировали с помощью 0,025% раствора трипсина (Gibco, Rockville, Мэриленд, США) и пассировали по 3×10⁶ клеток/флакон.

Для индукции дифференцировки в нейрональные клетки, 2×10⁶ LUHMES высевали и выращивали в колбе T75 в среде для пролиферации в течение 48 часов, затем в Advanced DMEM/F12, содержащей добавку 1×N-2, 2 мМ L-глутамина (Gibco), 1 мМ дибутирил-цАМФ (Sigma-Aldrich), 1 мкг/мл тетрациклина (Sigma-Aldrich) и 2 нг/мл рекомбинантного человеческого GDNF (R&D Systems). После двух дней культивирования в условиях дифференцировки LUHMES культивировали на 24-луночном планшете для дальнейших экспериментов на шестой день.

3. Оценка токсичности и защитной способности в отношении дофаминергических нейронов для различных лизатов тромбоцитов (PL).

Токсичность и защитную способность трех лизатов тромбоцитов (pHPL, HT_pHPL, HT_pHPL-GB) оценивали на линии дофаминергических клеток, называемой LUHMES (после 6 дней дифференцировки).

В нейропротективных исследованиях различные PL были проанализированы на противодействие гибели клеток, вызванной эрастином, (т.е. очень мощным индуктором гибели клеток в дофаминергических нейронах).

LUHMES дифференцировали в течение 6 дней и добавляли разные PL (при 5 об.%) в среду за 1 час до обработки эрастином.

В каждом исследовании жизнеспособность оценивали проточной цитометрией (с пропидием йодидом) в 24 лунках или посредством анализа с резазурином в 96-луночном планшете через 7 дней дифференцировки (через 24 часа после обработки PL).

- Анализ проточной цитометрией

Эксперименты проводили для количественной оценки токсичности и нейропротективной способности различных PL путем включения пропидия йодида. LUHMES культивировали в 24-луночном планшете.

Проточный цитометр, используемый для экспериментов, представляет собой модель CyAn™ с лазером 488 нм (Beckman Coulter).

- Анализ с применением резазурина.

Для подтверждения результатов, полученных методом проточной цитометрии, жизнеспособность LUHMES также измеряли колориметрическим тестом, анализом с применением резазурина (выполненным в 96-луночном планшете). Анализ проводили непосредственно на культуре клеток, без трипсинизации (и сбора клеток), что представляется интересным в свете экспериментов, проведенных с проточным цитометром.

4. Измерение pH

Для измерения pH в различных лизатах тромбоцитов использовали тест-полоски pH от Macherey-Nagel (pH Fix 6,0-10,0, ссылка 921 22).

5. Дозировка фибриногена

Концентрацию фибриногена измеряли в различных концентратах тромбоцитов (pHPL, HT_pHPL и HT_pHPL-GB) с помощью ELISA (R&D Systems). Для каждого концентрата тромбоцитов измерения проводили в двух экземплярах. Концентрации выражали в нг/мл.

6. Статистический анализ

Результаты выражали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ был выполнен с использованием одностороннего ANOVA после проверки нормального распределения данных. Непараметрические тексты Уилкоксона и Краскела-Уоллиса выполняли в случае ненормального распределения. Значение р <0,05 считали статистически значимым.

Результаты

Морфологическое наблюдение обработанных клеток LUHMES

Как показано на фигуре 1, без воздействия эрастина в контроле наблюдалась типичная форма клеток LUHMES на 7 день дифференцировки. Важные изменения в клеточной морфологии были отмечены в присутствии pHPL, HT_pHPL, со склонностью к «кластеризации» клеток. Этот аспект не наблюдался при использовании HT_pHPL-GB.

Под воздействием эрастина типичная форма отмирающих клеток наблюдалась только без какой-либо обработки лизатами тромбоцитов. Похоже, это указывает на то, что HT_pHPL и HT_pHPL-GB были способны к нейропротекции. Кластерные клетки все еще появлялись в присутствии pHPL, но не наблюдались, когда клетки обрабатывали лизатами тромбоцитов, подвергнутыми GB и термообработке. Не желая углубляться в какую-либо теорию, авторы изобретения считают, что она подтверждает возможную отрицательную роль присутствия фибриногена в pHPL в образовании этих кластеров.

Проточная цитометрия

Добавление pHPL вызывало явное желирование среды. Это не наблюдалось с другими препаратами лизатов. Кроме того, анализ методом проточной цитометрии требует получения разделенных клеток (путем трипсинизации). Эту стадию было очень трудно обеспечить, когда клетки обрабатывали pHPL. Тем не менее, исследования жизнеспособности были возможны при всех видах обработки (фигура 2).

Ни один лизат не обладал токсическим эффектом. Только один pHPL немного снижал жизнеспособность (≈85%) по сравнению с контролем и другими препаратами. Но это может быть связано с трудностью разделения клеток.

Эрастин эффективно лизировал контрольные клетки, но гибель клеток не наблюдалась, когда клетки LUHMES обрабатывали HT_pHPL и HT_pHPL-GB. Поэтому мы пришли к выводу, что объединенный лизат тромбоцитов человека в соответствии с изобретением проявляет сильную защитную способность на клетках LUHMES.

Анализ с резазурином

Прежде всего, значения жизнеспособности клеток, представленные без воздействия эрастина, подтвердили, что термически обработанный объединенный лизат тромбоцитов человека по изобретению кажется безвредным для клеток LUHMES.

Результаты с pHPL, вероятно, являются артефактом в эксперименте. Фактически, желирование среды (вероятно, из-за фибриногена, присутствующего в pHPL), по-видимому, ингибирует смешивание резазурина со средой, предотвращая проникновение резазурина в клетки и, таким образом, приводит к отсутствию обнаружения (потеря жизнеспособности приблизительно 15% не соответствует микроскопическим наблюдениям, показывающим, что почти все клетки в этих лунках демонстрировали ожидаемую морфологию живых клеток).

Эрастин эффективно лизировал клетки LUHMES при двух испытанных дозах, и подвергнутый тепловой обработке лизат тромбоцитов человека был способен предотвращать его токсический эффект (опять же наблюдается проблема поглощения резазурина клетками в результате обработки pHPL).

Содержание фибриногена

Результаты определения концентрации фибриногена для каждого концентрата тромбоцитов представлены в таблице 1 ниже:

Таблица 1

Концентрация (нг/мл) pHPL 503810 HT_ pHPL 14 HT_ pHPL-GB 11

Результаты показывают, что стадия тепловой обработки в соответствии с изобретением приводит к резкому снижению концентрации фибриногена в pHPL. Действительно, более 99,9% фибриногена было удалено. По крайней мере, комбинация двух обработок способна снизить концентрацию фибриногена в pHPL больше, чем одна стадия тепловой обработки.

Таким образом, на стадии тепловой обработки полученный подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека, в отличие от pHPL, можно считать свободным от фибриногена. Поскольку подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека предназначен для применения в головном мозге, эта характеристика является особенно выгодной, поскольку спинномозговая жидкость содержит менее 1 мг/мл белка. Таким образом, чем меньше концентрация фибриногена в pHPL, тем лучше для предотвращения перегрузки белка.

Значение рН среды

Полоски дали следующие результаты:

- pH от 7 до 7,3 для pHPL,

- pH 7 для HT_ pHPL, и

- рН 6 для HT_pHPL-GB.

Снижение pH в HT_pHPL-GB может быть связано с CaCl₂, использованным в протоколе.

Однако никакого изменения рН среды после обработки лизатами тромбоцитов (показанного индикатором феноловым красным) не наблюдалось.

Токсичность и защитная способность для дофаминергических нейронов

Эти результаты показывают, во-первых, что подвергнутые тепловой обработке объединенные лизаты тромбоцитов человека (HT_ pHPL и HT_pHPL-GB) не вызывают токсичности в клетках LUHMES.

Более того, когда клетки обрабатывали эрастином, HT_pHPL и HT_pHPL-GB в соответствии с изобретением защищали клетки от гибели путем ферроптоза. Этот результат был подтвержден двумя различными анализами.

Вместе эти результаты показывают, что HT_pHPL и HT_pHPL-GB являются очень хорошими препаратами, которые защищают дофаминергические клетки от гибели, вызванной мощным нейротоксином и не индуцируют морфологической модификации. Кроме того, подвергнутый тепловой обработке pHPL предназначен для использования в биотерапии, особенно посредством применения в головном мозге. Таким образом, тот факт, что подвергнутый тепловой обработке pHPL не содержит фибриногена, а также протеолитических ферментов, демонстрирует потенциал тепловой обработки pHPL для этой цели.

ПРИМЕР 2. Эксперимент in vivo

Этот эксперимент in vivo проводили для демонстрации нейропротективного эффекта подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека в соответствии с изобретением. Эффект сравнивали с эффектом, полученным с препаратом рилузолом, т.е. единственным известным эффективным средством лечения БАС.

Все эксперименты проводили в соответствии с «Принципами ухода за лабораторными животными» (публикация NIH 86-23, пересмотренная в 1985) и действующей законодательной и нормативной базой Франции и Европейского союза в области экспериментов на животных (Директива Совета европейских сообществ 86/609).

В исследование были включены мыши FVB-Tg(Sod1*G86R)M1Jwg/J из лабораторий JAX. Животных содержали в группах (по 10 на клетку) в помещении с контролируемой температурой (22±2°С) с 12/12-часовым циклом свет/темнота. Корм и воду обеспечивали без ограничения. После поступления у животных был 7-дневный период привыкания без проведения экспериментальных процедур. Разведение было осуществлено (с мая 2013) в учреждении SOPF, и генотипирование осуществляли с помощью кПЦР (из биопсии хвоста). Животные идентифицировали с применением клипс.

Материалы и методы

Периодическая интрацеребровентрикулярная инъекция и применение рилузола

Мышей обрабатывали и взвешивали в возрасте 60 дней. Интрацеребровентрикулярную (ICV) имплантацию канюли с помощью стереотаксии начинали с этой даты, и мышей акклиматизировали в течение 1 недели.

Препарат рилузол смешивали с определенным рационом и готовили в виде гранул. Рилузол применяли перорально (Gurney and al., Neurology, 1998). Затем проводили оценку два раза в неделю (массы тела и показателей нервной системы) от возраста 67 дней до смерти.

Лечение самцов SOD1m-FVB и WT-FVB:

Два различных вида лечения выполняли от 75 дня до смерти.

- HT_pHPL, приготовленный, как описано в примере 1, и при 1 г/л, pH 7,4 по сравнению с контрольным раствором. Доза HT_pHPL, вводимая периодически интрацеребровентрикулярно, составляла 4 мкл три раза в неделю со скоростью 0,5 мкл/мин. Время введения — 8 мин.

- Препарат рилузол вводили перорально в дозе 44 мг/ кг/сутки.

Экспериментальные группы

Самцы WT-FVB + контрольный раствор самки WT-FVB + Рилузол

Самцы WT-FVB + HT_pHPL самки SOD1m -FVB + Рилузол

Самцы WT-FVB + Рилузол

Самцы SOD1m-FVB + контрольный раствор

Самцы SOD1m-FVB + HT_pHPL

Самцы SOD1m-FVB + Рилузол

Результаты

1. Масса тела при использовании рилузола

Как показано на фигуре 4, ограниченное потребление пищи не влияло на изменение массы тела у мышей дикого типа. У мышей Tg мы можем наблюдать снижение массы тела в день 88 для самцов и самок.

2. Масса тела при использовании HT_pHPL

Как показано на фигуре 5, лечение HT_pHPL не оказывало эффекта у самцов дикого типа. Снижение массы тела наблюдалось в день 88 у мышей Tg, получавших HT_pHPL, указанное лечение также вызывало существенную задержку массы тела перед смертью у самцов со дня 124.

3. Кривая выживания

Как показано на фигуре 6, препарат рилузол оказывает влияние на время смерти у самцов Tg (с 91 по 102 день), но не влияет на продолжительность выживания.

В соответствии с задержкой предсмертной массы тела, лечение HT_pHPL отсрочило наступление смерти до 14 дней (со дня 91 до дня 105) и увеличило продолжительность выживания до 48 дней для самцов Tg (от дня 123 до дня 171).

В заключение, эксперименты in vivo демонстрируют, что подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека в соответствии с изобретением проявляет нейропротективный эффект. Эти результаты, полученные при боковом амиотрофическом склерозе, могут быть применены к другим нарушениям, при которых также наблюдается потеря нейронов.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу получения подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека, подвергнутому тепловой обработке объединенному лизату тромбоцитов человека, а также применению подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека для лечения бокового амиотрофического склероза. Способ получения подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека, включающий следующие стадии: (а) обеспечение объединенного лизата тромбоцитов человека (pHPL), (b) тепловая обработка объединенного лизата тромбоцитов человека при температуре от 56°С в течение 30 минут, (с) очистка центрифугированием при температуре 4°С в течение 15 минут при 10000g, который включает после стадии (b) стадию инактивации вирусов или удаления вирусов, выполненную путем сольвент-детергентной обработки (С/Д обработки), обработки только детергентом, пастеризации, обработки паром или пропаривания, обработки низким pH, обработки каприловой кислотой и нанофильтрации. Подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека, полученный вышеуказанным способом, для усиления лечения бокового амиотрофического склероза (БАС) путем индукции улучшенного нейропротективного эффекта, а также восстановления нервных клеток, имеющий содержание фибриногена менее 5 мас.% от содержания фибриногена в необработанном pHPL и имеющий содержание фибриногена менее 50 нг/мл. Применение подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека, вышеуказанного или полученного вышеуказанным способом, для лечения бокового амиотрофического склероза (БАС). Вышеуказанная группа изобретений позволяет получить объединенный лизат тромбоцитов человека, способный усиливать лечение неврологических расстройств путем индукции улучшенного нейропротективного эффекта, а также восстановления нервных клеток. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека, включающий следующие стадии:

(а) обеспечение объединенного лизата тромбоцитов человека (pHPL),

(b) тепловая обработка объединенного лизата тромбоцитов человека при температуре от 56°С в течение 30 минут,

(с) очистка центрифугированием при температуре 4°С в течение 15 минут при 10000g,

который включает после стадии (b) стадию инактивации вирусов или удаления вирусов, выполненную путем сольвент-детергентной обработки (С/Д обработки), обработки только детергентом, пастеризации, обработки паром или пропаривания, обработки низким pH, обработки каприловой кислотой и нанофильтрации.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий перед стадией (b) тепловой обработки стадию обработки, индуцирующей активацию каскада коагуляции.

3. Способ по п.1 или 2, в котором объединенный лизат тромбоцитов человека получают по меньшей мере из двух разных лизатов тромбоцитов, собранных от разных доноров.

4. Способ по п.3, в котором объединенный лизат тромбоцитов человека получают по меньшей мере из 5, по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 20, по меньшей мере из 30, по меньшей мере из 40, по меньшей мере из 50, по меньшей мере из 100, по меньшей мере из 140, по меньшей мере из 180, по меньшей мере из 200 или по меньшей мере из 240 различных лизатов тромбоцитов, собранных от разных доноров.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором объединенный лизат тромбоцитов человека (pHPL), полученный на стадии (а), получают способом, включающим следующие стадии:

(i) обеспечение концентратов тромбоцитов,

(ii) лизис по отдельности каждого концентрата тромбоцитов со стадии (i), и

(iii) смешивание лизатов, полученных на стадии (ii), для получения объединенного лизата тромбоцитов человека.

6. Способ по п.1, в котором концентрат тромбоцитов, обеспеченный на стадии (i), подвергают обработке, истощающей лейкоциты и/или обработке с инактивацией вирусов/патогенов.

7. Подвергнутый тепловой обработке объединенный лизат тромбоцитов человека, полученный способом по любому из пп.1-6, для усиления лечения бокового амиотрофического склероза (БАС) путем индукции улучшенного нейропротективного эффекта, а также восстановления нервных клеток, имеющий содержание фибриногена менее 5 мас.% от содержания фибриногена в необработанном pHPL и имеющий содержание фибриногена менее 50 нг/мл.

8. Применение подвергнутого тепловой обработке объединенного лизата тромбоцитов человека по п.7 или полученного способом по любому из пп.1-6 для лечения бокового амиотрофического склероза (БАС).

9. Применение по п.8, где pHPL вводят интратекальным, интраокулярным, интраназальным или интрацеребровентрикулярным путем.

10. Применение по п.9, где pHPL вводят интрацеребровентрикулярным путем, более конкретно, в правый боковой желудочек, предпочтительно поблизости от межжелудочкового отверстия, и более предпочтительно в третий желудочек.

11. Применение по п.10, где указанный pHPL адаптирован для введения с помощью программируемого лекарственного насоса.