СИСТЕМА АСИММЕТРИЧНОГО КОНИЧЕСКОГО БИОРЕАКТОРА И СПОСОБ ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12M3/00 C12M1/04 C12M1/34 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, для культивирования клеток. Асимметричный конический биореактор используется для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, система асимметричного конического биореактора предназначена для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов. Предлагаемая система может быть представлена как в качестве самостоятельного устройства, так и как часть биотехнологического комплекса, и может быть использована для выращивания культур клеток, чувствительных к механическому воздействию, выращивания клеток для традиционных ферментеров, для научных и промышленных исследований, для высококачественного производства клеток для промышленных биореакторов, для производства биомедицинских продуктов.

Предпосылки создания изобретения Биореакторы могут использоваться для производства таких продуктов, как фармацевтические препараты, вакцины, антитела и т.п.посредством культивирования клеток, организмов, культур и т.п.в условиях управляемой среды. Все более часто используются одноразовые биореакторы, которые содержат опорную структуру и одноразовый контейнер, выполненный с возможностью его установки внутри опорной структуры. Использование систем с одноразовыми контейнерами позволяет избежать рисков заражения и загрязнения между процессами.

Существует целый ряд конструктивных решений для одноразовых биореакторов. Компании Applikon Biotechnology (Нидерланды) и Stedim Inc. (Франция) предлагают одноразовую биореакторную систему Appliflex®, в которой используются 50-литровые гибкие мешки для культур, которые рассчитаны на размещение на моторизованной платформе, которая покачивает мешок для обеспечения аэрации и перемешивания питательной среды. Сходный одноразовый биореактор предлагается компанией Wave Biotech, LLD (Сомерсет, штат Нью-Джерси, США), в котором используются мешки для культур объемом до 1000 л, которые также аэрируются и перемешиваются с помощью моторизованной платформы. Аэрация и перемешивание обеспечиваются многоразовым лопастным рабочим колесом, прикрепленным к сложному приводному устройству, введенному мешок с культурой.

В патенте РФ №2468076 раскрыто одноразовое устройство для культивирования и сбора растительной ткани и/или клеток, которое содержит нежесткую емкость объемом по меньшей мере 400 л и снабженную каналами газообмена и каналом сбора; опорную конструкцию для поддержки упомянутого устройства, причем упомянутая опорная конструкция включает жесткое днище, имеющее форму усеченного конуса. Такая конфигурация специально разработанного опорного кожуха для работы влияет на общую жизнестойкость культур, так как позволяет избежать образование осадка клеток, которые могут усиливать распад и смерть клеток. Перемешивание осуществляется путем подачи воздуха или газа для аэрации и перемешивания.

Во всех вышеупомянутых системах системы опоры и аэрации/перемешивания сложные, дорогостоящие, узконаправленные и ограниченные по мощности. Так, хотя сам реакторный сосуд (контейнер) может быть одноразовым, использование этих систем требует дорогостоящей наладки и технического обслуживания.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является патент США №6544788. Клетки выращивают в пластиковом пакете, который качается и вентилируется на механической платформе. Мешок биореактора содержит фильтр, который позволяет удалять жидкость из биореактора без потери клеток. Питательные вещества можно добавлять через другой порт. Перфузионный фильтр сконструирован таким образом, что он может свободно перемещаться по поверхности жидкости. Фильтр быстро перемещается по поверхности в результате раскачивания биореактора, и это качательное движение фильтра предохраняет его от засорения. Система управления обеспечивает непрерывную работу в течение нескольких недель.

Помимо недостаточной производительности, экономичность в использовании подобного рода реактора во многих случаях невозможно обеспечить без достаточной пригодности к масштабированию. Увеличение масштабов в этой ситуации возможно лишь ценой возрастания сложности и снижения экономичности использования, путем дополнительного применения сложных технических решений. Данная система не позволяет начинать процессы с малых объемов (что позволяет экономить дорогостоящие реагенты) и постепенно увеличивать объем по мере экспансии клеток, а также осуществлять эксплуатацию одной и той же системы в мануальном, полуавтоматическом и полностью автоматическом режимах.

Таким образом, существует постоянная потребность в усовершенствовании существующих систем и устройств для культуры клеток, микроорганизмов и вирусов, чтобы иметь возможность выстраивать необходимые процессы в мануальном, полуавтоматическом и полностью автоматическом режимах, а также масштабировать системы и устройства без изменения конфигурации всей система биореактора с увеличением объема по мере экспансии клеток, а также повысить эффективность по стоимости.

Решению именно этой проблемы и посвящена настоящая заявка.

Суть изобретения

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является

- создание биореактора для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, который бы мог использоваться как самостоятельное устройство, так как и как часть автоматизированного биотехнологического комплекса, и который бы имел возможность уменьшения количества используемых реактивов и повышения жизнеспособности клеточных культур;

- создание гибкой системы биореактора, которая позволит выстроить необходимый процесс в мануальном, полуавтоматическом и полностью автоматическом режимах;

- возможность начинать процессы с малых объемов, что позволяет экономить дорогостоящие реагенты и постепенно увеличивать объем по мере экспансии клеток;

- производить подачу газов в биореактор с требуемыми параметрами.

При этом разработанная конструкция биореактора и система биореактора, которая ее использует, должна быть проста в обращении, должна удовлетворять высоким техническим требованиям фармацевтической промышленности в отношении очистки и стерильности.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение жизнеспособности культивируемой культуры клеток при ее эффективном размножении и одновременном улучшении массообменных характеристик.

Технический результат достигается за счет того, что согласно первому аспекту изобретения биореактор для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, включает герметичный жесткий сосуд для культивирования, при этом внутренняя поверхность сосуда выполнена в форме усеченного конуса и имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда, а на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия для установки датчиков для наблюдения за биотехнологическим процессом таким образом, чтобы при установке датчиков они были полностью погружены в культивируемую среду при заполнении ею сосуда.

Также технический результат достигается за счет того, что согласно второму аспекту изобретения биореактор для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, включает герметичный жесткий сосуд для культивирования, при этом внутренняя поверхность сосуда выполнена в форме усеченного конуса и имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда, а на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия для установки датчиков для наблюдения за биотехнологическим процессом таким образом, чтобы при установке датчиков они были полностью погружены в культивируемую среду при заполнении ею сосуда, при этом внутри сосуда установлена по меньшей мере одна мембрана, которая разделяет внутренний объем сосуда на по меньшей мере два пространства, одно из которых является областью пространства скопления газов, и в области пространства скопления газов расположен дренажный клапан с удлинителем для отвода воздушного пузыря из данного пространства.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сосуд имеет верхнюю крышку и нижнюю крышку, при этом внутреннее пространство сосуда, ограниченное внутренней поверхностью сосуда, разделено на три камеры мембранами, которые и образуют верхнее пространство, ограниченное внутренней поверхностью верхней крышки и первой мембраной, нижнее пространство, ограниченное внутренней поверхностью нижней крышки и второй мембраной, межмембранное пространство, ограниченное первой и второй мембранами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внешняя поверхность сосуда имеет преимущественно вертикальную цилиндрическую форму со скошенной боковой стенкой, сосуд герметизирован крышками с обеих торцов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сосуд и крышки имеют посадочные отверстия для установки портов, геометрия и функционал которых выбирается в соответствие с требованиями биотехнологического процесса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом являются одноразовыми или многоразовыми. При этом датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом выбраны из: датчик растворенного кислорода DO, датчик кислотно-щелочного баланса РН.

В некоторых вариантах осуществления изобретения биореактор дополнительно включает одноразовые датчики, размещаемые в посадочных отверстиях сосуда и выбранные из: датчик глюкозы, датчик лактата, датчик температуры, датчик уровня жидкости, датчик давления, датчик биомассы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом являются предустановленными.

В некоторых вариантах осуществления изобретения внутренний объем сосуда составляет приблизительно от 15 мл до 50000 мл.

В некоторых вариантах осуществления изобретения каждому посадочному отверстию соответствует порт, при этом порты выбраны из группы: порт ввода газа, порт выхода газа, порт для взятия образцов, порт для введения культур, порт для введения реагентов, порт для сбора выращиваемых культур, порт для отведения отходов, порт для отведения воздушного пузыря из-под мембраны.

В некоторых вариантах осуществления изобретения материал сосуда и/или крышек является биосовместимым материалом или комбинацией биосовместимых материалов при этом биосовместимый материал выбирается из группы: стекло, полиэтилен, нержавеющая сталь, поликорбонат, полисульфон.

Также технический результат достигается за счет того, что согласно третьему аспекту изобретения система биореактора для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов, включает вышеописанный биореактор со средством нагрева, и управляющую башню, оснащенную опорно-маятниковым механизмом, выполненным с возможностью удерживания, вращения и раскачивания вертикально установленного в нем сосуда биореактора относительно его вертикальной оси во время биотехнологического процесса, панелью электрических подключений, блоком питания, блоком управления, сконфигурированным выполнять команды с периферийных вычислительных устройств и/или пульта управления, интегрированного с опорно-маятниковым механизмом, для задания текущих параметров биотехнологического процесса, получать данные о тенденциях процесса от одноразовых или многоразовых датчиков для получений измерений физических, химических или биологических свойств содержимого сосуда во время биотехнологического процесса, корректировать параметры биотехнологического процесса в зависимости от полученных измерений путем подачи управляющих сигналов на механизмы подачи газа, питательных сред в сосуд биореактора, сконфигурированных для доставки газа, питательных сред в сосуд биореактора во время событий в ответ на управляющий сигнал, на средство нагрева, сконфигурированное для изменения и поддержания температуры в сосуде биореактора в ответ на управляющий сигнал, и на опорно-маятниковый механизм, сконфигурированный для изменения угла наклона в ответ на управляющий сигнал.

В некоторых вариантах осуществления опорно-маятниковый механизм выполнен в виде зажимного хомута, закрепленного на валу шагового двигателя, установленного на стойке, закрепленной на опорной пластине.

В некоторых вариантах осуществления текущие параметры биотехнологического процесса выбраны из: максимальная скорость и максимальный угол наклона сосуда биореактора от вертикальной оси опорно-маятникового механизма, объем и температура подаваемых реагентов и скорость их подачи, температура нагрева содержимого сосуда, давление в сосуде, рН, DO, Glu, Lac, Biomass.

В некоторых вариантах осуществления управляющая башня оснащена перильстатическими насосами для подачи реагентов в сосуд биореактора.

В некоторых вариантах осуществления пульт управления расположен на корпусе управляющей башни и выполнен в виде сенсорного дисплея, подключенного к блоку управления.

В некоторых вариантах осуществления пульт управления выполнен с возможностью передавать данные в вычислительный модуль, который выдает команды блоку управления.

В некоторых вариантах осуществления периферийный вычислительные устройства выбираются из: ноутбук, персональный компьютер, мобильный телефон, - и выполнены с возможностью запуска на них веб-приложения для задания текущих параметров биотехнологического процесса.

В некоторых вариантах осуществления периферийный вычислительные устройства выполнены с возможностью передавать данные в вычислительный модуль, который выдает команды блоку управления.

В некоторых вариантах осуществления панель электрических подключений выполнена с возможностью подключения опорно-маятникого механизма, многоразовых или одноразовых датчиков, запорной арматуры, механизмов подачи реагентов в сосуд биореактора, оборудования, необходимого для обеспечения биотехнологического процесса.

В некоторых вариантах осуществления блок питания выполнен с возможностью питания опорно-маятникового механизма, перильстатических помп, датчиков, дисплея, световой и звуковой индикации, вентиляторов, устройства управления, пережимных клапанов, проточного нагревателя жидкости, средства нагрева.

В некоторых вариантах осуществления на корпусе управляющей башни расположены LED-индикаторы, связанные с блоком управления и сигнализирующие по меньшей мере об одном из событий: аварийная ситуация; завершение процесса; отклонение показателей процесса от требуемых; готовность оборудования к началу процесса; нахождение системы в работе.

В некоторых вариантах осуществления средством нагрева является нагревательная рубашка, которая надевается снаружи на внешнюю поверхность сосуда для поддержания температуры культивирования биореактора.

В некоторых вариантах осуществления материалом сосуда биореактора является нержавеющая сталь, сосуд имеет по меньшей мере одно отверстие в стенке сосуда для установки нагревательного картриджа, а средством нагрева является нагревательный картридж для нагрева стенок сосуда, вставляемый в одно из указанных отверстий.

В некоторых вариантах осуществления средством нагрева является нагревательный картридж, вводимый непосредственно во внутреннее пространство сосуда.

В некоторых вариантах осуществления средством нагрева является встроенный нагреватель в корпусе сосуда биореактора.

В некоторых вариантах осуществления средством нагрева является теплопроводящий напыленный слой технологией вакуумного напыления на внутренней или внешней поверхности сосуда с припаянными к напыленному слою и выведенными наружу проводами.

В некоторых вариантах осуществления система дополнительно включает систему проточного подогрева жидкости, подаваемой в реактор, до необходимой температуры.

В некоторых вариантах осуществления система на управляющей башне устанавливается монтажная пластина таким образом, чтобы она находилась в области расположения сосуда биореактора, для расположения на ней оборудования, требуемого для обеспечения процесса, выбранное из: трубопровод, пережимные клапана, арматура, оксигенатор, ловушки для пузырьков, проточный нагревателя, проточные датчики температуры, проточные датчики DO, проточные датчики наличия среды, холодильная камера для хранения и подачи реагентов, необходимых для осуществления биотехнологических процессов.

В некоторых вариантах осуществления управляющая башня подключена к газовой станции для подготовки и подачи газов, необходимых для осуществления процессов.

Краткое описание чертежей Цели, особенности и преимущества данного изобретения станут более очевидными после обращения к следующему описанию и приложенным чертежам, на которых изображено:

Фиг. 1, Фиг. 2 - Объемное изображение асимметричного биореактора согласно настоящему изобретению,

Фиг. 3 - Поперечное сечение асимметричного биореактора,

Фиг. 4 - Башня управления с опорно-маятниковым механизмом, который выполнен для удерживания и раскачивания асимметричного биореактора,

Фиг. 5 - Пример компоновки и внутреннего оборудования башни управления,

Фиг. 6 - Фиг. 8 - Система асимметричного биореактора,

Фиг. 9 -11 - Расположение портов асимметричного биореактора,

Фиг. 12 - Схематичное изображение работы системы асимметричного биореактора.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает систему асимметричного конического биореактора для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, которая включает в себя многопортовый герметичный жесткий сосуд в форме асимметричного усеченного конуса с сечением в виде прямоугольной трапеции с меньшим основанием внизу сосуда и опорно-маятниковый механизм, предназначенный для удержания сосуда и создания настраиваемого и плавного движения (качение) биореактора относительно вертикальной оси во время биотехнологического процесса.

Как правило, опорная структура (опорно-маятниковый механизм) и контейнер (сосуд) проектируются для совместного использования. Предполагается, что в опорно-маятниковом механизме могут использоваться различные сосуды при условии, что они могут быть установлены в опорно-маятниковый механизм.

Ниже подробно изложены элементы конструкции биореактора и опорно-маятникого механизма.

Асимметричный конический биореактор представляет собой новое поколение уникальных одноразовых реакторов с плавным покачивающимся движением. Это масштабируемая система с рабочим диапазоном от 15 мл до 50 литров. Под рабочим диапазоном в данной заявке понимается диапазон объема жидкостей, с которым можно работать в реакторе при сохранении полного функционала (нагрев, контакт с датчиками, оксигенация среды и такдалее). Устройство разработано для одноразового использования и особенно учитывает особенности культур клеток, чувствительных к резким движениям, что не ограничивает в других его применениях. Преимущество конкретного реактора перед биореакторами многократного использования состоит в том, что затраты на техническое обслуживание и эксплуатацию снижаются за счет исключения следующих операций:

- стерилизации. Исключает необходимость иметь парк стерилизаторов, исключает затраты на обслуживание оборудование, сертификации и поверки;

- очистки. Исключает необходимость иметь парк стерилизаторов, исключает затраты на обслуживание оборудование, сертификации и поверки;

- сокращение временных и трудовых затрат на регулярное обслуживание при полном соответствии предъявляемым требованиям;

- снижение требований к квалификации персонала и затрат на его обучение;

- снижение рисков перекрестного загрязнения.

Варианты осуществления раскрытой здесь конструкции биореактора согласно настоящему изобретению имеют рабочий диапазон от 15 мл до 500 мл. Масштабируемость системы достигается за счет конфигурации внутренней поверхности сосуда для культивирования в виде асимметричного усеченного конуса, который в поперечном сечении имеет прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда. Емкость сосуда биореактора может иметь типичное отношение высоты к объему приблизительно 0,06-1 см/л.

Фиг. 1-3 представляют трехмерное изображение биореактора 100 согласно настоящему изобретению. Биореактор 100 имеет жесткий сосуд 110 со стенкой 101, определяющей его полость (внутренний объем сосуда). Внутренняя поверхность сосуда 110 выполнена в форме асимметричного усеченного конуса и имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда. Внешняя поверхность сосуда 110 имеет преимущественно вертикальную цилиндрическую форму со скошенной боковой стенкой.

Сосуд 110 герметизирован крышками с обеих торцов: нижней крышкой 130 и верхней крышкой 120. Верхняя крышка 120 соединена со стенками 101 сосуда 110 посредством фланца 121. В предпочтительном варианте выполнения согласно настоящему изобретению габаритные размеры сосуда 110 составляют 315 мм × 130 мм × 150 мм, вес сосуда - до 8 кг. Однако, приведенный пример никоим образом не ограничивает габаритные размеры конструкции сосуда 110 биореактора 100.

В некоторых вариантах осуществления внутри сосуда 110 установлена по меньшей мере одна мембрана, которая разделяет внутренний объем сосуда на по меньшей мере два пространства. Большая область служит для выращивания клеток, в ней находится среда с клетками и газами. При этом через меньшую область (нижнюю область) производится подача жидких питательных сред, в которой возможно скопление газов. В меньшей области расположен дренажный клапан с удлинителем для отвода воздушного пузыря из данного пространства.

В варианте осуществления изобретения, изображенном на фиг. 4 представлено использование двух мембран 140, 150, одна из которых 140 устанавливается между верхней крышкой 120 и фланцем 121, а вторая 150 - ставится в упоры стенок сосуда 110 в нижней части сосуда, ближе к нижней крышке 130. При этом обе мембраны 140, 150 установлены параллельно друг другу и перпендикулярно относительно продольной оси сосуда 110.

Таким образом, внутреннее пространство сосуда 110 биореактора 100, ограниченное внутренней поверхностью сосуда, разделено на три камеры (фиг. 3) мембранами 140, 150, которые установлены горизонтально и образуют верхнее пространство 161, ограниченное внутренней поверхностью верхней крышки 120 и первой мембраной 140, нижнее пространство 163, ограниченное внутренней поверхностью нижней крышки 130 и второй мембраной 140, межмембранное пространство 162, ограниченное первой 140 и второй мембраной 150.

Мембраны могут иметь различные характеристики, материальное исполнение и функционал в зависимости от требования процесса. Мембраны являются заменяемыми и пригодными для вторичной переработки.

В некоторых вариантах осуществления внутри сосуда установлен фильтрующий картридж.

Пространство 161 над первой мембраной 140, верхнее пространство, используется для портов для отвода жидкостей или воздуха через мембрану 140, удерживающую клетки.

Межмембранное пространство 162 образует собой пространство, в которое возможно свободно вводить и отводить реактивы, но при этом из-за размера пор мембран клетки это пространство покинуть не могут. Мембраны 140, 150 позволяют удерживать культивируемые материалы в межмембранном пространстве и вводить и отводить среду до или после мембран, или вводить реагенты и брать образцы непосредственно из межмембранного пространства. Таким образом, клетки при перфузии жидкостей в реакторе не теряются.

Сосуд 110 в зависимости от требований процесса и желания конечного пользователя может комплектоваться различными датчиками для управления и контроля биотехнологического процесса. Обычно, в системах биореактора многоразового использования для наблюдения за биотехнологическим процессом используются стандартные оптические, емкостные, гальванические и полярографические датчики. Биореактор 100 согласно настоящему изобретению оснащен зондами 170, 180 - одноразовыми или многоразовыми датчиками для наблюдения за биотехнологическим процессом, выбранные из: датчик растворенного кислорода DO, датчик кислотно-щелочного баланса РН.

Данные датчики 170, 180 могут быть установлены в сосуде 110 биореактора 100 штатно или опционально. Штатная комплектация датчиков 170, 180 подразумевает то, что датчики в некоторых вариантах осуществления являются предустановленными. Для установки датчиков для наблюдения за биотехнологическим процессом на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия 171, 181 (фиг. 3). Причем отверстия 171, 181 размещены таким образом, чтобы при установке датчиков 170, 180 они были полностью погружены в культивируемую среду при любом объеме жидкости из рабочего диапазона. Датчики 180 устанавливаются в посадочные отверстия 171, 181 с помощью цанговых штуцеров 172, 182. В варианте осуществления, показанном на фиг. 3, в посадочные отверстия 171, 181 устанавливают порты 173, 183 с целью размещения в них датчиков для наблюдения за биотехнологическом процессом, причем отверстия 171,181 расположены со стороны скошенной боковой стенки сосуда 110 биореактора 100 ближе к нижней крышке 130 сосуда. Датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом установлены в портах 173, 183 с помощью штуцеров 172, 182 таким образом, чтобы они были полностью погружены в культивируемую среду при любом объеме среды из рабочего диапазона.

Дополнительно к указанным выше датчикам, выбранным из: датчик растворенного кислорода DO, датчик кислотно-щелочного баланса рН, - биореактор оснащен одноразовыми датчиками, выбранными из: датчик глюкозы, датчик лактата, датчик температуры, датчик уровня жидкости, датчик давления, датчик биомассы. Для установки одноразовых датчиков в реакторе предусмотрены заглушки и цанговые штуцера. Так, например, в вариантах осуществления изобретения, изображенных на фиг. 2-3, во фланце, находящимся в контакте с верхней крышкой 120, предусмотрен датчик давления 122.

Поверхность сосуда, верхняя крышка 120, нижняя крышка 130 и фланец 121 имеют посадочные отверстия 190 для установки портов. Каждому посадочному отверстию 190 соответствует порт 191. Порты 191 могут быть различной геометрии и различного функционала и выбираться в соответствии с требованием биотехнологического процесса. Минимально необходимые порты 191: порт ввода газа, порт выхода газа, порт для взятия образцов, порт для введения культур, порт для введения реагентов, порт для сбора выращиваемых культур, порт для отведения отходов, порт для отведения воздушного пузыря из-под мембраны. Опционально могут использоваться дополнительные газовые порты и порты для введения активаторов и прочив реактивов, альтернативные порты сбора выращиваемых культур и альтернативные порты

В некоторых вариантах осуществления в место подключения порта 191 может быть установлен датчик, например датчик температуры.

Разъемы портов 191 с посадочными отверстиями имеют одинаковую резьбу, что позволяет в любой момент заменить тип подключения на подходящий. Использование соединителей датчиков и портов, например по типу люэровского присоединения, обеспечивают надежное соединение, позволяя осуществлять биотехнологические процессы требуемое время. Более того, конструкция предложенного сосуда биореактора позволяет провести все этапы, например, процесса получения CAR-T клеток, в одном сосуде. Указанный процесс включает в себя активацию Т лимфоцитов, их трансдукцию лентивирусным вектором и экспансию (наращивание количества).

Сложная форма внутренней поверхности сосуда 110 биореактора 100 позволяет начинать процесс культивирования и работы среды с минимальных объемов - экономит реактивы и при этом позволяет создавать достаточную высоту столба жидкости для размещения датчиков и поддержания их функционирования. Датчики 170, 180 для наблюдения за биотехнологическим процессом будут всегда погружены в среду с целью осуществления контроля за процессом.

В варианте осуществления изобретения, когда внутри сосуда 110 установлена по меньшей мере одна мембрана, на нижней крышке 130 сосуда выполнено посадочном отверстие 131, которому соответствует порт 132. В указанном порту 132 располагается удлинитель 133, выходящим внутрь сосуда 110 биореактора 100 непосредственно в зону потенциального образования воздушного пузыря, в частности, в нижнее пространство 163 сосуда 110 биореактора, ограниченное внутренней поверхностью нижней крышки 130 и второй мембраной 150. В процессе фильтрации под нижней мембраной 150 биореактора возможно образование воздушного пузыря, препятствующего непрерывному и равномерному поступлению/отводу жидкостей. Удлинитель 133 позволяет отводить воздушный пузырь, который скапливается под второй мембраной 150. Для более эффективного отвода воздушного пузыря сосуд наклоняют таким образом, чтобы пузырь поднялся в зону удлинителя 133. Отвод данного пузыря очень важен, так как повышение давления под второй мембраной 150 может повредить саму мембрану или создать прорыв воздушного пузыря, который в свою очередь создаст сильный барботаж и может повредить клеточную культуру.

В процессе работы ассиметричного конического биореактора, в него через гибкие трубки на заданной пользователем скорости подается среда и другие жидкости, которые непосредственно после поступления в биореактор проходят через первую фильтрующую мембрану 140 (фиг. 3).

Расположение портов 191 в отношении верхней или нижней части сосуда не является принципиальным и может быть любым. Важным является их расположение по высотам, но не их угол. Порты 191 могут располагаться в межмембранном пространстве 162, в верхнем пространстве 161, ограниченным внутренней поверхностью верхней крышки 120 и первой мембраной 140, в нижнем пространстве 163, ограниченным внутренней поверхностью нижней крышки 130 и второй мембраной 150. Порты 191 расположены таким образом, что могут вводить или отводить среды из ограниченными мембранами или одной мембраной пространств биореактора. Выбор портов 191 и их расположение определяется требованием конкретного технологического процесса.

Согласно некоторым вариантам осуществления стенка 101 многопортового жесткого сосуда 110 для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов может быть изготовлена из различных биосовместимых материалов. Например, нержавеющая сталь, поликарбонат, фторопласт или полисульфон. В других вариантах осуществления используются металлические материалы, керамика или композиты.

В других вариантах осуществления используется нержавеющая сталь, отдельно или в сочетании со стеклом. Например, при изготовлении стенки 101 сосуда биореактора 100 из нержавеющей стали (фиг. 2) предусмотрена планка 102 и смотровое стекло 103 для визуальной оценки среды, находящейся внутри биореактора 100. При этом крышки 120, 130 выполнены фторопластовыми.

В некоторых вариантах осуществления изобретения сосуд 110 изготавливается из тефлона и полисульфона (высокоэффективные термопласты) (сосуд 110 выполнен из полисульфона, а крышка 120, 130- из тефлона) или стекла. В некоторых вариантах осуществления изобретения сосуд 110 изготавливается из поликарбоната (сосуд и составные детали из поликарбоната). Выбор материалов, из которых изготовлена та или иная деталь биореактора, не ограничен данными материалами. В целом, список материалов для сосуда ограничен только биосовместимостью материалов.

Для изготовления стального сосуда могут быть использованы следующие методы изготовления: фрезерование, электроэррозионная обработка, токарные операции. Для изготовления пластмассовых сосудов используют литье под давлением, фрезерование, токарные операции, ЗД печать.

Для осуществления технологического процесса необходим нагрев и постоянное поддержание температуры содержимого биореактора, поэтому предусмотрен нагрев сосуда биореактора. В качестве средства нагрева для поддержания температуры культивирования биореактора в одном из вариантов осуществления может использоваться нагревательная рубашка, фиксируемая на внешней поверхности сосуда биореактора (на корпусе биореактора) при помощи шнурков, жесткого кожуха, повторяющего форму сосуда биореактора или другим доступным способом крепления. Нагревательная рубашка может просто одеваться на сосуд биореактора за счет упругости материалов кожуха и фиксироваться на сосуде болтом или нейлоновыми стяжками.

В другом варианте осуществления в качестве средства нагрева является нагревательный картридж, вводимый непосредственно во внутреннее пространство сосуда вместо заглушки, расположенной во фланце.

В другом варианте осуществления в качестве средства нагрева является нагревательный картридж для нагрева стенок сосуда, установленный в специальные отверстия в корпусе сосуда биореактора. Например, установка указанного картриджа возможна в варианте исполнения, когда материалом сосуда биореактора является нержавеющая сталь и сосуд имеет по меньшей мере одно отверстие в стенке сосуда.

В другом варианте осуществления в качестве средства нагрева является встроенный в стенку сосуда биореактора нагреватель. Такой вариант исполнения возможен в случае использования пластикового корпуса биореактора.

Также возможен вариант осуществления средства нагрева в виде теплопроводящего напыленного слоя на корпусе биореактора на внутренней или внешней поверхности сосуда. К напыленному слою припаиваются провода и выводятся наружу. Слой может напыляться с помощью известных технологий, например, с помощью технологии вакуумного напыления металлов. На внешней поверхности корпуса биореактора поверх напыленного слоя наносится слой теплоизоляции. На внутренней поверхности корпуса биореактора поверх напыленного слоя наносится слой инертного биосовместимого материала.

В другом варианте осуществления содержимое сосуда биореактора подогревается до необходимой температуры с помощью системы проточного подогрева жидкости, подаваемой в биореактор.

Биореактор 100 может работать в автоматическом, полуавтоматическом и ручном режимах.

В случае полностью ручного управления, все процессы, включая установку трубок, закачку жидкостей / газов (с использованием шприцев или автономных перистальтических насосов для жидкостей и источника сжатого воздуха / двуокиси углерода / кислорода / азота с калиброванным давлением), качание (с помощью встряхивающего устройства или аналогичного устройства), сбор урожая и удаление отходов осуществляются вручную или с использованием оборудования пользователя.

В случае автоматической или полуавтоматической работы все процессы, кроме установки, выполняются автоматически с помощью системы биореактора.

Второй аспект настоящего изобретения относится к системе биореактора, конструктив и функционал которой подробно описан ниже.

Система 200 биореактора для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов включает биореактор согласно любому варианту осуществления, описанному выше и управляющую башню 210 (фиг. 4), состоящую из опорно-маятникового механизма 220 (фиг. 5), выполненным с возможностью удерживания, вращения и раскачивания вертикально установленного в нем сосуда биореактора 100 относительно его вертикальной оси во время биотехнологического процесса, панелью электрических подключений 230, блоками питания 214, 215, блоком управления 250, пультом управления 216. В башне управления 210 модульно и гибко, с возможностью расширения размещается вся необходимая электроника для обеспечения работы системы.

Опорно-маятниковый механизм 220 (фиг. 4, 5) для биореакторов представлен в виде зажимного хомута 221, закрепленного на валу двигателя 222, который установлен на стойке 223, жестко закрепленной на опорной пластине 224. В предпочтительном варианте осуществления в качестве двигателя 222 используется шаговый мотор с редуктором с крутящим моментом не менее 10 н/м. В неограничивающем варианте осуществления может быть использован сервопривод с крутящим моментом, достаточным для приведения в движение сосуда. Стойка 223 может быть выполнена в виде трубы квадратного сечения. Материалом стойки 223 и опорной пластины может быть нержавеющая сталь. Стойки 223 между собой сварены в раму 225, а к раме винтами прикручена опорная пластина 224. В раме 225 установлен двигатель 222, связанный с устройством крепления 226 биореактора (с зажимным хомутом 221) винтами. Для отслеживания угла наклона сосуда 100 биореактора на зажимной хомут 221 устанавливается акселерометр 227 (фиг. 4). К раме прикручен корпус 211 управляющей башни, выполненный из пластика. В посадочных местах на корпусе 211 установлены вентиляторы 212 болтовым соединением. Внутри корпуса 212, на направляющих монтажных рельсах 213, закрепленных на опорной пластине 224, установлены блок управления 214 и блок питания 215. Электрические компоненты коммутированы между собой. Управляющая башня 210 также оснащена перильстатическими насосами 216 для подачи реагентов в сосуд 100 биореактора. Таким образом, весь механизм вместе с двумя перистальтическими насосами 216, охлаждающими вентиляторами 212 и блоком управления 214, заключен в пластиковый корпус 211.

В одном из неограничивающих примеров выполнения изобретения опорно-маятниковый механизм имеет: вес 40 кг, габаритные размеры механизма составляют 500 х 360 х 600 мм, внутренний диаметр зажимного хомута 96 мм, максимальная длина от дна биореактора до зажимного хомута маятникового механизма до 300 мм, максимальная длина от зажимного хомута маятникового механизма до верхних штуцеров биореактора составляет до 300 мм. При этом возможно использовать с данным опорно-маятниковым механизмом биореактор с максимальным весом до 10 кг.

Опорно-маятниковый механизм может использоваться при разработке технологических процессов в области биофармацевтики и иммунотерапии для раскачивания зафиксированного на нем одноразового биореактора со скоростью, безопасной для чувствительных клеточных культур (например, клеток млекопитающих, клеток человека), для обеспечения тщательного перемешивания жидкостей, находящихся в биореакторе.

Биореактор устанавливается в зажимной хомут маятникового механизма, приводимого в движение шаговым мотором. Зажимной хомут циклично покачивается маятниковым движением, например, со скоростью 57 мин., наклоняя биореактор на заданный угол, выбранный пользователем (значение можно также выбрать/настроить в процессе работы), в зависимости от количества содержимого, типа биореактора или требований технологического процесса.

Примеры максимальных углов наклона в зависимости от наполнения реактора:

- 83° от вертикальной оси (при наполнении до 500 мл);

- 73° от вертикальной оси (при наполнении до 300 мл);

- 61° от вертикальной оси (при наполнении до 100 мл);

- 23° от вертикальной оси (при наполнении до 15 мл).

Скорость движения зажимного хомута, в котором установлен биореактор, определяется текущим биотехнологическим процессом и выбранным типом биореактора. Например, скорость может достигать до 400 об/мин.

Все необходимые параметры, такие как скорость покачивания, длительность покачивания и угол наклона, выбираются оператором с помощью пульта управления 209, выполненного в виде сенсорного дисплея, подключенного к блоку управления 250 и расположенного на корпусе управляющей башни 211.

Блок управления 250 выполнен с возможностью выполнять команды с периферийных вычислительных устройств и/или пульта управления 209, интегрированного с опорно-маятниковым механизмом 220, для задания текущих параметров биотехнологического процесса. Также блок управления 250 дополнительно и предпочтительно должен быть способен:

получать данные о тенденциях процесса от одноразовых или многоразовых датчиков для получений измерений физических, химических или биологических свойств содержимого сосуда во время биотехнологического процесса,

корректировать параметры биотехнологического процесса в зависимости от полученных измерений путем подачи управляющих сигналов на механизмы подачи газа 260, питательных сред в сосуд 110 биореактора 100, сконфигурированных для доставки газа, питательных сред в сосуд 110 биореактора 100 во время событий в ответ на управляющий сигнал, на средство нагрева, сконфигурированное для изменения и поддержания температуры в сосуде 110 биореактора 100 в ответ на управляющий сигнал, и на опорно-маятниковый механизм 220, сконфигурированный для изменения угла наклона в ответ на управляющий сигнал.

Башня управления 210, монтажная пластина 270, механизм подачи газа 260 и реактор 100 предпочтительно соединен с разными измерительными приборами при эксплуатации настоящего изобретения, образуя систему 200 (фиг. 6) для автоматической или полуавтоматической эксплуатации настоящего изобретения. Например, башня управления 210 предпочтительно соединена с механизмом подачи газа 260 для контроля расхода газа или сочетания газов. Этот прибор предпочтительно соединен с газовым баллоном или магистралью, идущей от подходящего источника подачи воздуха, и контролирует поток воздуха или другого газа в трубе.

Блок управления 250 также предпочтительно соединен с термометром, который предпочтительно присутствует в окружающей среде сосуда биореактора, но более предпочтительно не в сосуде биореактора. Блоку управления 250 также дополнительно и предпочтительно должен быть способен управлять механизмом регулирования температуры, таким как средство нагрева и/или охладитель.

Блок управления 250 дополнительно и предпочтительно соединен с прибором, управляющим потоком среды и/или других питательных веществ из емкости для питательных веществ/среды в емкость сосуда биореактора.

Блок управления 250 предпочтительно соединен по меньшей мере с одним каналом сосуда биореактора и более предпочтительно по меньшей мере с каналом сбора сосуда биореактора. Блок управления 250 дополнительно может управлять автоматизированным средством отбора проб и/или сбора для удаления части содержимого емкости сосуда биореактора из дополнительного пробоотборного канала, для проверки и/или сбора (не показан). Блок управления также может быть дополнительно соединен с анализатором для анализа отбираемой части содержимого, например, чтобы обеспечивать обратную связь для работы блока управления.

Блок управления 250 может быть выполнен с возможностью контролировать такие параметры работы батареи и/или температуры, количества и времени поступления газа или сочетания газов в емкость, количество газа и время его выхода из емкости, количества и времени добавления по меньшей мере одного материала (питательные вещества, питательная среда и т.д.) и/или количество света. Блок управления способен детектировать количество получаемых отходов.

В некоторых вариантах осуществления блок управления выполнен с возможностью учета динамики роста клеток в режиме реального времени, а пульт управления выполнен с возможностью настраивания графической и 3D-визуализации процессов; задания пользователем конфигурация процессов; сохранения/загрузки данных; удаленного мониторинга эксперимента.

Подключение блока управления 250 к таким элементам как многоразовые или одноразовые датчики, запорная арматура, механизмы подачи реагентов в сосуд биореактора, шаговый мотор опорно-маятникового механизма и другое оборудование, необходимое для обеспечения биотехнологического процесса, осуществляется через панель электрических подключений.

Управляющая башня подключена через блок управления и панель электрических подключений к газовой станции для подготовки и подачи газов, необходимых для осуществления процессов.

Для подключения дополнительного оборудования башня управления 210 оснащена монтажной пластиной 270. Монтажная пластина 270 устанавливается таким образом, чтобы она находилась в области расположения сосуда биореактора. На монтажной пластине 270 может быть размещено оборудование, требуемое для обеспечения процесса, выбранное из: трубопровод, пережимные клапана, арматура, оксигенатор, ловушки для пузырьков, проточный нагревателя, проточные датчики температуры, проточные датчики DO, проточные датчики наличия среды, и другие компоненты, необходимые для осуществления биотехнологических процессов.

Блок питания выполнен с возможностью питания опорно-маятникового механизма, перильстатических помп, датчиков, дисплея, световой и звуковой индикации, вентиляторов, устройства управления, пережимных клапанов, проточного нагревателя жидкости, средства нагрева.

В качестве сенсорного дисплея в предпочтительном варианте изобретения может быть использован емкостный HDMI дисплей с размерами 11.6'', 1920×1080. Контроллер дисплея: RTD2556. Потребляемый ток: 1 А. Напряжение питания: 12 V. Контроллер сенсорной панели: ILI2511. Интерфейс тачскрина: USB

Пользователь имеет возможность, например, задавать параметры биотехнологического процесса при помощи меню, отображаемого на сенсорном дисплее маятникового механизма (расположен на корпусе) или, что более удобно, при помощи веб-приложения.

В первом случае после введения данных на сенсорном дисплее команды с пульта управления передаются в вычислительный модуль, который, в свою очередь, выдает команды блоку управления.

В последнем случае, при задании текущих параметров биотехнологического процесса через веб-приложение, веб-приложение для задания запускается на периферийных вычислительных устройствах, в качестве которых могут быть выбраны ноутбук, персональный компьютер, мобильный телефон. Периферийный вычислительные устройства выполнены с возможностью передавать данные в вычислительный модуль, который выдает команды блоку управления.

На корпусе управляющей башни также могут быть расположены LED-индикаторы, которые связаны электрически с блоком управления и оператора о статусе процесса. Например, LED-индикаторы могут сигнализировать по меньшей мере об одно из следующих событий:

- об аварийной ситуации;

- о завершении процесса;

- об отклонении показателей процесса от требуемых;

- о готовности оборудования к началу процесса

- о нахождении системы в работе.

Температура нагрева и ее поддержание на заданном пользователем уровне осуществляется автоматически посредством пульта управления, интегрированного с опорно-маятниковым механизмом, используемым для покачивания биореактора и контроля всех необходимых параметров технологического процесса. Кроме того, возможен также контроль при помощи персонального компьютера/планшета/мобильного телефона посредством веб-интерфейса.

На дисплее пульта управления/персонального компьютера/планшета/мобильного телефона графически отображаются все параметры технологического процесса (в том числе температуры): максимальная скорость и максимальный угол наклона сосуда биореактора от вертикальной оси опорно-маятникового механизма, объем и температура подаваемых реагентов и скорость их подачи, температура нагрева содержимого сосуда, давление в сосуде, рН, DO, Glu, Lac, Biomass, расход на перистальтических помпах и другие.

Кроме того, блок управления выполнен с возможностью уведомления оператора посредством пульта управления (через сенсорный дисплей, интегрированный в корпус башни управления, или через дисплей веб-приложения) о необходимости выполнения определенных действий и по мере необходимости, выдачи оповещения в случае выхода показаний приборов за пределы заданных диапазонов.

Пульт управления 209 включает средства ввода и регистрации данных, предназначенные для управления условиями культивирования в сосуде и управления клапанами распределения текучих сред в определенной последовательности. Автоматически осуществляется регистрация и запись всех событий и действий с системой на протяжении всего технологического процесса, включая показания датчиков. Доступ ко всем данных может храниться в облаке, доступ к которому можно получить удаленно с любого устройства, что позволяет следить за текущими процессами в режиме реального времени.

Порядок операций при эксплуатации системы биореактора для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов следующая.

Биореактор длиной не более указанной крепится в зажимном хомуте маятникового механизма. Для этого из проушин зажимного хомута выкручивают винты и снимают открученную часть зажимного хомута. Помещают сосуд биореактора в зажимной хомут. Устанавливают открученную ранее часть зажимного хомута на место, устанавливают и затягивают винты.

После этого устанавливают средство нагрева и опоры пережимных клапанов. Пережимные клапана устанавливаются на монтажной пластине, которая крепится к корпусу управляющей башни с помощью винтов.

Через систему распределения, которая разворачивается на монтажной пластине 270, протягивают гибкие трубки 275 и провода. Далее присоединяют гибкие трубки к сосуду биореактора в соответствии с ярлычками и цветовой идентификацией.

Устанавливают сетевые коннекторы (Ethernet, локальная сеть и т.д.) в соответствии с ярлычками и цветовой идентификацией: устройство нужно запитать от сети 220 В и подключить к интернету. Подключают внешний источник питания к заземленной розетке.

С помощью пульта управления (сенсорный дисплей или веб-приложение) устанавливают требуемые параметры технологического процесса (скорость покачивания, длительность покачивания, угол наклона) и запускают технологический процесс, который контролируется также через пульт управления.

Сосуд биореактора плавно раскачивается с заданной скоростью в течение заданного времени, выбранного оператором на сенсорном дисплее маятникового механизма, расположенном на корпусе, или при помощи веб-приложения. Покачивание вызывает в биореакторе движение среды с клеточной культурой. Это движение обеспечивает тщательное перемешивание суспензии с клетками, среды и других добавляемых жидкостей, со скоростью, безопасной для чувствительных клеток, а также обеспечивает необходимый уровень массообмена.

Маятниковый механизм останавливается по истечении заданного времени или во время выполнения определенных операций, таких как добавление реагентов, удаление отходов или забор продукта. На дисплее пульта управления появляется надпись «STOP» и устройство подаст повторяющийся звуковой сигнал. Работу можно приостановить в любой момент до истечения заданного времени, нажав кнопку «STOP». Маятниковый механизм примет вертикальное положение и остановится.

Устройство спроектировано для работы в помещениях с низкой температурой воздуха, а также в закрытых лабораторных помещениях при комнатной температуре от +4°С до +40°С в условиях без образования конденсата и при максимальной относительной влажности 80% при температуре до 31°С, линейно снижающейся до 50% при температуре 40°С.

Для отвода воздушного пузыря, который образуется под мембраной 150 в области нижнего пространства 183 сосуда биореактора осуществляют наклон биореактора на небольшой угол от вертикальной оси с одновременной подачи жидкости.

Отвод выполняется следующим образом:

(a) сосуд биореактора наклоняется так, чтобы воздушный пузырь переместился ближе к удлинителю 133;

(b) через порт 7 (см. фиг. 9, 11) при помощи помпы 216 в биореактор подается среда;

(c) через удлинитель 133 при помощи другой помпы (не указана на чертежах) среда и воздух откачиваются из биореактора 100 в контейнер для отходов.

На фиг. 6-8 изображен пример собранной системы биореактора для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов, состоящая из управляющей башни управления, ассиметричного конического биореактора и периферийного оборудования:

- монтажной доски 270, на которой размещается дополнительное оборудование, которое требуется для обеспечения процесса;

- пережимной клапан 271, количество и размещение определяется требованием процесса;

- оксигенатор 272 для обогащения загружаемой среды кислородом;

- проточный нагреватель 273 для подогрева среды перед загрузкой в нагреватель;

- проточный датчик температуры 274, для контроля температуры загружаемой среды;

- газовой станции 260, для подготовки и подачи газов, необходимых для осуществления процесса.

Примеры использование настоящего устройства для культивирования CAR-T клеток и получения НЕК293 клеток приведены ниже (фиг. 9-12).

CAR-T ПРОЦЕСС

1. Посадите клетки через порт №6 шприцем с соединением люэровского типа.

2. Добавьте необходимый объем (для ImmunoCult CD3/CD28 - 25 мкл активатора на 1 мл среды) и 100 Ед / мл IL2 через порт №11 с помощью шприца.

3. Включите мягкий наклон 5 градусов за 1 минуту.

4. После того, как активация пройдет (24-72 часа), наклоните реактор в горизонтальное положение в сторону порта для сбора продукта /сбора отходов со скоростью 5 градусов в минуту.

5. Откройте сливной клапан (порт №13) и увеличьте давление внутри реактора с помощью N2 через порт №15. При этом точные параметры давления следует определять экспериментально, но в диапазоне 1-2 бар.

6. Когда весь объем среды извлечен, закройте клапан и уменьшите давление.

7. Наполнить реактор предварительно нагретым (37°С) промывочным буфером (ДПБС) на половину объема реактора через порт №7 со скоростью 10 мл / мин.

8. Повторите шаги 5-6.

9. Добавьте объем предварительно нагретой свежей среды (AIM-V с IL-2) с объемом, необходимым для достижения плотности клеток 5*10⁶ / мл через порт №8 со скоростью 10 мл / мин.

10. Вернуть реактор в вертикальное положение со скоростью 5 градусов за 1 минуту.

11. Добавьте лентивирус и трансдукционный агент через соответствующие порты №9 и №10 с помощью шприца. Объем лентивируса следует рассчитывать, исходя из титра вируса и желаемой MOI. Объем гексадиметринбромида 6 мкг/ мл (трансдукционный агент).

12. Включите мягкий наклон со скоростью 5 градусов за 1 минуту.

13. После прохождения трансдукции (16 часов) повторите шаги 5-10.

14. Включите мягкий наклон на 5 градусов в минуту и добавьте свежую среду (AIM-V с IL-2) через порт №8 со скоростью 10 мл / мин, чтобы удвоить ее, когда плотность клеток возрастет на 2*10⁶ / мл.

15. Когда будет достигнуто желаемое количество клеток (в соответствии с подсчетом клеток в образце), повторите шаги 5-8.

16. Заполните реактор буфером для упаковки готового препарата через порт №4 (или средой через порт №8, если в текущем эксперименте не проводится тестирование КК по стандартам GMP) объемом, необходимым для получения конечной концентрации клеток продукта (5-10*10⁶ / мл) со скоростью 10 мл / мин.

17. Откройте порт №12 клапана сбора 1 и увеличьте давление внутри реактора с помощью N2 через порт №15.

Примечание: точные параметры давления следует определять экспериментально, но в диапазоне 1-2 бар.

18. Когда сбор клеток окончен (посмотрите в стеклянное окно), закройте клапан и уменьшите давление. Процесс получения CAR-T клеток окончен.

Образцы отбирают через порт №3 или №5, используя безопасную систему вакутейнер (3-5 мл) дважды в день, чтобы проверить жизнеспособность, количество и эффективность трансдукции клеток на протяжении всего процесса.

НЕК293 ПРОЦЕСС

1. Заполните реактор 150 мл предварительно нагретой (37°С) среды (MEM, содержащей 10% FBS (инактивированный нагреванием), 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) через порт №8 со скоростью 20 мл / мин.

2. Посадите 300*10⁶ клеток через порт №6 с помощью шприца с соединением люэровского типа.

3. Включите мягкий наклон 15 градусов за 1 минуту.

4. Растите клетки и добавляйте свежую среду через порт №8 со скоростью 20 мл / мин, чтобы удвоить ее, когда плотность клеток возрастет до 4*10⁶ / мл. Продолжайте до тех пор, пока не будет достигнут максимальный объем реактора (450 мл).

5. Наклоните реактор к горизонтали для сбора / отходов со скоростью 15 градусов в 1 минуту.

6. Откройте сливной клапан (порт №13) и увеличьте давление внутри реактора с помощью N2 через порт №15.

7. Когда весь объем среды извлечен, закройте клапан и уменьшите давление.

8. Заполните реактор предварительно нагретым (37°С) промывочным буфером (ДПБС) на половину объема реактора через порт №7 со скоростью 20 мл / мин.

9. Повторите пункты 6-7.

10. Добавьте предварительно нагретую (37°С) среду через порт №8 со скоростью 20 мл / мин в объеме, равном экстрагированному на шаге 7.

11. Вернуть реактор в вертикальное положение со скоростью 15 градусов за 1 минуту.

12. Добавьте смесь для трансфекции через порт №9 с помощью шприца.

13. Когда трансфекция будет завершена (6 часов), повторите шаги 5-11.

14. Включите мягкий наклон 15 градусов в 1 минуту на 48-72 часа, чтобы получить лентивирус.

15. Когда лентивирус будет готов (48-72 часа), наклоните реактор в горизонтальное положение со скоростью 15 градусов в минуту.

16. Откройте порт №14 клапана 2 для сбора продукта, увеличьте давление внутри реактора с помощью N2 через порт №15 и соберите среду с лентивирусом.

17. Затем вы можете закрыть клапан и повторить шаги 7-8, а затем собрать клетки через порт сбора №12. Процесс НЕК293 окончен.

Образцы отбирают через порт №3 или №5, используя безопасную систему вакутейнер (3-5 мл) дважды в день, чтобы проверить жизнеспособность, количество клеток на протяжении всего процесса.

Хотя настоящая патентная заявка относится к определенному в прилагаемой ниже в формуле изобретения, важно отметить, что настоящая заявка на патент содержит основание для формулировки других изобретений, которые могут, например, быть заявлены как объект уточненной формулы изобретения настоящей заявки или как объект формулы изобретения в выделенной заявке. Такой объект может быть охарактеризован любым признаком или комбинацией признаков, описанных в настоящем документе.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Асимметричный конический биореактор включает герметичный жесткий сосуд, содержащий верхнюю и нижнюю крышки, причем верхняя крышка соединена с сосудом при помощи фланца, при этом внутренняя поверхность сосуда выполнена в форме усеченного конуса, имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию, а на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия для установки датчиков для наблюдения за процессом, на поверхностях сосуда, крышек и фланца выполнены посадочные места для установки одного порта ввода газа, выхода газа, порта взятия образцов, порта введения культур, порта введения реагентов, порта сбора выращиваемых культур, порта отведения отходов. В варианте осуществления биореактор также включает внутри сосуда по меньшей мере одну мембрану, которая разделяет внутренний объем сосуда на два пространства, одно из которых является областью скопления газов, где расположен дренажный клапан с удлинителем для отвода воздушного пузыря. Также описана система биореактора для культивирования клеток, включающая указанный биореактор. Группа изобретений позволяет повысить жизнеспособность культивируемых клеток при одновременном улучшении массообменных характеристик. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 пр.

1. Биореактор для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, включающий

герметичный жесткий сосуд для культивирования, содержащий верхнюю и нижнюю крышки, причем верхняя крышка соединена с сосудом при помощи фланца,

при этом внутренняя поверхность сосуда выполнена в форме усеченного конуса и имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда,

а на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия для установки датчиков для наблюдения за биотехнологическим процессом таким образом, чтобы при установке датчиков они были полностью погружены в культивируемую среду при заполнении ею сосуда,

причем на поверхностях сосуда, верхней крышки, нижней крышки и фланца выполнены посадочные места для установки по крайней мере одного порта ввода газа, порта выхода газа, по крайней мере одного порта для взятия образцов, порта для введения культур, по крайней мере одного порта для введения реагентов, по крайней мере одного порта для сбора выращиваемых культур, порта для отведения отходов.

2. Биореактор для осуществления биотехнологических процессов, протекающих в жидкой фазе при культивировании клеток, микроорганизмов и вирусов, включающий

герметичный жесткий сосуд для культивирования, содержащий верхнюю и нижнюю крышки, причем верхняя крышка соединена с сосудом при помощи фланца,

при этом внутренняя поверхность сосуда выполнена в форме усеченного конуса и имеет в поперечном сечении прямоугольную трапецию с меньшим основанием книзу сосуда,

на внешней поверхности сосуда размещено по меньшей мере два посадочных отверстия для установки датчиков для наблюдения за биотехнологическим процессом таким образом, чтобы при установке датчиков они были полностью погружены в культивируемую среду при заполнении ею сосуда,

причем на поверхностях сосуда, верхней крышки, нижней крышки и фланца выполнены посадочные места для установки по крайней мере одного порта ввода газа, порта выхода газа, по крайней мере одного порта для взятия образцов, порта для введения культур, по крайней мере одного порта для введения реагентов, по крайней мере одного порта для сбора выращиваемых культур, порта для отведения отходов, порта для отведения воздушного пузыря из-под мембраны,

при этом внутри сосуда установлена по меньшей мере одна мембрана, которая разделяет внутренний объем сосуда на по меньшей мере два пространства, одно из которых является областью пространства скопления газов,

и в области пространства скопления газов расположен дренажный клапан с удлинителем для отвода воздушного пузыря из данного пространства.

3. Биореактор по п. 2, в котором сосуд имеет верхнюю крышку и нижнюю крышку, при этом внутреннее пространство сосуда, ограниченное внутренней поверхностью сосуда, разделено на три камеры мембранами, которые и образуют

верхнее пространство, ограниченное внутренней поверхностью верхней крышки и первой мембраной,

нижнее пространство, ограниченное внутренней поверхностью нижней крышки и второй мембраной,

межмембранное пространство, ограниченное первой и второй мембранами.

4. Биореактор по п. 1 или 2, в котором внешняя поверхность сосуда имеет преимущественно вертикальную цилиндрическую форму со скошенной боковой стенкой, сосуд герметизирован крышками с обеих торцов.

5. Биореактор по п. 4, в котором сосуд и крышки имеют посадочные отверстия для установки портов, геометрия и функционал которых выбирается в соответствии с требованиями биотехнологического процесса.

6. Биореактор по п. 1 или 2, в котором датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом являются одноразовыми или многоразовыми.

7. Биореактор по п. 6, в котором датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом выбраны из: датчик растворенного кислорода DO, датчик кислотно-щелочного баланса РН.

8. Биореактор по п. 7, который дополнительно включает одноразовые датчики, размещаемые в посадочных отверстиях сосуда и выбранные из: датчик глюкозы, датчик лактата, датчик температуры, датчик уровня жидкости, датчик давления, датчик биомассы.

9. Биореактор по п. 1 или 2, в котором датчики для наблюдения за биотехнологическим процессом являются предустановленными.

10. Биореактор по п 1 или 2, в котором внутренний объем сосуда составляет приблизительно от 15 мл до 50000 мл.

11. Биореактор по п. 1 или 2, в котором каждому посадочному отверстию соответствует порт, при этом порты выбраны из группы: порт ввода газа, порт выхода газа, порт для взятия образцов, порт для введения культур, порт для введения реагентов, порт для сбора выращиваемых культур, порт для отведения отходов, порт для отведения воздушного пузыря из-под мембраны.

12. Биореактор по п. 1 или 2, в котором материал сосуда и/или крышек является биосовместимым материалом или комбинацией биосовместимых материалов, при этом биосовместимый материал выбирается из группы: стекло, полиэтилен, нержавеющая сталь, поликорбонат, полисульфон.

13. Система биореактора для культивирования клеток, микроорганизмов и вирусов, включающая

биореактор по любому из пп. 1-12 со средством нагрева и управляющую башню, оснащенную

опорно-маятниковым механизмом, выполненным с возможностью удерживания, вращения и раскачивания вертикально установленного в нем сосуда биореактора относительно его вертикальной оси во время биотехнологического процесса,

панелью электрических подключений,

блоком питания,

блоком управления, сконфигурированным

выполнять команды с периферийных вычислительных устройств и/или пульта управления, интегрированного с опорно-маятниковым механизмом, для задания текущих параметров биотехнологического процесса,

получать данные о тенденциях процесса от одноразовых или многоразовых датчиков для получений измерений физических, химических или биологических свойств содержимого сосуда во время биотехнологического процесса,

корректировать параметры биотехнологического процесса в зависимости от полученных измерений путем подачи управляющих сигналов

на механизмы подачи газа, питательных сред в сосуд биореактора, сконфигурированных для доставки газа, питательных сред в сосуд биореактора во время событий в ответ на управляющий сигнал,

на средство нагрева, сконфигурированное для изменения и поддержания температуры в сосуде биореактора в ответ на управляющий сигнал,

и на опорно-маятниковый механизм, сконфигурированный для изменения угла наклона в ответ на управляющий сигнал.

14. Система по п. 13, в которой опорно-маятниковый механизм выполнен в виде зажимного хомута, закрепленного на валу шагового двигателя, установленного на стойке, закрепленной на опорной пластине.

15. Система по п. 13, в которой текущие параметры биотехнологического процесса выбраны из: максимальная скорость и максимальный угол наклона сосуда биореактора от вертикальной оси опорно-маятникового механизма, объем и температура подаваемых реагентов и скорость их подачи, температура нагрева содержимого сосуда, давление в сосуде, рН, DO, Glu, Lac, Biomass.

16. Система по п. 13, в которой управляющая башня оснащена перильстатическими насосами для подачи реагентов в сосуд биореактора.

17. Система по п. 13, в которой пульт управления расположен на корпусе управляющей башни и выполнен в виде сенсорного дисплея, подключенного к блоку управления.

18. Система по п. 17, в которой пульт управления выполнен с возможностью передавать данные в вычислительный модуль, который выдает команды блоку управления.

19. Система по п. 13, в которой периферийные вычислительные устройства выбираются из: ноутбук, персональный компьютер, мобильный телефон, и выполнены с возможностью запуска на них веб-приложения для задания текущих параметров биотехнологического процесса.

20. Система по п. 19, в которой периферийные вычислительные устройства выполнены с возможностью передавать данные в вычислительный модуль, который выдает команды блоку управления.

21. Система по п. 13, в которой панель электрических подключений выполнена с возможностью подключения опорно-маятникого механизма, многоразовых или одноразовых датчиков, запорной арматуры, механизмов подачи реагентов в сосуд биореактора, оборудования, необходимого для обеспечения биотехнологического процесса.

22. Система по п. 13, в которой блок питания выполнен с возможностью питания опорно-маятникового механизма, перильстатических помп, датчиков, дисплея, световой и звуковой индикации, вентиляторов, устройства управления, пережимных клапанов, проточного нагревателя жидкости, средства нагрева.

23. Система по п. 13, в которой на корпусе управляющей башни расположены LED-индикаторы, связанные с блоком управления и сигнализирующие по меньшей мере об одном из событий:

- аварийная ситуация;

- завершение процесса;

- отклонение показателей процесса от требуемых;

- готовность оборудования к началу процесса;

- нахождение системы в работе.

24. Система по п. 13, в которой средством нагрева является нагревательная рубашка, которая надевается снаружи на внешнюю поверхность сосуда для поддержания температуры культивирования биореактора.

25. Система по п. 13, в которой материалом сосуда биореактора является нержавеющая сталь, сосуд имеет по меньшей мере одно отверстие в стенке сосуда для установки нагревательного картриджа, а средством нагрева является нагревательный картридж для нагрева стенок сосуда, вставляемый в одно из указанных отверстий.

26. Система по п. 13, в которой средством нагрева является нагревательный картридж, вводимый непосредственно во внутреннее пространство сосуда.

27. Система по п. 13, в которой средством нагрева является встроенный нагреватель в корпусе сосуда биореактора.

28. Система по п. 13, в которой средством нагрева является теплопроводящий напыленный слой технологией вакуумного напыления на внутренней или внешней поверхности сосуда с припаянными к напыленному слою и выведенными наружу проводами.

29. Система по п. 13, которая дополнительно включает систему проточного подогрева жидкости, подаваемой в реактор, до необходимой температуры.

30. Система по п. 13, в которой на управляющей башне устанавливается монтажная пластина таким образом, чтобы она находилась в области расположения сосуда биореактора, для расположения на ней оборудования, требуемого для обеспечения процесса, выбранного из: трубопровод, пережимные клапаны, арматура, оксигенатор, ловушки для пузырьков, проточный нагреватель, проточные датчики температуры, проточные датчики DO, проточные датчики наличия среды, холодильная камера для хранения и подачи реагентов, необходимых для осуществления биотехнологических процессов.

31. Система по п. 13, в которой управляющая башня подключена к газовой станции для подготовки и подачи газов, необходимых для осуществления процессов.