Способ скрининговой неинвазивной диагностики болезни Крона методами метаболомно-геномного профилирования Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6872 G01N33/50 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящая заявка относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу определения типа воспалительного заболевания кишечника у индивида, а именно последовательному выявлению количественного содержанию валериановой кислоты в образцах стула для верификации воспалительного процесса в кишечнике и последующей дифференциальной диагностики с выявлением генетического риска развития язвенного колита или болезни Крона в ходе оценки полиморфизмов генов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Среди наиболее распространенных заболеваний кишечника различают болезнь Крона и язвенный колит. Данные патологии занимают одно из ведущих мест среди заболеваний органов пищеварения, что связано ни только с частотой выявления данного типа заболеваний, но и особенностью течения, высокой вероятностью формирования осложнений и, как результат, летальностью. (Burisch, J.; Munkholm, P. Inflammatory bowel disease epidemiology. Curr. Opin. Gastroenterol. 2013, 29, 357-362.). Основной проблемой диагностики ВЗК является высокий уровень вариабельности симптомов, а также скрытое течение, что способствует не только позднему выявлению, но и не своевременной терапии. В этой связи одной из важнейших задач является поиск диагностического решения, направленного на верификацию воспалительного процесса в кишечнике и последующую дифференциальную диагностику. (Cosnes, J.; Gower-Rousseau, С.; Seksik, P.; Cortot, A. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2011, 140, 1785-1794.). Верификация воспалительного процесса возможна по факту его наличия, благодаря молекулярным методам исследования, даже без характерных симптомов, таких как боль, изменение характера стула. Однако дифференциальная диагностика проводится уже в ходе инструментального исследования для пациентов с верифицированным воспалительным процессов в ЖКТ.

Два основных вида ВЗК - болезнь Крона и язвенный колит имеют различные варианты патогенеза и особенности течения заболеваний, однако на ранних стадиях трудно дифференциально диагностируемы, что зачастую способствует несвоевременному лечению (Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Crohn's disease. Lancet 2012, 380, 1590-1605). В случае болезни Крона ошибочная диагностика провоцирует переход заболевания в тяжелую или хроническую форму (Ordas, I.; Eckmann, L.; Talamini, M.; Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Ulcerative colitis. Lancet 2012, 380, 1606-1619.).

В этой связи основной проблемой, которую необходимо решать является поиск новых вариантов ранней верификации воспалительного процесса в ЖКТ, а также способы дифференциальной диагностики еще до появления характерной клинической картины заболеваний.

Имеющиеся на сегодняшний день комплексные подходы к поиску и апробации новых маркеров ВЗК базируются в основном на данных омиксных исследований. Значительный арсенал омиксных технологий является важнейшим этапом на пути поиска и последующей верификации наиболее информативных маркеров заболеваний (Yunki Yau, Rupert W Leong, Ming Zeng, Valerie С Wasinger Proteomics and metabolomics in inflammatory bowel disease J Gastroenterol Hepatol. 2013 Jul;28(7):1076-86.). Двухстадийный исследовательский процесс строится на омиксном поиске значимо отличных молекулярных маркеров с последующий этапом проверки выявленных отличий на независимой выборке. Важным дополнением является метаматематическая адаптация полученных результатов для эффективной трансляции создаваемых вариантов диагностики в клиническую практику.

Важное требование к современной молекулярной диагностике - ее малая инвазивность, для повышения охвата тестируемого населения. Известно, что инструментальные методы исследования, такие как колоноскопия, являясь "золотым стандартом" диагностики патологий ЖКТ имеют соответствующие риски и вызывают чувство опасения у пациентов перед предстоящей процедурой. В свою очередь, данная настороженность может усугубить течение заболевания при несвоевременном обращении, что сводит на нет попытки выявить указанные патологии на ранней стадии.

Молекулярные методы диагностики призваны не заменить, но дополнить инструментальные способы исследования. Такие биологические образцы, как сыворотка крови, кал, моча - являются кладезем полезной прогностической информации, а все более развивающиеся методы исследования молекулярных маркеров способствуют глубокому проникновению в понимание механизмов патогенеза заболеваний.

Однако обилие молекулярных методов исследования приводит к формированию значительного объема не интерпретируемых результатов. Особенно при анализе таких сложных структур, как геном, протеом или метаболом биологического образца. В этой связи необходимо найти удачное решение, которое позволит перевести найденные маркеры из терминов молекулярной биологии в термины практической медицины, а именно сформировать удобные для итогового прочтения результаты молекулярной диагностики.

Известно, что воспалительные заболевания имеют в своей основе генетическую предрасположенность (Barrett, J.C.; Hansoul, S.; Nicolae, D.L.; Cho, J.H.; Duerr, R.H.; Rioux, J.D.; Brant, S.R.; Silverberg, M.S.; Taylor, K.D.; Barmada, M.M.; et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease. Nat. Genet. 2008, 40, 955-962.).

Полногеномные исследования болезни Крона и язвенного колита позволили подтвердить генетическую основу ВЗК, учитывая семейную распространенность и частоту совпадений в парах близнецов (Franke, A.; McGovern, D.P.; Barrett, J.C.; Wang, K.; Radford-Smith, G.L.; Ahmad, Т.; Lees, C.W.; Balschun, Т.; Lee, J.; Roberts, R.; et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci. Nat. Genet. 2010, 42, 1118-1125). Большинство идентифицированных генетических локусов были обнаружены с помощью исследований ассоциации всего генома (Molodecky, N.A.; Soon, I.S.; Rabi, D.M.; Ghali, W.A.; Ferris, M.; Chernoff, G.; Benchimol, E.I.; Panaccione, R.; Ghosh, S.; Barkema, H.W.; et al. Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review. Gastroenterology 2012, 142, 46-54). Так в данных исследованиях были определены 163 локуса, связанных с развитием ВЗК, из которых 110 локусов оказались общими для БК и ЯК, другие специфически связаны с БК (30 локусов) или ЯК (23 локуса). В ходе ряда широкомасштабных геном-ассоциированных исследований удалось определить ряд полиморфизмов генов: NOD2 (rs2066845; rs2066847; rs17221417); ATG16L1(rs2241880); IL23R(rs2201841), DEFB1(rs11362), ассоциированных с болезнью Крона. Кроме того, множественные выявленные гены в пути IL-23 (IL23R, IL12B, STAT3, JAK2 и TYK2) оказались связанными как с ЯК, так и с БК (Barrett, J.C.; Hansoul, S.; Nicolae, D.L.; Cho, J.H.; Duerr, R.H.; Rioux, J.D.; Brant, S.R.; Silverberg, M.S.; Taylor, K.D.; Barmada, M.M.; et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease. Nat. Genet. 2008, 40, 955-962.). В нокаутных моделях животных с дефектами геном, обуславливающих желудочно-кишечный иммунный ответ удалось смоделировать воспалительные реакции в ответ на симбионтную флору [22]. Однако варианты потери функции гена являются скорее триггерами заболевания. Благодаря множественным исследованиям уже сегодня можно формировать генетические панели маркеров, призванные уточнить риск формирования не только типа патологического процесса, но и сформировать предсказательную модель эффективности и безопасности применения лекарственных препаратов при терапии ВЗК.

Кроме генетических исследований надежные данные для формирования диагностической модели ВЗК также получены при анализе метаболома. Некоторые типы метаболитов могут уже на ранних стадиях сигнализировать о наличие воспалительной реакции в пределах ЖКТ (McIntosh, K.; Reed, D.E.; Schneider, Т.; Dang, F.; Keshteli, A.H.; de Palma, G.; Madsen, K.; Bercik, P.; Vanner, S. Fodmaps alter symptoms and the metabolome of patients with IBS: A randomised controlled trial. Gut 2016.).. Воспаление является не только частью патологического процесса формирования ВЗК, но и опосредует ряд существенных изменений в структуре микрофлоры ЖКТ. Но выявить именно воспалительную реакцию в начале формирования патологии на уровне имеющихся биохимических, генетических или иных существующих тестов невозможно, поскольку даже сам пациент не связывает транзиторные нарушения пищеварения с развитием заболевания. В этом контексте важно, чтобы применяемые методы исследования позволяли бы выявить воспаление и направить пациента на следующих раунд исследований для прицельной диагностики тогда, когда патология еще не имеет ярко выраженной клинической картины.

В этой связи малейшие изменения при воспалительной реакции в кишечнике, на уровне процессов пищеварения или функциональной активности микрофлоры могут регистрироваться методами метаболомики, позволяющей проводить анализ низкомолекулярных веществ количественное изменение которых в первую очередь подвергается изменениям.

Происходящие в ЖКТ процессы пищеварения, как и функциональная активность микрофлоры в полной мере могут быть оценены путем метаболомного анализа стула пациента. При данном исследовании большое внимание уделяется оценке комплекса короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), активно продуцируемых как микрофлорой ЖКТ, так и формирующихся в процессе пищеварения (De Preter, V.; Machiels, K.; Joossens, M.; Arijs, I.; Matthys, С.; Vermeire, S.; Rutgeerts, P.; Verbeke, K. Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating compounds in IBD. Gut2015, 64, 447-458.). Известно, что количественное изменение некоторых КЖК связано с популяционными изменениями в составе микрофлоры вследствие развития патологии ЖКТ (Rehman, A.; Lepage, P.; Nolte, A.; Hellmig, S.; Schreiber, S.; Ott, S.J. Transcriptional activity of the dominant gut mucosal microbiota in chronic inflammatory bowel disease patients. J. Med. Microbiol. 2010, 59, 1114-1122.). Однако данная оценка проводится таргетно, т.е. внимание уделяется в большей степени относительному количественному содержанию ацетата, пропионата и бутирата. Тогда как спектр легколетучих соединений (ЛС) значительно более разнообразен и должен быть исследован совокупно. Новейшие инструменты для оценки летучего состава образцов стула уже активно эксплуатируются в формате научных исследований и работ. Такие методы, как газожидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (ГХ-МС), позволяют получить исчерпывающую информацию о метаболитах в анализируемых образцах (Ahmed, R Greenwood, В Costello, N Ratcliffe, С S Probert. Investigation of faecal volatile organic metabolites as novel diagnostic biomarkers in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 2016 Mar;43(5):596-611). Однако именно для образцов стула важно избрать такой способ пробоподготовки, который не затрагивал бы существенно количественно анализируемый спектр летучих соединений. Для этих целей ГХ-МС дополняется методом парофазной экстракции, что позволяет минимизировать этапы пробоподготовки и получить более полную информацию о содержании в образце короткоцепочечных, среднецепочных и длинноцепочечных жирных кислот, кислот с фенильным радикалом, альдегидов, гетероциклов и других (Sofia El Manouni El Hassani, Ruud J Soers, Daniel J С Berkhout, Hendrik J Niemarkt, Hans Weda, Tamara Nijsen, Marc A Benninga, Nanne K H de Boer, Tim G J de Meij, Hugo H Knobel. Optimized sample preparation for fecal volatile organic compound analysis by gas chromatography-mass spectrometry. Metabolomics. 2020 Oct 10;16(10):112.).

Метод парофазной экстракции с последующим анализом ЛС позволяет получить информацию о более чем 200 соединений и произвести количественное профилирование в рамках сравнительного анализа проб стула от пациентов с ВЗК и нормы (Zakharzhevskaya D. Kardonsky, D. Konanov, A. Silantyev, A. Troshenkova, S. Lyamina, I. Kolesnikova, E. Zhgun, E. Ilina, I. Maev, V. Govorun. HS-GC/MS-based metabolomics approach for volatile compounds analysis in IBD. N. UEG Journal Vol 9 Issue 8, Oct 2021, p. 471). Однако анализ профиля большого количества соединений едва ли может являться удобным способом быстрой оценки состояния пациента. В спектре работ по анализу стула методом ГХ, предоставленных к рассмотрению на предмет поиска новых маркеров ВЗК большое внимание уделяется значимости отдельных КЖК, таких как бутират, пропионат и т.д. В этой связи отдельные соединения могут быть полезными для установления самого факта наличия воспалительной реакции. С другой стороны, воспаление может быть вызвано ни только развитием язвенного колита и болезни Крона. В этой ситуации двухэтапный подход к ранней диагностике ВЗК с применением генетического исследования позволил бы на первой стадии посредством исследования относительного содержания выбранного метаболита установить вероятность воспаления ЖКТ, на второй стадии - генетическое исследование позволило бы провести скрининговую диагностику потенциального риска развития болезни Крона на фоне выявленного риска развития ВЗК. При отсутствии симптоматики, но выявлении воспалительной реакции по факту обнаружения метаболомного маркера с последующим проведением генетического тестирования позволило бы более пристально наблюдать за пациентом и предотвратить развитие патологии на начальных этапах ее развития.

Таким образом, в целях повышения эффективности выявления воспалительных заболеваний на ранней стадии, а также оценке риска развития болезни Крона необходимо выявить наборы метаболитов и полиморфизмов генов, комбинации которых достоверно характеризуют указанную патологию. Для оценки потенциала данного способа необходимо рассмотреть имеющиеся в данной области заявки по выявлению маркеров воспаления в образцах стула и предлагаемые схемы интерпретации получаемых данных.

Международная заявка WO/2021/113989 описывает способ диагностики болезни Крона и язвенного колита на основании определения метаболитов в образцах мочи, таких как серии, гипоксантин, кинуренин, треонин, диметилглицин, триптофан, индоксилсульфат, фенилацетилглутамин, сиаловая кислота, 5-гидрокси-6-индолил-о-сульфат, 5-(Δ-карбоксибутил)гомоцистеин и/или анион, имеющий m/z:RMT:полярность 345,1553:0,770:n, также предлагается определение таких метаболитов в образцах стула, как кетодезоксихолевая кислота, холевая кислота, холин, триптофан, триметиллизин, серии, масляная кислота, молочная кислота, гипоксантин и/или гуанин.

Международная заявка US 2018/0203018 описывает способ идентификации фенотипа болезни Крона у обследуемых, в основе которого лежит определение методом масс-спектрометрии трех и более идентифицированных метаболитов в разбавленном образце фекалий. Идентифицированные метаболиты выбирают из общего пула 21 метаболитов, сопоставляя полученные данные со средними уровнями метаболитов у здоровых субъектов. В качестве метаболитов интереса заявлены гликохолат, таурохолат и хенодезоксигликохолат. Гликохолат в указанном контексте используется в качестве маркера, определяющего БК, а повышенные уровни таурохолата или хенодезоксигликохолата позволяют предположить поражение подвздошной кишки. Также для дифференцировки фенотипа болезни Крона предложено использование (Z)/4/гидроксифенил-ацетальдоксима - для поражения толстой кишки, а арахидоновая кислота или октадекатриеновая кислота - для идентификации поражения подвздошной кишки.

Международная заявка US 8679457 описывает способ диагностики ВЗК, в том числе болезни Крона и язвенного колита, на основании применения различных биомаркеров воспалительных заболеваний кишечника. Предлагается способ дифференциальной диагностики болезни Крона и язвенного колита по анализу биологического образца обследуемого для определения уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров воспалительного заболевания кишечника, включающих 6-бета-ОН-литохолат, 7-альфа-гидрокси-3-оксо-4-холестеноат (7-НОСА), дезоксихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту и гиодезоксихолевую кислоту; а также сравнение уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров в образце с референсными уровнями, установленными для болезни Крона, язвенного колита.

Международная заявка WO 2012/127213 описывает способ выявления или мониторинга синдрома раздраженного кишечника (СРК) или воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), на основании обнаружения одного или нескольких летучих органических соединений (ЛОС) в образце, взятом у субъекта. В качестве биологического материала заявлены фекалии или моча. Согласно представленным данным, ЛОС могут представлять собой один или несколько этиловых эфиров пропановой или бутановой кислот, пропановой кислоты, бутановой кислоты, метилового эфира бутановой кислоты, метилового эфира пропановой кислоты, 3-метилбутановой кислоты, 1-бутанола, 1-пропанола, индола, 2-метилпропановая кислота, 1-пентанол, гидроксимочевина, метилциклобутан, (R)-(-)-2-амино-1-пропанол, 2-гидроксипропанамид, гидразид уксусной кислоты, 2-пентанон, пиррол, 1-бутокси- 2-пропанол, 2-бутанон, диметилдисульфид, 2-метил-1,3-диоксолан и диоксид серы.

В международной заявке WO 2012/127213 А1 представлен способ выявления или мониторинга синдрома раздраженного кишечника (СРК) или воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), на основании обнаружения одного или нескольких летучих органических соединений (ЛОС) в образце, взятом у субъекта. В качестве биологического материала заявлены фекалии или моча. Согласно представленным данным, ЛОС могут представлять собой один или несколько этиловых эфиров пропановой или бутановой кислот, пропановой кислоты, бутановой кислоты, метилового эфира бутановой кислоты, метилового эфира пропановой кислоты, 3-метилбутановой кислоты, 1-бутанола, 1-пропанола, индола, 2-метилпропановая кислота, 1-пентанол, гидроксимочевина, метилциклобутан, (R)-(-)-2-амино-1-пропанол, 2-гидроксипропанамид, гидразид уксусной кислоты, 2-пентанон, пиррол, 1-бутокси- 2-пропанол, 2-бутанон, диметилдисульфид, 2-метил-1,3-диоксолан и диоксид серы.

В международной заявке WO/2020/087130 описан способ определения прогноза развития ВЗК у индивидуума, включающий стадию определения наличия или отсутствия полиморфного маркера в гене рецептора интерлейкина-23 (IL23R) и/или белке в биологическом образце обследуемого, где полиморфный маркер представляет собой или содержит вариант rs 1209026 и/или маркер в неравновесном сцеплении с ним.

В заявке US 2015259748 представлен способ определения наличия или отсутствия генетических вариантов NOD2, TLR8, TLR2, CARD8, CARD15 и/или JAK3 для диагностики, прогнозирования прогрессирования ВЗК у индивидуума.

В заявке US 2012/0003633 представлены улучшенные способы исследования последовательностей нуклеиновых кислот, в которых используется по меньшей мере один дополнительный зонд, специфичный для варианта (псевдо)гена нуклеиновой кислоты-мишени. Предлагаемые сведения заявлены как способ определения предрасположенности к воспалительному заболеванию кишечника (ВЗК) и/или болезни Крона у индивидуума, включающий определение присутствия или отсутствия KIR2DL2 и KIR2DL3 в образце нуклеиновой кислоты указанного индивидуума; определение наличия или отсутствия лиганда HLA С1 и/или С2 в образце указанного индивидуума. Предлагается использовать состояние гетерозиготности по KIR2DL2, KIR2DL3 в сочетании с гомозиготностью по С1 как способ оценки предрасположенности к ВЗК и/или болезни Крона, а гетерозиготность по KIR2DL2, KIR2DL3 в сочетании с гомозиготностью по С2 в качестве прогноза протективного варианта ВЗК и/или болезни Крона, при этом набор зондов, имеет по меньшей мере 70% идентичности последовательности с набором зондов 415B/415C/415D, и/или 417А/417В/417С, и/или 420А/420В, и/или 706А/706В.

Рассмотренные международные заявки предлагают способы анализа метаболитов для верификации и дифференциальной диагностики таких заболеваний, как болезнь Крона и язвенный колит. Предлагаемые подходы к анализу генетической предрасположенности выступают как отдельные способы определения генетического риска развития ВЗК и/или болезни Крона. Предлагаемые технические решения позволяют выявить широкий спектр отличий анализируемых маркеров при сравнении патологии и нормы. При всем разнообразии выявляемых маркеров у предложенных способов есть недостатки, которые могут преодолены в описываемом в данной заявке способе.

Во-первых, работа с образцом стула сопряжена с необходимостью использования различных способов пробоподготовки, а также анализа с применением твердофазной экстракции. Большинство описанных способов исследования метаболома стула содержат многоступенчатые протоколы пробоподготовки. Высушивание и расчет итоговых концентраций на количество исходного материала также не является универсальным методическим решением, а результат в свою очередь полностью зависит от выбранного метода анализа и технических параметров используемого оборудования. Парофазный способ экстракции полностью решает вопрос о методике пробоподготовки, сводя к минимуму число необходимых подготовительных этапов, кроме того позволяет в полной мере проанализировать весь спектр летучих компонентов, без существенного влияния на исходные концентрационные соотношения компонентов метаболома в образце стула.

Во-вторых, получая полный спектр летучих соединений важнейшим этапом становится интерпретация полученных данных. В описанных способах анализа метаболома стула для диагностики ВЗК в качестве оценочной метрики приводят значения относительных концентраций компонентов метаболома, что в значительной степени является вариативным параметром и во многом определяется методическим подходом, используемым для анализа и идентификации метаболитов. Трансляция результатов описанных способов в область их практического применения, а именно использования данных клиническими специалистами для диагностики ВЗК является полностью невозможным. Получаемые данные хорошо интерпретируются профильными специалистами в области масс-спектрометрии и биоинформатики, тогда как должны легко быть интерпретируемы в первую очередь практикующими врачами. Описываемый в предлагаемой заявке способ решает проблему интерпретации, позволяя обработать в минимальном формате получаемые данные и благодаря представленному расчетному решению перевести значения относительных концентрации или интенсивностей анализируемых метаболитов в количественную метрику риска развития патологии.

В-третьих, в предлагаемой заявке реализован комплексный подход к скрининговой диагностике ни только ВЗК, но и болезни Крона. Пошаговый протокол с привлечением метаболомики и генетики позволяет последовательно выработать решение о тактике ведения пациента по данным метаболомного и геномного исследования. В частности предполагается анализ содержания метаболита, валериановой кислоты, отобранного в качестве прогностического маркера по результатам тестирования нескольких независимых выборок образцов стула. С другой стороны, путем оценки генетических маркеров, доступных в литературных источниках, согласно полученным расчетам произведен отбор наиболее значимых генов-кандидатов, способствующих как оценки риска развития ВЗК на первом этапе, так и Болезни Крона - на втором.

В-четвертых, в предлагаемой заявке реализован комплексный геномно-метаболомный подход к скрининговой диагностике ВЗК и болезни Крона посредством полностью неинвазивного метода исследования, что исключает любые побочные или негативные эффекты в процессе забора биологического материала. Для оценки рисков формирования ВЗК или болезни Крона в анализ берется образец фекалий тестируемого, который используется как для выделения метаболитов, так и для получения ДНК.

Описание изобретения

Авторами изобретения был разработан способ выявления воспалительных заболеваний кишечника и определения риска развития болезни Крона на основании данных относительно го количественного содержания валериановой кислоты в образцах стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции, а также генетического тестирования ДНК, выделенной из образцов стула.

Исходно в биологическом образце выполняется определение относительной концентрации валериановой кислоты методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции. При расчете относительных концентраций в качестве значимых рассматриваются следующие диапазоны: 0.0 до 0.1 относительных единиц - вероятность наличия ВЗК при воспалении снижается от 85% до 50%. Т.е. чем меньше количественное содержание валериановой кислоты, тем выше риск развития ВЗК у тестируемого. В дополнение к определению концентрации валериановой кислоты проводится генетический анализ следующих полиморфизмов:

• IRGM RS4958847

• ICOSLG RS762421

Исходя их полученных вариантов генотипов рассчитывается кумулятивный генетический риск, который при значении выше 1,36 считается диагностический значимым, т.е. может быть интерпретирован, как высокий генетический риск предрасположенности к формированию ВЗК.

Таким образом, первый этап позволяет на основании данных ГХ-МС и генетического анализа рассчитать как вероятность воспалительной реакции, так и определить принадлежность воспалительного процесса к группе ВЗК, среди которых превалируют ЯК и БК.

Далее выполняется прицельная скрининговая диагностика БК на основании данных генетической предрасположенности:

• NOD2 rs2066844

• NOD2 rs2066845

• NOD2 rs17221417

• RS7807268

• SLC22A4 RS1050152

Оценка риска выполняется согласно получаемым данным. Кумулятивный риск рассчитывается исходя из данных генетического тестирования и полученных вариантов генотипов. При значении кумулятивного риска выше 1,18 полученное значение считается диагностически значимым, т.е. может быть интерпретировано, как высокий генетический риск предрасположенности развития болезни Крона.

Краткое описание изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления риска формирования воспалительных заболеваний кишечника на основании данных метаболомного исследования валериановой кислоты в образце стула и включает несколько этапов:

а) выделение метаболитов из образца стула,

б) анализ спектра метаболитов стула, среди которых: Acetic acid, Benzaldehyde, Propanoic acid, Propanoic acid, 2-methyl-, Butanoic acid, Butanoic acid, 3-methyl-, Pentanoic acid, Pentanoic acid, 4-methyl-, Hexanoic acid, Heptanoic acid, Phenol, Octanoic acid, p-Cresol, Hexadecanal, n-Decanoic acid, 2,4-Di-tert-butylphenol, n-Nonadecanol-1, Indole, Indole, 3-methyl-, Benzeneacetic acid, Hydrocinnamic acid, Tetradecanoic acid, n-Hexadecanoic acid, Valeric acid, Octadecanoic acid методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции,

в) расчет относительной интенсивности валериановой кислоты, получаемой путем соотнесения с суммарным ионным током анализируемых в образце стула метаболитов (б)

г) Соотнесение полученного значения относительной концентрации валериановой кислоты с величиной риска развития ВЗК, согласно приведенной схеме: при значении относительной концентрации валериановой кислоты от 0,1 до 0,12 считать риск развития ВЗК равным от 50 до 85%.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления риска формирования воспалительных заболеваний кишечника на основании данных геномного исследования полиморфизмов в образце стула и включает несколько этапов:

а) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421

б) расчет кумулятивного риска развития ВЗК согласно данным генотипирования IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421, где значение риска выше 1,36 считается диагностически значимым.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления риска формирования Болезни Крона на основании данных геномного исследования полиморфизмов в образце стула и включает несколько этапов:

а) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152

б) расчет кумулятивного риска развития болезни Крона согласно данным генотипирования NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152, где значение риска выше 1,18 считается диагностически значимым.

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемые названия метаболитов, описанный метод газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, методы парофазной экстракции метаболитов, расчет коэффициентов риска развития воспалительного заболевания ЖКТ хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Описанные методы экстракции метаболитов проводятся согласно стандартному протоколу выделения метаболитов.

Подробное описание изобретения

На первом этапе комплексного исследования проводится оценка риска формирования ВЗК. Методами газовой хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, также в ходе генетического тестирования устанавливается как вероятность наличия воспалительной реакции у тестируемого на момент скрининга, так и производится оценка риска формирования ВЗК. Генетическое исследование на данном этапе позволяет разграничить клинические варианты транзиторного и ассоциированного с ВЗК воспаления и сформировать соответствующие риски в отношении ВЗК. Для этого проводится забор образца стула у пациента и одновременное выделение метаболитов для ГХ-МС исследования и геномной ДНК для генетического тестирования.

Выделение метаболитов проводят методом парофазной экстракции. Под ГХ-МС анализом мы понимаем прицельное исследование группы отобранных метаболитов методом газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией с последующим анализом относительного количественного содержания следующих метаболитов: Acetic acid, Benzaldehyde, Propanoic acid, Propanoic acid, 2-methyl-, Butanoic acid, Butanoic acid, 3-methyl-, Pentanoic acid, Pentanoic acid, 4-methyl-, Hexanoic acid, Heptanoic acid, Phenol, Octanoic acid, p-Cresol, Hexadecanal, n-Decanoic acid, 2,4-Di-tert-butylphenol, n-Nonadecanol-1, Indole, Indole, 3-methyl-, Benzeneacetic acid, Hydrocinnamic acid, Tetradecanoic acid, n-Hexadecanoic acid, Valeric acid и Octadecanoic acid. Под относительным количественным содержанием мы понимаем сравнение интенсивностей исследуемых метаболитов нормированных на общий ионный ток. Для валериановой кислоты расчет относительной интенсивности выглядит следующим образом:

Где, I_отн - относительная интенсивность метаболита

I_val - интенсивность валериановой кислоты (величина ионного тока по данному метаболиту)

- интенсивность всех анализируемых метаболитов (величина суммарного ионного тока)

В ходе применения ряда классификаторов был выбран оптимальный для формирования шкалы рисков по получаемым данным об относительной интенсивности валериановой кислоты: при значении относительной концентрации валериановой кислоты от 0,1 до 0,12 считать риск развития ВЗК на фоне воспаления равным от 50 до 85%.

Генетическое тестирование полиморфизмов генов с целью подтверждения возможных рисков развития ВЗК на фоне воспаления проводится в несколько этапов. На первом этапе генетического тестирования по определению риска развития ВЗК посредством набора Qiagen Stool mini kit (США) проводится выделение ДНК из образцов стула. На втором этапе генетического тестирования по определению риска развития ВЗК проводится ПЦР для получения фрагментов ДНК с целевыми полиморфизмами. Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: ПЦР-буфер (670 mmol/l Tris-HCl (рН 8.8), 166 mmol/l (NH₄)₂SO₄, 1% Triton Х-100, 25 mmol/l MgCl₂), 250 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 5 пмоль каждого праймера и 1 ед. Taq-полимеразы (Promega, США), объем реакционной смеси - 5 мкл.

Программа ПЦР для амплификации фрагментов ДНК включает следующие этапы:

1. Нагрев блока: 94°С - 1 мин

2. Денатурация ДНК: 94°С - 30 сек

3. Отжиг праймера: 59°С - 10 сек

4. Элонгация: 72°С - 20 сек

5. Выполнить 37 циклов

Наборы используемых для амплификации праймеров, среди которых IRGM-F, IRGM-R, ICOSLG F и ICOSLG R представлены в приложении 1.

На третьем этапе генетического тестирования по определению риска развития ВЗК для удаления из смеси всех незадействованных дезоксинуклеотидтрифосфатов проводится реакцию дефосфорилирования. Для этого к смеси добавляют 5 мкл раствора, содержащего 1 ед. щелочной фосфатазы (Shrimp Alkaline Phosphatase) (Fermentas, Литва) в 0,5 мкл буфера, использованного ранее для постановки первого варианта ПЦР. Реакцию проводят по программе: 37°С 30 мин, 85°С 10 мин.

На четвертом этапе генетического тестирования по определению риска развития ВЗК проводится реакция минисеквенирования путем добавления к смеси, полученной ранее на этапах ПЦР и дефосфорилирования, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкл буфера, использованного при постановке первого варианта ПЦР, 1,5 ед. термоустойчивой ДНК-полимеразы (TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония)), по 1 пмоль необходимых дидезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пмоль олигонуклеотидного зонда. Реакция включает следующие этапы:

1. Нагрев блока: 94°С - 5 мин

2. Денатурация ДНК: 94°С - 20 сек

3. Отжиг праймера: 55°С - 10 сек

4. Элонгация: 72°С - 10 сек

5. Выполнить 35 циклов

Нуклеотидные последовательности используемых для минисеквенирования зондов, среди которых IRGM-Z и ICOSLG Z представлены в приложении 1.

На финальном этапе генетического тестирования по определению риска развития ВЗК для улучшения качества анализа продуктов реакции к образцам добавляется по 12 мкл полимерной ионообменной смолы (Sequenom, США), чтобы очистить реакционную смесь от катионов металлов. На титановый чип (AnchorChip 400/384, Bruker Daltonics) наносят матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3'-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, Германия) в 50% ацетонитриле (Merck, Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного (Fluka, Германия). Очищенные ионнообменной смолой образцы наносят на кристаллы матрицы и проводят масс-спектрометрический анализ.

Спектры получают с использованием МАЛДИ-времяпролетного масс-спектрометра Autoflex (Bruker Daltonics, Германия). Все измерения проводят в линейном режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением - 20.0 кВ, накапливающем электроде - 18.65 кВ, фокусирующей линзе - 9.2 кВ и временем задержки анализатора - 400 нсек. Для получения каждого масс-спектра используют 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца.

Полученные значения масс сравнивают с данными для каждого варианта генотипа.

Варианты масс для анализируемых генотипов:

Для оценки кумулятивного риска формирования ВЗК на основании генетических данных используют следующую схему расчета популяционного риска:

Где MAG - вклад данного аллеля в суммарный риск

FR. allelic - популяционная частота по данному аллелю

FR.gen - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга

FR.gen % - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга, выраженная в процентах

AVG - вклад генотипа в популяционную частоту

Pop. Risk - величина популяционного риска, полученная путем сложения AVG для всех вариантов генотипов анализируемых полиморфизмов, деленная на количество анализируемых полиморфизмов или согласно формуле:

Значение индивидуального риска рассчитывается согласно данным показателя MAG согласно формуле:

Полученное значение индивидуального риска сравнивается со значением популяционного риска. При значении индивидуального риска равном или большем чем 1,36 считать риск формирования ВЗК диагностически значимым.

На втором этапе комплексного исследования проводится оценка генетического риска формирования болезни Крона (БК) при выявлении рисков развития ВЗК на предыдущем этапе.

Генетическое тестирование полиморфизмов генов с целью подтверждения возможных рисков развития БК на фоне выявленных рисков формирования ВЗК проводится в несколько этапов. На первом этапе генетического тестирования по определению риска развития БК проводится ПЦР для получения фрагментов ДНК с целевыми полиморфизмами. Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: ПЦР-буфер (670 mmol/l Tris-HCl (рН 8.8), 166 mmol/l (NH₄)₂SO₄, 1% Triton Х-100, 25 mmol/l MgCl₂), 250 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 5 пмоль каждого праймера и 1 ед. Taq-полимеразы (Promega, США), объем реакционной смеси - 5 мкл.

Программа ПЦР для амплификации фрагментов ДНК включает следующие этапы:

6. Нагрев блока: 94°С - 1 мин

7. Денатурация ДНК: 94°С - 30 сек

8. Отжиг праймера: 59°С - 10. сек

9. Элонгация: 72°С - 20 сек

10. Выполнить 37 циклов

Нуклеотидные последовательности используемых для амплификации праймеров, среди которых 44NOD2 - F, 44NOD2 - R, 45NOD2 - F, 45NOD2 - R, 17NOD2 - F, 17NOD2 - R, rs7807268 - F, rs7807268 - R, SLC22A4 - F, SLC22A4 - R представлены в приложении 1.

На втором этапе генетического тестирования по определению риска развития БК для удаления из смеси всех незадействованных дезоксинуклеотидтрифосфатов проводится реакцию дефосфорилирования. Для этого к смеси добавляют 5 мкл раствора, содержащего 1 ед. щелочной фосфатазы (Shrimp Alkaline Phosphatase) (Fermentas, Литва) в 0,5 мкл буфера, использованного ранее для постановки первого варианта ПЦР. Реакцию проводят по программе: 37°С 30 мин, 85°С 10 мин.

На третьем этапе генетического тестирования по определению риска развития БК проводится реакция минисеквенирования путем добавления к смеси, полученной ранее на этапах ПЦР и дефосфорилирования, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкл буфера, использованного при постановке первого варианта ПЦР, 1,5 ед. термоустойчивой ДНК-полимеразы (TermiPol DNA Polymerase (Solis Biodyne, Эстония)), по 1 пмоль необходимых дидезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 пмоль олигонуклеотидного зонда. Реакция включает следующие этапы:

6. Нагрев блока: 94°С - 5 мин

7. Денатурация ДНК: 94°С - 20 сек

8. Отжиг праймера: 55°С - 10 сек

9. Элонгация: 72°С - 10 сек

10. Выполнить 35 циклов

Нуклеотидные последовательности используемых для минисеквенирования зондов, среди которых 44NOD2 - Z, 45NOD2 - Z, 17NOD2 - Z, rs7807268 - Z, SLC22A4 - Z представлены в приложении 1.

На финальном этапе генетического тестирования по определению риска развития БК для улучшения качества анализа продуктов реакции к образцам добавляется по 12 мкл полимерной ионообменной смолы (Sequenom, США), чтобы очистить реакционную смесь от катионов металлов. На титановый чип (AnchorChip 400/384, Bruker Daltonics) наносят матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3'-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, Германия) в 50% ацетонитриле (Merck, Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного (Fluka, Германия). Очищенные ионнообменной смолой образцы наносят на кристаллы матрицы и проводят масс-спектрометрический анализ.

Спектры получают с использованием МАЛДИ-времяпролетного масс-спектрометра Autoflex (Bruker Daltonics, Германия). Все измерения проводят в линейном режиме, детектируя положительно заряженные ионы с ускоряющим напряжением - 20.0 кВ, накапливающем электроде - 18.65 кВ, фокусирующей линзе - 9.2 кВ и временем задержки анализатора - 400 нсек. Для получения каждого масс-спектра используют 50 импульсов лазера с мощностью излучения, установленной на уровне минимального порогового значения, достаточного для десорбции-ионизации образца.

Полученные значения масс сравнивают с данными для каждого варианта генотипа.

Варианты масс для анализируемых генотипов:

Для оценки кумулятивного риска формирования ВЗК на основании генетических данных используют следующую схему расчета популяционного риска:

Где MAG - вклад данного аллеля в суммарный риск

FR. allelic - популяционная частота по данному аллелю

FR.gen - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга

FR.gen % - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга, выраженная в процентах

AVG - вклад генотипа в популяционную частоту

Pop. Risk - величина популяционного риска, полученная путем сложения AVG для всех вариантов генотипов анализируемых полиморфизмов, деленная на количество анализируемых полиморфизмов или согласно формуле:

Значение индивидуального риска рассчитывается согласно данным показателя MAG согласно формуле:

Полученное значение индивидуального риска сравнивается со значением популяционного риска. При значении индивидуального риска равном или большем чем 1,18 считать риск формирования БК диагностически значимым.

В исследование, которое легло в основу данного патента, были включены 100 индивидов. Анализируемая выборка включала группу индивидов с установленным диагнозом болезнь Крона (n=15), группу индивидов с установленным диагнозом язвенный колит (n=35), а также здоровый контроль (n=50).

У всех испытуемых были собраны образцы стула для последующего исследования ЛС методом газожидкостной хроматографии совмещенной с масс-спектрометрией.

200 мкг образца стула помещали во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляли 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяли следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.

Флаконы запечатывали и анализировали на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С. Использовался режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров использовалась библиотека масс-спектров NIST 2014.

В результате анализа в исследуемых группах были получены значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: Acetic acid, Benzaldehyde, Propanoic acid, Propanoic acid, 2-methyl-, Butanoic acid, Butanoic acid, 3-methyl-, Pentanoic acid, Pentanoic acid, 4-methyl-, Hexanoic acid, Heptanoic acid, Phenol, Octanoic acid, p-Cresol, Hexadecanal, n-Decanoic acid, 2,4-Di-tert-butylphenol, n-Nonadecanol-1, Indole, Indole, 3-methyl-, Benzeneacetic acid, Hydrocinnamic acid, Tetradecanoic acid, n-Hexadecanoic acid, Valeric acid и Octadecanoic acid. В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток. Для выделения наиболее значимых метаболитов использовался тест Манна-Уитни. Согласно полученным данным валериановая кислота способствовала достоверному разделению выборки ВЗК против нормы.

Генетическое тестирование предварительно было проведено для 32 отобранных полиморфизмов генов. Полученные результаты для всей выборки были рассчитаны статистическими методами Пирсона и Фишера. Согласно полученным данным значимо разделяли выборку ВЗК против нормы полиморфизмы генов: IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421. Дальнейшие расчеты позволили значимо разделить выборку БК против нормы для таких полиморфизмов как NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152. Все полученные в ходе исследования результаты легли в основу данного изобретения.

Таким образом, согласно полученным результатам возможно оценить принадлежность тестируемого пациента к группе контроля или к группе пациентов с высоким риском развития ВЗК. На втором этапе для пациентов с высоким риском развития ВЗК могут быть получены данные о риске развития БК посредством генетического тестирования.

Техническим результатом описанного способа скрининговой неинвазивной диагностики болезни Крона методами метаболомно-геномного профилирования можно считать следующую совокупность разработок:

1. Применение новейшего метода исследования метаболитов посредством парофазной экстракции с последующим ГХ-МС анализом с минимальным числом этапов пробоподготовки. Данный результат является гарантией снижения числа возможных техническим проблем на указанных этапах пробоподготовки и минимизирует риск получения не интерпретабельного результата. Уровень предлагаемого методического решения позволяет допустить до используемого оборудования в том числе клинических специалистов при минимальной технической подготовке кадров.

2. Полученное вычислительное решение, которое позволяет сформировать конечный результат метаболомного анализа образца стула, является уникальным способом трансляции специальных научно-исследовательских данных в область практической медицины. Определение риска развития ВЗК позволяет мгновенно принимать решения о тактике дальнейшего ведения пациента, а дополнительное генетическое тестирование на этапе определения ВЗК способствует определению пациента в группу риска по потенциальному развитию болезни Крона.

3. Финальное генетическое тестирование для группы риска пациентов с ВЗК позволяет оценить возможность развития болезни Крона до появления характерных симптомов, а значит своевременно предотвращать развитие тяжелых симптомов заболевания.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема предлагаемых вариантов осуществления изобретения.

Пример 1

Испытуемый, имеющий в семейном анамнезе воспалительное заболевание кишечника у родственника, а также незначительные симптомы, характерные для данной группы заболеваний обращается в медицинский центр для неинвазивной диагностики и расчета риска развития ВЗК. Производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20 и доставляется в лабораторию для исследования.

200 мкг образца стула помещают во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляют 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяют следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.

Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.

Параллельно посредством набора Qiagen Stool mini kit (США) проводится выделение ДНК из образцов стула и генетическое исследование полиморфизмов генов IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421.

В результате ГХ-МС анализа образца стула полученное значение относительной интенсивности валериановой кислоты для данного пациента равно 0,19874, что соответствует низкому риску (не более 15%) формирования ВЗК или отсутствию ассоциации вероятного воспаления с группой ВЗК. Результаты генотипирования следующие:

IRGM RS4958847 - GG

ICOSLG RS762421 - GA

Согласно формуле расчета индивидуального риска, для данного пациента получается следующее значение кумулятивного риска:

При сравнении полученного значения с ожидаемым, показан низкий риск развития ВЗК.

Таким образом, данные геномно-метаболомного профилирования свидетельствуют об отсутствие рисков развития ВЗК. При наличии симптомов воспаления можно предположить иной генез данной патологии. В качестве рекомендации при сохранении симптомов воспалительной реакции при сопутствующей противовоспалительной терапии обратиться за лечением к гастроэнтерологу.

Пример 2

Испытуемый имеет симптомы, характерные для ВЗК, однако предварительно решает провести неинвазивную диагностику и расчет риска развития ВЗК. Производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20 и доставляется в лабораторию для исследования.

200 мкг образца стула помещают во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляют 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяют следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.

Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.

Параллельно посредством набора Qiagen Stool mini kit (США) проводится выделение ДНК из образцов стула и генетическое исследование полиморфизмов генов IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421.

В результате ГХ-МС анализа образца стула полученное значение относительной интенсивности валериановой кислоты для данного пациента равно 0,04557, что соответствует высокому риску (более 70%) формирования ВЗК или вероятной ассоциации воспаления с группой ВЗК. Результаты генотипирования следующие:

IRGM RS4958847 - GA

ICOSLG RS762421 - GA

Согласно формуле расчета индивидуального риска, для данного пациента получается следующее значение кумулятивного риска:

При сравнении полученного значения с ожидаемым, показан высокий риск развитая ВЗК.

Таким образом, данные геномно-метаболомного профилирования свидетельствуют об высоком риске ассоциации воспаления с группой ВЗК. Пациент направляется на дополнительное исследование инструментальными методами для верификации ВЗК. В ходе исследования отмечается значительная гиперемия слизистой тонкой кишки в дистальной области. Однако убедительных признаков, свидетельствующих за формирование болезни Крона нет. Пациент направляется на второй этапа скрининга -генетическое тестирование для оценки риска развития болезни Крона.

NOD2 rs2066844 - GG

NOD2 rs2066845 - GC

NOD2 rs17221417 - GC

RS7807268 - GC

SLC22A4 RS1050152 - CT

Согласно полученным данным рассчитывается индивидуальный риск развития болезни Крона.

Согласно полученным данным значение индивидуального риска для данного пациента высокое, что означает значительную вероятность генетической предрасположенности к развитию болезни Крона. С учетом данных инструментального и геномно-метаболомного исследования для данного пациента может быть назначена терапия, используемая при лечении болезни Крона с учетом раннего выявления.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

образования “Московский государственный медико-стоматологический

университет имени А.И. Евдокимова” Министерства здравоохранения Российской

Федерации (ФГБОУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России)

<120> «СПОСОБ СКРИНИНГОВОЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ КРОНА МЕТОДАМИ

МЕТАБОЛОМНО-ГЕНОМНОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ»

<160> 21

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер IRGM-F

<400> CCTCTCACTGGGAGAAGCTTTA

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер IRGM-R

<400> TGCATCACAATTTTCTCCTGTTAGT

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер ICOSLG -F

<400> ACACATTCACACACCCACAA

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер ICOSLG -R

<400> GGAAGTTGGATCTTTCTTGCACC

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер IRGM - Z

<400> TATAGATTTCATTGCCCAATAT

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер ICOSLG - Z

<400> CACACACCCACAAAAATCAA

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 44NOD2 - F

<400> GCACAACCTTCAGATCAC

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 44NOD2 - R

<400> CTCCTGCATCTCGTACAG

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 45NOD2 - F

<400> AGTTCATGTCTAGAACACATATC

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 45NOD2 - R

<400> CAAGAAAACTGCAGGATAGAC

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 17NOD2 - F

<400> GTTTCAGAAACCACTTTGATTC

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 17NOD2 - R

<400> TCTTAACCCCAAAACAAGAAAG

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер rs7807268 - F

<400> GGAAGGGTGATTTCCTCCTGTT

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер rs7807268 - R

<400> CCCTTCGCTACAGACATTGG

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер SLC22A4 - F

<400> AATGCTGCCCTACATCGTCA

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер SLC22A4 - R

<400> GCATCTGCTCTAAGGTTTCTGGA

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 44NOD2 - Z

<400> CATCTGAGAAGGCCCTGCTC

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 45NOD2 - Z

<400> GGCCTTTTCAGATTCTGG

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер 17NOD2 - Z

<400> CCTTCAGTTCCGGAGGTCC

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер rs7807268 - Z

<400> ATCACCATGGCCTAAGCTGT

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Геномный праймер SLC22A4 - Z

<400> TCTGACTGTCCTGATTGGAATC

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ скрининговой неинвазивной диагностики болезни Крона методами метаболомно-геномного профилирования на основании двухэтапного протокола. Протокол включает на первом этапе: а) выделение метаболитов и ДНК из образца стула, б) анализ метаболитов стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции; в) расчет относительной интенсивности валериановой кислоты, получаемой путем соотнесения с суммарным ионным током анализируемых в образце стула метаболитов (б); г) соотнесение полученного значения относительной концентрации валериановой кислоты с величиной риска развития ВЗК, согласно приведенной схеме: при значении относительной концентрации валериановой кислоты от 0,1 до 0,12 считать риск развития ВЗК равным от 50 до 85%; д) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421; е) расчет кумулятивного риска развития ВЗК согласно данным генотипирования IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421. При значении индивидуального риска, равном или большем чем 1,36, считать риск формирования ВЗК диагностически значимым. На втором этапе: а) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152; б) расчет кумулятивного риска развития болезни Крона согласно данным генотипирования NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RSI050152. Значение индивидуального риска рассчитывается согласно данным показателя MAG. Рассмотренный способ предоставляет возможность как выявить риск развития ВЗК, так и рассчитать возможную генетическую предрасположенность к развитию болезни Крона. 2 пр.

Способ скрининговой неинвазивной диагностики болезни Крона методами метаболомно-геномного профилирования на основании двухэтапного протокола, который включает:

на первом этапе:

а) выделение метаболитов и ДНК из образца стула;

б) анализ метаболитов стула: уксусная кислота, бензальдегид, пропановая кислота, 2-метил-пропановая кислота, бутановая кислота, бутановая кислота, 3-метил-пентановая кислота, пентановая кислота, 4-метил-гексановая кислота, гептановая кислота, фенол, октановая кислота, р-крезол, гексадеканол, n-декановая кислота, 2,4-ди-трет-бутилфенол, n-нонадеканол-1, индол, 3-метил-индол, бензоуксусная кислота, гидрокоричная кислота, тетрадекановая кислота, n-гексадекановая кислота, валериановая кислота, октадекановая кислота методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции;

в) расчет относительной интенсивности валериановой кислоты, получаемой путем соотнесения с суммарным ионным током анализируемых в образце стула метаболитов (б) по формуле

,

где I_отн - относительная интенсивность метаболита;

- интенсивность валериановой кислоты - величина ионного тока по данному метаболиту;

- интенсивность всех анализируемых метаболитов - величина суммарного ионного тока;

г) соотнесение полученного значения относительной концентрации валериановой кислоты с величиной риска развития ВЗК, согласно приведенной схеме: при значении относительной концентрации валериановой кислоты от 0,1 до 0,12 считать риск развития ВЗК равным от 50 до 85%;

д) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421;

е) расчет кумулятивного риска развития ВЗК согласно данным генотипирования IRGM RS4958847 и ICOSLG RS762421 и данным, приведенным в таблице

где MAG - вклад данного аллеля в суммарный риск,

FR. allelic - популяционная частота по данному аллелю,

FR.gen - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга,

FR.gen% - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга, выраженная в процентах,

AVG - вклад генотипа в популяционную частоту,

Pop.Risk - величина популяционного риска, полученная путем сложения AVG для всех вариантов генотипов анализируемых полиморфизмов, деленная на количество анализируемых полиморфизмов, или согласно формуле

;

значение индивидуального риска рассчитывается согласно данным показателя MAG согласно формуле

;

полученное значение индивидуального риска сравнивается со значением популяционного риска; при значении индивидуального риска, равном или большем чем 1,36, считать риск формирования ВЗК диагностически значимым;

на втором этапе:

а) определение вариантов генотипов полиморфизмов генов NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152;

б) расчет кумулятивного риска развития болезни Крона согласно данным генотипирования NOD2 rs2066844; NOD2 rs2066845; NOD2 rs17221417; RS7807268; SLC22A4 RS1050152 и данным, приведенным в таблице

где MAG - вклад данного аллеля в суммарный риск,

FR. allelic - популяционная частота по данному аллелю,

FR.gen - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга,

FR.gen% - частота каждого варианта генотипа, согласно равновесию Харди-Вайнберга, выраженная в процентах,

AVG - вклад генотипа в популяционную частоту,

Pop. Risk - величина популяционного риска, полученная путем сложения AVG для всех вариантов генотипов анализируемых полиморфизмов, деленная на количество анализируемых полиморфизмов, или согласно формуле

;

значение индивидуального риска рассчитывается согласно данным показателя MAG согласно формуле

;

полученное значение индивидуального риска сравнивается со значением популяционного риска; при значении индивидуального риска, равном или большем чем 1,18, считать риск формирования БК диагностически значимым.