Способ получения молекулярных однонуклеотидных маркеров для идентификации неизвестного индивида методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК, набор для получения молекулярных маркеров Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и прогностических тестов и используется для для идентификации неизвестного индивида. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение дает возможность определить генотип по однонуклеотидным ДНК маркерам для для идентификации неизвестного индивида из образцов геномной ДНК человека, в том числе в случае, когда ДНК в исследуемом образце находится в деградированном виде.

Уровень техники

В настоящее время ДНК-анализ является наиболее доказательным методом анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экспертизы. ДНК-анализ позволяет исследовать специфичные для каждого человека участки генома, и получить, таким образом, уникальный генетический "паспорт" или генетически профиль индивида. Индивидуализирующие признаки, определяемые на уровне ДНК, характеризуются почти абсолютной устойчивостью, то есть сохраняются в организме человека неизменными на продолжении всей жизни. В последние десятилетия для целей генетической идентификации личности широко применяется различные маркерные системы, локализованных как на аутосомах, так и на нерекомбинирующем участке Y-хромосомы и в митохондриальной ДНК.

Первые маркеры, которые использовали для идентификации личности были VNTR-маркеры или микросателлитные маркеры (variable number of tandem repeats) - высокополиморфные участки ДНК, представленные в геноме короткими повторяющимися последовательностями. На ранних этапах внедрения методов ДНК-идентификации в судебную практику для получения индивидуального профиля ДНК человека (ДНК-фингерпринт) использовали достаточно трудоемкую технологию, которая включала расщепление геномной ДНК специальными ферментами на короткие фрагменты, которые разделяли электрофоретически по размеру и гибридизовали с радиоактивно-мечеными пробами, соответствующими отдельным VNTR-маркерам [1, 2].

Однако, благодаря быстрым развитиям методов молекулярной биологии, в частности появлению метода полимеразной цепной реакции и ее применению в анализе ДНК, а также разработку методов прямого определения последовательности ДНК (секвенирования ДНК), ДНК-типирование стало широко использоваться в практике судебных экспертиз.

В настоящее время стандартным методом в области ДНК-идентификации является определение STR-профилей индивида с использованием метода капиллярного электрофореза. Однако, несмотря на большой прогресс в технологиях STR-анализа, есть ряд существенных проблем, которые зачастую существенно усложняют проведение генетических экспертиз путем STR-профилирования [3]. В частности, традиционный капиллярный электрофорез, широко используемый при определении STR-маркеров, основан на определении размера фрагмента ДНК. Таким образом, аллели одинаковой длины, но различной последовательности, не могут быть дискриминированы, а значит обычный фрагментный анализ STR-маркеров не может выявить точечные мутации в STR-локусах, и разрешать, например, сложные случаи отцовства [4]. Также при использовании STR-профилирования оказывается довольно затруднительно анализировать ДНК смеси от разных индивидов, что достаточно часто встречается в судебной практике [5].

В настоящее время разработаны и выпускаются наборы ДНК-маркеров на основе другого типа маркеров - SNP-маркеров, которые используются для ДНК-идентификации неизвестного индивида и установления биологического родства. При анализе SNP-маркеров отсутствуют методологические проблемы, характерные для STR-маркеров. Во-первых, очень короткие продукты амплификации, используемые для профилирования SNP, позволяют успешно применять их при анализе деградированной ДНК. Кроме того, при анализе SNP-маркеров практически исключены артефакты, обусловленные сдвигом матрицы (stutter) при амплификации STR-маркеров, и которые усложняют интерпретации профиля STR. Также, скорость мутирования SNP-маркеров существенно ниже, по сравнению с STR, что делает их более стабильными и более пригодными для анализа сложных случаев родства [3]. Секвенирование одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) вокруг и внутри STR также помогает существенно повысить эффективность анализа при определении родства [6]. Кроме того, большое количество SNP в геноме человека позволяет выбрать геномные варианты, наименее подверженные постмортальным модификациям ДНК, например, те, в которых не участвует цитозин (чтобы исключать постмортальные замены цитозина на урацил), или те, которые расположены в близком контакте с нуклеосомами, а значит защищены нуклеосомными белками и таким образом менее подвержены постмортальным химическим модификациям. В геномах людей существуют миллионы одно нуклеотидных полиморфизмов в отличие от сотен STR-маркеров. Это позволяет более гибко выбирать используемые для анализа SNP.

Значительным технологическим новшеством последних лет стало появление технологий секвенирования нового поколения масштабного параллельного секвенирования (NGS). Существенным преимуществом данного типа анализа является то, что с их применением стало возможным проведение анализа одновременно всех типов маркеров, основанных на SNP, STR и митохондриальной ДНК (мтДНК). Основная проблема которая может быть успешно решена на основе технологии NGS это способность различать аллели, имеющие аналогичную длину, что является необходимой предпосылкой для идентификации смесей образцов [4].

Преимущества использования SNP-маркеров в сочетании с методом массового параллельного секвенирования (NGS):

- возможность анализа деградированной ДНК (за счет уменьшения длинны ампликона)

- одновременный анализ сотен образцов

- возможность значительного увеличения точности системы за счет увеличения количества маркеров, анализируемых в одной пробирке (в мультиплексе)

На текущий день уже разработан ряд панелей SNP, достаточных для достоверного определения совпадения ДНК-профилей на уровне, сравнимом с анализом на основе STR-маркеров. Например, была разработана панель IISNP из 45 однонуклеотидных замен с помощью которой возможна ДНК-идентификация с точностью до 10-15. Расширенная версия панели, включающая 86 SNP, уменьшает вероятность ошибки до 10-30. Эта панель применяется в коммерческих системах MiSeq FGx™ Forensic Genomics System и HID-Ion AmpliSeq™ Identity Panel [7], которая использует технологии масштабного параллельного секвенирования для генотипирования. Кроме того, была предложена панель SNPforID из 52 маркеров, позволяющая получить вероятность случайного совпадения SNP-профилей 10-18 и используемая в коммерческой системе HID-Ion AmpliSeq™ Identity Panel [8]. В настоящее время SNP-маркеры для ДНК-идентификации (IISNP) используются в качестве аналога аутосомных STR маркеров для сравнения эталонных образцов с неизвестными образцами [7].

Имеющиеся в настоящее время разработки зарубежных наборов SNP-маркеров не учитывают специфики популяционной структуры населения России (большое число этнических групп, специфические для различных этнических групп полиморфизмы, которые не учитываются в иностранных разработках). В настоящее время на территории РФ нет разработки наборов для идентификации неизвестного индивида на основе SNP-маркеров, которые могли быть использованы в качестве более эффективного аналога применяемых в настоящее время зарубежных коммерческих наборов Для успешного применения SNP-маркеров для задач отечественной криминалистики и судебной медицины необходима разработка методик генотипирования и наборов SNP-маркеров, которая позволит максимально охватить генетическое разнообразие по этим локусам в российских популяциях. Кроме этого, немаловажным недостатком существующих импортных наборов для ДНК-идентификации является их значительная дороговизна, обусловленная необходимостью использования дорогостоящих расходных материалов (специфических ДНК-полимераз, растворов для ПЦР, буферных растворов). Для устранения указанных недостатков необходимым условием является повышение информативности предлагаемого набора и его экономичности, а также адаптации для специфики используемых в криминалистических экспертизах образцов биологического материала, где ДНК сильно деградирована или содержится в малом количествах.

Для решения поставленной задачи авторами предложен набор из 95 пар синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных участкам локусов SNP-маркеров для выявления генотипов, позволяющих проводить идентификации личности в российских популяциях.

Настоящее изобретение раскрывает разработанные синтетические оригинальные олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицировать локусы, содержащие целевые молекулярно-генетические маркеры для последующего секвенирования с помощью метода «массового параллельного секвенирования». Набор для генотипирования включает композицию, образованную 95 парами синтетическими оригинальными олигонуклеотидными праймерами для локусов в геноме человека, включающих SNP-маркеры, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР (нуклеотидная последовательность праймеров SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO 190, приведена в таблице 1). Синтетические олигонуклеотидные праймеры подобраны таким образцом, чтобы ПЦР-продукт имел минимальную длину, меньше 120 п. н., что позволяет успешно анализировать сильно деградированные образцы ДНК.

Преимущество данного набора состоит в том, что авторами изобретения создана система олигонуклеотидов, позволяющая одновременно анализировать множество образцов, учитывающая популяционный полиморфизм, встречающийся в российских популяциях, простое обнаружение с использованием высокопроизводительных технологий (NGS-секвенирование), а также предназначенная для использования на малых количествах биологического материала низкого качества, в том числе, криминалистических образцов, в который ДНК находится в сильно деградированном состоянии.

Выбор набора маркеров

Для эффективного использования биаллельных SNP маркеров для идентификации индивида необходимо увеличить их количество для достижения дискриминационного потенциала сравнимого с уровнем дискриминации STR маркеров. Число используемых однонуклеотидных вариантов должно быть в 3-1 раза больше чем STR маркеров[9] Однонуклеотидные маркеры для идентификации личности должны быть высоко гетерозиготны и обладать низкой частотой вариаций в разных популяциях. Основываясь на этих требованиях были разработаны первые SNP-панели, которые включали 40-50 SNP, которые обеспечивают вероятность идентификации, сравнимую со стандартными STR-панелями. Например, набор 45 несцепленных автономных SNP, который обеспечивает вероятность идентификации в пределах от 10-16 до 10-19 [10, 11] или панель "SNPforID" содержащая 52 SNP [12, 8]. Такие панели маркеров применимы к лицам европейского происхождения, но обладают немного меньшей дискриминационной способностью у неевропейцев. Эти панели SNP маркеров используются в коммерческих наборах для идентификации. Сейчас на рынке имеется две лидирующие панели для идентификации личности на основе SNP маркеров. "HID-Ion AmpliSeq Identity Panel" [13] включает 48 SNP из панели "SNPforID" и 43 маркера из панели К. Кидда. Совокупная вероятность совпадения генотипов в этой панели варьирует для разных популяций в пределах от 1 × 10-31 до 1 × 10-33. "ForenSeq DNA Signature Prep Kit" для приборов компании "Illumina" [14] содержит 94 SNP для идентификации из тех же панелей.

Критерии для выбора олигонуклеотидных последовательностей праймеров были следующими:

- Разработанная пара олигонуклеотидов должна обеспечивать специфическую амплификацию конкретного участка генома человека, содержащего выбранный ДНК маркер

- На последовательности олигонуклеотида не должно содержаться известных полиморфизмов, согласно базе данных gnomAD

- Температуры отжига разработанных олигонуклеотидов должны варьироваться от 57 до 58 градусов Цельсия

- Все разработанные пары олигонуклеотидов должны быть совместимы друг с другом, то есть не образовывать вторичных структур, чтобы избежать ингибирования амплификации некоторых геномных фрагментов при проведении мультиплексной ПЦР.

Так как разрабатываемая панель специально предназначена для работы с деградированной ДНК важно было минимизировать размер ампликона, содержащего маркер. Поэтому основным критерием для отбора SNP-маркера в панель был размер амплифицированного фрагмента, содержащего выбранный маркер, который не должен был превышать 120 пар оснований.

В результате были отобраны 95 одно нуклеотидных маркеров (Таблица 1).

Авторы изобретения провели анализ данных "массового параллельного секвенирования" на приборах Illumina, полученных для фрагментных библиотек, приготовленных на основе ПЦР-продуктов мультиплексной амплификации. Данный анализ подтвердил эффективность разработанной системы олигонуклеотидов для определения генотипов по всем выбранным 95 позициям для SNP маркеров. Кроме того, было проведено полногеномное секвенирование около 20 образцов ДНК различных индивидов и сравнение полученных профилей с данными секвенирования мультиплексных ПЦР-продуктов, содержащих набор разработанных маркеров. В результате анализа было выявлено 100%-ное соответствие генотипов полногеномного секвенирования с генотипами маркеров в ПЦР продуктах, полученными с помощью данного набора олигонуклеотидов на тех же образцах ДНК.

Осуществление способа

Пример генотипирования биологического образца.

В примере возможность идентификации неизвестного индивида показана на образцах геномной ДНК человека путем проведения мультиплексного ПЦР-анализа с последующим "массовым параллельным секвенированием" полученных ПЦР-продуктов на технологической платформе Illumina.

Для проведения ДНК-идентификации используется образец ДНК в количестве не менее 100 пкг, выделенная из любого биоматериала человека.

Получение ДНК

ДНК может быть получена из любой ткани человека, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи любого ранее широко применяемого метода выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным. В частности, есть несколько готовых наборов для выделения ДНК из различных тканей человека (например, представленных фирмой Qiagen)

Идентификация неизвестного индивида с помощью панели олигонуклеотидных праймеров для 95 SPN-маркеров включает в себя четыре этапа:

- Мультиплексная ПЦР геномной ДНК с использованием смеси специфических олигонуклеотидных праймеров;

- Приготовление фрагментных библиотек из полученных ПЦР-продуктов для секвенирования на платформе Illumina;

- Проведение широкомасштабного параллельного секвенирования полученных библиотек;

- Анализ данных секвенирования и интерпретация результатов.

Амплификация участков генома, содержащих исследуемые маркеры

Амплификация участков генома, содержащих исследуемые маркеры, может быть осуществлена с помощью наборов Multiplex PCR kit компании «Qiagen», на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems».

Состав реакционной смеси для мультиплексной ПЦР:

- Раствор олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР (в конечной концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ

- Смесь полимеразы и буфера

- Деионизированная вода

- Оптимизирующий раствор

- исследуемая ДНК

Оптимальное рекомендуемое количество анализируемой ДНК от 100 пг до 10 нг.При необходимости образец ДНК следует развести в буфере ЕВ.

Также необходимо проводить параллельно контрольную реакцию (отрицательный контроль), где вместо ДНК добавляется деионизированная вода.

Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, или планшетах предназначенных для ПЦР.

В отдельной стерильной пробирке смешать из расчета на одну реакцию все необходимые компоненты, согласно расчетной таблице (пробирка с раствором MasterMix).

После приготовления, смесь для амплификации помещают в амплификатор и выставляется программа:

95°С - 15 минут

94°С - 30 секунд

57°С - 90 секунд 35 циклов

72°С - 90 секунд

72°С - 10 минут

4°С ∞.

Наличие продуктов амплификации исследуемой ДНК и отсутствие продуктов амплификации в отрицательном контроле проверяют с помощью электрофореза в агарозном геле. Продукты амплификации очищают от остаточных праймеров с помощью соответствующих мини-колонок (например, Qiagen MinElute system) в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Полученные в результате мультиплексной амплификации очищенные ПЦР продукты, содержащие маркеры для идентификации неизвестного индивида используются в качестве матрицы для приготовления фрагментных геномных библиотек для секвенирования.

Приготовление фрагментных библиотек

Предварительно необходимо провести измерение концентрации очищенных ПЦР-фрагментов, полученных на предыдущем этапе мультиплексной амплификации на приборах NanoDrop или Qubit (ThermoFisher) в соответствии с инструкцией к прибору. Для приготовления фрагментных библиотек оптимально использовать около 300 нг ДНК очищенных ПЦР-продуктов мультиплексной амплификации. Приготовление фрагментных геномных библиотек проводят с использованием наборов реагентов Illumina®. TruSeq® DNA PCR-Free library prep kit в соответствии с инструкцией к набору. Для секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек одновременно необходимо использовать индексированные адаптеры (например, Dual index adaptors Illumina). Для каждого образца библиотеки используется отдельный индексируемый адаптер, который необходимо записать в таблицу для дальнейшего учета при анализе результатов секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек. Для приготовления фрагментных библиотек рекомендуется/возможно использовать 1/2 от объема всех реагентов, входящих в набор Illumina®. TruSeq® DNA PCR-Free library prep kit, прописанного в инструкции к набору.

Этапы 1-3 являются рекомендованными, но не обязательными.

1 Очистка фрагментных библиотек: необходимо нанести весь объем элюата в одну лунку 2% агарозного геля с красителем SYBR Gold (например, с использованием готового 2%-ного E-gel (Invitrogen)). Провести электрофорез с использованием маркера молекулярных весов 50 bp Ladder в течение 10 минут (в случае использования системы e-gel (Invitrigen)).

2 с использованием стерильного одноразового скальпеля вырезать кусочки геля, с фрагментами библиотеки от 220 п. н. и больше. Светящиеся фрагменты длиной меньше 150 п. н. соответствуют димерам адаптеров и не должны быть использованы для дальнейшего анализа.

3 Провести очистку вырезанных фрагментов ДНК с использованием набора реагентов MinElute gele extraction kit (Qiagen). Эллюировать в 20-22 мкл буфера ЕВ (Qiagen).

Приготовленные описанным выше способом фрагментные библиотеки можно напрямую использовать для секвенирования на технологической платформе Illumina, предварительно проведя оценку качества полученных фрагментных библиотек.

Качественную и количественную оценку фрагментных библиотек можно проводить стандартными методами, рекомендованными фирмой производителем платформ для секвенирования Illumina. Для оптимизации рабочего процесса рекомендуем использовать следующие этапы: измерить концентрации фрагментных библиотек на приборе Qubit с использованием набора реагентов HS. Для дальнейшего секвенирования рекомендуется использовать фрагментные библиотеки с концентрацией не менее 2 нМ/мкл.

Перед секвенированием необходимо провести мультиплексирование библиотек в эквимолярных количествах (объединение библиотек для нескольких образцов). Не допускается объединение в один пул библиотек с одинаковыми индексами.

Приготовленные фрагментные библиотеки секвенируют методом параллельного широкомасштабного секвенирования на технологической платформе Illumina в парноконцевом режиме с длинной прочтения не менее 75+75 п.о. Рекомендуемый прибор секвенатор MiSeq (Illumina).

Анализ результатов секвенирования

Анализ результатов секвенирования проводят следующим образом:

Картировать полученные прочтения на референсный геном человека (GRCh37) с помощью программы bwamem или аналогичной.

Определить генотипы по исследуемым маркерам с помощью программ GATK, freebayes или аналогичных.

Литературные источники:

1. Devesse L., Ballard D., Davenport L. et al. Concordance of the ForenSeq system and characterisation of sequence-specific autosomal STR alleles across two major population groups // Forensic Sci. Int. Genet. 2017. V. 34. P. 57-61. doi 10.1016/j.fsigen.2017.10.012

2. Phillips C, Gettings K.B., King J.L. et al. "the devil's in the detail": release of an expanded, enhanced and dynamically revised forensic STR sequence guide // Forensic Sci. Int. Genet. 2018. V. 34. P. 162 169. doi 10.1016/j.fsigen.2018.02.017

3. Gettings K.B., Borsuk L.A., Ballard D. et al. STRSeq: a catalog of sequence diversity at human identification short tandem repeat loci // Forensic Sci. Int. Genet. 2017. V. 31. P. 111-117. doi 10.1016/j.fsigen.2017.08.017

4. van der Gaag K.J., de Leeuw R.H., Hoogenboom J. et al. Massively parallel sequencing of short tandem repeats-population data and mixture analysis results for the PowerSeq system // Forensic Sci. Int. Genet. 2016. V. 24. P. 86-96. doi 10.1016/j.fsigen.2016.05.016

5. Phillips C, Fang R., Ballard D. et al. Evaluation of the Genplex SNP typing system and a 49plex forensic marker panel // Forensic Science International-Genetics. 2007. V. 1(2). P. 180-185. doi 10.1016/j.fsigen.2007.02.007

6. Tozzo P., Gabbin A., Politi C. et al. Combined Statistical Analyses of Forensic Evidence in Sexual Assault: A Case Report and Brief Review of the Literature // J. Forensic Sci. 2020. V. 65. P.1767-1773. doi 10.1111/1556-4029.14487

7. Fei Guo, Yishu Zhou, He Song, Jinling Zhao, Hongying Shen, Bin Zhao, Feng Liu, Xianhua Jiang, Next generation sequencing of SNPs using the HID-Ion AmpliSeq™ Identity Panel on the Ion Torrent PGM™ platform, Forensic Science International: Genetics, Volume 25, 2016, Pages 73-84, ISSN 1872-4973, https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2016.07.021.

8. Musgrave-Brown E, Ballard D, Balogh K, Bender K, Berger B, Bogus M et al. Forensic validation of the SNPforlD 52-plex assay. Forensic Science International-Genetics. 2007 Jun;l(2): 186-90. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2007.01.004

9. Krawczak M. 1999. Informativity assessment for biallelic single nucleotide polymorphisms. Electrophoresis. 20, 1676-1681. Berglund E.C., Kiialainen A., Syvanen A.-C. 2011. Next-generation sequencing technologies and applications for human genetic history and forensics. Investigative Genetics. 2, 23.

10. Pakstis A.J., Speed W.C., Fang R., Hyland F.C.L., Furtado M.R., Kidd J.R., Kidd K.K. 2010. SNPs for a universal individual identification panel. Hum Genet. 127, 315-324.

11. Kidd K.K. 2011. Population Genetics of SNPs for Forensic Purposes (Updated). NIJ Final Report. 103 p.

12. Sanchez J.J., Phillips C., Borsting C., Balogh K., Bogus M., Fondevila M., Harrison C.D., Musgrave-Brown E.,Salas A., Syndercombe-Court D., Schneider P.M., Carracedo A., Morling N. 2006. A multiplex assay with 52 single nucleotide polymorphisms for human identification. Electrophoresis. 27, 1713 1724.

13. Churchill J.D., Chang J., Ge J., Rajagopalan S.C. Wootton C.W. 2015. Blind study evaluation illustrates utility of the Ion PGM system for use in human identity DNA typing. Croat. Med. J. 56, 218 229., Life technologies. 2014. HID-Ion AmpliSeq Identity Panel Data Sheet. 2 P.

14. Illumina. 2014. ForenSeq DNA Signature Prep Kit Data Sheet. 4 P

Список нуклеотидных последовательностей

SEQ IID1

GAACTGCCTGGTGTGGACT

SEQ IID2

CCACACCTGAACCAGACACT

SEQ IID3

AGTGACCAGGACTGTACGTGT

SEQ IID4

CGGTACCCAAGAAGACTCTG

SEQ IID5

AGGAGTTCCCACCAGTTTCT

SEQ IID6

CAGGATGCAAACTCTTGGAG

SEQ IID7

TACCCTCTCTGCTTCTGGAG

SEQ IID8

TGAGTCTGGGAAAAACAACA

SEQ IID9

CATTTTCATCAAATTTCCATTC

SEQ IID10

TGTGTGAGCTATGACACTCCTT

SEQ IID11

GAATCCTGGTCAACAACCTC

SEQ IID12

CTGCAACATTCCATTATCCA

SEQ IID13

CATGCAGGCTCCATTTTTAT

SEQ IID14

AGCAGGCAGTTAGCAGAGTG

SEQ IID15

TGGTGAGGGTGGAGATTTTA

SEQ IID16

GTCTCAAGGTCGTGCCAGT

SEQ IID17

GGTGATTTTTCCCATGATGA

SEQ IID18

TGCTTTGTAAGGCAATAGAGC

SEQ IID19

TGATCAATTGTTTGTCAGAATGT

SEQ IID20

CAGCTCTGATGATGTGCAAG

SEQ IID21

CCCAGGGAGTTCCTGATAAC

SEQ IID22

AGCCTTGGAAAACACAGAAA

SEQ IID23

TGACTTCCCAAGCTGAATTT

SEQ IID24

TGAGAATTGAAAAGCCCAAT

SEQ IID25

TGTAACCCAGCAATTCCAGT

SEQ IID26

GGGGCAACTATGAATACAGC

SEQ IID27

AGCCAAGATCATGTCAGTGC

SEQ IID28

CAAGTTTGTTGGCTTCTTTTG

SEQ IID29

CCCTCACAGTTAAAGCTTTTGT

SEQ IID30

ATGACCTGGATTGATCAGAGA

SEQ IID31

CCATGATTTTCTTGTGGTGA

SEQ IID32

CATGTGCTTAGGCCACAAC

SEQ IID33

AAGGTTAGGGATTGGAATGG

SEQ IID34

CGTAGTAAATGAGAGCAAGTTT

SEQ IID35

TCTGCCAAATGTATCCTTACC

SEQ IID36

TGGTCATTGTTGACACTTCAC

SEQ IID37

TGGCAACTTCTGATAAAGGAT

SEQ IID38

TTCAGTAGTTAATATCAAGGAAGTTT

SEQ IID39

CCACACCTCCAGATGAGAGT

SEQ IID40

ATAAGGCAAGGATGAACAGG

SEQ IID41

AAGGTGCAAGGAATTAGCAG

SEQ IID42

CGGCTTTTGTCTTCTCTTCT

SEQ IID43

СTGTGTGTTTTAAAGCCAGG

SEQ IID44

ACCAGGCATTTGACCTTCTA

SEQ IID45

TTCCACGAAAGTTCTTCTCC

SEQ IID46

CATAGCTTGTGTTGGTCAGG

SEQ IID47

AAGCTTTAGAAAGGCATATCGT

SEQ IID48

TTGGGGGAGCTAAACCTAAT

SEQ IID49

GATTGACTGTTTCTCATCCTGTT

SEQ IID50

ATGGTTTTTAGGCACCATGA

SEQ IID51

TTCAGTGAATAAATGGGCTCT

SEQ IID52

CTGTGGCAAAATGAAGAATG

SEQ IID53

AGAGGGTGGGCAAAGTTATT

SEQ IID

TCTGGGGCAGATGAAGTAGT

SEQ IID54

CTCTCTCTCCTGCTCTCTGG

SEQ IID55

GAAGAATCCAGCCCTTGTC

SEQ IID56

TGCTGTGGACTGAAACTTGA

SEQ IID57

CCATCCCAGCTGAGTATTCC

SEQ IID58

GAATGAATTTGAAAAAGCATCA

SEQ IID59

CCTTTCTGTTTTGTCCATCTG

SEQ IID60

CATCAACTTTATCGCTTTTTCC

SEQ IID61

GGATGCTTGCAAACAAAGAC

SEQ IID62

TGAGCGTTTTCCTCTGTTTT

SEQ IID63

TCATGAGATTGCTGGGAGAT

SEQ IID64

AGTTGGGATAGGTGATGCAA

SEQ IID65

GTTCTTTTCTCCGGGCTAAC

SEQ IID66

CCATGAAGATGGAGTCAACA

SEQ IID67

CAACCAGAGCACAAGTGGTA

SEQ IID68

GGTTACCTGTTTTCCTTTTGTG

SEQ IID69

ATGTGCGTTTCTCCACACTT

SEQ IID70

CAGTCTCTCTGTGCCGAAG

SEQ IID71

GCCCTTACTGTGATGTAGGC

SEQ IID72

AGTGGCATTAGAAATTCCAGA

SEQ IID73

CAGTATCCCCGCAAACTAAC

SEQ IID74

GAGACTCAGTGTTCAAGGTCAC

SEQ IID75

GAGGCACACTCAGATGCAC

SEQ IID76

AACTGGGTGTTAGGGAGACA

SEQ IID77

GCGTTCTGTATAGGCACCAT

SEQ IID78

GCCTGTGGCTTTGTAGTTCT

SEQ IID79

GAAGGGCAGTGAGGAGTTC

SEQ IID80

TTGTCATTCTGATGGACTGG

SEQ IID81

AACATTGCCTCTCCTTTGTT

SEQ IID82

GGCAGCATACACTCATAGCC

SEQ IID83

GTGTGCATTGTCTCGTGTGT

SEQ IID84

CTGGGGAGTAGAGGAGACCT

SEQ IID85

GCTTCGCTTTGCTACTCTTC

SEQ IID86

ACCCAGTGTTCCCAGCTT

SEQ IID87

TGTTGACCCCGTCGTATCTA

SEQ IID88

CTATTGCCTACAAATTTCAATTACA

SEQ IID89

AATTTCCCAGCAAAAACTTCT

SEQ IID90

AGAAGGGACCTAACCTGGAG

SEQ IID91

AGTGTCACCGAATTCAACG

SEQ IID92

GGTGTGTATTCTGCGGTAGC

SEQ IID93

GAAACATGGGATGAACAAGG

SEQ IID94

CAAATAGCAATGGCTCGTCT

SEQ IID95

AGGGTTTGAGCAGTTCTGAG

SEQ IID96

GGAGGTGATTTCTGTGAGGA

SEQ IID97

AAGAACCAGAGGTTGCTGTC

SEQ IID98

TGAGATAAATCAGACCAGGATG

SEQ IID99

CCCTTCTCAGCACTTCCATA

SEQ IID100

CTATGTCAGTCTGGGTGCAA

SEQ IID102

TGGGCATCTGGAATGTACTA

SEQ IID102

SEQ IID 103

CCCACTTGTTCTTTTTCTGC

SEQ IID104

CGAAACATGCTTCAGAGGTTA

SEQ IID105

ACAGGTATCCTGGCCTCAC

SEQ IID106

TCCCATGAAACTTTTCAACTC

SEQ IID107

CACTTTTCCAGCTGTCCCTA

SEQ IID108

GCTGGAATCCCGCTTACTA

SEQ IID109

CTGAATCCAGCCATGTTGTA

SEQ IID110

GCAAGATCTTTGCCAGTGA

SEQ IID111

GACCAGCTTCTGTCTGGAAG

SEQ IID112

CACTGTCCATCACGACACC

SEQ IID113

GCAGGGTGCAGGTATGTATT

SEQ IID114

TCAACAAACGTGTGATGCTC

SEQ IID115

TTGTCAATCTTTCTACCAGAGG

SEQ IID116

CTTATGACGCCTGGATTTTC

SEQ IID117

TGGTTCAAGGTTCTGGAGTT

SEQ IID118

TTGTTCTTCTCCATCCCATT

SEQ IID119

TGGCTTCTCTTTCCCTTATG

SEQ IID120

AGGTTGCGATAGAAAACAGTG

SEQ IID121

GGGGAGGAGGGAAATACA

SEQ IID122

GCAGCTGTCCATCATCAGTA

SEQ IID123

GGTAGGACCAGAAGTGTTTCA

SEQ IID124

TTGTGTTTAAACTTGGATACCATC

SEQ IID125

GATAGCCCTGCATTCAAATC

SEQ IID126

CTCTGGTTCACAAATGAGCA

SEQ IID127

CGATGATGACTTCCCAGAG

SEQ IID128

CTTCCTCAGTAGCAGCACCT

SEQ IID129

CTTTGTGTGGCTGAGAGAGA

SEQ IID1130

ATCTGGCTCACTGGTTGTTT

SEQ IID131

ACAATGGAGCCACTGAACTG

SEQ IID132

CTTTGTGTGGCTGAGAGAGA

SEQ IID133

ATCTTCCTCCTGGAGATCAA

SEQ IID134

GCAAGTATGTTTGGCAAATG

SEQ IID135

AAGCAAAGCAAAGCCTCAT

SEQ IID136

AAGTAACACATTTCCCTCTTGC

SEQ IID137

TCAAAAAGTTGTCAGCATGG

SEQ IID138

AACCAGCAACACTCCTAATCA

SEQ IID139

TGAATGGTGTGATGTAAACG

SEQ IID140

CCACCTATGGGCTCTTCTTA

SEQ IID141

GCACGAAGGAGAAACACCT

SEQ IID142

AGCAAAAATCCCTTAGGATG

SEQ IID143

ATTCATGAGCTGGTGTCCAA

SEQ IID144

AGGGACAAAGCTGACAAGC

SEQ IID145

GTTTGCTAAGTAAGGTGAGTGG

SEQ IID146

AGGTTCGAGTTTTGGCTTTA

SEQ IID147

ACCACCTGCCTCTCATCTT

SEQ IID148

GCTGGCAGAACAGAGAGATATT

SEQ IID149

GGAGGAGTCTTAGAGGAGGTG

SEQ IID150

GACTCAGCTACTGCCAACCT

SEQ IID151

CCAAAGCTATTCTCTCTTTTGG

SEQ IID152

TGAGAAAACTTGAAAATGTTGG

SEQ IID153

GATGCAACATGAGAGAGCAG

SEQ IID154

AGGTCACGAGCTCAATTTTC

SEQ IID155

GACAGTTAAGAGAAGGCTGCTT

SEQ IID156

CCCCACTCAACACACAGAA

SEQ IID157

TTATCCTTTCCTGCTTTTCC

SEQ IID158

GAGAGACGATAGGTCTGTAAGGA

SEQ IID159

CTCCCATCAACCTCTTTTGT

SEQ IID160

ATGATAGTGGCAAAGGAGAGA

SEQ IID161

CTTTCCCACATTATGGTCCT

SEQ IID162

CCCTATGCCAAGGATATAACA

SEQ IID163

ACCCATCACACTATCCTGACA

SEQ IID164

CACCTGGCCTACAATTCAAA

SEQ IID165

GGGAGGAGACAGCTTCTTG

SEQ IID166

ACTTTAGCCACCAAAATCCA

SEQ IID176

GGTTTGTGTGTGAGTGTTTCA

SEQ IID178

CAGTCCTCCAGCTCCTTATG

SEQ IID169

TTTTTCTGAAGCCCTTTCAT

SEQ IID170

CCCATGCAGAAATGAATGTA

SEQ IID171

AATCCCCGTTCACTTAGATG

SEQ IID172

GAAATATTCAGCACATCCAA

SEQ IID173

CCATGAGACTGGGTTCACTT

SEQ IID174

AGGCTCTGAATCAGGATGAG

SEQ IID175

AATTGGGGACCTATGCTGT

SEQ IID176

CCAACAATTTCCCTAGAACC

SEQ IID177

CGAGAATACAAGCAGCAGAG

SEQ IID178

AGACCAGTCACCTGTTTTGC

SEQ IID179

CCTCTGAGATGATGAATGCTT

SEQ IID180

GTCCATGCTAGAAAAAGCTGA

SEQ IID181

CAAGTGGGGAAACTAGGTCA

SEQ IID182

CAGTGCCACTCTTCACTGAG

SEQ IID183

AAGTACACCCCAGGCTCAG

SEQ IID184

CTCGCTTGAGTTTTCTTTGG

SEQ IID185

CACTGTTTGGCATGAACTTG

SEQ IID186

CCATGCCATCGTCTGTATTA

SEQ IID187

TCTGGAATGCCAGTTCTTTT

SEQ IID188

AGAACGCCTATGAAAACCAG

SEQ IID189

CTCCCTGACCTGTGGTCTT

SEQ IID190

GGATGAAGGTTAGAGCCAGA

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, судебной медицины и криминалистики, генетическим исследованиям в области идентификации человека. Представлен способ получения молекулярных однонуклеотидных маркеров для идентификации неизвестного индивида методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК; набор для получения молекулярных маркеров. Изобретение раскрывает разработанные синтетические оригинальные олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицировать локусы, содержащие целевые однонуклеотидные маркеры для последующего секвенирования с помощью метода «массового параллельного секвенирования». Набор для генотипирования включает композицию, образованную 95 парами синтетических оригинальных олигонуклеотидных праймеров для локусов в геноме человека, включающих однонуклеотидные маркеры, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР. Последовательность праймеров приведена в SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO 190. Синтетические олигонуклеотидные праймеры подобраны таким образцом, чтобы ПЦР-продукт имел минимальную длину, меньше 120 п.н. Изобретение позволяет успешно анализировать деградированные образцы ДНК, идентифицировать неизвестного индивида и определить биологическое родство в российской популяции с высокой чувствительностью, специфичностью и точностью по сравнению с существующими аналогами. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

1. Способ получения молекулярных однонуклеотидных маркеров для идентификации неизвестного индивида методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК, характеризующийся тем, что для генотипирования используют композицию из 95 пар оригинальных синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 190, фланкирующих участки ДНК, содержащие однонуклеотидные вариации (SNP); ПЦР-продукты, соответствующие выбранным праймерам, представляют собой маркеры.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что размер полученных ПЦР-продуктов составляет не более 120 п.н.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные в результате мультиплексной амплификации ПЦР-продукты, содержащие маркеры для идентификации неизвестного индивида, используются в качестве матрицы для различных методов генетического определения нуклеотидной последовательности.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение нуклеотидной последовательности ПЦР-продуктов, содержащих маркеры для идентификации неизвестного индивида, проводят секвенированием по методу «массового параллельного секвенирования» (NGS).

5. Способ по п. 1 для идентификации неизвестного индивида, происходящего из популяций Российской Федерации.

6. Набор для получения молекулярных маркеров способом по п. 1, используемых для генотипирования индивида, используемый для детектирования присутствия молекулярных однонуклеотидных SNP-маркеров, предназначенных для идентификации неизвестного индивида, включающий оригинальные синтетические олигонуклеотидные праймеры с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO 190.