АНТИТЕЛО К CLDN18.2 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 C07K16/30 C07K14/725 C12N5/20 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к области лечения заболеваний и иммунологии. В частности, данное изобретение относится к антителу к CLDN18.2 или его антигенсвязывающему фрагменту, молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей их, иммуноконъюгату, биспецифической молекуле, химерному антигенному рецептору и фармацевтической композиции, содержащей их, а также к их применению в профилактике и/или лечении опухоли.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак желудка представляет собой одну из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей в мире, 5-летняя выживаемость при данном заболевании низкая и в большинстве стран составляет от 20% до 40%, и ежегодно от данного заболевания погибают приблизительно 700 000 человек. Выживаемость при раке желудка в Китае составляет 35,9%. Согласно статистике, число новых случаев рака желудка достигло 679,1/100 000, а количество летальных исходов в Китае в 2015 году составило 498,0/100 000, таким образом, рак желудка стал второй наиболее распространенной опухолью после рака легкого, с высокой заболеваемостью и смертностью. Рак желудка отличается высокой степенью злокачественности и, поскольку скрининг рака желудка широко не проводился, обычно он диагностируется у пациентов на поздней стадии, так что возможность радикального хирургического вмешательства оказывается упущенной, и в качестве основного способа лечения остается только химиотерапия.

С развитием молекулярной биологии опухолей подтвердилась эффективность лекарственных средств направленного действия и иммунотерапии в лечении гемобластозов, рака молочной железы и колоректального рака, однако их применение в лечении рака желудка относительно ограничено. В настоящее время одобренные в мировой практике мишени для таргетной терапии рака желудка включают человеческие рецептор 2 эпидермального фактора роста (HER2) и фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), а одобренной мишенью для иммунотерапии рака желудка является белок программируемой гибели 1 (PD-1). В сентябре 2017 на основании крупномасштабного клинического исследования III фазы ATTRACTION-2 Министерство здравоохранения, труда и благосостояния Японии одобрило антитело к PD-1 под названием Opdivo для лечения пациентов с устойчивым к химиотерапии распространенным раком желудка: по сравнению с плацебо, препарат Opdivo смог снизить смертность на 37% и продемонстрировал эффективность 11,2%. На основании клинического исследования II фазы Keynote 059 антитело к PD-1 под названием Китруда® (Keytruda) получило ускоренное одобрение FDA для лечения пациентов с устойчивым к химиотерапии PD-L1-положительным распространенным раком желудка, показав эффективность 15,5%. Что касается таргетной терапии, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) не только способствует ангиогенезу опухоли, но также связывается с рецепторами на поверхности опухолевых клеток и активирует нижележащие сигнальные пути и непосредственно участвует в формировании, возникновении и миграции опухолевых стволовых клеток. Безопасность и эффективность двух ингибиторов VEGFR2, апатиниба и рамуцирумаба, в нацеленой на VEFR терапии распространенного рака желудка в качестве второй и последующих линий подтверждена клинически. Амплификация гена HER2 или сверхэкспрессия белка возникает приблизительно в 6 - 35% новых случаев рака желудка ежегодно, таким образом, HER2 является одной из важных мишеней в противоопухолевой терапии. Клиническое исследование III фазы TOGA впервые продемонстрировало преимущества трастузумаба в качестве первой линии терапии HER2 (+) распространенного рака желудка, при этом общая выживаемость (OS) в группе, получавшей трастузумаб в комбинации с химиотерапией, была существенно дольше, чем в группе, получавшей только химиотерапию (13,8 месяцев против 11 месяцев), и вторичные показатели эффективности, включая выживаемость без прогрессирования (PFS), долю пациентов с объективным ответом (ORR) и время до прогрессирования (ТТР) тоже существенно улучшались. Однако, доля HER2-положительных пациентов в Китае составляет всего лишь 10%, поэтому необходимо проводить поиск новых терапевтических мишеней для рака желудка.

Клаудин представляет собой трансмембранный белковый комплекс плотных контактов эпителия, расположенный в апикальной части щели между соседними клетками. Его распространение является ткане- и органоспецифичным, и его функции в основном включают клеточную адгезию, поддержание полярности клеток, регуляцию параклеточной проницаемости и участие в регуляции пролиферации и дифференцировке клеток. Молекула клаудина 18 представлят собой тетраспанин с четыремя трансмембранными гидрофобными областями и двумя внеклеточными петлями и существует в виде двух различных сплайс-вариантов, CLDN18.1 и CLDN18.2. CLDN18.1 и CLDN18.2 отличаются последовательностью N-концевой внутриклеточной области и первой внеклеточной петли, но остальные части имеют одинаковую первичную белковую последовательность. Тканевое распределение CLDN18 свидетельствует, что CLDN18.1 экспрессируется избирательно только клетками легкого, тогда как CLDN18.2 экспрессируется только клетками желудка, и экспрессия CLDN18.2 в нормальном желудке ограничена дифференцированными короткоживущими эпителиальными клетками желудка. CLDN18.2 часто сохраняется при злокачественной трансформации клеток желудка и, следовательно, часто экспонируется на поверхности опухолевых клеток желудка человека, и от 60% до 80% желудочно-кишечных аденом являются положительными по CLDN18.2 (Clinical Cancer Research 2008, 14 (23): 7624-34). Кроме того, при раке протоков поджелудочной железы и метастатическом раке поджелудочной железы имеет место высокая экспрессия CLDN18.2, при этом степень позитивности составляет 60-70%, и поэтому CLDN18.2 можно использовать в качестве диагностического маркера и терапевтической мишени при раке протоков поджелудочной железы/раке поджелудочной железы (Journal of Clinical Pathology 2012, 65: 431-436; World Journal of Gastroenterology 2014, 20 (31): 10813-10824; International Journal of Cancer 2014, 134: 731-739). Интенсивных исследований эктопической активации CLDN18.2 при других опухолях не проводится, и из существующих на данный момент публикаций следует, что помимо вышеупомянутой эктопической активации при раке поджелудочной железы, данный белок также экспрессируется при раке пищевода, раке бронхов, немелкоклеточном раке легкого (NSCLC), раке молочной железы, опухолях ЛОР-органов, раке яичника, раке толстой кишки, раке печени и их метастазах, в частности, при таких метастазах рака желудка, как опухоль Крукенберга, метастазы в брюшную полость и метастазы в лимфоузлы (Clinical Cancer Research 2008, 14 (23): 7624-34; International Journal of Cancer 2014, 134: 731 739; Cancer Letters 2017, 403: 66-73; International Journal of Cancer 2014, 135 (9): 2206-2214). CLDN18.2 представляет собой опухолевую мишень лечебного и профилактического значения, и его дифференциальная экспрессия в опухолевых клетках и нормальных клетках, его мембранная локализация, его отсутствие в большинстве подверженных влиянию токсичности нормальных тканей и ограничение его экспрессии в желудке дифференцированными клетками желудка, которые могут быть восполнены за счет мишень-негативных стволовых клеток (или находящихся в недоступном расположении стволовых клеток) желудка, делают CLDN18.2 привлекательной мишенью для иммунотерапии рака. Таким образом, существует острая необходимость в разработке антител к CLDN18.2, обладающих высокой специфичностью, более низкой токсичностью или меньшими побочными эффектами и большей клинической эффективностью, которые обеспечат больше возможностей для лечения пациентов, страдающих раком.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитело по данному изобретению способно специфически распознавать/связывать человеческий CLDN18.2 и способно индуцировать гибель клетки (например, опухолевой клетки), экспрессирующей CLDN18.2, через ADCC и/или CDC и демонстрирует улучшенные функциональные характеристики по сравнению с известным антителом к CLDN18.2. Таким образом, антитело по данному изобретению является перспективным для профилактики и/или лечения опухоли и имеет большое клиническое значение.

Антитела по данному изобретению

Так, в одном аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие три области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 75 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 75,

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 76 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 76, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 77 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 77;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие три области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 78 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 78,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 79 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 79, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 80 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с SEQ ID NO: 80.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену;

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 75, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 76, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 77; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 78 или 96, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 79, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 80.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способный специфически связываться с CLDN18.2, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(а) вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 73; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 74; или

(б) вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 91; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 92.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с испольованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 44F7 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 75, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 76, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 77; VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 78 или 96, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 79, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 80; или

(2) (a) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 73; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 74; или (б) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 91; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 92.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 73;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 73; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 73;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 74;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) каркасную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативную замену до 20 аминокислот (например, консервативную замену до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативную замену 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, из которой он получен; и/или

(б) каркасную область легкой цепи человеческого иммуноглобулина или ее вариант, где вариант имеет консервативную замену до 20 аминокислот (например, консервативную замену до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, консервативную замену 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, из которой он получен.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область человеческого иммуноглобулина, такую как каркасная область, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном первичного антитела человека. В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи первичного антитела человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи первичного антитела человека.

В указанных воплощениях каркасная область (каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный). В некоторых предпочтительных воплощениях каркасная область (каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи) содержит один или более чем один аминокислотный остаток, которые мутированы обратно в соответствующие мышиные остатки или консервативную аминокислотную замену соответствующих мышиных остатков (такая мутация называется обратной мутацией).

Таким образом, в некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область человеческого иммуноглобулина (например, каркасную область, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном первичного антитела человека), каркасная область возможно содержит одну или более чем одну обратную мутацию человеческих остатков в мышиные остатки.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 91;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 91; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 91;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 92;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 92; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 92.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (ii) или (v), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 99;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 99; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 99;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 100;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 100; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 100.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 101;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 101; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 101;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 102;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 102; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 102.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 101, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 102.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 3 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 4 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 5 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 6 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 7 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 8 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 3, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 5; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 6, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 7, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 8.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 1D10 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или 0,02 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 1 мкг/мл или менее;

(в) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(д) опосредование интернализации CLDN18.2 в клетку (например, опухолевую клетку), например, с уровнем интернализации по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или более) при определении посредством FACS или проточной цитометрии; клетка имеет экспрессируемый на своей поверхности CLDN18.2;

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 3, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 4, и VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 5, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 6, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 7, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 8; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 2.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 11 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 12 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 13 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 14 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 15 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 16 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (vi), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 11, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 12, и VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 13; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 14, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 15, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 16.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 9; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 10.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 2F12 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 11, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 12, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 13, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 14, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 15, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 16; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 9; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 10.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 9;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 10;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 10; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 10;

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 19 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 20 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 21 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 22 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 23 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 24 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 19, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 20, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 21; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 22, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 24.

В настоящем изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 17; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 18.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 3F2 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 19, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 20, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 21, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 22, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 23, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 24; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 17; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 18.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 17;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 17; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 17;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 18;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 18; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 18.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 27 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 28 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 29 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 30 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 31 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 32 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 27, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 28, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 29; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 30, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 31, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 32.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 25; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 26.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 5F9 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,5 мкг/мл или менее;

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,2 мкг/мл или менее;

(в) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(д) опосредование интернализации CLDN18.2 в клетку (например, опухолевую клетку), например, с уровнем интернализации по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или более) при определении посредством FACS или проточной цитометрии; клетка имеет экспрессируемый на своей поверхности CLDN18.2;

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 27, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 28, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 29, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 30, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 31, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 32; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 25; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 26.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 25;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 25; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 25;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 26;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 26; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 26.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 35 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 36 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 37 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 38 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 39 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 40 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 35, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 36, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 37; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 38, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 39, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 40.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 33; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 34.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 9F3 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,2 мкг/мл или менее;

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 35, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 36, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 37, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 38, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 39, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 40; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 33; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 34.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 33;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 33; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 33;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 34;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34;

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 33, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 43 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 44 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 45 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 46 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 47 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 48 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 43, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 44, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 45; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 46, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 47, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 48.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 41; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 42.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 10 В11 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 43, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 44, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 45, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 46, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 47, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 48; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 41; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 42.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 41;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 41; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 41;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 42;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 41, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 42.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать одну или более чем одну обратную мутацию, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 51 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 52 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 53 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 54 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 55 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 56 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 51, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 52, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 53; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 54, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 55, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 56.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 49; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 50.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 27 В5 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,2 мкг/мл или менее;

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 51, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 52, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 53, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 54, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 55, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 56; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 49; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 50.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 49;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 49; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 49;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 50;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 50; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 50.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 59 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 60 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 61 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 62 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 63 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 64 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 59, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 60, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 61; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 62, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 63, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 64.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 57; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 58.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 37В1 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее (например, 0,05 мкг/мл или менее);

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 59, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 60, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 61, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 62, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 63, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 64; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 57; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 58.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 57;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 57; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 57;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 58;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 58; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 58.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 57, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 58.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В другом аспекте данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(1) VH CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 67 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

(2) VH CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 68 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(3) VH CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 69 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 области, определяющие комплементарность (CDR):

(4) VL CDR1, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 70 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней,

(5) VL CDR2, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 71 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней, и

(6) VL CDR3, которая состоит из следующей последовательности: SEQ ID NO: 72 или последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2 или 3 аминокислот) по сравнению с ней.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в любом из (1) - (6), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 67, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 68, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 69; и VL антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 70, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 71, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 72.

В данном изобретении также предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 65; и вариабельная область легкой цепи содержит 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых предпочтительных воплощениях 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи и/или 3 CDR вариабельной области легкой цепи определены с использованием систем нумерации Kabat, Chothia или IMGT.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой 44А8 или его антигенсвязывающий фрагмент, его химерное антитело или его гуманизированное антитело или их вариант, где вариант по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более чем одной из следующих биологических функций:

(а) связывание с человеческим CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(б) связывание с мышиным CLDN18.2 с ЕС50 0,1 мкг/мл или менее;

(в) отсутствие связывания с человеческим CLDN18.1;

(г) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC);

(д) индукция гибели клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2 (например, опухолевой клетки, такой как опухолевая клетка, экспрессирующая CLDN18.2) через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC);

(е) опосредование интернализации CLDN18.2 в клетку (например, опухолевую клетку), например, с уровнем интернализации по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20% или более) при определении посредством FACS или проточной цитометрии; клетка имеет экспрессируемый на своей поверхности CLDN18.2;

(ж) профилактика и/или лечение опухоли (например, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2) у субъекта.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 67, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 68, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 69, VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 70, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 71, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 72; или

(2) 3 CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 65; и 3 CDR вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 66.

В приведенном в качестве примера воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 65;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 65; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 65;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 66;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот (например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 66; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 66.

В некоторых предпочтительных воплощениях замена, указанная в (ii) или (v), представляет собой консервативную замену.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 65, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 66.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

В некоторых предпочтительных воплощениях VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), происходящую из человеческого иммуноглобулина, и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит каркасную область (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), происходящую из человеческого иммуноглобулина. В указанных воплощениях FR вариабельной области тяжелой цепи и/или FR вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать один или более чем один аминокислотный остаток, не являющийся человеческим (например, мышиный), например, каркасная область FR тяжелой цепи и/или каркасная область FR легкой цепи может содержать обратную мутацию одной или более чем одной аминокислоты, и указанные обратные мутации содержат соответствующие мышиные аминокислотные остатки.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут дополнительно содержать последовательность константной области, происходящую из иммуноглобулина млекопитающего (например, мыши или человека) или ее вариант, где вариант имеет замену, делецию или вставку одной или более чем одной аминокислоты по сравнению с последовательностью, из которой получен вариант. В некоторых предпочтительных воплощениях вариант имеет консервативную замену одной или более чем одной аминокислоты по сравнению с последовательностью, из которой он получен.

В некоторых предпочтительных воплощениях тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению содержит константную область тяжелой цепи (СН) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где вариант имеет замену, делецию или вставку одной или более чем одной аминокислоты (например, замену, делецию или вставку вплоть до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот; например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот); и/или

Легкая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению содержит константную область легкой цепи (CL) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где вариант имеет замену, делецию или вставку вплоть до 20 аминокислот (например, замену, делецию или вставку вплоть до 15, до 10, до 10 или до 5 аминокислот; например, замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот).

В некоторых предпочтительных воплощениях константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG, такую как константная область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых предпочтительных воплощениях константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 мыши. В некоторых предпочтительных воплощениях константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых воплощениях константная область тяжелой цепи предпочтительно представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG4 человека.

В некоторых предпочтительных воплощениях константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи к. В некоторых предпочтительных воплощениях константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи к мыши. В некоторых предпочтительных воплощениях константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи к человека.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению содержит константную область тяжелой цепи (СН), приведенную в SEQ ID NO: 81; и/или константную область легкой цепи (CL), приведенную в SEQ ID NO: 82.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело по данному изобретению представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, биспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело. В некоторых предпочтительных воплощениях антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, связанного дисульфидными связями Fv, scFv, диатела и однодоменного антитела (sdAb).

В данном изобретении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению может включать вариант, который отличается от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является, только консервативной заменой одного или более чем одного аминокислотного остатка (например, консервативной заменой до 20, до 15, до 10 или до 5 аминокислот) или имеет последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, производным которых он является, и по существу сохраняет биологическую функцию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, производным которых он является.

Получение антител

Антитело по данному изобретению может быть получено различными способами, известными в области техники, например, генно-инженерными рекомбинантными способами. Например, молекулу ДНК, кодирующую гены тяжелой цепи и легкой цепи антитела по данному изобретению, получают химическим синтезом или ПЦР-амплификацией. Полученную молекулу ДНК встраивают в экспрессирующий вектор и затем трансфицируют в клетку-хозяина. Затем трансфицированную клетку культивируют в специфических условиях для экспрессии антитела по данному изобретению.

Антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению может быть получен посредством гидролиза интактной молекулы антитела (см.: Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992); и Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). В качестве альтернативы, указанные антигенсвязывающие фрагменты также можно получать непосредственно в рекомбинантных клетках-хозяевах (обзор представлен Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)). Например, Fab' фрагменты могут быть получены непосредственно из клеток-хозяев; Fab' фрагменты могут быть химически связаны с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Кроме того, фрагменты Fv, Fab или F(ab')₂ также можно выделять непосредственно из среды культивирования рекомбинантных клеток-хозяев. Специалистам в области техники известны другие способы получения указанных антигенсвязывающих фрагментов.

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению или вариабельную область его тяжелой цепи и/или вариабельную область его легкой цепи. В некоторых предпочтительных воплощениях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению или вариабельную область его тяжелой цепи и/или вариабельную область его легкой цепи.

В другом аспекте данного изобретения предложен вектор (например, клонирующий вектор или экспрессирующий вектор), содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях вектор по данному изобретению представляет собой, например, плазмиду, космиду, фаг и тому подобное. В некоторых предпочтительных воплощениях вектор способен экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению у субъекта (например, млекопитающего, такого как человек).

В другом аспекте данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению или вектор по данному изобретению. Такая клетка-хозяин включает, без ограничения, прокариотическую клетку, такую как клетка Е. coli, и эукариотическую клетку, такую как клетка дрожжей, клетка насекомого, клетка растения и клетка животного (например, клетка млекопитающего, такая как клетка мыши, клетка человека и т.д.). В некоторых предпочтительных воплощениях клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка СНО (например, СНО-К1, CHO-S, СНО DG44).

В другом аспекте предложен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина по данному изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивируемой клетки-хозяина.

Дериватизированные антитела

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть дериватизированы, например, связаны с другой молекулой (например, другим полипептидом или белком). В общем, дериватизация (например, мечение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента не сказывается отрицательным образом на его связывании с CLDN18.2 (в частности, с человеческим CLDN18.2). Таким образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению также охватывают такие дериватизированные формы. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть функционально связаны (посредством химического присоединения, слияния генов, нековалентного связывания или другими способами) с одной или более чем одной группой других молекул, таких как другое антитело (например, с образованием биспецифического антитела), детектирующий реагент, фармацевтический реагент и/или белок или полипептид (например, авидин или полигистидиновая метка), способных опосредовать связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой. Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению также могут быть дериватизированы химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метил или этил, или гликозил. Указанные группы могут применяться для улучшения биологических свойств антитела, таких как увеличение времени полужизни в сыворотке.

Таким образом, в некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению являются меченными. В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению несут детектируемую метку, такую как фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество (например, хемилюминесцентное вещество) или биотин. Детектируемая метка по данному изобретению может представлять собой любое вещество, которое может быть детектировано флуоресцентными, спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунологическими, электрическими, оптическими или химическими способами. Такие метки хорошо известны в области техники и их примеры включают, без ограничения, ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т.д.), радионуклиды (например, ³Н, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴С или ³²Р), флуоресцентные красители (например, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), флуоресцеин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC), фикоэритрин (РЕ), Техасский красный, родамин, квантовые примеси или производные красителя цианин (например, Су7, Alexa 750), люминесцентные материалы (например, хемилюминесцентные материалы, такие как акридиновые эфиры), магнитные бусинки (например, Dynabeads^®), метки для колориметрических исследований, такие как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или пластиковые бусинки (например, полистироловые, полипропиленовые, латексные и т.д.) и биотины для связывания с авидином (например, стрептавидином), модифицированные вышеуказанными метками. Патенты, в которых изложено применение указанных меток, включают патенты US 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241, но не ограничиваются перечисленными (все они включены в данный документ посредством ссылки). Детектируемые метки, описанные выше, могут быть определены способами, хорошо известными в области техники. Например, радиоактивные метки могут быть детектированы с применением фотографической пленки или сцинтилляционного счетчика, а флуоресцентные метки могут быть детектированы с применением фотодетектора для регистрации испускаемого света. Ферментные метки обычно детектируют, предоставляя ферменту субстрат и определяя продукт реакции, образующийся под влиянием фермента на субстрат. В колориметрических исследованиях окрашенные метки определяют просто путем визуализации. В некоторых воплощениях такие метки подходят для иммунологического определения (например, в иммуноферментном анализе, радиоиммуноанализе, флуоресцентном иммуноанализе, хемилюминесцентном иммуноанализе и т.д.). В некоторых воплощениях детектируемая метка, как описано выше, может быть связана с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по данному изобретению посредством линкеров различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия.

Биспецифические или мультиспецифические молекулы

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут применяться для образования биспецифических или мультиспецифических молекул. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению может быть частью биспецифической или мультиспецифической молекулы, а биспецифическая или мультиспецифическая молекула содержит вторую функциональную молекулу (например, второе антитело), обладающую иной связывающей детерминантой, нежели антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению, так что она способна связываться по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть связаны со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые способны специфически связываться с любым белком, который может применяться в качестве возможной мишени для комбинированной терапии. Для содания биспецифической или мультиспецифической молекулы антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть связаны (например, посредством химического связывания, слияния генов, нековалентной ассоциации или другими способами) с одной или более чем одной связывающейся молекулой (например, дополнительными антителами, фрагментами антител, пептидами или связывающимися миметиками).

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложена биспецифическая или мультиспецифическая молекула, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению.

В некоторых предпочтительных воплощениях биспецифическая или мультиспецифическая молекула специфически связывается с CLDN18.2 и дополнительно специфически связывается с одной или более чем одной другой мишенью.

В некоторых предпочтительных воплощениях биспецифическая или мультиспецифическая молекула дополнительно содержит по меньшей мере одну молекулу (например, второе антитело), имеющую связывающую детерминанту ко второй мишени.

Иммуноконъюгаты

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут быть связаны с веществом терапевтического назначения для образования иммуноконъюгата. Поскольку такие иммуноконъюгаты обладают способностью избирательно доставлять одно или более чем одно вещество терапевтического назначения в ткани-мишени (например, в опухоли, экспрессирующие опухолеассоциированные антигены, такие как CLDN18.2), иммуноконъюгаты могут усиливать терапевтическую эффективность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению в лечении заболеваний (например, злокачественных новообразований).

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложен иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению и вещество терапевтического назначения, связанное с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

В некоторых предпочтительных воплощениях иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC).

В некоторых предпочтительных воплощениях вещество терапевтического назначения представляет собой цитотоксическое вещество. В данном изобретении цитотоксическое вещество включает любое вещество, которое наносит вред клетке (например, вызывает гибель клетки).

В некоторых предпочтительных воплощениях вещество терапевтического назначения выбрано из группы, состоящей из алкилирующих веществ, антимитотических веществ, противоопухолевых антибиотиков, антиметаболитов, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов тирозинкиназы, радионуклидов и любых их комбинаций.

Примеры алкилирующих веществ, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, производные хлорэтиламинов (например, дихлорэтилметиламин, хлорамбуцил, мелфалан, циклофосфамид и т.д.), этиленимины (например, тиотепа и т.д.), сульфонаты и полиолы (например, бусульфан, дибромманнитол (миелобромол)), нитрозомочевины (например, кармустин, ломустин и т.д.), противоопухолевые вещества на основе платины (например, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин и т.д.).

Примеры антимитотических веществ, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, майтансиноиды (например, майтансин, майтансинол, С-3 эфиры майтансинола и т.д.), таксаны (например, доцетаксел, паклитаксел или наночастицы паклитаксела и т.д.), алкалоиды барвинка розового (например, винбластина сульфат, винкристин, винбластин или винорелбин и т.д.).

Примеры противоопухолевых антибиотиков, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, актиномицин, антибиотики антрациклинового ряда (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин и т.д.), калихеамицин, дуокармицин и т.д.

Примеры антиметаболитов, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения антагонисты фолата (например, метотрексат и т.д.), антагонисты пиримидина (например, 5-фторурацил, фторуридин, цитарабин, капецитабин, гемцитабин и т.д.), антагонисты пуринов (например, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и т.д.), ингибиторы аденозиндезаминазы (например, кладрибин, флударабин, неларабин, пентостатин и т.д.).

Примеры ингибиторов топоизомеразы, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, капмтотецины и их производные (например, иринотекан, топотекан и т.д.), амсакрин, дауномицин, адриамицин, эпиподофиллотоксин, эллиптицин, эпирубицин, этопозид, разоксан, тенипозид и т.д.

Примеры ингибиторов тирозинкиназы, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, акситиниб, бозутиниб, силдениб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб, вандетаниб и т.д.

Примеры радиоактивных веществ, которые могут применяться в иммуноконъюгатах по данному изобретению, включают, без ограничения, I¹³¹, In¹¹¹, Y⁹⁰, Lu¹⁷⁷ и т.п.

В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях вещество терапевтического назначения выбрано из группы, состоящей из противоопухолевых веществ на основе платины, антибиотиков антрациклинового ряда, таксанов, аналогов нуклеозидов, соединений камптотецина и их аналогов или гомологов, а также любых их комбинаций.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению возможно конъюгированы с веществом терапевтического назначения посредством линкера.

В данном изобретении цитотоксическое вещество может быть присоединено к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту по данному изобретению с применением технологии линкеров, известной в области техники. Примеры типов линкеров, которые применялись для присоединения цитотоксического вещества к антителу, включают гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептид-содержащие линкеры, но не ограничиваются перечисленным. Например, можно выбрать линкер, который подвержен расщеплению под воздействием низких значений рН внутри лизосомального компартмента или подвержен расщеплению протеазами, такими как протеазы, предпочтительно экспрессируемые в опухолевой ткани, такими как катепсины (например, катепсины В, С, D).

Более подробное обсуждение типов цитотоксических веществ, линкеров и способов присоединения веществ терапевтического назначения к антителам также можно найти в документах Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, PA et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, TM (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. and Kreitman, RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, PD and Springer, С J (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Химерный антигенный рецептор

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут применяться для конструирования химерного антигенного рецептора (CAR), химерный антигенный рецептор содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен (например, scFv), который специфически связывается с CLDN18.2 и соединен с трансмембранным доменом и одним или более чем одним внутриклеточным Т-клеточным сигнальным доменом. Внутриклеточный Т-клеточный сигнальный домен может включать, например, сигнальные домены Т-клеточного рецептора, сигнальные домены костимулирующих молекул Т-клеток или их комбинации. Сигнальный домен Т-клеточного рецептора относится к части CAR, которая содержит внутриклеточный домен Т-клеточного рецептора (например, внутриклеточную часть белка CD3ζ). Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, которая содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы, а костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенных рецепторов или их лигандов, необходимую для эффективного ответа лимфоцитов на антиген.

Характеристики CAR по данному изобретению включают его способность перенацеливать специфичность и реакционноспособность Т-клеток на клетку, экспрессирующую CLDN18.2 (например, опухолевую клетку), не рестрицированным по МНС образом. Не рестрицированное по МНС распознавание CLDN18.2 придает Т-клеткам, экспрессирующим CAR по данному изобретению, способность распознавать антиген независимо от процессирования антигена.

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антигенсвязывающий домен антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению.

В некоторых предпочтительных воплощениях антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению.

В некоторых предпочтительных воплощениях антигенсвязывающий домен представляет собой scFv.

В некоторых предпочтительных воплощениях химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv) антитела по данному изобретению.

В некоторых предпочтительных воплощениях химерный антигенный рецептор экспрессируется иммунной эффекторной клеткой (например, Т-клеткой).

В некоторых предпочтительных воплощениях между антигенсвязывающим доменом и транс мембранным доменом CAR может находиться спейсерный домен, содержащий полипептидную последовательность. Спейсерный домен может содержать до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот, и наиболее предпочтительно, от 25 до 50 аминокислот. В некоторых воплощениях спейсерный домен может содержать домен иммуноглобулина, такой как последовательность человеческого иммуноглобулина. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях домен иммуноглобулина содержит последовательности доменов СН2 и СН3 иммуноглобулина. В таких воплощениях, не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что домены СН2 и СН3 сдвигают антигенсвязывающий домен CAR от мембраны экспрессирующей CAR клетки и могут более точно имитировать размер и структуру доменов естественного TCR.

В некоторых предпочтительных воплощениях трансмембранный домен может происходить из естественного или искусственного источника. В таких воплощениях домен может происходить из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Примеры трансмембранных доменов, которые могут применяться в CAR по данному изобретению могут содержать по меньшей мере трансмембранную область α, β или ζ, цепи Т-клеточного рецептора, а Т-клеточнй рецептор может быть выбран из группы, состоящей из CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154. В альтернативном варианте трансмембранный домен может иметь искусственное происхождение и таком случае он будет преимущественно содержать гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин.

В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях трансмембранный домен содержит трансмембранный домен Т-клеточного рецептора, такой как трансмембранный домен CD8.

В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях трансмембранный домен содержит трансмембранный домен Т-клеточной костимулирующей молекулы (например, CD 137 или CD28).

В некоторых предпочтительных воплощениях примеры внутриклеточных Т-клеточных доменов, которые могут применяться в CAR, включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и костимулирующие молекулы, которые действуют совместно, инициируя передачу сигнала после связывания антигена с рецептором, а также любые производные или варианты указанных последовательностей и любые синтетические последовательности, обладающие аналогичными функциональными способностями.

В некоторых предпочтительных воплощениях внутриклеточная область CAR может содержать первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая действует стимулирующим образом, которая может содержать сигнальный мотив, известный как иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив, или ITAM. Примеры ITAM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые могут содержаться в CAR, включают такие, которые происходят из белков CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CDS, CD22, CD79a, CD79b и CD66d.

В некоторых предпочтительных воплощениях внутриклеточная область CAR может содержать ITAM, содержащий первичный цитоплазматический сигнальный домен (например, CD3ζ) в отдельности или в комбинации с любым другим желаемым цитоплазматическим доменом, который может применяться в CAR. Например, цитоплазматический домен CAR содержит часть цепи CD3ζ и внутриклеточный костимулирующий сигнальный домен. Костимулирующий сигнальный домен относится к части CAR, которая содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Ко стимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенных рецепторов или их лигандов, которые требуются для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ОХ40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS, лимфоцитарный функциональный антиген 1 типа (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C и В7-НЗ.

В некоторых предпочтительных воплощениях CAR может содержать сигнальный домен CD3ζ, сигнальный домен CD8, сигнальный домен CD28, сигнальный домен CD137 или любую их комбинацию. Порядок одного или более чем одного Т-клеточного сигнального домена в CAR может быть изменен специалистом в области техники при необходимости.

Способы создания химерных антигенных рецепторов и Т-клеток, содержащих такой рецептор, а также их применения (например, применение в лечении рака) известны в области техники, а их подробное описание можно найти, например, у Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18: 4,666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, опубликовано он-лайн 23 февраля 2010, p.1-9; Till et al., 2008, Blood, 112: 2261-2271; Park et al., Trends Biotechnol., 29: 550-557, 2011; Grupp et al., NEnglJMed., 368: 1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; в публикации PCT WO 2012/079000, WO 2013/126726; и публикации US 2012/0213783, содержание всех перечисленных документов включено во всей полноте путем ссылки. Например, для получения CAR молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный антигенсвязывающий рецептор по данному изобретению, может содержаться в экспрессирующем векторе (например, лентивирусном векторе) для экспрессии в клетке-хозяине, такой как Т-клетка. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях способ применения химерного антигенного рецептора включает выделение Т-клетки у субъекта, трансформацию Т-клетки экспрессирующим вектором (например, лентивирусным вектором), кодирующим химерный антигенный рецептор, и введение модифицированной Т-клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор субъекту для осуществления лечения, например, лечения у субъекта опухоли.

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный антигенный рецептор по данному изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует химерный антигенный рецептор по данному изобретению.

В другом аспекте данного изобретения предложен вектор (например, клонирующий вектор или экспрессирующий вектор), содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную выше. В некоторых предпочтительных воплощениях вектор по данному изобретению представляет собой, например, плазмиду.

В другом аспекте данного изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, описанные выше. В некоторых предпочтительных воплощениях клетка-хозяин представляет собой Т-клетку. В некоторых предпочтительных воплощениях клетка-хозяин представляет собой Т-клетку с химерным антигенным рецептором (CAR-T).

Способ лечения и фармацевтическая композиция

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут индуцировать ADCC и/или CDC путем связывания с CLDN18.2, и поэтому могут применяться для профилактики и/или лечения опухоли.

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу или иммуноконъюгат по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

В некоторых предпочтительных воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительное фармацевтически активное вещество.

В некоторых предпочтительных воплощениях дополнительное фармацевтически активное вещество представляет собой противоопухолевое вещество, такое как алкилирующее вещество, антимитотическое вещество, противоопухолевый антибиотик, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, ингибитор тирозинкиназы, радионуклид, радиосенсибилизирующее вещество (например, гемцитабин, 5-фторурацил, таксан, цисплатин и т.д.), антиангиогенное вещество, цитокин (например, GM-CSF, IL-7, IL- 12, IL-15, IL-18, IL-21 и т.д.), молекулярно-направленное вещество (например, антитело к CD20, такое как ритуксимаб, антитело к Her2, такое как трастузумаб, антитело к VEGF, такое как бевацизумаб, антитело к EGFR, такое как цетуксимаб), ингибитор иммунной контрольной точки (например, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к CTLA-4, антитело к LAG-3 и т.д.), онколитический вирус и тому подобное.

В некоторых предпочтительных воплощениях в фармацевтической композиции антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула или иммуноконъюгат по данному изобретению и дополнительное фармацевтически активное вещество представлены в виде отдельных компонентов или в виде компонентов единой композиции. Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула или иммуноконъюгат по данному изобретению и дополнительное фармацевтически активное вещество можно вводить одновременно, раздельно или последовательно.

В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях фармацевтическая композиция содержит стерильную жидкость для инъекций (например, водную или неводную суспензию или раствор). В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях такая стерильная жидкость для инъекций выбрана из группы, состоящей из воды для инъекций (WFI), бактериостатической воды для инъекций (WFI), раствора хлорида натрия (например, 0,9% (масс./об.) NaCl), раствора глюкозы (например, 5% глюкозы), раствора, содержащего поверхностно-активное вещество (например, 0,01% полисорбат 20), буферного раствора для поддержания рН (например, фосфатного буферного раствора), раствора Рингера и любой их комбинации.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки, который включает приведение клетки в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, биспецифической или мультиспецифической молекулой, иммуноконъюгатом или фармацевтической композицией по данному изобретению, чтобы уменьшить уровень экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки; где клетка имеет экспрессируемый на своей поверхности CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях клетка представляет собой опухолевую клетку, экспрессирующую CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях способ применяют для уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки in vitro в недиагностических целях.

В другом аспекте предложено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата или фармацевтической композиции по данному изобретению в изготовлении лекарственного средства для уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки.

В другом аспекте предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат или фармацевтическая композиция по данному изобретению для уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки.

В другом аспекте изобретения предложен способ ингибирования роста и/или способ уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CLDN18.2, который включает приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T)) по данному изобретению.

Способ может применяться в терапевтических целях или в целях, не являющихся терапевтическими. В некоторых предпочтительных воплощениях способ может применяться в целях, не являющихся терапевтическими, и способ применяется для ингибирования роста и/или для уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CLDN18.2, in vitro.

В другом аспекте изобретения предложено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T)) по данному изобретению в изготовлении лекарственного средства для ингибирования роста и/или для уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CLDN18.2.

В другом аспекте предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат, фармацевтическая композиция, химерный антигенный рецептор или клетка-хозяин, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (например, Т-клетка с химерным антигенным рецептором (CAR-T)) для ингибирования роста и/или уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CLDN18.2.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ профилактики и/или лечения опухоли у субъекта (например, человека), включающий введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-T)).

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль включает в себя опухолевую клетку, экспрессирующую CLDN18.2. В некоторых предпочтительных воплощениях CLDN18.2 экспрессируется на поверхности опухолевой клетки.

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль экспрессирует CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов (например, метастазов рака желудка, таких как опухоль Крукенберга, метастазов в брюшную полость или метастазов в лимфатические узлы).

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат, фармацевтическая композиция, химерный антигенный рецептор или клетка-хозяин, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (например, Т-клетка с химерным антигенным рецептором (CAR-T)) по данному изобретению применяются в комбинации с дополнительным противоопухолевым агентом. Указанный дополнительный противоопухолевый агент можно вводить перед, в то же время или после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, CAR-T).

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат, фармацевтическая композиция, химерный антигенный рецептор или клетка-хозяин, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (например, (CAR-T) по данному изобретению вводятся в комбинации с дополнительной терапией. Такая дополнительная терапия может представлять собой любую известную терапию опухолей, такую как хирургическое вмешательство, химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия, иммунотерапия, гормональная терапия, генная терапия или паллиативное лечение. Указанная дополнительная терапия может осуществляться перед, в то же время или после введения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, CAR-T) по данному изобретению.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат, фармацевтическая композиция, химерный антигенный рецептор или клетка-хозяин, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (например, CAR-T) по данному изобретению, могут быть составлены в виде любой лекарственной формы, известной в области медицины, например, в виде таблеток, пилюль, суспензий, эмульсий, растворов, гелей, капсул, порошков, гранул, эликсиров, пастилок, суппозиториев, инъекций (включая инъекционные жидкости, стерильные порошки для инъекций и концентрированные растворы для инъекций), средств для ингаляции, спреев и т.д. Предпочтительная лекарственная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Фармацевтическая композиция по данному изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения. Одной из предпочтительных лекарственных форм является инъекционная. Такая инъекционная форма может представлять собой стерильный раствор для инъекций. Например, стерильный раствор для инъекций может быть получен следующим способом: включение необходимого количества антитела по данному изобретению в соответствующий растворитель и, возможно, одновременное включение других желаемых ингредиентов (включая вещество для доведения рН, поверхностно-активное вещество, адъювант, средство, увеличивающее ионную силу, изотоническое вещество, консервант, разбавитель или любую их комбинацию, не ограничиваясь перечисленным), а затем осуществление стерилизации фильтрованием. Кроме того, стерильный раствор для инъекций может быть приготовлен в виде стерильного лиофилизированного порошка (например, посредством вакуумной сушки или лиофильной сушки) для удобства хранения и применения. Такой стерильный лиофилизированный порошок может быть диспергирован перед применением в подходящем носителе, таком как вода для инъекций (WFI), бактериостатическая вода для инъекций (WFI), раствор хлорида натрия (например, 0,9% (мас./об.) NaCl), раствор глюкозы (например, 5% глюкоза), раствор, содержащий поверхностно-активное вещество (например, 0,01% полисорбат 20), буферный раствор для поддержания рН (например, фосфатный буферный раствор), раствор Рингера и любую их комбинацию.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическая или мультиспецифическая молекула, иммуноконъюгат, фармацевтическая композиция, химерный антигенный рецептор или клетка-хозяин, экспрессирующая химерный антигенный рецептор (например, Т-клетка) по данному изобретению могут находиться в форме дозированной фармацевтической композиции для удобства введения.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, иммуноконъюгат, фармацевтическую композицию, химерный антигенный рецептор или клетку-хозяина, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (например, Т-клетку) по данному изобретению можно вводить любым подходящим способом, известным в области техники, включая пероральный, трансбуккальный, сублингвальный, внутриглазной, местный, парентеральный, ректальный, субарахноидальный, внутрицитоплазматический, паховый, внутрипузырный, местный (например, для порошков, мазей или капель) или назальный путь. Однако, при многих терапевтических применениях предпочтительным путем/способом введения является парентеральное введение (например, внутривенная инъекция или болюс, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, внутримышечная инъекция). Специалист в области техники поймет, что путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от предполагаемого назначения. В предпочтительном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу, иммуноконъюгат, фармацевтическую композицию, химерный антигенный рецептор или клетку-хозяина, экспрессирующую химерный антигенный рецептор (например, Т-клетку) по данному изобретению вводят посредством внутривенной инъекции или болюса.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, биспецифической или мультиспецифической молекулы, иммуноконъюгата, фармацевтической композиции, химерного антигенного рецептора или клетки-хозяина, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (например, Т-клетки) по данному изобретению. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для предупреждения, остановки или замедления развития заболевания. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для излечения или, по меньшей мере, для частичного торможения заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего заболеванием. Терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению может варьировать в зависимости от таких факторов, как тяжесть заболевания, лечение которого осуществляют, общее состояние иммунной системы пациента, общее состояние пациента, такое как возраст, масса тела и пол, способа введения и других одновременно применяемых терапий.

В данном изобретении схема введения может быть скорректирована для достижения оптимального ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно вводить одну дозу или несколько доз в течение периода времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, в зависимости от терапевтической ситуации.

В данном изобретении субъект может представлять собой млекопитающего, такого как человек.

Способ определения и набор

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению могут специфически связываться с CLDN18.2, и поэтому могут применяться для определения наличия или уровня CLDN18.2 в образце.

Таким образом, в другом аспекте данного изобретения предложен набор, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению. В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению мечены детектируемой меткой. В предпочтительном воплощении набор дополнительно содержит вторичное антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению. Предпочтительно, второе антитело дополнительно содержит детектируемую метку.

В данном изобретении детектируемая метка может представлять собой любое вещество, которое может быть детектировано флуоресцентными, спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунологическими, электрическими, оптическими или химическими способами. В частности, предпочтительно, чтобы такая метка была подходящей для иммунологического определения (например, в иммуноферментном анализе, радиоиммуноанализе, флуоресцентном иммуноанализе, хемилюминесцентном иммуноанализе и т.д.). Такие метки хорошо известны в области техники и включают, без ограничения, ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т.д.), радионуклиды (например, ³Н, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴С или ³²Р), флуоресцентные красители (например, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), флуоресцеин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC), фикоэритрин (РЕ), Техасский красный, родамин, квантовые примеси или производные красителя цианин (например, Су7, Alexa 750), люминесцентные материалы (например, хемилюминесцентные материалы, такие как акридиновые эфиры), магнитные бусинки (например, Dynabeads^®), метки для колориметрических исследований, такие как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или пластиковые бусинки (например, полистироловые, полипропиленовые, латексные и т.д.) и биотины для связывания с авидином (например, стрептавидином), модифицированные вышеуказанными метками. Патенты, в которых изложено применение указанных меток, включают патенты US 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149 и 4366241, но не ограничиваются перечисленными (все они включены в данный документ посредством ссылки). Детектируемые метки, описанные выше, можно определять способами, хорошо известными в области техники. Например, радиоактивные метки могут быть детектированы с применением фотографической пленки или сцинтилляционного счетчика, а флуоресцентные метки могут быть детектированы с применением фотодетектора для регистрации испускаемого света. Ферментные метки обычно детектируют, предоставляя ферменту субстрат и определяя продукт реакции, образующийся под влиянием фермента на субстрат. В колориметрических исследованиях окрашенные метки определяют просто путем визуализации. В некоторых воплощениях детектируемая метка, описанная выше, может быть связана с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по данному изобретению посредством линкеров различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ определения присутствия или количества CLDN18.2 в образце, включающий стадии:

(1) приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по данному изобретению;

(2) определение образования или количества комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и CLDN18.2;

Образование комплекса указывает на присутствие CLDN18.2 или клетки, экспрессирующей CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях образец представляет собой клеточный образец, т.е. образец, содержащий клетку (например, опухолевую клетку). В таких воплощениях, предпочтительно, образуется комплекс между антителом, антигенсвязывающим фрагментом или конъюгатом и CLDN18.2, экспрессируемым клеткой в образце.

В предпочтительном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению дополнительно мечены детектируемой меткой. В другом предпочтительном воплощении на стадии (2) реагент с детектируемой меткой применяют для определения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению.

Способ может применяться в диагностических целях или в целях, не являющихся диагностическими (например, образец представляет собой клеточный образец, а не образец от пациента). В некоторых предпочтительных воплощениях CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2.

В другом аспекте предложено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению для изготовления набора для определения присутствия или количества CLDN18.2 в образце. В некоторых предпочтительных воплощениях CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2.

В другом аспекте данного изобретения предложен способ определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2, включающий следующие стадии:

(1) приведение образца, содержащего опухолевую клетку, в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по данному изобретению;

(2) определение образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и CLDN18.2;

В некоторых предпочтительных воплощениях образуется комплекс между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и CLDN18.2, экспрессируемым опухолевой клеткой в образце.

В некоторых предпочтительных воплощениях образец происходит от субъекта, который имеет опухоль, у которого подозревают наличие опухоли или у которого существует риск наличия опухоли. В некоторых предпочтительных воплощениях образец происходит из ткани или органа, в котором клетки по существу не экспрессируют CLDN18.2, когда ткань или орган не поражены раком. В некоторых предпочтительных воплощениях ткань выбрана из группы, состоящей из ткани желудка, ткани легкого, ткани пищевода, ткани поджелудочной железы или ткани молочной железы, и, возможно, было диагностировано, что ткань поражена раком, например, посредством визуальной оценки или культурального исследования ткани или клеток органа. В некоторых предпочтительных воплощениях ткань представляет собой ткань желудка. В некоторых предпочтительных воплощениях ткань представляет собой ткань легкого, ткань пищевода, ткань поджелудочной железы или ткань молочной железы. В таких воплощениях указывают, что субъект подходит для противоопухолевой терапии, нацеленной на CLDN18.2, когда присутствует CLDN18.2 или клетка, экспрессирующая CLDN18.2, и/или когда количество CLDN18.2 или клетки, экспрессирующей CLDN18.2, повышается по сравнению с референтные уровнем (например, по сравнению с пациентом, не имеющим опухолевого заболевания).

В предпочтительном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по данному изобретению дополнительно мечены детектируемой меткой. В другом предпочтительном воплощении на стадии (2) реагент с детектируемой меткой применяют для определения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению.

В некоторых предпочтительных воплощениях CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов (например, метастазов рака желудка, таких как опухоль Крукенберга, метастазов в брюшную полость или метастазов в лимфатические узлы).

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль выбрана из группы, состоящей из рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов (например, метастазов рака желудка, таких как опухоль Крукенберга, метастазов в брюшную полость или метастазов в лимфатические узлы).

В другом аспекте предложено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению в изготовлении набора для определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент мечены детектируемой меткой.

В некоторых предпочтительных воплощениях CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2.

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов (например, метастазов рака желудка, таких как опухоль Крукенберга, метастазов в брюшную полость или метастазов в лимфатические узлы).

В некоторых предпочтительных воплощениях опухоль выбрана из группы, состоящей из рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов (например, метастазов рака желудка, таких как опухоль Крукенберга, метастазов в брюшную полость или метастазов в лимфатические узлы).

ТЕРМИНОЛОГИЯ

В данном изобретении, если не указано иное, все научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют обычное значение, известное специалистам в области техники. Кроме того, использованные лабораторные методы клеточной культуры, биохимии, химии нуклеиновых кислот и иммунологии представляют собой стандартные методы, широко используемые в соответствующих областях. При этом, для лучшего понимания данного изобретения ниже приведены определения и трактовка соответствующих терминов.

В данном описании термин «CLDN18 (клаудин 18)» имеет общепринятое значение, известное специалистам в области техники, и относится к представителю семейства клаудинов, который представляет собой трансмембранный белок в плотных контактах эпителия и эндотелия, существующий в форме двух сплайс-вариантов, CLDN18.1 и CLDN18.2. Последовательности CLDN18.1 и CLDN18.2 хорошо известны в области техники. Более подробно, см. номера доступа NP_057453.1 и NP_001002026.1. в базе данных NCBI.

В данном описании термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, которая обычно состоит из двух пар полипептидных цепей, и каждая пара имеет легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС). Легкие цепи антител можно классифицировать как легкие цепи κ (каппа) и λ (лямбда). Тяжелые цепи можно классифицировать как μ, δ, γ, α или ε, и изотипы антител характеризуют как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В составе легкой цепи и тяжелой цепи вариабельные и константные области соединены «J» сегментом, который имеет длину приблизительно 12 аминокислот или более, а тяжелые цепи дополнительно содержат «D» сегмент приблизительно из 3 аминокислот или более. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов (CHI, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из домена CL. Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но демонстрируют ряд эффекторных функций, такие как опосредование связывания иммуноглобулина с тканью или фактором организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент классического пути комплемента (C1q). Области VH и VL можно также подразделить на области с высокой денатурацией (обозначаемые областями, определяющими комплементарность (CDR)), которые перемежаются с разделенными промежутками консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждый V_H и V_L состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4 в направлении от амино-конца к карбокси-концу. Вариабельные области (VH и VL) каждой пары тяжелая цепь/легкая цепь образуют антигенсвязывающий сайт, соответственно. Нумерация аминокислотных остатков в вариабельных областях или доменах производится в соответствии с определениями Kabat, приведенными в публикации Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883.

В данном описании термин «область, определяющая комплементарность», или «CDR» относится к аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые отвечают за связывание антигена. Каждая вариабельная область тяжелой и легкой цепей содержит 3 CDR, обозначаемые CDR1, CDR2 и CDR3. Точные границы указанных CDR можно определить согласно различным системам нумерации, известным в области техники, например, согласно системе нумерации Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), системе нумерации Chothia (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) или системе нумерации IMGT (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003). Специалист в области техники легко установит CDR для заданного антитела согласно каждой системе нумерации. Специалистам в области техники также хорошо известно, как соотнести различные системы нумерации между собой (см., например, Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003).

В данном изобретении CDR, входящие в состав антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению, могут быть определены согласно различным системам нумерации, известным в области техники. В некоторых воплощениях CDR, входящие в состав антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению, предпочтительно определяют согласно системам нумерации Kabat, Chothia или IMGT. В некоторых воплощениях CDR, входящие в состав антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по данному изобретению, предпочтительно определяют согласно системе нумерации Kabat.

В данном документе термин остатки «каркасной области» или «FR» относится к таким остаткам вариабельных доменов, которые не являются остатками CDR, определенными выше.

Термин «антитело» не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, он включает рекомбинантне антитело, моноклональное антитело и поликлональное антитело. Антитело может представлять собой антитело различных изотипов, например, антитело IgG (например, подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

В данном описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к полипептиду, содержащему фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же самым антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, который также обозначается «антигенсвязывающей частью». См., Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd Edition, Raven Press, NY (1989)), содержание данного документа включено во всей полноте путем ссылки. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может бть получен посредством технологии рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением целого антитела. Неисчерпывающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, фрагменты областей, определяющих комплементарность (CDR), scFv, диател, однодоменных антител, химерных антител, линейных антител, наноантител (технология, разработанная Domantis), проантител и такие полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть антитела, достаточную для того, чтобы придать полипептиду специфическую антигенсвязывающую способность. Обзор генно-модифицированных вариантов антител представлен Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136.

Используемый в данном документе термин «полноразмерное антитело» относится антителу, состоящему из двух «полноразмерных тяжелых цепей» и двух «полноразмерных легких цепей». «Полноразмерная тяжелая цепь» относится к полипептидной цепи, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи (VH), домена СН1 константной области тяжелой цепи, шарнирной области (HR), домена СН2 и домена СН3 константной области тяжелой цепи в направлении от N-конца к С-концу; а когда полноразмерное антитело относится к изотипу IgE, возможно дополнительное включение домена СН4 константной области тяжелой цепи. Предпочтительно, «полноразмерная тяжелая цепь» представляет собой полипептидную цепь, состоящую из VH, CHI, HR, СН2 и СН3 в направлении от N-конца к С-концу. «Полноразмерная легкая цепь» представляет собой полипептидную цепь, которая состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL) в направлении от N-конца к С-концу. Две пары полноразмерных цепей антитела соединены друг с другом посредством дисульфидной связи между CL и СН1 и дисульфидной связи между HR двух полноразмерных тяжелых цепей. Полноразмерное антитело по данному изобретению может происходить из одного биологического вида, такого как человек, или может быть химерным или гуманизированным антителом. Полноразмерное антитело по данному изобретению содержит два антигенсвязывающих сайта, образованных парами VH и VL, соответственно, и эти два антигенсвязывающих сайта специфически распознают/связывают один и тот же антиген.

В данном описании термин «Fd» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и СН1; термин «фрагмент dAb» относится к фрагменту антитела, состоящему из домена VH (Ward et al., Nature 341: 544 546 (1989)); термин «Fab фрагмент» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL, VH, CL и СН1; термин «F(ab')₂ фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему два Fab фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; термин «Fab' фрагмент» относится к фрагменту, полученному путем восстановления дисульфидной связи, соединяющей фрагменты двух тяжелых цепей в F(ab')₂ фрагмент, состоящему из одной полной легкой цепи и фрагмента Fd тяжелой цепи (состоящего из доменов VH и СН1).

В данном описании термин «Fv» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL и VH одного плеча антитела. Фрагмент Fv обычно считают наименьшим фрагментом антитела, способному образовывать полный антигенсвязывающий сайт. Как правило, считают, что антигенсвязывающую специфичность антителу придают 6 CDR. Однако, даже вариабельная область (например, фрагмент Fd, содержащий только 3 антигенспецифических CDR) способен распознавать и связывать антиген, хотя его аффинность может быть ниже, чем у полного сайта связывания.

В данном описании термин «Fc» относится к фрагменту антитела, который образован связыванием второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи антитела со второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи посредством дисульфидной связи. Fc фрагмент антитела выполняет множество различных функций, однако не участвует в связывании антигена.

В данном описании термин «scFv» относится к единой полипептидной цепи, содержащей домены VL и VH, где домены VL и VH соединены посредством линкера (см., например, Bird et al., Science 242: 423 -426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, под ред. Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)). Такая молекула scFv может иметь общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-линкер-VL-COOH. Подходящий линкер, известный из уровня техники, состоит из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта. Например, может использоваться линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)4, но также может использоваться ее вариант (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые могут найти применение в данном изобретении, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293: 41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. В некоторых случаях между VH и VL scFv может также существовать дисульфидная связь.

В данном описании термин «диатело» относится к фрагменту, в котором домены VH и VL экспрессируются в единой полипептидной цепи, однако используемый линкер слишком короткий, чтобы было возможным спаривание двух доменов одной и той же цепи, таким образом форсируется спаривание с комплементарным доменом другой цепи и формируются два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) и Poljak RJ et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).

В данном описании термин «однодоменное антитело (sdAb)» имеет общепринятое значение, известное специалистам в области техники, и относится к фрагменту антитела, состоящему из одного мономерного вариабельного домена антитела (например, вариабельной области одной тяжелой цепи), который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело. Однодоменное антитело также известно как наноантитело.

В данном описании термин «проантитело» имеет общепринятое значение, известное специалистам в области техники, и относится к маскированному антителу, которое остается инертным в здоровой ткани, но может специфически активироваться в патологическом окружении (например, при протеолитическом расщеплении протеазой, которой обогащено патологическое окружение или которая присутствует исключительно в патологическом окружении). Для подробного описания см., например, Desnoyers et al., Sci. Transl. Med., 5: 207ral44, 2013. Аналогичные способы маскирования можно применять для любых антител или их антигенсвязывающих частей, описанных в данном документе.

Каждый из вышеупомянутых фрагментов антител сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, вышеупомянутый фрагмент антитела) можно получить из заданного антитела (например, антитела, предложенного в данном изобретении) с применением стандартного способа, известного специалистам в области техники (например, технологии рекомбинантной ДНК или способов ферментативного или химического расщепления) и провести скрининг специфичности тем же самым способом, который применялся при скрининге интактных антител.

В данном контексте, если не приведено точное определение, упоминание термина «антитело» охватывает не только интактное антитело, но также и антигенсвязывающий фрагмент антитела.

В данном описании термины «моноклональное антитело», «mAb» имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо и относятся к антителу или фрагменту антитела, происходящими из популяции высокогомогенных молекул антител, которая представляет собой популяцию идентичных молекул антител, если не считать естественные мутации, которые могут возникнуть спонтанно. Моноклональное антитело является высокоспецифичным в отношении единственного эпитопа на антигене. Поликлональное антитело по сравнению с моноклональным антителом обычно содержит по меньшей мере два или более различных антител, которые обычно распознают различные эпитопы на антигене. Кроме того, прилагательное «моноклональное» указывает лишь на то, что антитело получено из высокогомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом.

Моноклональное антитело по данному изобретению может быть получено различными способами, такими как гибридомная технология (см., например, Kohler et al. Nature, 256: 495, 1975), технология рекомбинантной ДНК (см., например, заявку на патент US 4816567) или технология фаговых библиотек антител (см., например, Clackson et al. Nature352: 624-628, 1991 или Marks et al. J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991).

Антитела могут быть очищены хорошо известными способами, такими как аффинная хроматография с применением белка А или белка G. После этого или в качестве альтернативы специфический антиген (молекула-мишень, распознаваемая антителом) или его эпитоп могут быть иммобилизованы на колонке, и иммуноспецифическое антитело может быть очищено посредством иммуноаффинной хроматографии. По очистке иммуноглобулина можно процитировать, например, D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia Pa., Vol.14, No. 8 (Apr. 17, 2000), pp.25-28).

В данном описании термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором часть его легкой и/или тяжелой цепи происходит из одного антитела (которое может происходить из конкретного биологического вида или принадлежать к конкретному классу или подклассу антител), а другая часть его легкой и/или тяжелой цепи происходит из другого антитела (которое может происходить из того же самого или другого биологического вида или принадлежать к тому же самому или иному классу или подклассу антител), но в любом случае оно по-прежнему сохраняет связывающую активность к антигену-мишени (патент US 4816567 (Cabilly et al.); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Например, термин «химерное антитело» может охватывать такое антитело (например, химерное мышиное-человеческое антитело), в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела происходят из первого антитела (например, мышиного антитела), тогда как константные области тяжелой и легкой цепей антитела происходят из второго антитела (например, человеческого антитела).

В данном описании термин «гуманизированное антитело» относится к генетически модифицированному антителу, не являющемуся человеческим, аминокислотная последовательность которого модифицирована для увеличения гомологии с последовательностью человеческого антитела. Как правило, все или часть областей CDR гуманизированного антитела происходят из антитела, не являющегося человеческим (донорского антитела), и все или часть областей, отличных от CDR (например, FR вариабельной области и/или константная область), происходят из иммуноглобулина человека (реципиентного антитела). Гуманизированное антитело как правило сохраняет ожидаемые свойства донорского антитела, включая, без ограничения, антигенную специфичность, аффинность, реакционноспособность и тому подобное. Донорское антитело может представлять собой антитело мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося человеком (например, яванского макака) с ожидаемыми свойствами (например, антигенной специфичностью, аффинностью, реакционноспособностью и т.д.).

В данной заявке ожидаемые свойства антитела по данному изобретению включают способности: (1) специфически распознавать/связывать CLDN18.2 (в частности, человеческий CLDN18.2); (2) опосредовать интернализацию CLDN18.2; (3) индуцировать гибель клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2, через антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); (4) индуцировать гибель клетки, экспрессирующей человеческий CLDN18.2, через комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC); (5) предупреждать и/или излечивать опухоль. Антитело по данному изобретению обладает одним или несколькими вышеупомянутыми ожидаемыми свойствами.

Химерное антитело или гуманизированное антитело по данному изобретению может быть получено на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующая тяжелую и легкую цепи, может быть получена из целевой мышиной гибридомы и модифицирована, чтобы содержать последовательность иммуноглобулина, не являющегося мышиным (например, человеческого) с применением стандартных молекулярно-биологических способов.

Для получения химерного антитела вариабельная область иммуноглобулина мыши может быть присоединена к константной области человеческого иммуноглобулина с применением способа, известного в области техники (см., например, патент US 4816567 (Cabilly et al.)). Например, чтобы получить ген полноразмерной тяжелой цепи, ДНК, кодирующую VH, функционально связывают с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи. Последовательность гена константной области тяжелой цепи человека хорошо известна в области техники (см., например, Kabat, ЕА et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), фрагмент ДНК, содержащий указанные области, может быть получен стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но как правило, предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. Например, чтобы получить ген полноразмерной тяжелой цепи (а также ген легкой цепи Fab), ДНК, кодирующую VL, функционально связывают с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL. Последовательность гена константной области легкой цепи человека хорошо известна в области техники (см., например, Kabat, ЕА et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), фрагмент ДНК, содержащий указанные области, может быть получен стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область κ или λ, но как правило, предпочтительно представляет собой константную область κ.

Для получения гуманизированного антитела мышиные CDR области можно пересаживать на человеческие каркасные последовательности с применением любых способов, известных в области техники (см. патент US 5225539 (Winter); патенты US 5530101, 5585089, 5693762 и 6180370 (Queen et al; и Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004, под ред. Lo, Benny, КС). В качестве альтернативы можно также использовать трансгенное животное, которое после иммунизации способно производить полную библиотеку человеческих антител, не производя эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция J-сегмента гена тяжелой цепи антитела (JH) у химерных мышей с терминальной мутацией приводит к полному подавлению выработки эндогенных иммуноглобулинов, и перенос набора генов первичных иммуноглобулинов человека в таких мышей с терминальной мутацией приведет к выработке человеческих антител в ответ на введение антигена (см., например, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Immunology 7: 33 и Duchosal et al., 1992, Nature 355: 258). Неисчерпывающие примеры упомянутых выше трансгенных животных включают мышей HuMAb (Medarex, Inc.), которые содержат минилокусы гена иммуноглобулина человека, кодирующие неперестроенные последовательности тяжелых цепей (μ и γ) и последовательности легких цепей κ иммуноглобулина человека, а также целевую мутацию, которая инактивирует локусы эндогенных цепей μ и κ (см., например, Lonberg et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859); или «мышь КМ™», которая несет трансгенную человеческую тяжелую цепь и трансхромосому с человеческой легкой цепью (см.: заявку на патент WO 02/43478). Другие способы гуманизации антител включают технологию фагового дисплея (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14: 309).

В данном описании термин «ген первичного антитела» или «сегмент гена первичного антитела» относится к присутствующей в геноме организма последовательности, кодирующей иммуноглобулин, не прошедший процесс созревания, способный привести к генной перестройке и мутациям для экспрессии конкретного иммуноглобулина. В данном изобретении термин «ген первичной тяжелой цепи» относится к гену или фрагменту гена первичного антитела, кодирующему тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащему ген V (от англ. variable), ген D (от англ. diversity), ген J (от англ. joining) и ген С (от англ. constant); аналогично, термин «ген первичной легкой цепи» относится к гену или фрагменту гена первичного антитела, кодирующему легкую цепь иммуноглобулина, содержащему ген V (variable), ген J (joining) и ген С (constant). В данном изобретении аминокислотная последовательность, кодируемая геном первичного антитела или фрагментом гена первичного антитела также обозначается «первичной последовательностью». Ген первичного антитела или фрагмент гена первичного антитела, а также их соответствующие первичные последовательности хорошо известны специалистам в области техники и могут быть получены или найдены в специализированных базах данных (например, IMGT, UNSWIg, NCBI или VBASE2).

В данном описании термин «специфически связывается» или «специфическое связывание» относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, такой как реакция между антителом и антигеном, против которого оно направлено. Сила или аффинность специфического взаимодействия может быть выражена термином константы равновесия реакции диссоциации (K_D). В данном изобретении термин «K_D» относится к константе равновесия реакции диссоциации специфического взаимодействия антитело-антиген, которая используется для описания аффинности связывания между антителом и антигеном. Чем ниже константа равновесия реакции диссоциаци, тем прочнее связывание между антителом и антигеном и выше аффинность антитела к антигену. В некоторых воплощениях специфическое связывание антитела с антигеном (или антитело, являющееся специфическим к антигену) означает, что антитело связывается с антигеном с аффинностью (K_D) менее чем приблизительно 10^-9 М, например, менее чем приблизительно 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 М или 10^-12 М или менее. Способность двх молекул специфически связываться можно определять известным в области техники способом, например, определять посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на инструменте BIACORE.

В данном описании термин «цитотоксический агент» охватывает любые агенты, наносящие вред клетке (например, вызывающие гибель клетки), такие как химиотерапевтическое средство, бактериальный токсин, фитотоксин или радиоактивный изотоп и т.п.

В данном описании термин «вектор» относится к нуклеиновой кислоте-носителю, в которую может быть встроен полинуклеотид. Когда вектор обеспечивает экспрессию белка, кодируемого встроенным полинуклеотидом, вектор обозначается экспрессирующий вектором. Вектор может быть внедрен в клетку-хозяина посредством трансформации, трансдукции или трансфекции, так что элементы генетического материала, которые несет вектор, могут экспрессироваться в клетке-хозяине. Векторы хорошо известны специалистам в области техники и включают: плазмиды, фагмиды, космиды, искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы дрожжей (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) или искусственные хромосомы на основе фага Р1 (РАС); фаги, такие как фаг λ или фаг М13, и вирусы животных, но не ограничиваются перечисленным. Вирусы животных, которые могут применяться в качестве векторов, включают ретровирусы (включая лентивирусы), аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, герпес-вирусы (например, вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, папилломавирусы, паповавирусы (например, SV40), но не ограничиваются перечисленными. Вектор может содержать ряд элементов, регулирующих экспрессию, включая последовательность промотора, последовательность инициации транскрипции, последовательность энхансера, элемент, по которому проводят отбор и ген-репортер, но не ограничиваются перечисленным. Кроме того, вектор может содержать сайт инициации репликации.

В данном описании термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую может быть внедрен вектор, которая включает прокариотические клетки, такие как Е. coli или Bacillus subtilis, клетки грибов, такие как клетки дрожжей или aspergillus, клетки насекомых, такие как клетки S2 дрозофилы или Sf9, или клетки животных, такие как фибробласты, клетки СНО, клетки COS, клетки NSO, клетки HeLa, клетки ВНК, клетки НЕК 293 или клетки человека, не ограничиваясь перечисленным.

В данном описании термин «идентичность» относится к степени сходства между двумя полипептидами или двумя нуклеиновыми кислотами. Когда две сравниваемые последовательности имеют в определенном сайте одинаковые мономерные субъединицы, представляющие собой основание или аминокислоту (например, каждая из двух молекул ДНК имеет в определенном сайте аденин или каждые два полипептида имеют в определенном сайте лизин), две молекулы являются идентичными по указанному сайту. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных сайтов, имеющихся у двух последовательностей, поделенного на общее количество сравниваемых сайтов и умноженное на 100. Например, если совпадают 6 из 10 сайтов в двух последовательностях, эти две последовательности имеют идентичность 60%. Например, последовательности ДНК: CTGACT и CAGGTT обладают идентичностью 50% (3 из 6 сайтов совпадают). В общем, сравнение двух последовательностей проводят способом, позволяющим получить максимальную идентичность. Такое выравнивание можно осуществлять с применением компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc.), которая основана на способе, предложенном Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно также определять с применением алгоритма Е. Meyers & W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), встроенного в программу ALIGN (версии 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков РАМ 120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за внесение гэпа 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно установить при помощи алгоритма Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), встроенного в программу GAP пакета программ GCG (доступного по адресу http://www.geg.com), либо с использованием матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250 и штрафа за внесение гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В данном описании термины «консервативная замена» и «консервативная аминокислотная замена» относятся к аминокислотным заменам, которые не оказывают неблагоприятного влияния или не изменяют ожидаемых свойств белка/полипептида, содержащего аминокислотную последовательность. Например, консервативная замена может быть внедрена посредством стандартных методик, известных в области техники, таких как направленный мутагенез и опосредованный ПЦР мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, в которых аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь, например, остатком, обладающим физическим или функциональным сходством (таким как имеющим аналогичный размер, заряд, форму, химические свойства, включая способность образовывать ковалентную связь или водородную связь и т.д.) с соответствующим аминокислотным остатком. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, известны в области техники. Такие семейства включают аминокислоты с положительно заряженными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), аминокислоты с отрицательно заряженными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), аминокислоты с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), аминокислоты с β-разветвленными боковыми цепями (такие как треонин, валин, изолейцин) и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, соответствующий аминокислотный остаток предпочтительно заменен другим аминокислотным остатком из семейства с аналогичными боковыми цепями. Способы выявления консервативных аминокислотных замен хорошо известны в области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412-417 (1997), включенные в данное описание путем ссылки).

Рассматриваемые 20 аминокислот экспрессируют в соответствии со стандартными способами. См., например, Immunology-A Synthesis (2nd Edition, Е.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), содержание данного документа включено в данное описание путем ссылки. В изобретении термины «полипептид» и «белок» имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо. Кроме того, в изобретении аминокислоты обычно обозначаются однобуквенными кодами и трехбуквенными кодами. Например, аланин может обозначаться как А или Ala.

В данном описании термин «химерный антигенный рецептор (CAR)» относится к генномодифицированному Т-клеточому рецептору, имеющему внеклеточный обеспечивающий адресную доставку домен, происходящий из антитела (например, scFv), который конъюгирован с одним или более чем одним внутриклеточными сигнальными доменами Т-клеточного рецептора. В данном изобретении термин «Т-клетка с химерным антигенным рецептором» относится к Т-клетке, которая экспрессирует CAR и имеет антигенную специфичность, определяемую обеспечивающим адресную доставку доменом CAR. Способы получения CAR (например, для применения в лечении рака) известны в области техники, см., например, Park et al., Trends Biotechnol., 29: 550-557, 2011; Grupp et al., NEnglJMed., 368: 1509-1518, 2013; Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; публикации РСТ WO 2012/079000, WO 2013/059593; а также публикация US 2012/0213783, содержание которых включено в данный документ во всей полноте путем ссылки.

В данном описании термин «фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент» относится к носителю и/или эксципиенту, который является фармакологически и/или физиологически совместимым с субъектом и активным ингредиентом, хорошо известен в области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences. Под ред. Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), и включает вещества для доведения рН, поверхностно-активные вещества, адъюванты, вещества, увеличивающие ионную силу, разбавители, вещества для поддержания осмотического давления, вещества для замедления всасывания, консерванты, без ограничения перечисленным. Например, вещества для доведения рН включают фосфатный буферный раствор, но не ограничиваются им. Поверхностно-активные вещества включают, без ограничения, катионные, анионные или неионные поверхностно-активные вещества, такие как Твин-80. Вещества, увеличивающие ионную силу, включают хлорид натрия, но не ограничиваются им. Консерванты включают различные антибактериальные и противогрибковые вещества, такие как парабены, трихлор-т-бутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п., но не ограничиваются перечисленным. Вещества для поддержания осмотического давления включают сахар, NaCl и т.п., но не ограничиваются перечисленным. Вещества для замедления всасывания включают моностеарат и желатин, но не ограничиваются перечисленным. Разбавители включают воду, водные буферные растворы (например, забуференный физиологический раствор), спирты и полиолы (например, глицерин) и т.п., но не ограничиваются перечисленным. Консерванты включают различные антибактериальные и противогрибковые вещества, такие как мертиолят, 2-феноксиэтанол, парабены, трихлор-т-бутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п., но не ограничиваются перечисленным. Стабилизаторы имеют общепринятое значение, известное специалистам в области техники, относящееся к способности стабилизировать желаемую активность активного ингредиента лекарственного средства, и включают глутамат натрия, желатин, SPGA (сахароза, фосфат, глутамат, альбумин), сахариды (например, сорбит, маннит, крахмал, сахарозу, лактозу, декстран или глюкозу), аминокислоты (например, глутаминовую кислоту, глицин), белки (например, сухую молочную сыворотку, альбумин или казеин) или продукты их распада (например, гидролизат молочного альбумина) и т.д., без ограничения перечисленным. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент включает стерильную жидкость для инъекций (например, водную или неводную суспензию или водный или неводный раствор). В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях такая стерильная жидкость для инъекций выбрана из группы, состоящей из воды для инъекций (WFI), бактериостатической воды для инъекций (BWFI), раствора хлорида натрия (например, 0,9% (масс./об.) NaCl), раствора глюкозы (например, 5% глюкозы), раствора, содержащего поверхностно-активное вещество (например, 0,01% полисорбат 20), буферного раствора для поддержания рН (например, фосфатного буферного раствора), раствора Рингера и любой их комбинации.

В данном описании термин «профилактика/осуществлять профилактику» относится к способу, осуществляемому для предупреждения или замедления возникновения заболевания или нарушения или симптома (например, опухоли) у субъекта. В данном описании термин «лечение/лечить» относится к способу, осуществляемому для достижения благоприятного или желаемого клинического результата. Для задач данного изобретения благоприятный или желаемый клинический результат включает облегчение симптома, уменьшение объема заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие дальнейшего ухудшения) болезненного состояния, отсрочивание или замедление развития заболевания, улучшение или смягчение статуса заболевания и смягчение симптома (либо частично, либо полностью), как детектируемое, так и недетектируемое, без ограничения перечисленным. Кроме того, термин «лечение/лечить» может также относиться к увеличению периода выживаемости по сравнению с ожидаемым периодом выживаемости (при отсутствии лечения).

В данном описании термин «субъект» относится к млекопитающему, такому как представитель отряда приматов, такому как человек. В некоторых воплощениях субъект (например, человек) имеет опухоль (например, опухоль, экспрессирующую CLDN18.2) или у него существует риск наличия вышеупомянутых заболеваний.

В данном описании термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения или по меньшей мере частичного достижения желаемого эффекта. Например, количество, эффективное для профилактики заболевания (например, опухоли), представляет собой количество, достаточное для предупреждения, остановки или отсрочивания возникновения заболевания (например, опухоли); количество, эффективное для лечения заболевания, представляет собой количество, достаточное для излечивания или по меньшей мере частичного торможения заболевания и его осложнений у пациента, страдающего заболеванием. Определение такого эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в области техники. Например, эффективное количество при терапевтическом применении будет зависеть от тяжести заболевания, лечение которого осуществляют, общего состояния иммунной системы пациента, общего состояния пациента, такого как возраст, масса тела и пол, способа введения лекарственных средств и других одновременно применяемых терапий и т.д.

В данном описании термин «иммунная эффекторная клетка» охватывает клетки, которые имеют гемопоэтическое происхождение и играют роль в иммунном ответе, например, лимфоциты, такие как В-клетки и Т-клетки, естественные киллерные клетки, миелоидные клетки такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты. В некоторых предпочтительных воплощениях иммунная эффекторная клетка представляет собой Т-клетку.

В данном описании термин «метастазы» относится к распространению опухолевых клеток из первичного очага в другие части тела. Образование метастазов представляет собой очень сложный процесс и зависит от отсева злокачественных клеток первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновения через эндотелиальную базальную мембрану в полости тела и кровеносные сосуды и последующей инфильтрации органов-мишеней с током крови. Наконец, рост новых опухолей (т.е. вторичных опухолей или метастатических опухолей) в сайте-мишени зависит от ангиогенеза. Метастазы опухолей часто возникают даже после удаления первичной опухоли, поскольку опухолевые клетки или компоненты могут оставаться и реализовывать метастатический потенциал. В одном воплощении термин «метастазы» по данному изобретению относится к «отдаленным метастазам», которые относятся к метастазам, расположенным на отдалении от первичной опухоли и системы регионарных лимфатических узлов. Клетки вторичной или метастатической опухоли аналогичны клеткам первоначальной опухоли. Это означает, например, что при метастазах рака яичника в печень вторичная опухоль состоит из аномальных клеток яичника (а не аномальных клеток печени). Поэтому опухоли в печени называют метастазами рака яичника (а не раком печени).

Преимущества данного изобретения

По сравнению с известным уровнем техники, техническое решение данного изобретения имеет следующие преимущества:

Антитело по изобретению способно специфически распознавать/связывать CLDN18.2 и способно индуцировать гибель клетки (например, опухолевой клетки), экспрессирующей CLDN18.2, через ADCC и/или CDC. Таким образом, антитело по данному изобретению может применяться для профилактики и/или лечения опухоли, в частности, опухоли, экспрессирующей CLDN18.2. Гуманизированное антитело по данному изобретению не только сохраняет функцию и свойства родительского антитела, но и имеет высокую степень гуманизации, так что его можно безопасно вводить субъекту-человеку, не вызывая иммунного ответа. В частности, неожиданным является то, что антитело по данному изобретению имеет существенно улучшенную аффинность и противоопухолевую активность по сравнению с известными антителами к CLDN18.2. Таким образом, антитело (в частности, гуманизированное антитело) по данному изобретению имеет большое клиническое значение.

Далее воплощения данного изобретения будут описаны более подробно с отсылкой к графическим материалам и примерам, однако специалистам в области техники понятно, что приведенные ниже графические материалы и примеры приведены только в целях иллюстрации данного изобретения, а не для ограничения объема данного изобретения. Различные объекты и преимущества данного изобретения станут очевидны специалистам в области техники, исходя из следующего далее подробного описания графических материалов и предпочтительных воплощений.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1А - 1D показаны результаты измерения связывающей активности мышиного антитела к CLDN18.2 с CLDN18.2 или CLDN18.1 на поверхностях различных клеток, соответственно. Фиг. 1А: HEK293T-hCLDN18.2; Фиг. 1В: HEK293T-mCLDN18.2; Фиг. 1С: HEK293T-hCLDN18.1; Фиг. ID: НЕК293Т.

На Фиг. 2 показаны результаты измерения связывающей активности химерного антитела к CLDN18.2 с CLDN18.2 клеточной поверхности.

На Фиг. 3А - 3С показаны результаты измерения ADCC активности, опосредуемой химерным антителом к CLDN18.2, в отношении HEK293T-hCLDN18.2, КАТО-III и NUGC4, соответственно. Фиг. 3А: HEK293T-hCLDN18.2; Фиг. 3В: КАТО-III; Фиг. 3С: NUGC4.

На Фиг. 4А - 4 В показаны результаты измерения CDC активности, опосредуемой химерным антителом к CLDN18.2, в отношении HEK293T-hCLDN18.2 и КАТО-III, соответственно. Фиг. 4А: HEK293T-hCLDN18.2; Фиг. 4 В: КАТО-III.

На Фиг. 5 показаны результаты измерения связывающей активности гуманизированного антитела к CLDN18.2 с CLDN18.2 клеточной поверхности.

На Фиг. 6 показаны результаты измерения ADCC активности, опосредуемой гуманизированным антителом к CLDN18.2, в отношении КАТО-III.

На Фиг. 7 показаны результаты измерения CDC активности, опосредуемой гуманизированным антителом к CLDN18.2, в отношении КАТО-III.

На Фиг. 8А - 8В показано влияние антитела к CLDN18.2 на объем опухоли (А) и время выживания (В), соответственно, на моделях опухоли у мышей.

Информация о последовательностях

Информация о некоторых последовательностях, включенных в данное изобретение, представлена в Таблице 1 ниже.

ЧАСТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение будет более подробно описано ниже, с отсылкой к следующим примерам, которые приведены для иллюстрации изобретения, не ограничивая его объем.

Если не указано иное, принцип экспериментальных методов молекулярной биологии и иммуноанализа, использованных в данном изобретении, можно найти в документах J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995; рестрикционные ферменты применяли согласно условиям, рекомендованным производителем. Специалисты в области техники поймут, что воплощения приведены в качестве примеров, описывающих изобретение, и не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения.

Пример 1. Получение мышиных антител к CLDN18.2

Для получения антитела к человеческому CLDN18.2 мышей (линия 216, Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.) вакцинировали с применением различных стратегий иммунизации (Таблица 2), чтобы запустить образование мышиных моноклональных антител. Антигены включали: экспрессионную плазмиду, экспрессирующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен 1 человеческого CLDN18.2 (CLDN18.2-ECL1 DNA; SEQ ID NO: 83, вектором служила pcDNA3.1), экспрессионную плазмиду, экспрессирующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточный домен 1 человеческого CLDN18.2-комплемент С3 (CLDN18.2-ECL1-C3d DNA; SEQ ID NO: 84, вектором служила pcDNA3.1), экспрессионную плазмиду, экспрессирующую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный CLDN18.2 (hCLDN18.2 DNA; SEQ ID NO: 85, вектором служила pcDNA3.1), трансфицированные клетки яичника китайского хомячка, экспрессирующие человеческий CLDN18.2 (CHO-hCLDN18.2), трансфицированные клетки почки эмбриона с высоким уровнем экспрессии человеческого CLDN18.2 (HEK293-hCLDN18.2). Адъюванты включали: in vivo-jetPEI (Polyplus Transfection Company, каталожный номер 201-50G), ODN 1826 VacciGrade (InvivoGen Company, каталожный номер vac-1826-1), полный адъювант Фрейнда CFA (InvivoGen Company, каталожный номер vac-cfa-60). Пути введения включали: внутримышечную (вм), внутрибрюшинную (вб) и подкожную (пк) инъекции. Через 3 дня после бустерной иммунизации клетки селезенки иммунизированных мышей сливали с клетками миеломы мыши SP2/0, применяя метод с полиэтиленгликолем, получая таким образом слитые клетки, которые могли экспрессировать антитела и бесконечно пролиферировать in vitro, и культивировали слитые клетки в селективной среде HAT. Слитые клетки гибридомы высаживали в 96-луночные паншеты для клеточных культур и отбирали положительные клоны в ходе первичного скрининга и подвергали 2-3 раундам субклонирования.

Первичный скрининг: При первичном скрининге надосадочную жидкость растущих клонов тестировали по способности связываться с CLDN18.2 на поверхности клеток, используя клетки, экспрессирующие человеческий CLDN18.2. Присутствие реакционноспособнных антител в надосадочной жидкости определяли с применением вторичного козьего антитела против IgG мыши, конъюгированного с DyLight488 (Abeam, каталожный номер ab97015), и оценивали связывающую способность при помощи сканирующего полное поле цитометра (см. Пример 3).

Вторичный скрининг: Надосадочную жидкость слитого клона, демонстрирующую связывание с человеческим CLDN18.2, тестировали по способности связываться с CLDN18.1 на поверхности клеток, используя клетки, экспрессирующие человеческий CLDN18.2. Присутствие реакционноспособнных антител в надосадочной жидкости определяли с применением вторичного козьего антитела против IgG мыши, конъюгированного с DyLight488 (Abeam, каталожный номер аЬ97015), и оценивали связывающую способность при помощи сканирующего полное поле цитометра (для подробного описания стадий эксперимента см. Пример 3). Наконец, получали 10 положительных моноклональных клеточных штаммов гибридомы и выделяли из культуральной надосадочной жидкости и очищали следующие антитела: 1D10, 2F12, 3F2, 5F9, 9F3, 10 В11, 27 В5, 37 В1, 44А8, 44F7.

Пример 2. Оценка антигенсвязывающей активности мышиных антител к CLDN18.2

2.1. Создание клеточных линий, экспрессирующих CLDN18.2

Человеческий CLDN18.2 (SEQ ID NO: 86) или CLDN18.1 (SEQ ID NO: 88) или мышиный CLDN18.2 (SEQ ID NO: 87) сверхэкспрессировали в клетках НЕК293Т (АТСС), клетках CHOS (Invitrogen), клетках опухоли желудка OCUM-1 (Nanjing Kebai Biotechnology Co., Ltd.) методом инфицирования лентивирусом и скрининга на устойчивость к антибиотикам (MOI=3 - 10, 5 мкг/мл полибрен). Лентивирус был предоставлен Shanghai Genechem Co., Ltd. Через 72 ч после инфицирования клеток применяли соответствующий антибиотик и продолжали культивирование от 2 до 4 недель, с последующим наращиванием и криоконсервацией для дальнейших экспериментов.

2.2. Определение связывания мышиных антител с CLDN18.2 и CLDN18.1 на поверхности клеток при помощи сканирующего клеточного цитометра

Использовали HEK293T-hCLDN18.2 и OCUM-1-hCLDN18.2, экспрессирующие человеческий CLDN18.2 (hCLDN18.2), или HEK293T-mCLDN18.2, экспрессирующие мышиный CLDN18.2 (mCLDN18.2), и соответствующую линию клеток НЕК293Т, служившую отрицательным контролем, или использовали HEK293T-hCLDN18.1 и CHOS-hCLDN18.1, экспрессирующие человеческий CLDN18.1 (hCLDN18.1). В качестве вторичного антитела использовали козье антитело против IgG мыши, конъюгированное с DyLight488 (Abeam, каталожный номер ab97015), или козье антитело против IgG человека, конъюгированное с DyLight488 (Abeam, каталожный номер ab97003). Кривые связывания получали с применением следующего способа.

10000 клеток высаживали в 100 мкл на лунку DMEM, содержащей 10% FBS, в плоскодонные 96-луночные планшеты. После адгезии или оседания клеток на дно лунок в течение ночи надосадочную жидкость на следующий день удаляли. Выполняли серию 3-кратных разведений антитела путем разведения 1/3 от общего объема (т.е. 100 мкл) в 200 мкл DMEM. 100 мкл разведенного антитела (в скрининге использовали надосадочную жидкость слитых клонов или субклонов) добавляли в каждую лунку планшета для клеточных культур, в соответствующую лунку, служившую отрицательным контролем, добавляли 100 мкл DMEM и проводили инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости в каждую лунку добавляли по 100 мкл вторичного антитела (5 мкг/мл, разведенного в DMEM) и инкубировали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. После окрашивания надосадочную жидкость удаляли, после чего однократно промывали PBS. В каждую лунку добавляли по 100 мкл PBS и затем считывали показания при помощи цитометра.

Для считывания экспериментальных данных в планшете использовали сканирующий полное поле цитометр (Nexcelom, Celigo^® Image Cytometer). В процессе измерения одновременно проводили высокоскоростную сканирующую визуализацию клеток в лунке в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, соответствующего вторичному антителу, и в канале для светлопольных изображений. Клетки, связавшиеся с антителом, подсчитывали на изображении, полученном в канале для зеленого флуоресцентного сигнала с настройками параметров в зависимости от морфологии и интенсивности флуоресценции флуоресцентно меченных клеток, а адгезировавшие клетки подсчитывали на изображении, полученном в канале для светлопольных изображений с настройками параметров в зависимости от морфологии клеток. Подсчитывали процент связавшихся с антителом клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, от общего числа адгезировавших клеток (% флуоресцентных клеток) путем деления результата подсчета, полученного в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, на результат подсчета, полученный в канале для светлопольных изображений. По указанному процентному показателю определяли связывающую активность антитела к CLDN18.2 с экспрессирующими CLDN18.2 клетками, чем ниже процентный показатель, тем хуже способность антитела к CLDN18.2 связываться с CLDN18.2 на поверхности клеток; и наоборот, чем выше процентный показатель, тем лучше способность антитела к CLDN18.2 связываться с CLDN18.2 на поверхности клеток. Данные анализировали с использованием программы GraphPad.

Результаты измерения связывающей активности антитела к CLDN18.2 с НЕК293Т, экспрессирующими человеческий CLDN18.2, НЕК293Т, экспрессирующими мышиный CLDN18.2, НЕК293Т, экспрессирующими человеческий CLDN18.1, и контрольными НЕК293Т показаны на Фиг. 1А - 1D, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, на оси ординат указано процентное содержание связывающихся с антителом к CLDN18.2 клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, в общем количестве адгезировавших клеток. Далее получали ЕС50 антигеневязывающей активности антитела к CLDN18.2 по аппроксимированным кривым, результаты показаны в Таблице 3, где референтным антителом было 175D10 (Ganymed Pharmaceuticals AG), описанное, например, в CN101312989 В и CN103509114B.

Приведенные выше результаты продемонстрировали, что все из 1D10, 2F12, 3F2, 5F9, 9F3, 10В11, 27 В5, 37 В1, 44А8 и 44F7 могли связываться с клетками, экспрессирующими человеческий CLDN18.2, и существенно превосходили референтное антитело 175D10, и указанные антитела не связывались с клетками, служившими отрицательным контролем (НЕК293Т), которые не экспрессировали CLDN18.2.

Значения ЕС50 связывающей активности антитела к CLDN18.2 с CLDN18.1 показаны в Таблице 4. Результаты продемонстрировали, что ни одно из 2F12, 3F2, 9F3, 10В11, 27В5, 37В1, 44А8 и 44F7 не связывалось с CLDN18.1, демонстрируя хорошую специфичность связывания с CLDN18.2.

Пример 3. Определение последовательности мышиного антитела к CLDN18.2 и получение химерного антитела

3.1 Определение последовательности вариабельной области мышиного антитела к CLDN18.2 человека

Клетки гибридомы собирали путем центрифугирования и к 5-10×10⁶ клеткам добавляли 1 мл TRIzol и 0,2 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 15 секунд, после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. После центрифугирования собирали водную фазу и добавляли 0,5 мл изопропанола, после чего инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Преципитат собирали и промывали этанолом, и высушивали для получения РНК. РНК-матрицу и праймеры добавляли в центрифужную пробирку в ледяной бане; проводили обратную транскрипцию, когда праймеры и матрица надлежащим образом спаривались, после чего проводили ПЦР-амплификацию. После завершения амплификации в каждую из 4 микроцентрифужных пробирок добавляли по 2,5 мкл смеси dNTP/ddNTP и инкубировали при 37°С в течение 5 минут для дальнейшего использования. В чистую микроцентрифужную пробирку добавляли 1 пмоль амплифицированного продукта ПЦР, 10 пмоль праймера для секвенирования, 2 мкл 5× буфера для секвенирования и дважды дистиллированную воду до общего объема 10 мкл, после чего нагревали при 96°С в течение 8 минут, помещали на ледяную баню на 1 мин и центрифугировали при 4°С и 10000g в течение 10 секунд. Добавляли 2 мкл предварительно охлажденной смеси для введения метки (0,75 мкмоль/л каждого из dCTP, dGTP и dTTP), α-32P-dATP 5 мкКи, 1 мкл 0,1 моль/л DDT, 2 Ед фермента для секвенирования, затем добавляли воду до 15 мкл, тщательно перемешивали и помещали на лед на 2 мин. 3,5 мкл реакционной смеси для введения метки добавляли в 4 подготовленные микроцентрифужные пробирки и инкубировали при 37°С в течение 5 минут. В каждую пробирку добавляли по 4 мкл останавливающего раствора. Образцы подвергали тепловой денатурации в водяной бане при 80° С в течение 5 минут, загружали в каждую дорожку секвенирующего геля в количестве 2 мкл и разделяли указанные фрагменты путем электрофореза для сбора информации о последовательности.

Последовательности VH и VL 10 мышиных антител показаны в Таблице 5 ниже. Дополнительно определяли последовательности CDR 10 моноклональных мышиных антител (Таблица 6) согласно способу, предложенному Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991), pp.647-669).

3.2 Получение химерных человеческих-мышиных антител и оценка антигенсвязывающей активности

Генные последовательности (см. SEQ ID NO: 103-122), кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей вышеупомянутых мышиных антител, лигировали с последовательностями, кодирующими константную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 81) и константную область легкой цепи (SEQ ID NO: 82) человеческого антитела, соответственно, и рекомбинантно экспрессировали в клетках НЕК293 (АТСС), таким образом получая соответствующие химерные антитела 1D10-chlgG1, 2F12-chIgG1, 3F2-chIgG1, 5F9-chIgG1, 9F3-chIgG1, 10B11-chlgG1, 27B5-chIgG1, 37B1-chIgG1, 44A8-chIgG1, 44F7-chIgG1. Определяли связывающую активность химерных антител в различных концентрациях с клетками НЕК293Т, экспрессирующими человеческий CLDN18.2 (HEK293T-hCLDN18.2) согласно способу, описанному в Примере 2. Результаты показаны на Фиг. 2, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, а на оси ординат указано процентное содержание связывающихся с антителом к CLDN18.2 клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, в общем количестве адгезировавших клеток (% флуоресцентных клеток). Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 связывающей активности химерных антител к антигену, которые показаны в Таблице 7. Результаты продемонстрировали, что все химерные антитела 3F2-chIgG1, 5F9-chIgG1, 9F3-chIgG1, 10B11-chlgG1, 27B5-chIgG1, 37B1-chIgG1, 44A8-chIgG1 и 44F7-chIgG1 могли распознавать/связывать человеческий CLDN18.2.

Пример 4. Оценка способности химерного антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC

HEK293T-hCLDN18.2 или опухолевые клетки желудка человека линий КАТО-III и NUGC4, которые естественным образом экспрессируют hCLDN18.2, использовали в качестве клеток-мишеней; а в качестве эффекторных клеток использовали мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные с применением реагента Ficoll. Клетки-мишени собирали и дважды промывали PBS. Краситель для прижизненного окрашивания клеток Calcein AM (50 мкг сухого порошка Calcein AM (Life Technologies, каталожный номер С3100МР) растворяли в 50 мкл DMSO) разводили до 3 мкМ и окрашивали клетки-мишени при 5% СО₂ и температуре 37° С в течение 30 минут. После окрашивания клетки дважды промывали PBS и 50 000 клеток-мишеней высаживали в 100 мкл DMEM на лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Выполняли серию 3-кратных разведений исследуемого антитела путем разведения 1/3 от общего объема (т.е. 100 мкл) в 200 мкл DMEM. 50 мкл разведенного антитела добавляли в соответствующие лунки планшета с клетками (в контрольные лунки добавляли 50 мкл среды DMEM для неспецифического цитолиза) и инкубировали с клетками-мишенями при 5% СО₂ и температуре 37° С в течение 30 минут. Затем в каждую лунку добавляли 50 000 выделенных РВМС в качестве эффекторных клеток, после чего центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, чтобы осадить клетки на дно планшета. Считывали данные планшета, в котором проводили эксперимент, с применением сканирующего полное поле цитометра (Nexcelom, визуализирующий цитометр Celigo^®) в несколько моментов времени (0 часов, 2 часа, 3 часа, 4 часа и 6 часов). В процессе измерения одновременно проводили высокоскоростную сканирующую визуализацию клеток в лунке в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, соответствующего Calcein AM, и в канале для светлопольных изображений. В каждой лунке подсчитывали живые клетки на изображении, полученном в канале для зеленого флуоресцентного сигнала с настройками параметров в зависимости от морфологии и интенсивности флуоресценции флуоресцентно меченных клеток, а общее число клеток в каждой лунке подсчитывали на изображении, полученном в канале для светлопольных изображений с настройками параметров в зависимости от морфологии клеток. Подсчитывали процент живых клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, от общего числа клеток путем деления результата подсчета, полученного в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, на результат подсчета, полученный в канале для светлопольных изображений. Процент клеток, подвергшихся специфическому клеточному лизису в присутствии антитела, от общего числа клеток получали путем вычитания соответствующего процентного показателя, полученного в присутствии антитела, из процентного показателя в контрольной лунке с неспецифическим лизисом. По указанному процентному показателю определяли способность антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC, чем ниже процентный показатель, тем меньше способность антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC; и наоборот, чем выше процентный показатель, тем лучше способность антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC. Данные анализировали с использованием программы GraphPad.

Результаты измерения способности антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC показаны на Фиг. 3А - 3С, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, а на оси ординат указан скорректированный процентный показатель специфического лизиса. Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 способности антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC, результаты показаны в Таблице 8. Результаты продемонстрировали, что исследованные антитела могли индуцировать опосредованную РВМС гибель клеток, экспрессирующих человеческий CLDN18.2, существенно лучше по сравнению с референтным антителом 175D10.

Пример 5. Оценка способности химерного антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC

HEK293T-hCLDN18.2 или опухолевые клетки желудка человека линии КАТО-III, которые естественным образом экспрессируют hCLDN18.2, использовали в качестве клеток-мишеней; а в качестве эффекторных клеток использовали свежую человеческую сыворотку. Клетки-мишени собирали и дважды промывали PBS. Краситель для прижизненного окрашивания клеток Calcein AM (50 мкг сухого порошка Calcein AM (Life Technologies, каталожный номер С3100МР) растворяли в 50 мкл DMSO) разводили до 3 мкМ и окрашивали клетки-мишени при 5% СО₂ и температуре 37° С в течение 30 минут. После окрашивания клетки дважды промывали PBS и 8000 клеток-мишеней высаживали в 25 мкл DMEM на лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты. Выполняли серию 3-кратных разведений исследуемого антитела путем разведения 1/3 от общего объема (т.е. 100 мкл) в 200 мкл DMEM. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл разведенного антитела (в контрольные лунки добавляли 25 мкл среды DMEM для неспецифического цитолиза) и инкубировали с клетками-мишенями при 5% СО₂ и температуре 37° С в течение 30 минут. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл свежеполученной 20% человеческой сыворотки (разведенной DMEM) в качестве эффекторных клеток, после чего центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, чтобы осадить клетки на дно планшета. Считывали данные планшета, в котором проводили эксперимент, с применением сканирующего полное поле цитометра (Nexcelom, визуализирующий цитометр Celigo^®) в несколько моментов времени (0, 1, 2, 3 и 4 часа). В процессе измерения одновременно проводили высокоскоростную сканирующую визуализацию клеток в лунке в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, соответствующего Calcein AM, и в канале для светлопольных изображений. В каждой лунке подсчитывали живые клетки на изображении, полученном в канале для зеленого флуоресцентного сигнала с настройками параметров в зависимости от морфологии и интенсивности флуоресценции флуоресцентно меченных клеток, а общее число клеток в каждой лунке подсчитывали на изображении, полученном в канале для светлопольных изображений с настройками параметров в зависимости от морфологии клеток. Подсчитывали процент живых клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, от общего числа клеток путем деления результата подсчета, полученного в канале для зеленого флуоресцентного сигнала, на результат подсчета, полученный в канале для светлопольных изображений. Процент клеток, подвергшихся специфическому клеточному цитолизу в присутствии антитела, от общего числа клеток получали путем вычитания соответствующего процентного показателя, полученного в присутствии антитела, из процентного показателя в контрольной лунке с неспецифическим цитолизом. По указанному процентному показателю определяли способность антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC, чем ниже процентный показатель, тем меньше способность антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC; и наоборот, чем выше процентный показатель, тем лучше способность антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC. Данные анализировали с использованием программы GraphPad.

Результаты измерения способности антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC показаны на Фиг. 4А - 4 В, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, а на оси ординат указан скорректированный процентный показатель специфического цитолиза. Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 способности антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC, результаты показаны в Таблице 9. Результаты продемонстрировали, что исследованные антитела могли индуцировать опосредованную комплементом человеческой сыворотки гибель клеток, экспрессирующих человеческий CLDN18.2, существенно лучше по сравнению с референтным антителом 175D10.

Пример 6. Оценка способности антитела к CLDN18.2 индуцировать интернализацию CLDN18.2

В данном примере определяли уровень интернализации CLDN18.2 на поверхности клеток (HEK293T-hCLDN 18.2), опосредуемой антителом к CLDN18.2, при помощи проточной цитометрии. Два образца клеток инкубировали с 10 мкг/мл химерного антитела при 37° С в течение 1 часа и 4 часов, соответственно. После нескольких промываний PBS, содержащим 2% FBS, добавляли 10 мкг/мл вторичного антитела и окрашивали при 4° С в течение 30 минут. Затем исследовали уровень экспрессии CLDN18.2 на поверхности клеток при помощи проточной цитометрии.

Значение MFI_4H представляло собой MFI образца через 4 часа инкубации, MFI_1H представляло собой MFI образца через 1 час инкубации, при этом предполагали, что связывание антитела было завершено, а эндоцитоз еще не начинался. Значение MFI_background представлялло собой MFI только вторичного антитела. Процентный показатель опосредованной антителом интернализации CLDN18.2 кеточной поверхности рассчитывали по следующей формуле:

Процент интернализованного CLDN18.2 (%)=100 - 100 × (MFI_4H - MFI_1h)/(MFI_1H- MFI_background)

Результаты показаны в Таблице 10. Указанные антитела опосредовали различную степень интернализации CLDN18.2 на поверхности клеток HEK293T-hCLDN18.2.

Пример 7. Гуманизация антитела к CLDN18.2 и оценка его активности

Для улучшения гомологии последовательностей антител-кандидатов и человеческих антител и уменьшения иммуногенности антител для человека, мышиные антитела, полученные в указанных выше Примерах, можно было подвергнуть модификации и подготовить к гуманизации, при которой мышиные области CDR пересаживали на человеческие каркасные последовательности (см. патент US 5225539 (Winter); патенты US 5530101, 5585089, 5693762 и 6180370 (Queen et al); и Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004, под ред. Lo, Benny, КС). Как правило, все или часть областей CDR гуманизированных антител происходят из антител, не являющихся человеческими (донорских антител) и все или часть областей, отличных от CDR (например, FR вариабельной области и/или константные области), происходят из иммуноглобулина человека (реципиентного антитела).

Основываясь на этом, авторы данного изобретения создали и получили 3 гуманизированных антитела мышиного антитела 44F7, которые были обозначены 7004-09hu09, 7004-09hul0 и 7004-09hul5, соответственно. Их аминокислотные последовательности представлены в таблице, приведенной ниже.

Генные последовательности (см. SEQ ID NO: 123-128), кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей вышеупомянутых гуманизированных антител лигировали с последовательностями, кодирующими константную область тяжелой цепи (SEQ ID NO: 81) и константную область легкой цепи (SEQ ID NO: 82) человеческого антитела, соответственно, после чего осуществляли рекомбинантную экспрессию. Определяли связывающую способность гуманизированных антител с CLDN18.2, экспрессированным на поверхности HEK293T-hCLDN18.2 при помощи сканирующего клеточного цитометра с применением способа, описанного в Примере 2.2. Результаты показаны на Фиг. 5, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, а на оси ординат указан процент связывающихся с антителом к CLDN18.2 клеток, испускающих зеленый флуоресцентный сигнал, от общего количества адгезировавших клеток (% флуоресцентных клеток). Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела к CLDN18.2, результаты показаны в Таблице 12. Результаты продемонстрировали, что все исследованные гуманизированные антитела могли связываться с экспрессирующими hCLDN18.2 клетками, и их аффинность была того же порядка, что и у родительского химерного антитела.

Далее авторы данного изобретения исследовали способность гуманизированных антител индуцировать ADCC, способ оценки описан в Примере 4. Опухолевые клетки желудка человека линии КАТО-III использовали в качестве клеток-мишеней; а в качестве эффекторных клеток использовали мононуклеарные клетки периферической крови человека, выделенные с применением Ficoll. Результаты измерения показаны на Фиг. 6, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, а на оси ординат указан скорректированный процентный показатель специфического клеточного лизиса. Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 способности химерного антитела к CLDN18.2 индуцировать ADCC, результаты показаны в Таблице 13. Результаты продемонстрировали, что все исследованные антитела могли индуцировать опосредованную РВМС гибель клеток, экспрессирующих человеческий CLDN18.2, а их способность индуцировать ADCC была того же порядка, что и у родительского химерного антитела и существенно лучше, чем у референтного антитела 175D10.

Авторы данного изобретения также исследовали способность гуманизированных антител индуцировать CDC, способ оценки описан в Примере 5. Опухолевые клетки желудка человека КАТО-III использовали в качестве клеток-мишеней; а в качестве эффекторных клеток использовали свежую человеческую сыворотку. Результаты измерения показаны на Фиг. 7, где на оси абсцисс указан логарифм концентрации антитела, на оси ординат указан скорректированный процентный показатель специфического цитолиза. Далее по аппроксимированным кривым получали значения ЕС50 способности химерного антитела к CLDN18.2 индуцировать CDC, результаты показаны в Таблице 14. Результаты продемонстрировали, что все исследованные антитела могли индуцировать опосредованную комплементом человеческой сыворотки гибель клеток, экспрессирующих человеческий CLDN18.2, а их способность индуцировать CDC была того же порядка, что и у родительского химерного антитела и существенно лучше, чем у референтного антитела 175D10.

Приведенные выше результаты показали, что гуманизированные антитела по данному изобретению не только обладали высокой степенью гуманизации и поэтому уменьшали возможность иммунного отторжения, но также демонстрировали противоопухолевую активность, которая была сопоставима с таковой родительского химерного антитела и превосходила таковую известных антител.

Пример 8. Оценка противоопухолевой активности химерного антитела к CLDN18.2 in vivo

Для исследования противоопухолевого влияния антитела к CLDN18.2 у животных бестимусным мышам (SCID, Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.) инокулировали подкожно 1×10⁷ клеток HEK293T-hCLDN18.2. Начиная с дня инокуляции осуществляли поочередно внутривенное введение и внутрибрюшинное введение, дважды в неделю на протяжение 4 недель, каждый раз по 10 мг/кг. После завершения введения продолжали определять размер опухоли у мышей. На Фиг. 8А показано изменение объема опухоли у мышей после лечения. Результаты продемонстрировали, что лечение антителом 44F7-chIgG1 не только существенно подавляло рост опухоли, но также полностью устраняло опухоли у мышей в группе, которой осуществляли введение, и его противоопухолевый эффект был существенно лучше, чем у референтного антитела 175D10. Кроме того, на Фиг. 8 В показано, что 44F7-chIgG1 существенно пролонгировало общее время выживания у мышей, имеющих опухоли, демонстрируя превосходную противоопухолевую активность. Можно заметить, что по сравнению с референтным антителом 175D10, 44F7-chIgG1 также демонстрировало существенные преимущества в увеличении времени выживания. Указанные технические эффекты были существенными и неожиданными.

Несмотря на подробное описание частных воплощений данного изобретения специалисту в области техники будет понятно, что на основании всех опубликованных принципов возможны различные модификации и изменения деталей, и объем правовой охраны данного изобретения будет распространяться на все эти изменения. Данное изобретение и любые его эквиваленты изложены во всей полноте в прилагающейся формуле изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитела к CLDN18.2 или их антигенсвязывающие фрагменты и способ их получения и применения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, конъюгаты для определения количества CLDN18.2 или определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин. А также указаны: иммуноконъюгат, химерный антигенный рецептор, фармацевтическая композиция, наборы для определения количества CLDN18.2, способ уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2, способ уничтожения опухолевой клетки, способ лечения опухоли, наборы для определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2 Изобретения используются для профилактики и/или лечения опухоли. 30 н. и 21 з.п. ф-лы, 14 табл., 8 ил., 8 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 75, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 76, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 77; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 78 или 96, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 79, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 80.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 3, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 4, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 5; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 6, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 7, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 8.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 11, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 12, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 13; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 14, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 15, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 16.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 19, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 20, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 21; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 22, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 23, и VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 24.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 27, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 28, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 29; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 30, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 31, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 32.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 35, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 36, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 37; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 38, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 39, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 40.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 43, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 44, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 45; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 46, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 47, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 48.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 51, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 52, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 53; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 54, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 55, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 56.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 59, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 60, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 61; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 62, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 63, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 64.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с CLDN18.2, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL),

где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 67, VH CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 68, VH CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 69; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 70, VL CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 71, VL CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 72.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 73;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 73; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 73;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 74;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 74;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 73, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 74.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент гуманизированы.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 12, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 91;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 91; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 91;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 92;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 92; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 92;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 91, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 12, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 99;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 99; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 99;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 100;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 100; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 100;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 99, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 100.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 12, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 101;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 101; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 101;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 102;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 102; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 102;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 101, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 102.

16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2.

17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 9;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 10;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 10; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 10;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 9, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 10.

18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 17;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 17; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 17;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 18;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 18; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 18;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18.

19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 25;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 25; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 25;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 26;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 26; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 26;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 25, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 26.

20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 6, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 33;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 33; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 33;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 34;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 34;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 33, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 34.

21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, содержащие: (а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 41;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 41; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 41;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 42;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 42;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 41, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 42.

22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 49;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 49; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 49;

и/или

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 50;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 50; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 50;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50.

23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 9, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 57;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 57; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 57;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 58;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 58; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 58;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 57, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 58.

24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 10, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(1) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 65;

(2) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 65; или

(3) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 65;

и

(б) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(4) последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 66;

(5) последовательности, имеющей замену, делецию или вставку 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 66; или

(6) последовательности, обладающей идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 66;

предпочтительно замена, указанная в (2) или (5), представляет собой консервативную замену;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: VH, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 65, и VL, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 66.

25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-24, содержащие константную область тяжелой цепи (СН) и константную область легкой цепи (CL), происходящие из человеческого иммуноглобулина.

26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 25, где константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG, такую как константная область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), приведенную в SEQ ID NO: 81.

27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 25, где константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи κ;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи (CL), приведенную в SEQ ID NO: 82.

28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-27, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, связанного дисульфидными связями Fv, scFv и однодоменного антитела (sdAb); и/или антитело представляет собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.

29. Конъюгат для определения количества CLDN18.2, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28 и детектируемую метку; предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

30. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28.

31. Экспрессирующий вектор для получения антитела, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 30.

32. Клетка-хозяин для получения антитела, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 30 или вектор по п. 31.

33. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 32 в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивируемой клетки-хозяина.

34. Иммуноконъюгат для лечения опухоли, экспрессирующей CLDN18.2, у субъекта, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28 и вещество терапевтического назначения, связанное с антителом или его антигенсвязывающий фрагментом;

предпочтительно вещество терапевтического назначения представляет собой цитотоксическое вещество;

предпочтительно вещество терапевтического назначения выбрано из алкилирующего вещества, антимитотического вещества, противоопухолевого антибиотика, антиметаболита, ингибитора топоизомеразы, ингибитора тирозинкиназы, радионуклида и любой их комбинации;

предпочтительно иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC).

35. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, экспрессирующей CLDN18.2, у субъекта, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28 или иммуноконъюгата по п. 34 и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

36. Фармацевтическая композиция по п. 35, которая дополнительно содержит дополнительное фармацевтически активное вещество;

предпочтительно дополнительное фармацевтически активное вещество представляет собой противоопухолевое вещество, такое как алкилирующее вещество, антимитотическое вещество, противоопухолевый антибиотик, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, ингибитор тирозинкиназы, радионуклид, радиосенсибилизирующее вещество, антиангиогенное вещество, цитокин, молекулярно-направленное вещество, ингибитор иммунной контрольной точки или онколитический вирус;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или иммуноконъюгат и дополнительное фармацевтически активное вещество представлены в виде отдельных компонентов или в виде компонентов единой композиции.

37. Набор для определения количества CLDN18.2, содержащий антитело, меченное детектируемой меткой, где антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28;

предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

38. Набор для определения количества CLDN18.2, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28 и второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28; и второе антитело дополнительно содержит детектируемую метку;

предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

39. Химерный антигенный рецептор для лечения опухоли, экспрессирующей CLDN18.2, у субъекта, содержащий антигенсвязывающий домен антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28;

предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28;

предпочтительно антигенсвязывающий домен представляет собой scFv;

предпочтительно химерный антигенный рецептор содержит антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп. 1-28;

предпочтительно химерный антигенный рецептор экспрессируется иммунной эффекторной клеткой.

40. Способ уменьшения уровня экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки, включающий приведение клетки в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-28, или иммуноконъюгатом по п. 34, или фармацевтической композицией по п. 35, или химерным антигенным рецептором по п. 39, так что уровень экспрессии CLDN18.2 на поверхности клетки уменьшается; где клетка имеет CLDN18.2, экспрессируемый на ее поверхности;

предпочтительно клетка представляет собой опухолевую клетку, экспрессирующую CLDN18.2.

41. Способ уничтожения опухолевой клетки, экспрессирующей CLDN 18.2, включающий приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28, или иммуноконъюгата по п. 34, или фармацевтической композиции по п. 35, или химерного антигенного рецептора по п. 39.

42. Способ лечения опухоли, экспрессирующей CLDN18.2, у субъекта, включающий введение субъекту, которому это необходимо, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28, или иммуноконъюгата по п. 34, или фармацевтической композиции по п. 35, или химерного антигенного рецептора по п. 39;

предпочтительно опухоль включает опухолевую клетку, экспрессирующую CLDN18.2; предпочтительно CLDN18.2 экспрессируется на поверхности опухолевой клетки;

предпочтительно опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов;

предпочтительно субъект представляет собой млекопитающего, такого как человек.

43. Способ по п. 42, который дополнительно включает введение дополнительного противоопухолевого вещества, такого как алкилирующее вещество, антимитотическое вещество, противоопухолевый антибиотик, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, ингибитор тирозинкиназы, радионуклид, радиосенсибилизирующее вещество, антиангиогенное вещество, цитокин, молекулярно-направленное вещество, ингибитор иммунной контрольной точки или онколитический вирус; или

способ дополнительно включает введение дополнительной противоопухолевой терапии, такой как хирургическое вмешательство, химиотерапия, лучевая терапия, таргетная терапия, иммунотерапия, гормональная терапия, генная терапия или паллиативное лечение.

44. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28, или иммуноконъюгата по п. 34, или фармацевтической композиции по п. 35, или химерного антигенного рецептора по п. 39 в изготовлении лекарственного средства для профилактики и/или лечения опухоли, экспрессирующей CLDN18.2, у субъекта;

предпочтительно опухоль включает опухолевую клетку, экспрессирующую CLDN18.2; предпочтительно CLDN18.2 экспрессируется на поверхности опухолевой клетки;

предпочтительно опухоль выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов;

предпочтительно субъект представляет собой млекопитающего, такого как человек.

45. Применение по п. 44, где лекарственное средство дополнительно содержит дополнительное фармацевтически активное вещество;

предпочтительно дополнительное фармацевтически активное вещество представляет собой противоопухолевое вещество, такое как алкилирующее вещество, антимитотическое вещество, противоопухолевый антибиотик, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, ингибитор тирозинкиназы, радионуклид, радиосенсибилизирующее вещество, антиангиогенное вещество, цитокин, молекулярно-направленное вещество, ингибитор иммунной контрольной точки или онколитический вирус.

46. Способ определения количества CLDN18.2 в образце, включающий следующие стадии:

(1) приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-28;

(2) определение образования или количества комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и CLDN18.2;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент мечены детектируемой меткой;

предпочтительно CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2.

47. Способ определения, поддается ли опухоль противоопухолевой терапии, нацеленной на CLDN18.2, включающий следующие стадии:

(1) приведение образца, содержащего опухолевую клетку, в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-28;

(2) определение образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и CLDN18.2;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент мечены детектируемой меткой;

предпочтительно CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2;

предпочтительно опухоль выбрана из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов.

48. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28 в изготовлении набора для определения, поддается ли опухоль противоопухолевой терапии, нацеленной на CLDN18.2;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент мечены детектируемой меткой;

предпочтительно CLDN18.2 представляет собой человеческий CLDN18.2;

предпочтительно опухоль выбрана из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака бронхов, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уха-горла-носа (ЛОР-органов), рака яичника, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазов.

49. Конъюгат для определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28 и детектируемую метку; предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

50. Набор для определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2, содержащий антитело, меченное детектируемой меткой, где антитело представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28;

предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.

51. Набор для определения, поддается ли опухоль лечению противоопухолевой терапией, нацеленной на CLDN18.2, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28 и второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-28; и второе антитело дополнительно содержит детектируемую метку;

предпочтительно детектируемая метка представляет собой фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество или биотин.