КОНЪЮГАТЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ КЛАУДИНА 18.2 Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 C07K16/30 A61K31/40 A61K39/00 A61K47/68 A61P35/00 

Моноклональные антитела (mAB) произвели революцию в лечении онкологических заболеваний в течение последних двух десятилетий (Sliwkowski, M. X. et al. (2013) Science 341 (6151), 1192-1198). Критической особенностью mAB является их высокая специфичность и способность поражать опухолевые клетки, маркируя их для опосредованного иммунными эффекторами клеточного убийства (комплементарно-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)) и/или приводя к уменьшению пролиферации и апоптозу (Kubota, T. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (9), 1566-1572). Конъюгация с цитотоксическими препаратами может расширить полезность mAB и повысить их активность и эффективность (Goldmacher, V.S. et al. (2011) Ther. Deliv. 2 (3), 397-416; Sievers, E. L. (2013) Annu. Rev. Med. 64, 15-29).

Исторически использование цитотоксических препаратов для лечения онкологических заболеваний сосредоточено на химиотерапии, которая нацелена на деление клеток злокачественных опухолей. Эти соединения не только нацелены на клетки злокачественных опухолей, но и на другие делящиеся здоровые клетки в организме, а пациенты, получающие лечение, испытывают серьезные побочные эффекты, которые ограничивают дозу. Терапевтический индекс (максимальная переносимая доза/минимальная эффективная доза) для этих лекарств является низким, что приводит к узкому терапевтическому окну (Ismael, G.F.V. et al. (2008) Cancer Treat Rev. 34 (1), 81-91). Чтобы обойти это препятствие при разработке лекарственных средств и улучшить терапевтический индекс, антитела могут быть использованы для доставки цитотоксического лекарственного средства прямо в опухоль. При объединении уникальной возможности таргетинга антитела со способностью цитотоксического лекарственного средства уничтожать злокачественные опухоли, конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) проявляют более низкие побочные эффекты и обеспечивают более широкое терапевтическое окно по сравнению с традиционными химиотерапевтическими средствами (Gerber, H.-P. et al. (2013) Nat. Prod. Rep.30 (5), 625-639).

ADC предназначены для уничтожения клеток злокачественных опухолей зависимым от мишени образом. Первым шагом в этом процессе является связывание антитела с его антигеном. При связывании ADC весь комплекс антиген-ADC интернализуется и цитотоксическая полезная нагрузка высвобождается в опухолевую клетку, приводя к гибели клеток. Факторы, которые влияют на терапевтический индекс для ADC, включают антитело, антиген опухоли-мишени, цитотоксическое лекарственное средство и линкер (Panowksi, S. et al. (2014) MAbs 6 (1), 34-45).

В качестве основной предпосылки для разработки ADC, антиген опухолевой мишени должен быть локализован на поверхности клетки и доступен для циркулирующего антитела. Кроме того, селективность опухоли и уровень экспрессии целевого антигена являются критическими параметрами для разработки безопасных и эффективных ADC. В настоящее время различные связанные с опухолью клеточные поверхностные антигены оцениваются как мишени ADC для лечения онкологических заболеваний (Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129; Teicher, B. A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9 (8), 982-1004).

Эффективность ADC также зависит от цитотоксического лекарственного средства. Поскольку количество антитела, которое локализуется в опухоли, очень мало по сравнению с вводимой дозой, требуются токсичные соединения с субнаномолярной активностью. Ауристатины и майтанзиноиды представляют собой два класса высокоэффективных цитотоксинов, которые в настоящее время используются при разработке ADC (Trail, P. A. (2013) Antibodies 2 (1), 113-129). Оба являются антимитотическими агентами, блокирующими полимеризацию тубулина, вызывая гибель клеток путем остановки клеточного цикла в фазе G2/M (Lopus, M. et al. (2010) Mol. Cancer Ther. 9 (10), 2689-2699; Francisco, J. A et al. (2003) Blood 102 (4), 1458-1465). В дополнение к специфичности mAB и эффективности лекарственного средства линкер является важным элементом при разработке ADC. Линкер должен быть устойчивым, чтобы использовать фармакокинетический период полувыведения mAB, и не должен выделять цитотоксическое лекарство до опосредованной антигеном интернализации. Линкеры могут быть классифицированы по механизму высвобождения лекарственного средства: расщепляемые линкеры высвобождают лекарство путем гидролиза или ферментативного расщепления после антигенспецифической интернализации, тогда как нерасщепляемые линкеры, высвобождают лекарство путем деградации mAB в лизосомах после интернализации (Dosio, F. et al. (2011) Toxins (Basel) 3 (7), S. 848-883).

В зависимости от компоновки линкера мембранные проницаемые (липофильные) токсины, которые высвобождаются внутри положительных по мишени клеток, могут проходить клеточную мембрану и убивать другие близкие клетки, включая соседние клетки злокачественных опухолей, которые не имеют экспрессии антигена («эффект свидетеля», неспецифический цитолиз) (Kovtun, Y.V. et al. (2006) Cancer Res. 66 (6), 3214-3221). Способность этих цитотоксических препаратов опосредовать локальный неспецифический цитолиз является важным критерием отбора для тех ADC, которые направлены против антигенов, гетерогенно экспрессирующихся в опухолях.

Молекула плотного контакта клаудин 18, изотип 2 (CLDN18.2) является ассоциированным со злокачественной опухолью вариантом сплайсинга клаудина 18. CLDN18.2 представляет собой трансмембранный белок 27,8 кДа, содержащий четыре трансмембранных домена с двумя небольшими внеклеточными петлями (петля 1, охваченная гидрофобной областью 1 и гидрофобной областью 2, петля 2, охваченная гидрофобными областями 3 и 4). CLDN18.2 представляет собой высокоселективный антиген желудочного происхождения, исключительно экспрессируемый на короткоживущих дифференцированных желудочных эпителиальных клетках и не обнаруживаемый в любой другой нормальной ткани человека. Антиген эктопически экспрессируется на значительных уровнях в разнообразных злокачественных новообразованиях человека, включая гастроэзофагеальный рак и рак поджелудочной железы (Sahin, U., et al., Clin Cancer Res, 2008. 14 (23): p.7624-34). Белок CLDN18.2 также часто обнаруживается в метастазах в лимфатических узлах рака желудка и в отдаленных метастазах. CLDN18.2, по-видимому, участвует в пролиферации CLDN18.2-положительных опухолевых клеток, поскольку отрицательная регуляция мишени с помощью технологии siRNA приводит к ингибированию пролиферации клеток рака желудка.

IMAB362 представляет собой химерное моноклональное антитело подтипа IgG1, направленное против CLDN18.2. IMAB362 распознает первый внеклеточный домен CLDN18.2 с высокой аффинностью и специфичностью и не связывается с каким-либо другим членом семейства клаудинов, включая близкородственный вариант сплайсинга 1 клаудина 18 (CLDN18.1). У мышей, несущих ксенотрансплантаты человека, экспрессирующие CLDN18.2, после введения IMAB362 наблюдались повышение выживаемости и регрессия опухолей. При внутривенном введении релевантным видам животных токсичность в желудочной ткани не наблюдалась, поскольку целевой эпитоп недоступен. Однако мишень опухоли становится доступной для IMAB362 во время злокачественной трансформации. IMAB362 объединяет четыре независимых сильнодействующих механизма действия: (i) антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), (ii) комплементарно-зависимая цитотоксичность (CDC), (iii) индукция апоптоза, вызванная сшиванием мишени на поверхности опухоли и (iv) прямое ингибирование пролиферации. Предыдущее исследование фазы I оценило IMAB362 в качестве монотерапии в разовой дозе у пациентов с гастроэзофагеальным раком в поздней стадии. Это исследование показывает, что однократное введение этого антитела является безопасным и хорошо переносимым в дозе до 1000 мг/м², так как не было выявлено каких-либо существенных различий в профиле AE и других параметрах безопасности между группами доз (AE=неблагоприятное событие). Лучшие результаты в отношении противоопухолевой активности были получены для групп 300 мг/м² и 600 мг/м². Это клиническое исследование фазы IIa проводилось для определения безопасности, переносимости и противоопухолевой активности повторных доз IMAB362 у пациентов с метастатическим, рефрактерным или рецидивирующим заболеванием прогрессирующей аденокарциномы желудка или нижнего пищевода, доказанного гистологией.

Как описано выше, CLDN18.2 имеет ограниченный паттерн экспрессии в нормальных клетках и, таким образом, представляется идеальной мишенью для антителозависимой терапии злокачественных новообразований, экспрессирующих CLDN18.2. Соответственно, существует потребность в терапии, направленной против CLDN18.2-экспрессирующих клеток злокачественных опухолей, которая способна оказывать клинически полезный цитотоксический или цитостатический эффект на клетки, экспрессирующие CLDN18.2, в частности, не оказывая нежелательного воздействия на клетки, неэкспрессирующие CLDN18.2. Предпочтительно, терапия не должна быть связана с недостатками и нежелательными побочными эффектами, обычно связанными с подходами, которые были использованы для повышения терапевтической эффективности антител, такими как радиоактивное мечение и комбинирование с химиотерапией. Например, изотопная терапия связана с миелосупрессией, а комбинированная терапия антителами и химиотерапией связана с иммуносупрессией. Кроме того, изотопно-меченые вещества трудно получать, а пациенты часто испытывают рецидив после первоначального лечения изотопно мечеными веществами.

Настоящее изобретение демонстрирует существование моноклональных антител против CLDN18.2, которые могут быть высокоэффективно интернализованы при связывании с CLDN18.2 на экспрессирующих CLND18.2 клетках и, следовательно, пригодны для разработки ADC. Кроме того, раскрыто успешное конъюгирование таких антител с лекарственными средствами DM4 и MMAE с использованием расщепляющихся линкеров SPDB или Val-Cit (vc), соответственно. In vitro конъюгаты антител снижают жизнеспособность клеток злокачественных опухолей желудка и поджелудочной железы, экспрессирующих CLDN18.2. IMAB362-vcMMAE и IMAB362-DM4 не связывают или не влияют на жизнеспособность отрицательных по CLDN18.2 клеток. Оба конъюгата DM4 и vcMMAE оказывают эффекты неспецифического цитолиза на отрицательные по CLDN18.2 клетки злокачественных опухолей, совместно культивируемые in vitro с положительными по CLDN18.2 клетками злокачественных опухолей. Кроме того, in vivo, внутривенное введение конъюгатов антител голым мышам с ксенотрансплантатами CLDN18.2-положительной опухоли желудка или поджелудочной железы приводит к дозозависимому ингибированию роста опухоли, выживанию и даже полной регрессии ранних и прогрессирующих опухолей. Значительные терапевтические эффекты наблюдаются при однократном внутривенном применении~4-8 мг/кг; оптимальные терапевтические эффекты достигаются при 15-16 мг/кг. Максимальная переносимая разовая доза обоих конъюгатов не может быть определена, так как максимально возможные тестируемые дозы 15,2 и 16 мг/кг не приводят к гепатотоксичности или другим токсическим эффектам.

Из представленных в данном документе данных можно сделать вывод, что конъюгаты антитело-лекарственное средство против CLDN18.2, такие как описанные в данном документе, являются сильнодействующими лекарственными средствами для лечения CLDN18.2-положительных карцином человека, таких как карциномы желудка и поджелудочной железы.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение в целом обеспечивает терапию для эффективного лечения и/или профилактики онкологических заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими CLDN18.2, такими как рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак легкого, такого как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак яичника, рак толстой кишки, рак печени, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и метастазы, в частности метастазы рака желудка, такие как опухоли Крюкенберга, перитонеальный метастаз и метастазы в лимфатические узлы. Особенно предпочтительными онкологическими заболеваниями являются аденокарциномы желудка, пищевода, протоков поджелудочной железы, желчных протоков, легких и яичника.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2, включающему введение конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего антитело, способное связываться с CLDN18.2, ковалентно связанное, по меньшей мере, с одной токсинной лекарственной группой, пациенту с онкологическим заболеванием.

В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство интернализуется в клетки после связывания с CLDN18.2, который экспрессируется клетками.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, специфически связывается с CLDN18.2. В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство специфически связывается с CLDN18.2.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, представляет собой моноклональное, химерное или гуманизированное антитело или фрагмент антитела. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, представляет собой моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с нативными эпитопами CLDN18.2, присутствующими на поверхности живых клеток. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с внеклеточным доменом CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с первой внеклеточной петлей CLDN18.2.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является антителом, выбранным из группы, состоящей из (i) антитела, продуцируемого и/или получаемого из клона, депонированного под учетным номером DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 или DSM ACC2810, (ii) антитела, которое является химеризированной или гуманизированной формой антитела (i), (iii) антитела, имеющего специфичность антитела (i), и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающую часть или антигенсвязывающий сайт, в частности вариабельный участок антитела (i) и предпочтительно со специфичностью антитела (i). В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или фрагмент его или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или его фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмент, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35 или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмент, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20 или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. Антитело, которое конкурирует со вторым антителом за связывание с мишенью, предпочтительно является антагонистом к указанному второму антителу.

В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства является проницаемой для клеточной мембраны. В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство. В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства представляет собой майтанзиноид или ауристатин. В одном воплощении майтанзиноид выбран из группы, состоящей из DM1 и DM4. В одном воплощении ауристатин выбирают из группы, состоящей из монометилауристатина E (MMAE) и монометилауристатина F (MMAF).

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, ковалентно присоединено к фрагменту лекарственного средства-токсина посредством линкера. В одном воплощении линкер является расщепляемым линкером. В одном воплощении линкер расщепляется во внутриклеточных условиях. В одном воплощении линкер гидролизуется при рН менее 5,5. В одном воплощении линкер расщепляется внутриклеточной протеазой. В одном воплощении линкер является линкером, расщепляемым катепсином. В одном воплощении линкер содержит дипептид. В одном воплощении дипептид является val-cit или phe-lys. В одном воплощении антитело присоединено к линкеру через цистеиновый тиол антитела. В одном воплощении антитело присоединено к линкеру через аминогруппы, в частности аминогруппы лизиновых остатков антитела.

В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство вводят в количестве, эффективном для лечения или профилактики злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2. В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство вводят в дозе от 3 до 30 мг/кг массы тела, например от 4 до 25, от 5 до 20, от 10 до 18 или от 15 до 16 мг/кг массы тела. В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство вводят в дозе от 8 до 150, от 9 до 100 или от 9 до 90 мг/м² поверхности тела пациента-человека, например от 12 до 75, от 15 до 60, 30 до 54, или от 45 до 48 мг/м² поверхности тела пациента-человека. В одном воплощении вводят одну дозу конъюгата антитело-лекарственное средство или две или более доз конъюгата антитело-лекарственное средство. В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство вводят путем внутривенной инъекции.

В одном воплощении способ по изобретению дополнительно включает осуществление хирургии, химиотерапии и/или лучевой терапии.

В одном воплощении экспрессия CLDN18.2 происходит на клеточной поверхности клеток злокачественных опухолей. В одном воплощении рак представляет собой аденокарциному, в частности прогрессирующую аденокарциному. В одном воплощении злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак яичника, рак толстой кишки, рак печени, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и метастазы, в частности метастазы рака желудка, такие как опухоли Крюкенберга, перитонеальный метастаз и метастазы в лимфатические узлы. В одном воплощении злокачественное новообразование выбирают из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, в частности нижнего пищевода, рака пищеводно-желудочного перехода и гастроэзофагеального рака. В одном воплощении пациент является отрицательным по HER2/neu пациентом или пациентом с положительным статусом HER2/neu, но не подходящим для терапии трастузумабом.

В одном воплощении CLDN18.2 имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, ковалентно присоединенное, по меньшей мере, к одной части токсинного лекарственного средства.

В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство интернализуется в клетки после связывания с CLDN18.2, экспрессируемым клетками.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, специфически связывается с CLDN18.2. В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство специфически связывается с CLDN18.2.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, представляет собой моноклональное, химерное или гуманизированное антитело или фрагмент антитела. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, представляет собой моноклональное антитело.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с нативными эпитопами CLDN18.2, присутствующими на поверхности живых клеток. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с внеклеточным доменом CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с первой внеклеточной петлей CLDN18.2.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является антителом, выбранным из группы, состоящей из (i) антитела, продуцируемого и/или получаемого из клона, депонированного под учетным номером DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 или DSM ACC2810, (ii) антитела, которое является химеризированной или гуманизированной формой антитела (i), (iii) антитела, имеющего специфичность антитела (i), и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающую часть или антигенсвязывающий сайт, в частности вариабельный участок антитела (i) и предпочтительно со специфичностью антитела (i). В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35 или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, распознает тот же или по существу тот же эпитоп, что и CLDN18.2-связывающее антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20 или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2. Антитело, которое конкурирует со вторым антителом за связывание с мишенью, предпочтительно является антагонистом к указанному второму антителу.

В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства является проникающей через клеточную мембрану. В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство. В одном воплощении токсинная часть лекарственного средства представляет собой майтанзиноид или ауристатин. В одном воплощении майтанзиноид выбран из группы, состоящей из DM1 и DM4. В одном воплощении ауристатин выбирают из группы, состоящей из монометилауристатина E (MMAE) и монометилауристатина F (MMAF).

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, ковалентно присоединено к фрагменту лекарственного средства-токсина посредством линкера. В одном воплощении линкер является расщепляемым линкером. В одном воплощении линкер расщепляется при внутриклеточных условиях. В одном воплощении линкер гидролизуется при рН менее 5,5. В одном воплощении линкер расщепляется внутриклеточной протеазой. В одном воплощении линкер является расщепляемым катепсином линкером. В одном воплощении линкер содержит дипептид. В одном воплощении дипептид является val-cit или phe-lys. В одном воплощении антитело присоединено к линкеру через цистеиновый тиол антитела. В одном воплощении антитело присоединено к линкеру через аминогруппы, в частности аминогруппы лизиновых остатков антитела.

В одном воплощении CLDN18.2 имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство по изобретению, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к медицинскому препарату, содержащему конъюгат антитело-лекарственное средство по изобретению. В одном воплощении медицинский препарат присутствует в виде набора, содержащего контейнер, включающий конъюгат антитело-лекарственное средство. В одном воплощении медицинский препарат дополнительно включает печатные инструкции для использования препарата в способе лечения или профилактики онкологических заболеваний, в частности злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2.

В следующем аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат антитело-лекарственное средство по изобретению, фармацевтическую композицию по изобретению или медицинский препарат по изобретению для использования в терапии, в частности для использования в способе лечения или профилактики онкологического заболевания, в частности, экспрессирующее CLDN18.2 злокачественное новообразование. В одном воплощении способ лечения или профилактики онкологического заболевания представляет собой способ лечения или профилактики по изобретению злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Конъюгация лекарственного средства и антитела.

Фигура 2. Снижение жизнеспособности после совместной инкубации клеток HEK293~CLDN18.2 с химерными mAb против CLDN18.2 и Fab-ZAP (косвенная оценка интернализации)

Клетки HEK293~CLDN18.2 инкубировали в течение 72 ч с анти-CLDN18.2 специфическими антителами и конъюгированным с сапорином антителом против IgG Fab человека (Fab-ZAP человека). Эндоцитоз IMAB362, chim mAB294, chim mAB308 и chim mAB359 определяли опосредованно, измеряя жизнеспособность клеток. Точки данных (n=3 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 3. Снижение жизнеспособности после совместной инкубации клеток HEK293~CLDN18.2 с мышиными антителами против CLDN18.2 и Fab-ZAP (косвенная оценка интернализации)

Клетки HEK293~CLDN18.2 инкубировали в течение 72 ч с реакционноспособными мышиными антителами против CLDN18.2 и конъюгированным с сапорином антителом против IgG Fab мыши (Fab-ZAP мыши). Эндоцитоз различных анти-CLDN18.2 реактивных мышиных антител опосредованно определяли путем измерения жизнеспособности клеток.

Фигура 4. Относительные аффинности связывания IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE с CLDN18.2-положительными клетками

Относительные аффинности связывания конъюгатов IMAB362-токсина по сравнению с неконъюгированным IMAB362 определяли на клетках (A) NUGC-4 10cF7-5 sort3a и (B) DAN-G 1C5F2, эндогенно экспрессирующих CLDN18.2, (C) NCI-N87~CLDN18.2 и (D) BxPC-3~CLDN18.2, эктопически сверхэкспрессирующих CLDN18.2, с помощью проточной цитометрии в концентрациях антител до 20 мкг/мл. Точки данных (n=2 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 5. CLDN18.2-опосредованное связывание IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE

CLDN18.2-опосредованное связывание конъюгатов IMAB362-токсин анализировали на клетках (A) NCI-N87~CLDN18.2, эктопически сверхэкспрессирующих CLDN18.2, и на (B) соответствующей CLDN18.2-отрицательной опухолевой клеточной линии человека, с помощью проточной цитометрии с концентрациями антитела вплоть до 20 мкг/мл. Точки данных (n=2 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 6. Специфичность связывания IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE

Специфичность связывания конъюгатов IMAB362-токсина определяли на клетках (A) HEK293~CLDN18.2, (B) HEK293~CLDN18.1 или (C) HEK293~mock в качестве отрицательного контроля. Связывание анализировали с помощью проточной цитометрии с концентрацией антител вплоть до 20 мкг/мл. Точки данных (n=2 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 7. Влияние IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE на жизнеспособность CLDN18.2-экспрессирующих клеточных линий карциномы человека

Кривые доза-ответа IMAB362-DM4- и IMAB362-vcMMAE-опосредованного снижения жизнеспособности клеток (A) NUGC-4 10cF7-5 sort 3a, (B) NCI-N87~CLDN18.2 и (C) BxPC-3~CLDN18.2. IMAB362 использовался как отрицательный контроль (никакого эффекта в анализах жизнеспособности в этих условиях). Клетки инкубировали в течение 72 ч в присутствии антител в концентрациях вплоть до 16875 нг/мл. Снижение жизнеспособности клеток измеряли с использованием анализа жизнеспособности на основе XTT. Точки данных (n=3 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 8. Зависимость CLDN18.2 от IMAB362-vcMMAE-опосредованного снижения жизнеспособности опухолевых клеток

Целевую зависимость IMAB362-vcMMAE-опосредованного снижения жизнеспособности клеток определяли на клетках NCI-N87 (отрицательные по CLDN18.2) и NCI-N87-CLDN18.2, эктопически экспрессирующих мишень. Клетки инкубировали в течение 72 ч с IMAB362-vcMMAE или неконъюгированным IMAB362 при концентрациях вплоть до 16875 нг/мл. Известно, что IMAB362 не обладает активностью в экспериментальных условиях, используемых в данном документе. Снижение жизнеспособности клеток измеряли с использованием анализа жизнеспособности на основе XTT. Точки данных (n=3 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 9. Специфичность опосредованного IMAB362-vcMMAE снижения жизнеспособности клеток

Целевая специфичность IMAB362-vcMMAE-опосредованного снижения жизнеспособности клеток тестировали на стабильно трансфецированных клетках HEK293~CLDN18.2, HEK293~CLDN18.1 и HEK293~mock. Клетки инкубировали в течение 72 ч в присутствии концентраций IMAB362-vcMMAEat вплоть до 16875 нг/мл. Снижение жизнеспособности клеток измеряли с использованием анализа жизнеспособности на основе XTT. Точки данных (n=3 повтора) обозначаются как среднее±SD.

Фигура 10. Активности «эффекта свидетеля» у IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE

IMBA362-DM4- и IMAB362-vcMMAE-опосредованную индукцию «эффектов свидетеля» определяли в экспериментах по совместной культуре с использованием клеток PA-1 (Luc) (CLX18.2-положительные/люцифераза) и NUGC-4 10cE8 (CLDN18.2-положительные/люцифераза-отрицательные). В качестве фонового контроля клетки PA-1 (Luc) инкубировали с IMAB362-DM4- или IMAB362-vcMMAE. Для обработки клетки культивировали в течение 4 дней в присутствии 200 нг/мл IMAB362-DM4, 800 нг/мл IMAB362-vcMMAE или 800 нг/мл IMAB362. Измеряли активность люциферазы.

Фигура 11. Ингибирование роста прогрессирующих опухолей ксенотрансплантата BxPC-3~CLDN18.2 с помощью IMAB362-DM4

CLDN18.2-положительные клетки BxPC-3~CLDN18.2 прививали подкожно в бок самок бестимусных мышей. На 14-й день мышей организовали в 4 группы и вводили им внутривенно одной дозой носитель, 7,5 мг/кг, 15 мг/кг IMAB362-DM4 или повторной дозой 15 мг/кг IMAB362-DM4 (14 и 21 день). Размер подкожных опухолей измеряли два раза в неделю (среднее значение+SEM). Размер группы n=5. SD: разовая доза, RD: повторная доза.

Фигура 12. Средняя масса тела мышей, обработанных IMAB362-DM4

Масса тела голых мышей, с опухолью BxPC-3~CLDN18.2, обработанных однократной дозой контроля над носителем, 7,5 мг/кг или 15 мг/кг или повторных доз 15 мг/кг IMAB362-DM4, соответственно, контролировали дважды в неделю. Масса тела 4 групп представлена как среднее. Размер группы n=5.

Фигура 13. Параметры клинической химии при однократной и повторной дозе IMAB362-DM4 у голых мышей с ксенотрансплантатом

Клиническая химия самок голых мышей, несущих BxPC-3~CLDN18.2-опухоль, получавших внутривенно однократную дозу носителя, 7,5 мг/кг, 15 мг/кг IMAB362-DM4 или повторную дозу 15 мг/кг IMAB362-DM4, анализировали на 49 день после приживления. A) Аланинтрансаминаза (GPT), B) аспартаттрансаминаза (GOT), C) глутаматдегидрогеназа, D) щелочная фосфатаза, E) α-амилаза, F) холинэстераза, G) креатинкиназа (CK), H) лактатдегидрогеназа (LDH), I) липаза, J) мочевина, K) глюкоза, L) общий белок и M) альбумин.

Фигура 14. Гистологический анализ срезов желудка от IMAB362-DM4 и мышей, обработанных носителем

Мыши, несущие ксенотрансплантатные опухоли BxPC-3~CLDN18.2, получали IMAB362-DM4. На 49-й день после трансплантации опухоли мышей умерщвляли, а отдельные органы расчленяли и фиксировали в формалине. Срезы этих FFPE-тканей окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали микроскопически на предмет морфологических изменений. (A, C) Ткани желудка репрезентативной мыши из группы обработки с наибольшей экспозицией IMAB362-DM4 (15 мг/кг IMAB362-DM4 на 14 день и 21 день после трансплантации). (B, D) Желудочная ткань мыши контрольной группы, обработанной только носителем. Увеличение: см. шкалу.

Фигура 15. Ингибирование роста прогрессирующих ксенотрансплантированных опухолей BxPC-3~CLDN18.2 с помощью IMAB362-vcMMAE

CLDN18.2-положительные BxPC-3~CLDN18.2 клетки трансплантировали подкожно в бок самок голых мышей. На 14-й день мышей организовали в 4 группы и вводили внутривенно одной дозой носитель, 8 мг/кг, 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE или повторную дозу 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE (14 и 21 день). Размер подкожных опухолей измеряли два раза в неделю (среднее значение+SEM). Размер группы n=5.

Фигура 16. Средняя масса тела мышей, обработанных IMAB362-vcMMAE

Масса тела несущих опухоли самок голых мышей, получавших однократную дозу группы контроля, 8 мг/кг или 16 мг/кг, или повторную дозу 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE контролировали два раза в неделю. Масса тела 4 групп представлена как среднее. Размер группы n=5.

Фигура 17. Параметры клинической химии при однократном и повторном назначении дозы IMAB362-vcMMAE у мышей с ксенотрансплантатом

Клиническую химию самок голых мышей, несущих BxPC-3~CLDN18.2-опухоли, внутривенно обработанных одной дозой носителя, 8 мг/кг, 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE или повторной дозой 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE, анализировали на 37-й день после трансплантации. A) аланинтрансаминаза (GPT), B) аспартаттрансаминаза (GOT), C) глутаматдегидрогеназа, D) щелочная фосфатаза, E) α-амилаза, F) холинэстераза, G) креатинкиназа (CK), H) лактатдегидрогеназа (LDH), I) липаза, J) мочевина, K) глюкоза, L) общий белок и M) альбумин.

Фигура 18. Дозозависимая противоопухолевая эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в модели ксенотрансплантированной прогрессирующей опухоли NCI-N87~CLDN18.2 человека

Клетки NCI-N87~CLDN18.2, эктопически экспрессирующие CLDN18.2 человека, подкожно вводили в бок самок голых мышей. На 10-й день после трансплантации мыши были организованы в группы и им вводили внутривенно одну дозу носителя, 3,8, 7,6 или 15,2 мг/кг IMAB362-DM4 или 4, 8 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE на 13-й день. Другая контрольная группа получала повторные дозы~8 мг/кг IMAB362 два раза в неделю, чередуя инъекции в.в. и в.б. Объемы опухолей измеряли два раза в неделю. Животных умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1400 мм³ или когда опухоли изъязвлялись. Статистический анализ роста опухоли проводили с использованием тестов Kruskal-Wallis и post-hoc Dunn. Выживание анализировали с использованием теста Mantel Cox, сравнивающего контрольную группу носителя с IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE, соответственно. (A-H) Кривые роста опухоли, (I, K) средний рост опухолей (±SEM), и (J, L) графики выживаемости мышей, обработанных с помощью контроля-носителя, IMAB362 или IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Размер группы: n=11; *: p<0,05; *** р<0,001. Стрелка указывает начало обработки.

Фигура 19. Противоопухолевая эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в ранней модели ксенотрансплантата желудочной опухоли человека NUGC-4 10cF7-5 sort3a

Клетки NUGC-4 10cF7-5 sort3a, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2, подкожно трансплантировали в бок самок голых мышей. На 3-й день мыши получали носитель, 15,2 мг/кг IMAB362-DM4 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE с помощью одной в.в. инъекции. Объемы опухолей измеряли два раза в неделю. Животных умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1400 мм³ или когда опухоли изъязвлялись или после заданного периода наблюдения в течение 120 дней. Статистический анализ роста опухоли проводили с использованием тестов Kruskal-Wallis и post-hoc Dunn. Выживание анализировали с использованием теста Mantel Cox. (A-C) Кривые роста опухоли, (D) средний рост опухоли (±SEM) и (E, F) графики выживаемости мышей, обработанных с помощью контроля-носителя, IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Размер группы: n=10; ***: p<0,001; ****: p<0,0001. Стрелка указывает момент начала обработки.

Фигура 20. Дозозависимая противоопухолевая эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в усовершенствованной модели опухоли ксенотрансплантата поджелудочной железы человека BxPC-3~CLDN18.2

Клетки BxPC-3~CLDN18.2, эктопически экспрессирующие человеческий CLDN18.2, подкожно трансплантировали в бок самок голых мышей. На 13-й день мышей организовывали в группы и вводили внутривенно одной дозой носителя, 3,8, 7,6 или 15,2 мг/кг IMAB362-DM4 или 4, 8 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE на 14-й день. Мыши из контрольной группы антител получали ~8 мг/кг неконъюгированного IMAB362 два раза в неделю путем чередования в.в. и в.б. инъекций. Размер опухоли измеряли два раза в неделю. Животных умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1400 мм³ или когда опухоли были изъязвлены. Статистический анализ роста опухоли проводили с использованием тестов Kruskal-Wallis и post-hoc Dunn. Выживание анализировали с использованием теста Mantel Cox, сравнивающего контрольную группу носителя с IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE, соответственно. (AH) Кривые роста опухоли, (I, K) средний рост опухоли (±SEM) и (J, L) графики выживаемости мышей, обработанных с помощью контроля-носителя, IMAB362, IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Размер группы: n=11; р<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001; ****: p<0,0001. Стрелка указывает момент начала обработки.

Фигура 21. Противоопухолевая эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в ранней модели опухоли ксенотрансплантата поджелудочной железы человека DAN-G 1C5F2.

Клетки DAN-G 1C5F2, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2, трансплантировали подкожно в бок самок голых мышей. На 3-й день после трансплантации мышей обрабатывали одной внутривенной инъекцией контроля-носителя, 15,2 мг/кг IMAB362-DM4 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE. Объемы опухолей измеряли два раза в неделю. Животных умерщвляли, когда мыши теряли более 10% массы тела из-за раковой кахексии, когда опухоли изъязвлялись или после заданного периода наблюдения 120 дней. Статистический анализ роста опухоли проводили с использованием тестов Kruskal-Wallis и post-hoc Dunn. Выживание анализировали с использованием теста Mantel Cox. (A-C). Кривые роста опухоли (D) означают графики роста опухолей (±SEM) и (E, F) выживания мышей, обработанных с помощью контроля-носителя, IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Размер группы: n=10; **: p<0,01; ***: p<0,001. Стрелка указывает момент начала обработки.

Фигура 22. Гистологический анализ срезов желудка из мышей, обработанных IMAB362-vcMMAE и носителем

Мыши, несущие опухоли ксенотрансплантата BxPC-3~CLDN18.2, получали IMAB362-vcMMAE. На 37-й день после трансплантации мышей умерщвляли, а отдельные органы рассекали и фиксировали формалином. Срезы этих тканей FFPE окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали микроскопически на предмет морфологических изменений. (A, C) Желудочная ткань репрезентативной мыши из группы обработки с наибольшей экспозицией IMAB362-vcMMAE (16 мг/кг IMAB362-vcMMAE на 14-й день и 21-й день после трансплантации). (B, D) Желудочная ткань мышей контрольной группы, обработанных только носителем. Увеличение: см. шкалу.

Фигура 23. Индукция апоптоза с помощью IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE

IMAB362-DM4- и IMAB362-vcMMAE-опосредованную индукцию апоптоза определяли путем измерения активности каспазы 3/7 и окрашивания аннексином V с использованием положительных по мишени клеток NUGC-4 10cE8. A) Активность каспазы 3/7 анализировали после того, как клетки инкубировали в течение 3 дней в присутствии 2,5 мкг/мл антител IMAB362 (n=3 повтора, среднее±SD). B) Проточный цитометрический анализ клеток, окрашенных аннексином V и йодидом пропидия (PI), проводили через 4 дня после обработки антителами IMAB362 объемом 2,5 мкг/мл (n=3 повтора). Необработанные клетки служили контролем.

Фигура 24. Противоопухолевая эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в модели ксенотрансплантата прогрессирующей опухоли желудка человека NUGC-4 10cF7-5

Клетки NUGC-4 10cF7-5 sort3a, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2, подкожно трансплантировал в бок самок голых мышей. На 10-й день мышам вводили носитель, 15,2 мг/кг IMAB362-DM4 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE с помощью одной в.в. инъекции. Объемы опухолей измеряли два раза в неделю. Животных умерщвляли, когда объем опухоли превышал 1400 мм³, когда опухоли изъязвлялись или после заданного периода наблюдения 120 дней. Статистический анализ роста опухоли проводили с использованием тестов Kruskal-Wallis и post-hoc Dunn. Выживание анализировали с использованием теста Mantel Cox. (A-C) Кривые роста опухоли, (D) означает графики оценки роста опухоли (±SEM) и (E, F) выживаемости мышей, обработанных с помощью контроля-носителя, IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Размер группы: n=10; *: p<0,05; ***: p<0,001. Стрелка указывает момент начала обработки.

Фигура 25. IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE-опосредуемая ADCC на CLDN18.2- экспрессирующих клетках злокачественных опухолей человека

A) Кривые доза-ответ IMAB362-DM4-(сплошные черные круги), IMAB362-vcMMAE-(сплошные черные треугольники) и IMAB362-(открытые черные квадраты), опосредуемой ADCC на эндогенно CLDN18.2-экспрессирующих клетках карциномы желудка NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10. Эксперименты проводили с использованием отношения эффектора к мишени~40: 1. Точки данных (n=4 повтора) обозначаются как среднее±SD. B) Проточный цитометрический анализ экспрессии CLDN18.2 на клетках NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151 #10. Гистограмма, залитая серым: анти-CLDN18.2 (IMAB362, 50 мкг/мл). Черная пунктирная линия: изотипический контроль.

Фигура 26. IMAB362-DM4- и IMAB362-vcMMAE-опосредованная CDC на CLDN18.2-экспрессирующих клетках злокачественных опухолей человека

A) Кривые доза-ответ IMAB362-DM4 (сплошные черные круги), IMAB362-vcMMAE (сплошные черные треугольники) и IMAB362 (открытые черные квадраты), опосредуемой CDC на эндогенно CLDN18.2-экспрессирующих KATO-III FGF BP # 12 adM p3151 # 25 (слева) и NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 клетках карциномы желудка человека (справа). Люциферазы, экспрессирующие клетки-мишени, инкубировали в течение 90 мин. с 20% человеческой сывороткой (пул здоровых доноров) и соответствующими антителами в указанных концентрациях. Точки данных (n=3 повтора) обозначаются как среднее±SD. B) Проточный цитометрический анализ экспрессии CLDN18.2 на клетках KATO-III FGF BP#12 adM p3151#25 (слева) и NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 (справа). Гистограмма, залитая серым: анти-CLDN18.2 (IMAB362, 50 мкг/мл). Черная пунктирная линия: изотипический контроль.

Подробное описание изобретения

Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными методологиями, протоколами и реагентами, описанными в данном документе, поскольку они могут различаться. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для целей описания только конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники.

Ниже будут описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены в конкретных воплощениях, однако следует понимать, что они могут быть объединены любым способом и любым числом для создания дополнительных воплощений. Различные описанные примеры и предпочтительные воплощения не должны толковаться как ограничивающие настоящее изобретение только явно описанными воплощениями. Это описание следует понимать как поддерживающее и охватывающее воплощения, которые объединяют явно описанные воплощения с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в этом приложении должны рассматриваться раскрытыми описанием настоящей заявки, если контекст не указывает иное.

Предпочтительно термины, используемые в данном документе, определяются в соответствии с описанием «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», HGW Leuenberger, B. Nagel и H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995).

Практическое осуществление настоящего изобретения будет использовать, если не указано иное, традиционные способы химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и рекомбинантных ДНК, которые объясняются в литературе в данной области (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

Всюду по этому описанию и последующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать», и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумеваться как включение заявленного элемента, целого или стадии или группы членов, целых или стадий, но не исключение любого члена, целого или стадии или группы членов, целых или стадий, хотя в некоторых воплощениях может быть исключен такой другой элемент, целое или стадия или группа членов, целые или стадии, т.е. объект изобретения заключается во включении указанного члена, целого или стадии или группы членов, целых или стадий. Термины «a» и «an» и «the» и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или нет явного противоречия контексту. Изложение диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа обращения индивидуально к каждому отдельному значению, входящему в диапазон. Если не указано иное, каждое индивидуальное значение включается в описание, как если бы оно было индивидуально описано в данном документе. Все описанные в данном документе способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или иное явно противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или примерной формулировки (например, «такой как»), приведенных в данном документе, предназначено просто для лучшей иллюстрации изобретения и не представляет собой ограничение объема изобретения, заявленного иным образом. Ни одна формулировка в описании не должна быть истолкована как указание на любой незаявленный элемент как существенный при практическом осуществлении изобретения.

В тексте этого описания приводятся несколько документов. Каждый из документов, процитированных в данном документе (включая все патенты, заявки на патент, научные публикации, спецификации производителей, инструкции и т.д.), независимо от того, находятся они выше или ниже, полностью включены в настоящее описание ссылкой. Никакую часть настоящего документа не следует считать признанием того, что изобретение не может претендовать на более раннюю дату настоящего описания в силу предшествующего изобретения.

Клаудины - это семейство белков, которые являются наиболее важными компонентами плотных контактов, в которых они устанавливают парацеллюлярный барьер, контролирующий поток молекул в межклеточном пространстве между клетками эпителия. Клаудины - трансмембранные белки, пересекающие мембрану 4 раза, с N- и C-концом, которые оба локализованы в цитоплазме. Первая внеклеточная петля или домен состоит в среднем из 53 аминокислот, а вторая внеклеточная петля или домен состоит из около 24 аминокислот. Белки клеточной поверхности семейства клаудинов, такие как CLDN18.2, экспрессируются в опухолях различного происхождения и особенно подходят в качестве целевых структур в случае антитело-опосредуемой иммунотерапии злокачественных новообразований из-за их избирательной экспрессии (отсутствие экспрессии в релевантной к токсичности нормальной ткани) и локализации в плазматической мембране.

Используемый в данном документе термин «CLDN» означает клаудин и включает CLDN18.2. Предпочтительно клаудин является человеческим клаудином.

Термин «CLDN18» относится к клаудину 18 и включает любые варианты, включая вариант сплайсинга 1 клаудина 18 (клаудин 18.1 (CLDN18.1)) и вариант сплайсинга 2 клаудина 18 (клаудин18.2 (CLDN18.2)).

Термин «CLDN18.1» предпочтительно относится к человеческому CLDN18.1 и, в частности, к белку, содержащему, предпочтительно состоящему из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей или варианта указанной аминокислотной последовательности. Первая внеклеточная петля или домен CLDN18.2 предпочтительно содержит аминокислоты с 27 по 81, более предпочтительно аминокислоты 29-78 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Вторая внеклеточная петля или домен CLDN18.2 предпочтительно содержит аминокислоты 140-180 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Указанные первая и вторая внеклеточные петли или домены предпочтительно образуют внеклеточную часть или домен CLDN18.2.

CLDN18.2 избирательно экспрессируется в нормальных тканях в дифференцированных эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка. CLDN18.2 экспрессируется в злокачественных новообразованиях различного происхождения, таких как карцинома поджелудочной железы, карцинома пищевода, карцинома желудка, бронхиальная карцинома, карцинома молочной железы и ЛОР-опухоли. CLDN18.2 является ценной мишенью для профилактики и/или лечения первичных опухолей, таких как рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак яичников, рак толстой кишки, рак печени, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и метастазы, в частности метастазы рака желудка, такие как опухоли Крюкенберга, перитонеальные метастазы и метастазы в лимфатические узлы.

Термин «CLDN18.1» предпочтительно относится к человеческому CLDN18.1 и, в частности, к белку, содержащему, предпочтительно состоящему из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 2 перечня последовательностей или варианта указанной аминокислотной последовательности.

Термин «вариант» согласно изобретению относится, в частности, к мутантам, вариантам сплайсинга, конформациям, изоформам, аллельным вариантам, видам и гомологам видов, в частности к тем, которые встречаются в природе. Аллельный вариант относится к изменению нормальной последовательности гена, значение которого часто неясно. Секвенирование полного гена часто идентифицирует многочисленные аллельные варианты для данного гена. Гомолог вида представляет собой нуклеиновую кислоту или аминокислотную последовательность вида другого происхождения, полученным из данной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Термин «вариант» должен охватывать любые посттрансляционно модифицированные варианты и конформационные варианты.

В соответствии с изобретением термин «CLDN18.2-экспрессирующее злокачественное новообразование» или «CLDN18.2-положительноей злокачественное новообразование» означает злокачественное новообразование, включающее клетки злокачественных опухолей, экспрессирующие CLDN18.2, предпочтительно на поверхности указанных клеток злокачественных опухолей.

«Клеточная поверхность» используется в соответствии с ее нормальным значением в данной области техники и, таким образом, включает внешнюю поверхность клетки, которая доступна для связывания белками и другими молекулами.

CLDN18.2 экспрессируется на поверхности клеток, если он расположен на поверхности указанных клеток и доступен для связывания с CLDN18.2-специфическими антителами, добавленными к клеткам.

Термин «внеклеточная часть» или «внеклеточный домен» в контексте настоящего изобретения относится к части молекулы, такой как белок, которая обращена к внеклеточному пространству клетки и предпочтительно доступна извне указанной клетки, например, антигенсвязывающим молекулам, таким как антитела, расположенные вне клетки. Предпочтительно, термин относится к одной или нескольким внеклеточным петлям или доменам или их фрагменту.

Согласно изобретению CLDN18.2 существенно не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии ниже по сравнению с экспрессией в клетках желудка или ткани желудка. Предпочтительно уровень экспрессии составляет менее 10%, предпочтительно менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% или 0,05% от экспрессии в клетках желудка или в тканях желудка или даже ниже. Предпочтительно, CLDN18.2 существенно не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии превышает уровень экспрессии в незлокачественной ткани, отличной от желудка, не более чем в 2 раза, предпочтительно в 1,5 раза, и предпочтительно не превышает уровень экспрессии в указанной незлокачественной ткани. Предпочтительно CLDN18.2 по существу не экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии ниже предела обнаружения и/или если уровень экспрессии слишком мал, чтобы позволить связывание CLDN18.2-специфическими антителами, добавленными к клеткам.

Согласно изобретению CLDN18.2 экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии превышает уровень экспрессии в незлокачественной ткани, отличной от желудка, предпочтительно более чем в 2 раза, предпочтительно в 10 раз, в 100 раз, 1000 или 10000 раз. Предпочтительно CLDN18.2 экспрессируется в клетке, если уровень экспрессии выше предела обнаружения и/или если уровень экспрессии достаточно высок, чтобы позволить связывание с CLDN18.2-специфическими антителами, добавленными к клеткам. Предпочтительно CLDN18.2, экспрессируемый в клетке, экспрессируется или экспонируется на поверхности указанной клетки.

Термин «заболевание» относится к аномальному состоянию, которое влияет на организм человека. Заболевание часто истолковывается как медицинское состояние, связанное со специфическими симптомами и симптомами. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими из внешнего источника, такими как инфекционное заболевание, или может быть вызвано внутренними дисфункциями, такими как аутоиммунные заболевания. У людей «заболевание» часто используется более широко, чтобы ссылаться на любое состояние, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть для отдельных страдающих или подобных проблем для тех, кто находится в контакте с человеком. В этом более широком смысле заболевание иногда включает травмы, инвалидности, расстройства, синдромы, инфекции, выделенные симптомы, девиантное поведение и атипичные вариации структуры и функции, тогда как в других контекстах и для других целей они могут рассматриваться как отличимые категории. Заболевания обычно затрагивают людей не только физически, но и эмоционально, поскольку приобретение и жизнь со многими заболеваниями могут изменить точку зрения на жизнь и личность индивидуума. Согласно изобретению термин «заболевание» включает злокачественное новообразование, в частности те формы злокачественных новообразований, которые описаны в данном документе. Любая ссылка в данном документе на злокачественное новообразование или конкретные формы злокачественных новообразований также включает метастазы злокачественных новообразований. В предпочтительном воплощении заболевание, подлежащее лечению в соответствии с настоящей заявкой, включает клетки, экспрессирующие CLDN18.2.

«Заболевание при участии клеток, экспрессирующих CLDN18.2» или «заболевание, связанное с клетками, экспрессирующими CLDN18.2» или аналогичные выражения, означают в соответствии с изобретением, что CLDN18.2 экспрессируется в клетках больной ткани или органа. В одном воплощении экспрессия CLDN18.2 в клетках больной ткани или органа увеличивается по сравнению с состоянием в соответствующей здоровой ткани или органе. Увеличение относится к увеличению, по меньшей мере, на 10%, в частности, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 100%, по меньшей мере, на 200%, по меньшей мере, на 500%, по меньшей мере, на 1000%, по меньшей мере, на 10000% или даже больше. В одном воплощении экспрессия обнаруживается только в пораженной ткани, тогда как экспрессия в соответствующей здоровой ткани репрессируется. Согласно изобретению заболевания, связанные с клетками, экспрессирующими CLDN18.2, включают онкологические заболевания. Кроме того, согласно изобретению, онкологические заболевания предпочтительно представляют собой те, в которых клетки злокачественных опухолей экспрессируют CLDN18.2.

Термины «онкологическое заболевание» или «злокачественное новообразование» относятся к физиологическому состоянию индивидуума или описывают его физиологическое состояние, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественных новообразований включают, без ограничения указанным, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. В частности, примеры таких злокачественных новообразований включают злокачественные новообразования кости, крови, легких, печени, поджелудочной железы, кожи, головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак матки, карциному половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почек, почечно-клеточную карциному, карциному почечной лоханки, неоплазии центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак, опухоли оси позвоночника, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин «злокачественное новообразование» в соответствии с изобретением также включает метастазы злокачественных новообразований. Предпочтительно «онкологическое заболевание» характеризуется клетками, экспрессирующими CLDN18.2, и клетка злокачественной опухоли экспрессирует CLDN18.2. Клетка, экспрессирующая CLDN18.2, предпочтительно представляет собой клетку злокачественной опухоли, предпочтительно злокачественного новообразования, описанного в данном документе.

Согласно изобретению термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к аномальному росту клеток (называемых неопластическими клетками, туморогенными клетками или опухолевыми клетками), предпочтительно образующими опухоль или лезию. Под «опухолевой клеткой» подразумевается аномальная клетка, которая растет быстрым, неконтролируемым клеточным распространением и продолжает расти после того, как стимулы, которые положили начало новому росту, прекратились. Опухоли проявляют частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью и обычно образуют отчетливую массу ткани, которая может быть либо доброкачественной, предзлокачественной, либо злокачественной. В соответствии с изобретением «онкологическое заболевание» предпочтительно представляет собой «опухолевое заболевание». Однако, как правило, термины «злокачественная опухоль» и «опухоль» используются в данном документе взаимозаменяемо.

В одном воплощении злокачественное новообразование в соответствии с изобретением включает клетки злокачественных опухолей, экспрессирующие CLDN18.2. В одном воплощении злокачественное новообразование является положительным по CLDN18.2. В одном воплощении экспрессия CLDN18.2 осуществляется на поверхности клеток. В одном воплощении, по меньшей мере, 50%, предпочтительно 60%, 70%, 80% или 90% клеток злокачественных опухолей являются CLDN18.2-положительными и/или, по меньшей мере, 40%, предпочтительно, по меньшей мере, 50% клеток злокачественных опухолей являются положительными по поверхностной экспрессии CLDN18.2. В одном воплощении, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% клеток злокачественных опухолей являются CLDN18.2-положительными. В одном воплощении, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 90% клеток злокачественных опухолей являются положительными по поверхностной экспрессии CLDN18.2.

В одном воплощении CLDN18.2-экспрессирующее злокачественное новообразование, включающее клетки злокачественных опухолей, экспрессирующих CLDN18.2 или положительное по CLDN18.2 злокачественное новообразование, выбрано из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака легкого, такого как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рака молочной железы, рака яичников, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастазы, опухоли Крюкенберга, перитонеальных метастаз и/или метастаз в лимфатических узлах. В одном воплощении злокачественное новообразование представляет собой аденокарциному, в частности прогрессирующую аденокарциному. Особенно предпочтительными онкологическими заболеваниями являются аденокарциномы желудка, пищевода, протоков поджелудочной железы, желчных протоков, легких и яичника. В одном воплощении злокачественное новообразование выбирают из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, в частности нижнего пищевода, рака пищеводно-желудочного перехода и гастроэзофагеального рака. В особенно предпочтительном воплощении злокачественное новообразование представляет собой гастроэзофагеальный рак, такой как метастатический, рефрактерный или рецидивирующий прогрессирующий гастроэзофагеальный рак.

Согласно изобретению, «карцинома» представляет собой злокачественную опухоль, полученную из эпителиальных клеток. Эта группа представляет собой наиболее распространенные виды злокачественных новообразований, включая распространенные формы рака молочной железы, предстательной железы, легких и толстой кишки.

«Аденокарцинома» - это злокачественное новообразование, которое возникает в железистой ткани. Эта ткань также является частью более широкой категории тканей, известной как эпителиальная ткань. Эпителиальная ткань включает кожу, железы и множество других тканей, которые выстилают полости и органы тела. Эпителий получается эмбриологически из эктодермы, эндодермы и мезодермы. Чтобы быть классифицированным как аденокарцинома, клетки не обязательно должны быть частью железы, если они обладают секреторными свойствами. Эта форма карциномы может встречаться у некоторых высших млекопитающих, включая людей. Хорошо дифференцированные аденокарциномы имеют тенденцию напоминать железистую ткань, из которой они происходят, тогда как плохо дифференцированные могут не напоминать. Путем окрашивания клеток биопсии патологоанатом определит, является ли опухоль аденокарциномой или другим типом злокачественной опухоли. Аденокарциномы могут возникать во многих тканях тела из-за вездесущей природы желез в организме. Хотя каждая железа не может выделять одно и то же вещество, при условии экзокринной функции в клетке, она считается железистой, поэтому ее злокачественная форма называется аденокарциномой. Злокачественные аденокарциномы вторгаются в другие ткани и часто метастазируют, если у них достаточно времени. Аденокарцинома яичников является наиболее распространенным типом карциномы яичников. Она включает серозную и муциновую аденокарциному, почечно-клеточную карциному и эндометриоидную аденокарциному.

Под «метастазами» подразумевается распространение клеток злокачественных опухолей с исходного места в другую часть организма. Образование метастазов является очень сложным процессом и зависит от отрыва злокачественных клеток от первичной опухоли, инвазии внеклеточного матрикса, проникновения через эндотелиальные базальные мембраны в полость тела и сосудов, а затем, после транспортировки кровью, инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли на целевом участке зависит от ангиогенеза. Опухолевые метастазы часто возникают даже после удаления первичной опухоли, потому что опухолевые клетки или компоненты могут оставаться и развивать метастатический потенциал. В одном воплощении термин «метастаз» в соответствии с изобретением относится к «отдаленному метастазированию», которое относится к метастазированию, удаленному от первичной опухоли и региональной системы лимфатических узлов. В одном воплощении термин «метастаз» в соответствии с изобретением относится к метастазированию в лимфатические узлы. Одна конкретная форма метастазов, которая поддается лечению с использованием терапии по изобретению, представляет собой метастаз, происходящий из рака желудка в качестве первичного сайта. В предпочтительных вариантах такой метастаз рака желудка представляет собой опухоли Крюкенберга, перитонеальный метастаз и/или метастаз в лимфатические узлы.

Опухоль Крюкенберга - необычная метастатическая опухоль яичника, составляющая от 1% до 2% всех опухолей яичников. Прогноз опухоли Крюкенберга по-прежнему очень плохой, и нет никакого пути лечения опухолей Крукенберга. Опухоль Крюкенберга представляет собой метастазирующую аденокарциному перстевидных клеток яичника. Желудок является первичным участком в большинстве случаев опухолей Крюкенберга (70%). Карциномы толстой кишки, аппендикса и молочной железы (преимущественно инвазивная дольковая карцинома) являются наиболее распространенными первичными участками. Сообщалось о редких случаях опухоли Крукенберга, происходящих от карцином желчного пузыря, желчных путей, поджелудочной железы, тонкой кишки, фатеровой ампулы, шейки матки и мочевого пузыря/урахуса. Интервал между диагнозом первичной карциномы и последующим открытием участия яичников обычно составляет 6 месяцев или менее, но сообщалось о более длительных периодах. Во многих случаях первичная опухоль очень мала и может избежать обнаружения. История предшествующей карциномы желудка или другого органа может быть получена только в 20-30% случаев.

У пациентов с опухолями Крюкенберга общая смертность значительно выше. Большинство пациентов умирают в течение 2 лет (средняя выживаемость, 14 месяцев). Несколько исследований показывают, что прогноз плохой, когда первичная опухоль идентифицирована после обнаружения метастаза в яичник, и прогноз ухудшается, если первичная опухоль остается скрытой.

В литературе четко не определена оптимальная стратегия лечения опухолей Крюкенберга. Следует ли проводить хирургическую резекцию, еще не решено. Химиотерапия или лучевая терапия не оказывают существенного влияния на прогноз пациентов с опухолями Крукенберга.

Термин «терапевтическое лечение», в частности в связи с лечением злокачественного новообразования, при использовании в данном документе, относится к любому лечению, которое направлено на улучшение состояния здоровья и/или продление (увеличение) продолжительности жизни пациента. Указанное лечение может устранить злокачественное новообразование, уменьшить размер или количество опухолей у пациента, остановить или замедлить развитие злокачественного новообразования у пациента, ингибировать или замедлять развитие нового злокачественного новообразования у пациента, уменьшать частоту или тяжесть симптомов у пациента и/или уменьшить рецидивы у пациента, который в настоящее время страдает от или у которого ранее было злокачественное новообразование. (Терапевтическое) воздействие на злокачественное новообразование может быть выбрано из группы, состоящей из хирургического вмешательства, химиотерапии, лучевой терапии и таргетной терапии.

Термин «хирургическое вмешательство», используемый в данном документе, включает удаление опухолей при операции. Это распространенное лечение злокачественных новообразований. Хирург может удалить опухоли, используя местное иссечение.

Используемый в данном документе термин «химиотерапия» относится к применению химиотерапевтических агентов или комбинаций химиотерапевтических агентов, предпочтительно для остановки роста клеток злокачественных опухолей, либо путем уничтожения клеток, либо путем прекращения их деления. Когда химиотерапию принимают внутрь или вводят в вену или мышцу, препараты поступают в кровоток и могут проникать в клетки злокачественных опухолей по всему организму (системная химиотерапия). Когда химиотерапия помещается непосредственно в спинномозговую жидкость, орган или полость тела, такую как брюшная полость, препараты в основном воздействуют на клетки злокачественных опухолей в этих областях (региональная химиотерапия).

Химиотерапевтические агенты согласно изобретению включают цитостатические соединения и цитотоксические соединения. Традиционные химиотерапевтические агенты действуют путем убийства клеток, которые быстро делятся, что является одним из основных свойств большинства клеток злокачественных опухолей. Это означает, что химиотерапия также вредит клеткам, которые быстро делятся при нормальных обстоятельствах, таких как клетки в костном мозге, пищеварительном тракте и волосяных фолликулах. Это приводит к наиболее частым побочным эффектам химиотерапии. В соответствии с изобретением термин «химиотерапия» предпочтительно не включает антитела, которые нацелены на белки, которые аномально экспрессируются в клетках злокачественных новообразований (опухолевые антигены, такие как CLDN18.2), и действуют путем рекрутирования иммунной системы пациента для уничтожения опухолевых клеток. Однако антитела, которые нацелены на белки, которые аномально экспрессируются в клетках злокачественных опухолей (опухолевые антигены, такие как CLDN18.2), и действуют через терапевтический фрагмент или агент, конъюгированный с антителом, можно рассматривать как форму химиотерапии. Однако в строгом смысле термин «химиотерапия» в соответствии с изобретением не включает таргетную терапию.

В соответствии с изобретением термин «таргетная терапия» относится к любой терапии, которая может быть использована для нацеливания преимущественно на пораженные клетки, такие как клетки злокачественных опухолей, и которая не нацеливается или нацеливается в меньшей степени на не затронутые заболеванием клетки. Нацеливание на больные клетки предпочтительно приводит к убийству и/или ухудшению пролиферации или жизнеспособности пораженных клеток. Такая терапия включает: i) антитела, фрагменты антител и белки, которые являются либо непокрытыми, либо конъюгированными с терапевтическим фрагментом, которые нацелены на определенные мишени клеточной поверхности на пораженных клетках, такие как опухолевые антигены, например CLDN18.2 (например, антитела или конъюгаты антител против CLDN18.2, как описано в данном документе) или ii) небольшие молекулы, которые нарушают пролиферацию или жизнеспособность пораженных клеток. В конкретном воплощении агент связывается с антигеном, который экспрессируется на большем уровне на больных, чем на нормальных стволовых клетках. В конкретном воплощении агент связывается специфически с опухолевым антигеном. Традиционная химиотерапия или лучевая терапия не считаются «таргетной терапией», несмотря на то, что их часто нацеливают на опухоли. Кроме того, термин «антительная терапия» согласно изобретению предпочтительно не включает терапию антителами, их фрагментами или производными, которые конъюгированы с терапевтической группой, но просто относится к терапии антителами, фрагментами или их производными, действующими посредством рекрутирования иммунной системы пациента для уничтожения опухолевых клеток.

В контексте настоящего изобретения такие термины, как «защита», «предотвращение» или «профилактика», относятся к предотвращению возникновения и/или распространения заболевания у объекта и, в частности, к минимизации вероятности того, что у объекта будет развиться заболевание или к задержке развития заболевания. Например, объект, подверженный риску злокачественного новообразования, будет кандидатом на терапию для профилактики злокачественной новообразования.

Под «находящимся под угрозой» подразумевается объект, который идентифицируется как имеющий более высокий, чем обычно, шанс развития заболевания, в частности злокачественного новообразования, по сравнению с общей популяцией. Кроме того, объект, который имел или у которого в настоящее время есть заболевание, в частности злокачественное новообразование, представляет собой объект, у которого повышен риск развития заболевания, поскольку у такого объекта может продолжить развиваться заболевание. Объекты, которые в настоящее время имеют или у которых было злокачественное новообразование, также имеют повышенный риск развития метастазов злокачественного новообразования.

Термины «индивидуум» и «объект» используются в данном документе взаимозаменяемо. Они относятся к людям, не являющихся человеком приматам или другим млекопитающим (например, мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, коровам, свиньям, овцам, лошадям или приматам), которые могут быть затронуты или восприимчивы к заболеванию или расстройству (например, злокачественному новообразованию), но могут иметь или не иметь заболевание или расстройство. Во многих воплощениях индивидуум является человеком. Если не указано иное, термины «индивидуум» и «объект» не обозначают определенный возраст и, следовательно, охватывают взрослых, пожилых людей, детей и новорожденных. В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения «индивидуум» или «объект» является «пациентом». Термин «пациент» означает в соответствии с изобретением объект для лечения, в частности больной объект.

Термин «антиген» относится к агенту, такому как белок или пептид, содержащему эпитоп, против которого направлен иммунный ответ и/или должен быть направлен. В предпочтительном воплощении антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, такой как CLDN18.2, то есть элемент клеток злокачественных опухолей, который может быть получен из цитоплазмы, поверхности клетки и клеточного ядра, в частности тех антигенов, которые продуцируются, предпочтительно в большом количестве, внутриклеточно или в качестве поверхностных антигенов на клетках злокачественных опухолей.

В контексте настоящего изобретения термин «ассоциированный с опухолью антиген» или «опухолевый антиген» предпочтительно относится к белкам, которые в нормальных условиях, специфически экспрессируются в ограниченном количестве тканей и/или органов или на конкретных стадиях развития и экспрессируются или аберрантно экспрессируется в одной или нескольких опухолевых или неопластических тканях. В контексте настоящего изобретения ассоциированный с опухолью антиген предпочтительно связывается с поверхностью клетки злокачественной опухоли и предпочтительно не экспрессируется или редко экспрессируется в нормальных тканях.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, т.е. к части молекулы, которая распознается иммунной системой, например, которая распознается антителом. Например, эпитопы представляют собой дискретные трехмерные участки на антигене, которые распознаются иммунной системой. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним, теряется в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп белка, такого как CLDN18.2, предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть указанного белка и предпочтительно составляет от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот в длину, например, эпитоп может быть предпочтительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот в длину.

Термин «антитело» включает гликопротеин, содержащий, по меньшей мере, две тяжелые (H) цепи и две легкие цепи (L), связанные между собой дисульфидными связями, и любую молекулу, содержащую антигенсвязывающую часть такого гликопротеина. Термин «антитело» включает моноклональные антитела, рекомбинантные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, молекулы, содержащие связывающие фрагменты или производные антител, включая, без ограничения указанным, одноцепочечные антитела, например фрагменты scFv и антигенсвязывающие антитела, такие как Fab и Fab', а также включает все рекомбинантные формы антител, например антитела, экспрессированные в прокариотах, негликозилированные антитела и любые антигенсвязывающие фрагменты и производные антител, как описано в данном документе. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Области VH и VL можно далее подразделить на области гипервариабельности, которые называются областями определения комплементарности (CDR), чередующимися с областями, которые более консервативны, и называются каркасными областями (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к препарату молекул антител с одним молекулярным составом. Моноклональное антитело проявляет единственную связывающую специфичность и аффинность. В одном воплощении моноклональные антитела получают гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от не являющегося человеком животного, например мыши, слитую с иммортализованной клеткой.

Используемый в данном документе термин «рекомбинантное антитело» включает все антитела, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такими как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов, или полученной из них гибридомы, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.

Используемый в данном документе термин «человеческое антитело» предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и постоянные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человека зародышевой линии. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина человека зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайтоспецифическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo).

Термин «гуманизированное антитело» относится к молекуле, имеющей сайт связывания антигена, который по существу получен из иммуноглобулина не являющихся человеком видов, в котором оставшаяся структура иммуноглобулина молекулы основана на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Участок связывания антигена может либо содержать полные вариабельные домены, слитые с константными доменами, либо только области, определяющие комплементарность (CDR), привитые в соответствующие каркасные области в вариабельных доменах. Сайты связывания антигена могут быть дикого типа или могут быть модифицированы одной или несколькими аминокислотными заменами, например, модифицированы так, чтобы более точно напоминать человеческие иммуноглобулины. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиного антитела). Другие формы имеют одну или несколько CDR, которые изменяются относительно исходного антитела.

Термин «химерное антитело» относится к тем антителам, где одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из одного вида или принадлежащих к определенному классу, тогда как оставшийся сегмент цепи гомологичен соответствующим последовательностям в другом виде или классе. Обычно вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей имитирует вариабельные области антител, полученных от одного вида млекопитающих, тогда как константные части гомологичны последовательностям антител, полученных из другого организма. Одним явным преимуществом таких химерных форм является то, что вариабельный участок может быть удобно получен из известных в настоящее время источников с использованием легко доступных В-клеток или гибридом из организмов-хозяев не являющихся человеком в комбинации с постоянными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. Хотя вариабельная область имеет преимущество легкости получения, и на специфичность не оказывает влияние источник, константная область их человека с меньшей вероятностью вызывает иммунный ответ у человека при введении антитела, чем постоянная область из источника, не являющегося человеком. Однако это определение не ограничивается этим конкретным примером.

Термины «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «связывающая часть») или «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или просто «связывающий фрагмент») или сходные термины относятся к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть выполнена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) Fab-фрагменты, моновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH; (ii) фрагменты F(ab')₂, двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагменты Fd, состоящие из доменов VH и CH; (iv) фрагменты Fv, состоящие из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагменты dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), которые состоят из домена VH; (vi) выделенные области определения комплементарности (CDR) и (vii) комбинации двух или более выделенных CDR, которые могут быть необязательно соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя две области фрагмента Fv, VL и VH кодируются отдельными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные способы, синтетическим линкером, который позволяет получить одиночную белковую цепь, в которой VL и VH-пары образуют одновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Другим примером являются слитые белки иммуноглобулина и связывающего домена, содержащие (i) полипептид связывающего домена, который слит с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с шарнирной областью, и (iii) константная область CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с константной областью CH2. Полипептид связывающего домена может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Слитые белки связывающего домена и иммуноглобулина далее описаны в US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Эти фрагменты антител получают обычными методами, известными специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу на предмет полезности таким же образом, как и интактные антитела.

Естественно встречающиеся антитела, как правило, моноспецифичны, то есть они связываются с одним антигеном. Настоящее изобретение включает антитела, связывающиеся с клеткой-мишенью (путем взаимодействия с опухолевым антигеном) и второй сущностью, такой как цитотоксическая клетка (например, путем взаимодействия с CD3-рецептором). Антитела по настоящему изобретению могут быть биспецифическими или мультиспецифическими, такими как триспецифические, тетраспецифические и так далее.

Термин «биспецифическая молекула» предназначен для включения агента, который имеет две различные специфичности связывания. Например, молекула может связываться с (а) клеточным поверхностным антигеном, таким как CLDN18.2, и (b) рецептором, таким как Fc-рецептор на поверхности эффекторной клетки. Термин «мультиспецифическая молекула» предназначен для включения агента, который имеет более чем две различные специфичности связывания. Например, молекула может связываться с или взаимодействовать с (а) антигеном клеточной поверхности, таким как CLDN18.2, (b) рецептором, таким как Fc-рецептор на поверхности эффекторной клетки, и (c) по меньшей мере, с одним другим компонентом. Соответственно, термин «антитело против опухолевого антигена» включает, без ограничения указанным, биспецифические, триспецифические, тетраспецифические и другие мультиспецифические молекулы, которые направлены на опухолевый антиген, и на другие мишени, такие как Fc-рецепторы на эффекторных клетках. Термин «биспецифические антитела» также включает диатела. Диатела являются двухвалентными, биспецифическими антителами, в которых VH и VL-домены экспрессируются в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для того, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами в одной и той же цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два сайта связывания антигена (см., например, Holliger, P., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).

Антитела могут быть получены из разных видов, включая, без ограничения указанным, мышей, крыс, кроликов, морских свинок и человека.

Используемый в данном документе термин «изотип» относится к классу антител (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.

Используемый в данном документе термин «переключение изотипа» относится к феномену, с помощью которого класс или изотип антитела изменяется от одного класса Ig к одному из других классов Ig.

Антитела, описанные в данном документе, включают IgA, такие как IgA1 или IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM и IgD антитела. В различных воплощениях изобретения антитело представляет собой антитело IgG1, более конкретно IgG1, каппа или IgG1, лямбда - изотипа (то есть IgG1, κ, λ), IgG2a антитела (например, IgG2a, κ, λ), антитело IgG2b (например, IgG2b, κ, λ), IgG3, антитело (например, IgG 3, κ, λ) или IgG4 - антитело (например, IgG4, κ, λ).

Используемый в данном документе термин «гетерологичное антитело» определяется по отношению к трансгенному организму, продуцирующему такое антитело. Этот термин относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую той, которая обнаружена в организме, не совпадающем с трансгенным организмом, и обычно получена из вида, отличного от трансгенного организма.

Используемый в данном документе термин «гетерогибридное антитело» относится к антителу, имеющему легкие и тяжелые цепи с происхождением из различных организмов. Например, антитело, имеющее тяжелую цепь человека, связанную с легкой цепью мыши, представляет собой гетерогибридное антитело.

Описанные в данном документе антитела предпочтительно выделяют. «Выделенное антитело», при использовании в данном документе, предназначено для обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, имеющих разные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с опухолевым антигеном, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены другого опухолевого антигена). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом опухолевого антигена человека, может, однако, иметь перекрестную реактивность по отношению к другим родственным антигенам, например, из других видов (например, гомологов опухолевых антигенов). Кроме того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ. В одном воплощении изобретения комбинация «выделенных» моноклональных антител относится к антителам, имеющим разную специфичность, и сочетающихся в четко определенной композиции или смеси.

В контексте настоящего изобретения антитело способно воздействовать путем рекрутирования иммунной системы пациента для уничтожения опухолевых клеток, если антитело, в частности, когда оно связано со своей мишенью, такой как опухолевой антиген на пораженной клетке, вызывает функции иммунного эффектора, как описано в данном документе. Предпочтительно указанные иммунные эффекторные функции направлены против клеток, таких как клетки злокачественных опухолей, несущих опухолевый антиген, такой как CLDN18.2, на своей поверхности.

Термин «функции иммунного эффектора» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, которые приводят, например, к ингибированию роста опухоли и/или ингибированию развития опухоли, включая ингибирование распространения опухолей и метастазов. Предпочтительно, функции иммунного эффектора приводят к уничтожению клеток злокачественных опухолей. Такие функции включают комплементарно-зависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), индукцию апоптоза в клетках, несущих опухолевый антиген, цитолиз клеток, несущих опухолевый антиген и/или ингибирование пролиферации клеток, несущих опухолевый антиген.

Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность

ADCC описывает способность эффекторных клеток, в частности лимфоцитов, которые предпочтительно требуют, чтобы клетка-мишень была отмечена антителом, убивать клетки.

ADCC предпочтительно возникает, когда антитела связываются с антигенами на опухолевых клетках, а Fc-домены антитела взаимодействуют с Fc-рецепторами (FcR) на поверхности иммунных эффекторных клеток. Было идентифицировано несколько семейств Fc-рецепторов, а специфические клеточные популяции характерно экспрессируют определенные Fc-рецепторы. ADCC можно рассматривать как механизм, позволяющий непосредственно индуцировать вариабельную степень немедленного разрушения опухоли, что приводит к представлению антигена и индукции опухоль-индуцируемых Т-клеточных реакций. Предпочтительно in vivo индукция ADCC приведет к опухоль-индуцируемым Т-клеточным ответам и ответам хозяйских антител.

Цитотоксичность, зависящая от комплемента

CDC - еще один способ уничтожения клеток, который может быть управляться антителами. IgM является наиболее эффективным изотипом активации комплемента. IgG1 и IgG3 также очень эффективны при управлении CDC через классический путь активации комплемента. Предпочтительно в этом каскаде образование комплексов антиген-антитело приводит к оголению множественных сайтов связывания C1q в непосредственной близости от CH2-доменов участвующих молекул антитела, таких как молекулы IgG (C1q является одним из трех подкомпонентов комплемента C1). Предпочтительно, эти оголенные сайты связывания C1q превращают ранее низкоаффинное взаимодействие C1q-IgG во взаимодействие с высокой авидностью, которая запускает каскад событий, включающих ряд других белков комплемента, и приводит к протеолитическому высвобождению хемотаксисических/активирующих агентов эффекторной клетки C3a и C5a. Предпочтительно каскад комплемента заканчивается образованием комплекса мембранной атаки, который создает поры в клеточной мембране, облегчающих свободный проход воды и растворенных веществ в клетку и из нее.

Неожиданно было обнаружено, что конъюгаты антитело-лекарственное средство, описанные в данном документе, способны опосредовать убийство клеток, в частности клеток, экспрессирующих CLDN18.2, таких как клетки злокачественных опухолей, путем индуцирования лизиса, опосредуемого зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC) и/или лизиса, опосредуемого антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). Таким образом, в одном воплощении конъюгаты антитело-лекарственное средство по изобретению опосредуют убийство клеток путем индуцирования лизиса, опосредуемого зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC) лизиса и/или лизиса, опосредуемого антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), предпочтительно путем индуцирования лизиса, опосредованного CDC, и лизиса, опосредованного ADCC.

При использовании в данном документе, антитело является «полученным из» конкретной последовательности зародышевой линии, если антитело получено из системы путем иммунизации животного или путем скрининга библиотеки генов иммуноглобулина и где выбранное антитело, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентично по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, антитело, полученное из конкретной последовательности зародышевой линии, будет содержать не более 10 аминокислотных различий, более предпочтительно не более 5 или даже более предпочтительно не более 4, 3, 2 или 1 аминокислотных различий с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.

Используемый в данном документе термин «гетероантитела» относится к двум или более антителам, их производным или связанным друг с другом с антигенсвязывающим областям, по меньшей мере, две из которых имеют разные специфичности. Эти разные специфичности включают специфичность связывания с Fc-рецептором на эффекторной клетке и специфичность связывания с антигеном или эпитопом на клетке-мишени, например опухолевой клетке.

Используемый в данном документе термин «трансфектома» включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитело, такие как клетки СНО, клетки NS/0, клетки HEK293, клетки HEK293T, растительные клетки или грибы, включая дрожжевые клетки.

Изобретение включает все антитела и производные антител, описанные в данном документе, которые для целей изобретения охватываются термином «антитело». Термин «производные антитела» относится к любой модифицированной форме антитела, например, к конъюгату антитела и другого агента или антитела или к фрагменту антитела.

Термин «антитело против опухолевого антигена» или аналогичные термины относится к антителу, направленному или обладающему способностью связываться с опухолевым антигеном. Термин «связывание» согласно изобретению предпочтительно относится к специфическому связыванию.

В соответствии с настоящим изобретением конъюгат антитело или антитело-лекарственное средство способен связываться с заданной мишенью, если он имеет значительное аффинность к указанной заданной мишени и связывается с указанной заданной мишенью в стандартных анализах. «Аффинность» или «аффинность связывания» часто измеряется константой равновесной диссоциации (K_D). Предпочтительно термин «значительная аффинность» относится к связыванию с заданной мишенью с константой диссоциации (K_D) 10^-5 М или ниже, 10^-6 М или ниже, 10^-7 М или ниже, 10^-8 М или ниже, 10^-9 М или ниже, 10^-10 М или ниже, 10^-11 М или ниже, или 10^-12 М или ниже.

Антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство (по существу) не способен связываться с мишенью, если не имеет значительной аффинности к указанной мишени и не связывается значимым образом, в частности, не связывается детектируемым образом с указанной мишенью в стандартных анализах. Предпочтительно, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство детектируемо не связываются с указанной мишенью, если присутствуют в концентрации вплоть до 2, предпочтительно 10, более предпочтительно 20, в частности 50 или 100 мкг/мл или выше. Предпочтительно, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство не имеет значительной аффинности к мишени, если связывается с указанным объектом с K_D, которая, по меньшей мере, в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10 раз⁴, 10⁵ раз или в 10⁶ раз выше, чем K_D для связывания с заданной мишенью, с которой антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство способны связываться. Например, если K_D для связывания антитела или антитело-лекарственного конъюгата с мишенью, с которой антитело или лекарственное средство конъюгат способен связываться, составляет 10^-7 М, K_D для связывания с мишенью, к которой антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство не имеет значительной аффинности, будет составлять, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство специфичен для предопределенной мишени, если они способны связываться с указанной заданной мишенью, и при этом не способны связываться с другими мишенями, то есть не имеют значительной аффинности к другим мишеням и не имеют существенного связывания с другими мишенями в стандартных анализах. Согласно изобретению антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство специфичны к опухолевому антигену, такому как CLDN18.2, если они способны связываться с опухолевым антигеном, но (по существу) не способны связываться с другими мишенями. Предпочтительно, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство являются специфичными к опухолевому антигену, если аффинность и связывание с такими другими мишенями незначительно превышает аффинность или связывание с белками, несвязанными с опухолевым антигеном, такими как бычий сывороточный альбумин (BSA) казеин, человеческий сывороточный альбумин (HSA) или трансмембранные белки, не являющиеся опухолевым антигеном, такие как молекулы МНС или рецептор трансферрина или любой другой указанный полипептид. Предпочтительно, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство являются специфичными к заранее определенной мишени, если они связываются с указанной мишенью с K_D, которая, по меньшей мере, в 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз ниже, чем K_D для связывания с мишенью, для которой они не являются специфичными. Например, если K_D для связывания антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство с мишенью, для которой они являются специфичными, составляет 10^-7 М, K_D для связывания с мишенью, для которой они не являются специфичными, будет составлять, по меньшей мере, 10^-6 М, 10^-5 М, 10^-4 М, 10^-3 М, 10^-2 М или 10^-1 М.

Связывание антитела с мишенью может быть определено экспериментально с использованием любого подходящего способа; см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), и способы, описанные в данном документе. Аффинности могут быть легко определены с использованием обычных методов, таких как равновесный диализ; с помощью прибора BIAcore 2000, используя общие процедуры, указанные производителем; путем радиоиммунологического анализа с использованием радиоактивно меченного антигена; или другим способом, известным специалисту в данной области техники. Данные о аффинности могут быть проанализированы, например, способом Scatchard et al., Ann NY Acad. ScL, 51:660 (1949). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может изменяться, если измерять ее в разных условиях, например, концентрации соли, рН. Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров, например K_D, IC₅₀, предпочтительно производятся со стандартизованными растворами антител и антигена и стандартизованным буфером.

Термин «встречающийся в природе», используемый в данном документе для применения к объекту, относится к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории, является встречающейся в природе.

Используемый в данном документе термин «перегруппированный» относится к конфигурации локуса иммуноглобулина тяжелой цепи или легкой цепи, где V-сегмент расположен непосредственно рядом с сегментом D-J или J в конформации, кодирующей, по существу, полный домен VH или VL, соответственно. Перестроенный локус гена иммуноглобулина (антитела) может быть идентифицирован путем сравнения с ДНК зародышевой линии; перестроенный локус будет иметь, по меньшей мере, один рекомбинированный элемент гомологии гептамера/нонамера.

Термин «неперестроенный» или «конфигурация зародышевой линии», при использовании в данном документе в отношении V-сегмента, относится к конфигурации, в которой V-сегмент не рекомбинирован, чтобы быть непосредственно смежным с сегментом D или J.

Согласно изобретению антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2 представляет собой антитело, способное связываться с эпитопом, присутствующим в CLDN18.2, предпочтительно эпитопом, находящимся во внеклеточных доменах CLDN18.2, в частности, первом внеклеточном домене, предпочтительно в аминокислотных положениях 29-78 в CLDN18.2. В конкретных воплощениях антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является антителом, способным связываться с (i) эпитопом на CLDN18.2, который отсутствует на CLDN18.1, предпочтительно SEQ ID NO: 3, 4 и 5, (ii) эпитопом, локализованном в CLDN18.2-петле 1, предпочтительно SEQ ID NO: 8, (iii) эпитопом, локализованном в CLDN18.2-петле 2, предпочтительно SEQ ID NO: 10, (iv) эпитопом, локализованном в CLDN18.2- петле D3, предпочтительно SEQ ID NO: 11, (v) эпитопом, который охватывает CLDN18.2-петлю 1 и CLDN18.2-петлю D3, или (vi) негликозилированным эпитопом, локализованным на CLDN18.2–петле D3, предпочтительно SEQ ID NO: 9.

Согласно изобретению антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, предпочтительно представляет собой антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, но не с CLDN18.1. Предпочтительно, антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является специфичным к CLDN18.2. Предпочтительно, антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, предпочтительно представляет собой антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, экспрессируемым на поверхности клетки. В предпочтительных воплощениях антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с нативными эпитопами CLDN18.2, присутствующими на поверхности живых клеток. Предпочтительно антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, связывается с одним или несколькими пептидами, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 и 48-50. Предпочтительно антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является специфичным для вышеупомянутых белков, пептидов или иммуногенных фрагментов или их производных. Антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, может быть получено способом, включающим стадию иммунизации животного белком или пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3-11, 44, 46 и 48-50, или нуклеиновой кислотой или клеткой-хозяином, экспрессирующей указанный белок или пептид. Предпочтительно антитело связывается с клетками злокачественных опухолей, в частности с клетками указанных выше типов злокачественных новообразований, и предпочтительно не связывается по существу с клетками, которые не являются клетками злокачественных опухолей.

В особенно предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, получают с помощью гибридомы, депонированной в DSMZ (Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; new address: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany) и имеет следующее обозначение и учетный номер:

а. 182-D1106-055, учетный номер DSM ACC2737, депонированное 19 октября 2005 года

b. 182-D1106-056, учетный номер DSM ACC2740, депонированное 19 октября 2005 года

c. 182-D1106-057, учетный номер DSM ACC2740, депонированное 19 октября 2005 года

d. 182-D1106-058, учетный номер DSM ACC2740, депонированное 19 октября 2005 года

e. 182-D1106-059, учетный номер DSM ACC2740, депонированное 19 октября 2005 года

f. 182-D1106-062, учетный номер DSM ACC2742, депонированное 19 октября 2005 года,

g. 182-D1106-067, учетный номер DSM ACC2740, депонированное 19 октября 2005 года

h. 182-D758-035, учетный номер DSM ACC2745, депонированное 17 ноября 2005 г.

i. 182-D758-036, учетный номер DSM ACC2746, депонированное 17 ноября 2005 г.

j. 182-D758-040, учетный номер DSM ACC2747, депонированное 17 ноября 2005 г.

k. 182-D1106-061, учетный номер DSM ACC2748, депонированное 17 ноября 2005 года

l. 182-D1106-279, учетный номер DSM ACC2808, депонированное 26 октября 2006 г.

m. 182-D1106-294, учетный номер DSM ACC2809, депонированное 26 октября 2006 года,

n. 182-D1106-362, учетный номер DSM ACC2810, депонированное 26 октября 2006 года.

Предпочтительными антителами в соответствии с изобретением являются те, которые продуцируются и получаются из вышеописанных гибридом; т.е. 37G11 в случае 182-D1106-055, 37H8 в случае 182-D1106-056, 38G5 в случае 182-D1106-057, 38H3 в случае 182-D1106-058, 39F11 в случае 182-D1106-059, 43A11 в случае 182-D1106-062, 61C2 в случае 182-D1106-067, 26B5 в случае 182-D758-035, 26D12 в случае 182-D758-036, 28D10 в случае 182-D758-040, 42E12 в случае 182-D1106-061, 125E1 в случае 182-D1106-279, 163E12 в случае 182-D1106-294 и 175D10 в случае 182-D1106-362; и их химеризованные и гуманизированные формы.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является антителом, выбранным из группы, состоящей из (i) антитела, продуцируемого и/или получаемого из клона, депонированного под учетным номером DSM ACC2737, DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSM ACC2809 или DSM ACC2810, (ii) антитела, которое является химеризированной или гуманизированной формой антитела (i), (iii) антитела, имеющего специфичность антитела (i), и (iv) антитела, содержащего антигенсвязывающую часть или антигенсвязывающий сайт, в частности вариабельный участок, антитела (i) и предпочтительно со специфичностью антитела (i).

Предпочтительные антитела, в частности химеризированные антитела и их последовательности, показаны в следующей таблице.

клон mAb Изотип Вариабельная область Химеризованное антитело Тяжелая цепь 43A11 182-D1106-062 IgG2a SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:14 163E12 182-D1106-294 IgG3 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:15 125E1 182-D1106-279 IgG2a SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:16 166E2 182-D1106-308 IgG3 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:18 175D10 182-D1106-362 IgG1 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:17 45C1 182-D758-187 IgG2a SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:19 легкая цепь 43A11 182-D1106-062 IgK SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:21 163E12 182-D1106-294 IgK SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:20 125E1 182-D1106-279 IgK SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:22 166E2 182-D1106-308 IgK SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:25 175D10 182-D1106-362 IgK SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:24 45C1 182-D758-187 IgK SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:23 45C1 182-D758-187 IgK SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:26 45C1 182-D758-187 IgK SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:27 45C1 182-D758-187 IgK SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:28

В предпочтительных воплощениях антитела, в частности химеризованные формы антител в соответствии с изобретением, включают антитела, содержащие константную область тяжелой цепи (CH), включающую аминокислотную последовательность, полученную из константной области тяжелой цепи человека, такую как аминокислотная последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 или ее фрагмент. В других предпочтительных воплощениях антитела, в частности химеризованные формы антител в соответствии с изобретением, включают антитела, содержащие константную область легкой цепи (CL), включающую аминокислотную последовательность, полученную из константной области легкой цепи человека, такую как аминокислотная последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12 или ее фрагмент. В конкретном предпочтительном воплощении антитела, в частности химеризованные формы антител в соответствии с изобретением, включают антитела, которые содержат CH, включающую аминокислотную последовательность, полученную из человеческой CH, такую как аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 13 ее или фрагмент, и включают CL, включающую аминокислотную последовательность, полученную из человеческой CL, такую как аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 12, или ее фрагмент.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, представляет собой химерное мышиное/человеческое IgG1 моноклональное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи каппа мыши, константную область легкой цепи каппа человека аллотипа Km(3), вариабельную область тяжелой цепи мыши, константную область IgG1 человека, аллотипа G1m (3).

В некоторых предпочтительных воплощениях химеризованные формы антител включают антитела, содержащие тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51 и ее фрагмента и/или содержащие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 и ее фрагмента.

В некоторых предпочтительных воплощениях химеризованные формы антител включают антитела, содержащие комбинацию тяжелых цепей и легких цепей, выбранных из следующих вариантов (i)-(ix):

(i) тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, или ее фрагмент,

(ii) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, или ее фрагмент,

(iii) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22, или ее фрагмент,

(iv) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18 или ее фрагмент, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, или его фрагмент,

(v) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент,

(vi) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, или ее фрагмент,

(vii) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, или ее фрагмент,

(viii) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, или ее фрагмент,

(ix) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28 или ее фрагментом, и

(x) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 51 или ее фрагмент, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент.

Антитела согласно (ii), (v) или (x) являются предпочтительными воплощениями «антитела, обладающего способностью связываться с CLDN18.2». Особенно предпочтительным является антитело согласно (v) или (x).

«Фрагмент» или «фрагмент аминокислотной последовательности», как используется выше, относится к части последовательности антитела, то есть к последовательности, которая представляет последовательность антитела, укороченную на N- и/или С-конце, которая, когда она заменяет указанную антительную последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с CLDN18.2. Предпочтительно, фрагмент аминокислотной последовательности содержит, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% аминокислотных остатков из указанной аминокислотной последовательности. Фрагмент аминокислотной последовательности, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 51, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, предпочтительно относится к указанной последовательности, где 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислоты на N-конце удаляются.

В предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, включает вариабельный участок тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 и их фрагмента.

В предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, включает вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 и их фрагмента.

В некоторых предпочтительных воплощениях антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, включает комбинацию вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), выбранной из следующих вариантов (i)-(ix):

(i) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36 или ее фрагментом,

(ii) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35 или ее фрагментом,

(iii) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37 или ее фрагментом,

(iv) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, или ее фрагмент, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40 или ее фрагментом,

(v) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39 или ее фрагментом,

(vi) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38 или ее фрагментом,

(vii) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41 или ее фрагментом,

(viii) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42 или ее фрагментом,

(ix) VH содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34 или ее фрагментом, и VL содержит аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43 или ее фрагментом.

Антитела согласно (ii) или (v) являются предпочтительными воплощениями «антитела, обладающего способностью связываться с CLDN18.2». Особенно предпочтительным является антитело согласно (v).

В соответствии с изобретением термин «фрагмент» относится, в частности, к одной или нескольким областям, определяющим комплементарность (CDR), предпочтительно, по меньшей мере, к вариабельной области CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL). В одном воплощении указанная одна или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), выбираются из набора областей, определяющих комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3. В особенно предпочтительном воплощении термин «фрагмент» относится к областям, определяющим комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL).

В предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, содержит VH, содержащий набор областей, определяющих комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из следующих вариантов (i)-(vi):

(i) CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: положения 116-125 SEQ ID NO: 14,

(ii) CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: положения 116-126 SEQ ID NO: 15,

(iii) CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: положения 116-124 SEQ ID NO: 16,

(iv) CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: положения 116-126 SEQ ID NO: 17,

(v) CDR1: положения 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: положения 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: положения 115-125 SEQ ID NO: 18 и

(vi) CDR1: положения 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положения 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положения 117-128 SEQ ID NO: 19.

В предпочтительном воплощении антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, включает VL, содержащий набор областей, определяющих комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из следующих воплощений (i)-(ix):

(i) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 20, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 20,

(ii) CDR1: положения 49-53 SEQ ID NO: 21, CDR2: положения 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: положения 110-118 SEQ ID NO: 21,

(iii) CDR1: положения 47-52 SEQ ID NO: 22, CDR2: положения 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: положения 109-117 SEQ ID NO: 22,

(iv) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 23, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 23,

(v) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 24, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 24,

(vi) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 25, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: положения 115-122 SEQ ID NO: 25,

(vii) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 26, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 26,

(viii) CDR1: положения 47-58 SEQ ID NO: 27, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 27 и

(ix) CDR1: положения 47-52 SEQ ID NO: 28, CDR2: положения 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: положения 109-117 SEQ ID NO: 28.

В предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, содержит комбинацию VH и VL, каждая из которых содержит набор областей, определяющих комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из следующих воплощений (i)-(ix):

(i) VH: CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 14, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 14, CDR3: положения 116-125 SEQ ID NO: 14, VL: CDR1: положения 49 -53 SEQ ID NO: 21, CDR2: положения 71-73 SEQ ID NO: 21, CDR3: положения 110-118 SEQ ID NO: 21,

(ii) VH: CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 15, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 15, CDR3: положения 116-126 SEQ ID NO: 15, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 20, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 20, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 20,

(iii) VH: CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 16, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 16, CDR3: положения 116-124 SEQ ID NO: 16, VL: CDR1: положения 47 -52 SEQ ID NO: 22, CDR2: положения 70-72 SEQ ID NO: 22, CDR3: положения 109-117 SEQ ID NO: 22,

(iv) VH: CDR1: положения 44-51 SEQ ID NO: 18, CDR2: положения 69-76 SEQ ID NO: 18, CDR3: положения 115-125 SEQ ID NO: 18, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 25, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 25, CDR3: положения 115-122 SEQ ID NO: 25,

(v) VH: CDR1: положения 45-52 SEQ ID NO: 17, CDR2: положения 70-77 SEQ ID NO: 17, CDR3: положения 116-126 SEQ ID NO: 17, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 24, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 24, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 24,

(vi) VH: CDR1: положения 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положения 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положения 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 23, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 23, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 23,

(vii) VH: CDR1: положения 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положения 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положения 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 26, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 26, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 26,

(viii) VH: CDR1: положения 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положения 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положения 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положения 47 -58 SEQ ID NO: 27, CDR2: положения 76-78 SEQ ID NO: 27, CDR3: положения 115-123 SEQ ID NO: 27 и

(ix) VH: CDR1: положения 45-53 SEQ ID NO: 19, CDR2: положения 71-78 SEQ ID NO: 19, CDR3: положения 117-128 SEQ ID NO: 19, VL: CDR1: положения 47 -52 SEQ ID NO: 28, CDR2: положения 70-72 SEQ ID NO: 28, CDR3: положения 109-117 SEQ ID NO: 28.

Антитела согласно (ii) или (v) являются предпочтительными воплощениями «антитела, обладающего способностью связываться с CLDN18.2». Особенно предпочтительным является антитело согласно (v).

В других предпочтительных воплощениях антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, предпочтительно включает одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), предпочтительно, по меньшей мере, вариабельную область CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела против CLDN18.2, предпочтительно моноклонального антитела против CLDN18.2, описанного в данном документе, и предпочтительно содержит одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), предпочтительно, по меньшей мере, вариабельную область CDR3 вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и/или вариабельных областей легкой цепи (VL), описанных в данном документе. В одном воплощении упомянутая одна или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), выбираются из набора областей, определяющих комплементарность CDR1, CDR2 и CDR3, описанных в данном документе. В особенно предпочтительном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, предпочтительно содержит области CDR1, CDR2 и CDR3 комплементарности вариабельной области тяжелой цепи (VH) и/или вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела против CLDN18.2, предпочтительно моноклонального антитела против CLDN18.2, описанного в данном документе, и предпочтительно содержит области комплементарности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей тяжелой цепи (VH) и/или вариабельных областей легкой цепи (VL), описанных в данном документе.

В одном воплощении антитело, содержащее один или несколько CDR, набор CDR или комбинацию наборов CDR, как описано в данном документе, содержит упомянутые CDR вместе с их промежуточными каркасными областями. Предпочтительно, эта часть также будет включать, по меньшей мере, около 50% одной или обеих из первой и четвертой каркасных областей, причем 50% являются С-концевой 50% первой каркасной области и N-концевой 50% четвертой каркасной области. Конструирование антител, полученных методами рекомбинантной ДНК, может привести к введению остатков N- или С-концов в вариабельные области, кодируемые линкерами, введенными для облегчения клонирования или других манипуляций, включая введение линкеров для присоединения вариабельных областей изобретения к дополнительные белковые последовательности, включая тяжелые цепи иммуноглобулина, другие вариабельные домены (например, при производстве диател) или белковые метки.

В одном воплощении антитело, содержащее один или несколько CDR, набор CDR или комбинацию наборов CDR, как описано в данном документе, содержит указанные CDR в каркасе человеческого антитела.

Ссылка в данном документе на антитело, содержащее по отношению к его тяжелой цепи конкретную цепь или конкретную область или последовательность, предпочтительно относится к ситуации, когда все тяжелые цепи указанного антитела содержат указанную конкретную цепь, область или последовательность. Это применимо, соответственно, к легкой цепи антитела.

В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2 в соответствии с изобретением, относится к антителу, которое распознает, т.е. связывается с тем же или по существу тем же эпитопом, что и CLDN18.2-связывающее антитело, описанное в данном документе, и/или конкурирует с указанным CLDN18.2-связывающим антителом за связывание с CLDN18.2.

В соответствии с изобретением антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, в частности, когда оно присутствует в конъюгате антитело-лекарственное средство, предпочтительно имеет аффинность и/или специфичность к CLDN18.2, подходящие для эндоцитоза антитела и/или конъюгата антитело-лекарственное средство.

Термин «эндоцитоз» относится к процессу, в котором эукариотические клетки интернализуют сегменты плазматической мембраны, рецепторы клеточной поверхности и компоненты из внеклеточной жидкости. Механизмы эндоцитоза включают опосредованный рецепторами эндоцитоз. Термин «опосредуемый рецепторами эндоцитоз» относится к биологическому механизму, посредством которого лиганд при связывании со своей мишенью запускает мембранную инвагинацию и сдавливание, становясь интернализованными и доставленными в цитозоль или перенесенными в соответствующие внутриклеточные компартменты.

Настоящее изобретение также предусматривает воплощения, в которых «антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2», имеет значение, которое охватывает любой «агент, связывающийся с CLDN18.2». В соответствии с изобретением «агент, связывающийся с CLDN18.2» включает любое соединение, которое имеет способность связывания с CLDN18.2. Предпочтительно такой связывающий агент содержит, по меньшей мере, один связывающий домен для CLDN18.2. Термин включает все искусственные связывающие молекулы (каркасы), имеющие способность связывания с CLDN18.2, включая, без ограничения указанным, наночастицы, аффитело (белок-миметик антител, созданный компанией Affibody AB), антикалины, сконструированные белки с анкириновым повтором, мономеры, авимеры и микротела. В одном воплощении указанный связывающий агент связывается с внеклеточным доменом CLDN18.2. В одном воплощении указанный связующий агент связывается с нативными эпитопами CLDN18.2, присутствующими на поверхности живых клеток. В одном воплощении указанный связующий агент связывается с первой внеклеточной петлей CLDN18.2. В одном воплощении связывание с CLDN18.2 является специфическим связыванием.

Термин «связывающий домен» характеризует в связи с настоящим изобретением структуру, например антитела, которая связывается/взаимодействует с данной целевой структурой/антигеном/эпитопом. Таким образом, домен связывания в соответствии с изобретением обозначает «сайт взаимодействия антигена».

Любой агент, который оказывает терапевтическое действие на клетки злокачественных опухолей, может быть использован в качестве лекарственного средства для конъюгации с антителом против CLDN18.2 или его производным. Предпочтительно конъюгация лекарственного средства не изменяет или существенно не изменяет характеристики связывания, в частности специфичность антитела, обсуждаемую в данном документе. Таким образом, конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с изобретением предпочтительно имеет те же или по существу те же характеристики связывания, в частности специфичность, что и антитело, используемое для конъюгации. Соответственно, если в данном документе описаны некоторые связывающие характеристики для антитела, используемого для конъюгации, предпочтительно, чтобы конъюгат антитело-лекарственное средство имел такие же связывающие характеристики. Например, если описано, что антитело, имеющее способность связываться с CLDN18.2, связывается с внеклеточным доменом CLDN18.2 и/или связывается с первой внеклеточной петлей CLDN18.2, предпочтительно, чтобы также конъюгат антитело-лекарственное средство связывается с внеклеточным доменом CLDN18.2 и/или связывается с первой внеклеточной петлей CLDN18.2.

Как правило, препарат представляет собой цитотоксический или цитостатический агент.Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который вреден для клеток и, в частности, убивает клетки.

Полезные классы цитотоксических агентов включают, например, антитубулиновые агенты, вещества связывающиеся с малой бороздкой ДНК (например, енедиины и лекситропсины), ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты (например, комплексы платины, такие как цис-платин, моно (платина), бис (платина) и трехъядерные платиновые комплексы и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, сенсибилизаторы химиотерапии, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, нитрозомочевины, платиноны, преформующие соединения, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, сенсибилизаторы излучения, стероиды, таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел), ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка и т.п.

Отдельные цитотоксические агенты включают, например, андроген, антрамицин (AMC), аспарагиназу, 5-азацитидин, азатиоприн, блеомицин, бусульфан, бутохинонсульфоксимин, камптотецин, карбоплатин, кармустин (BSNU), CC-1065, хлорамбуцил, цисплатин, колхицин, циклофосфамид, цитарабин, цитидина-арабинозид, цитохалазин В, дакарбазин, дактиномицин (ранее актиномицин), даунорубицин, декарбазин, доцетаксел, доксорубицин, эстроген, 5-фтордероксиуридин, 5-фторурацил, грамицидин D, гидроксимочевина, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин (CCNU), мехлорэтамин, мелфалан, 6-меркаптопурин, метотрексат, митрамицин, митомицин C, митоксантрон, нитроимидазол, паклитаксел, пликамицин, прокарбизин, стрептозотоцин, тенопозид, 6-тиогуанин, тиотепа, топотекан, винбластин, винкристин, винорелбин, VP-16 и VM-26.

Примеры антитубулиновых агентов включают, без ограничения указанным, доластатины (например, ауристатин E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), майтанзиноиды, таксаны (например, паклитаксел, доцетаксел), T67 (туларик), алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин), производные баккатина, аналоги таксанов (например, эпотилон А и В), нокодазол, колхицин и колцимид, эстрамустин, криптофизины, кемадотин, комбретастатины, дискодермолид и элеутеробин.

В конкретных воплощениях цитотоксический или цитостатический агент представляет собой ауристатин E (также известный в данной области как доластатин-10) или его производное. Как правило, производным ауристатина Е является, например, сложный эфир, образованный между ауристатином Е и кетокислотой. Например, ауристатин E можно подвергнуть взаимодействию с параацетилбензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой для получения AEB и AEVB, соответственно. Другие типичные производные ауристатина включают AFP, MMAF и MMAE.

В некоторых воплощениях цитотоксический или цитостатический агент представляет собой майтанзиноид, еще одну группу антитубулиновых агентов. Например, в конкретных воплощениях майтанзиноид представляет собой майтанзин, DM-1 или DM-4.

Майтанзиноиды являются мощными нацеленными на микротрубочками соединениями, которые ингибируют пролиферацию клеток в митозе. Майтанзиноиды являются производными майтанзина, который представляет собой 19-членную структуру анса-макролида, присоединенную к хлорированному бензольному кольцу. Майнтанзин имеет следующую формулу:

Было обнаружено, что некоторые микробы также продуцируют майтанзиноиды, такие как майтанзинол и сложные эфиры майтанзинола C-3 (патент США №4 151 042). Синтетические майтанзинол и аналоги майтанзинола представлены, например, в пат.США №4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4362663; и 4371533, и Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451, включенных в данный документ ссылкой.

Майтанзиноиды хорошо известны в данной области и могут быть синтезированы известными способами или выделены из природных источников. Особенно предпочтительными майтанзиноидами в соответствии с изобретением являются тиолсодержащие производные майтанзина, такие как DM1 и DM4. Такие тиолсодержащие производные майтанзина включают соединения, в которых метильная группа, связанная с карбонильной группой, замещена группой, содержащей свободную сульфгидрильную группу, такую как группа -R-SH, где R представляет собой алкиленовую группу или другую углеродсодержащую группу атомов.

DM1, также известный как мертанзин, представляет собой майтанзиноид, имеющий следующую формулу:

В частности, термин «мертанзин» или «DM1» относится к соединению N^2'-деацетил-N^2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин.

«DM4» относится к соединению N^2'-деацетил-N^2'-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин.

Конъюгаты анти-CLDN18.2-антитело-майтанзиноид могут быть получены химическим связыванием антитела против CLDN18.2 с молекулой майтанзиноида без значительного уменьшения биологической активности либо антитела, либо молекулы майтанзиноида. В среднем 3-4 молекулы майтанзиноида может быть конъюгировано на молекулу антитела, хотя ожидается, что даже одна молекула токсина на антитело усиливает цитотоксичность по сравнению с использованием «невооруженного» антитела.

В этом отношении термин «антитело, ковалентно связанное, по меньшей мере, с одним компонентом токсинного лекарственного средства» включает ситуации, когда одна или несколько молекул одного и того же лекарственного средства ковалентно присоединены к молекуле антитела, а также, когда разные лекарственные средства ковалентно присоединены к молекуле антитела. В последнем случае одна или несколько молекул каждого из различных лекарственных средств могут быть присоединены к молекуле антитела или их комбинации (например, одна молекула одного лекарственного средства присоединена, когда присоединены несколько молекул другого лекарственного средства).

В некоторых воплощениях изобретения антитело конъюгируют с доластатинами или пептидными аналогами и производными долостатина, ауристатинами (патенты США №5635483, 5780588, включенные в данный документ ссылкой). Ауристатины представляют собой синтетические аналоги долостатина 10, натурального продукта, полученного из морского моллюска, Dolabela auricularia. Подобно майтанзиноидам, ауристатины разрушают микротрубочки. Доластатин или лекарственный фрагмент ауристатина могут быть присоединены к антителу через N (амино) конец или C (карбоксильный) конец пептидной части лекарственного средства.

Типичные варианты ауристатина включают монометилауристатиновые лекарственные фрагменты, такие как MMAE и MMAF, которые предпочтительно связаны с N-концом.

MMAE, также известный как монометилауристатин E, имеет следующую формулу:

В частности, термин «MMAE» относится к соединению (S)-N-((3R, 4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4 ил)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид. MMAE на самом деле является десметил-ауристатином Е, то есть N-концевая аминогруппа имеет только один метильный заместитель вместо двух, как в самом ауристатине Е.

Частично предпочтительными согласно изобретению являются конъюгаты антитело-vc-ауристатин, такие как конъюгаты антитело-vcMMAE. Согласно изобретению термин «антитело-vc-ауристатин» или «vcMMAE» относится к конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC), содержащему ауристатин, такой как MMAE, связанный через линкер, содержащий лизосомально расщепляемый дипептид, валин-цитруллин (vc), с антителом.

MMAF, также известный как монометилауристатин F, относится к соединению (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановой кислоты.

Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство может быть осуществлено любым способом, известным специалисту в данной области. Конъюгаты антитело-лекарственное средство могут быть получены путем связывания лекарственного средства с антителом в соответствии с общепринятой методикой. Антитело и лекарственное средство могут быть непосредственно связаны друг с другом через их собственные линкерные группы или опосредованно через линкер или другое вещество.

Существует множество различных реакций для ковалентного прикрепления лекарств к антителам. Это часто достигается реакцией аминокислотных остатков молекулы антитела, включая аминогруппы лизина, свободные карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильные группы цистеина и различные фрагменты ароматических аминокислот.Одним из наиболее часто используемых неспецифических способов ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция для связывания карбокси (или амино) группы соединения с амино (или карбокси) группами антитела. Кроме того, бифункциональные агенты, такие как диальдегиды или имидоэфиры, были использованы для связывания аминогруппы соединения с аминогруппами молекулы антитела. Также для прикрепления лекарственных средств к антителам также доступна реакция основания Шиффа. Этот способ включает окисление периодата лекарственного средства, которое содержит гликолевые или гидроксильные группы, с образованием таким образом альдегида, который затем подвергается взаимодействию с молекулой антитела. Присоединение происходит путем образования основания Шиффа с аминогруппами молекулы антитела. Изотиоцианаты также могут быть использованы в качестве связующих агентов для ковалентного прикрепления лекарственных средств к антителам. Другие методы известны специалисту в данной области техники и в пределах объема настоящего изобретения.

Существует много связывающих групп, известных в данной области для получения конъюгатов антитело-лекарство. Линкер предпочтительно содержит одну или несколько функциональных групп, которые реагируют с любым или обоими антителами и лекарственным средством. Примеры функциональных групп включают аминогруппу, карбоксильную, меркапто, малеимидную и пиридинильную группы.

В одном воплощении изобретения антитело связано с лекарственным средством через бифункциональный сшивающий реагент. Используемый в данном документе термин «бифункциональный сшивающий реагент» относится к реагенту, который обладает двумя реакционноспособными группами, одна из которых способна реагировать с антителом, тогда как другая способна взаимодействовать с лекарственным средством для связывания антитела с лекарственным средством, тем самым образуя конъюгат. Любой подходящий бифункциональный сшивающий реагент может использоваться в связи с изобретением до тех пор, пока линкерный реагент обеспечивает сохранение свойств лекарственного средства, например цитотоксичности и целевых характеристик антитела. Предпочтительно, линкерная молекула соединяет лекарственное средство с антителом посредством химических связей, так что лекарственное средство и антитело химически связаны (например, ковалентно связаны) друг с другом.

В одном воплощении бифункциональный сшивающий реагент содержит нерасщепляемые линкеры. Нерасщепляемый линкер представляет собой любой химический фрагмент, который способен связывать лекарственное средство, такое как майтанзиноид, с антителом, стабильным ковалентным образом. Предпочтительно нерасщепляемый линкер не расщепляется в физиологических условиях, в частности внутри клетки. Таким образом, нерасщепляемые линкеры по существу устойчивы к кислотоиндуцированному расщеплению, светоиндуцированному расщеплению, пептидаза-индуцированному расщеплению, эстераза-индуцированному расщеплению и расщеплению дисульфидной связи в условиях, при которых лекарство или антитело остаются активными. Подходящие сшивающие реагенты, которые образуют нерасщепляемые линкеры между лекарственным средством и антителом, хорошо известны в данной области. В одном воплощении лекарственное средство связывается с антителом через тиоэфирную связь.

В одном особенно предпочтительном воплощении связывающий реагент является расщепляемым линкером. Предпочтительно, расщепляемый линкер расщепляется в физиологических условиях, в частности внутри клетки. Примеры подходящих расщепляемых линкеров включают дисульфидные линкеры, кислотолабильные линкеры, фотолабильные линкеры, пептидаза-лабильные линкеры и эстераза-лабильные линкеры.

Примеры линкеров включают, без ограничения указанным, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) бутират (SPDB), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), сульфосукцинимидил-4-(N- малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (Sulfo-SMCC), N-сукцинимидил-4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат) (LC-SMCC), N-гидроксисукцинимидный эфир 4-малеимидомасляной кислоты (GMBS), 3-малеимидокапропиловый эфир N-гидроксисукцинимида цинка (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), N-(α-малеимидоацетокси)-сукцинимидный эфир (AMAS), сукцинимидил-6-(β-малеимидопропионамидо) гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил-4-(p-малеимидофенил)-бутират (SMPB), N-(p-малеимидофенил) изоцианат (PMPI) 6-малеимидокапроил (MC), малеимидопропаноил (MP), p-аминобензилоксикарбонил (PAB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио) пентаноат (SPP) и N-сукцинимидил (4-иодацетил) аминобензоат (SIAB). Также может быть использован пептидный линкер, такой как валин-цитруллин (Val-Cit) или аланинфенилаланин (ala-phe), и любой из вышеупомянутых линкеров можно использовать в адекватной комбинации.

Дисульфидсодержащие линкеры являются линкерами, расщепляемыми посредством дисульфидного обмена, которые могут возникать в физиологических условиях. В других воплощениях линкер расщепляется в восстановительных условиях (например, дисульфидный линкер). В данной области известны различные дисульфидные линкеры, в том числе, например, те, которые могут быть получены с использованием SATA (N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетата), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионата), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) бутирата) и SMPT (N-сукцинимидил-оксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуола).

Кислотолабильные линкеры представляют собой линкеры, расщепляемые при кислом рН. Например, некоторые внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют кислый рН (рН 4-5) и обеспечивают условия, подходящие для расщепления кислотолабильных линкеров. Кислотолабильные линкеры относительно стабильны при нейтральных условиях рН, например, в крови, но нестабильны при рН ниже 5,5 или 5,0. Например, можно использовать гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь и т.п.

Фотолабильные линкеры полезны на поверхности тела и во многих полостях тела, которые доступны для света. Кроме того, инфракрасный свет может проникать в ткань.

Пептидаза-лабильные линкеры могут использоваться для расщепления определенных пептидов внутри или снаружи клеток. В одном воплощении расщепляемый линкер расщепляется в мягких условиях, то есть в условиях внутри клетки, которые не влияют на активность цитотоксического агента.

Линкер может содержать или может содержать, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточной пептидазой или протеазным ферментом, включая, без ограничения перечисленным, лизосомную или эндосомную протеазу. Как правило, пептидильный линкер имеет, по меньшей мере, две аминокислоты в длину или, по меньшей мере, три аминокислоты в длину. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D и плазмин, все из которых, как известно, гидролизуют производные дипептида и лекарственного средства, приводящие к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней. Например, можно использовать пептидильный линкер, который расщепляется тиолозависимой протеазой катепсин-В, которая на высоком уровне экспрессируется в ткани злокачественной опухоли (например, лиганд Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). В конкретных воплощениях пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, представляет собой связующий линкер валин-цитруллин (Val-Cit; vc) или линкер фенилаланин-лизин (Phe-Lys). Одним из преимуществ применения внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического агента является то, что агент обычно ослабляется при конъюгировании, а стабильность конъюгатов в сыворотке обычно высока.

В одном особенно предпочтительном воплощении линкер в соответствии с изобретением содержит или состоит из дипептида валина (Val)- цитруллина (Cit) (vc), который расщепляется катепсином внутри опухолевых клеток.

В одном воплощении лекарственное средство представляет собой майтанзиноид, такой как DM4, который связан с антителом, имеющим способность связываться с CLDN18.2 через аминогруппу и сульфгидрильный реакционноспособный гетеробифункциональный белковый перекрестносшивающий линкер, который реагирует с первичными аминами (что обнаруживается в лизиновых боковых цепях или на N-конце белков) антитела и с сульфгидрильной группой мейтанзиноида с получением обратимой дисульфидной связи. В одном воплощении амино- и сульфгидрильный реакционноспособный гетеробифункциональный белковый сшивающий агент представляет собой SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) бутират), который реагирует с помощью сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) с первичными аминами (которые обнаруживаются в лизиновых боковых цепях или на N-конце белков) антитела и через пиридинилдисульфидную группу с сульгидрильной группой DM4 с образованием обратимой дисульфидной связи (фигура 1).

В одном воплощении лекарственное средство представляет собой ауристатин, такой как MMAE, который связан с антителом, имеющим способность связываться с CLDN18.2 через пептидный линкер, такой как пептидный линкер, расщепляемый катепсином, в частности Val-Cit (vc). В одном воплощении антитело, обладающее способностью связываться с CLDN18.2, является тиолированным, например, с помощью гетеробифункционального линкера 2-IT (2-иминотиолана), который реагирует со свободными аминами лизиновых остатков.

В одном особенно предпочтительном варианте конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с изобретением содержит антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, связанного (предпочтительно через их аминогруппы) с DM4 (предпочтительно через его сульфгидрильную группу). В одном воплощении антитело связывается с DM4 через линкер SPDB.

В одном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с изобретением содержит антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или его фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или его фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, связанного (предпочтительно через их аминогруппы) с DM4 (предпочтительно через его сульфгидрильную группу). В одном воплощении антитело связывается с DM4 через линкер SPDB.

В одном особенно предпочтительном варианте конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с изобретением содержит антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, или ее фрагмент или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, связанного (предпочтительно через их аминогруппы) с MMAE (предпочтительно через его N-концевую аминогруппу). В одном воплощении антитело связывается с MMAE через линкер, содержащий дипептид vc.

В одном особенно предпочтительном варианте конъюгат антитело-лекарственное средство в соответствии с изобретением содержит антитело, содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17 или 51, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, или ее фрагмент, или вариант указанной аминокислотной последовательности или фрагмента, связанного (предпочтительно через их аминогруппы) с MMAE (предпочтительно через его N-концевую аминогруппу). В одном воплощении антитело связывается с MMAE через линкер, содержащий дипептид vc.

Используемый в данном документе термин «нуклеиновая кислота» предназначен для включения ДНК и РНК. Нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

Согласно изобретению термин «экспрессия» используется в его наиболее общем значении и включает продуцирование РНК или РНК и белка/пептида. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот.Кроме того, экспрессия может выполняться транзиторно или стабильно.

Описание, данное в данном документе в отношении конкретных аминокислотных последовательностей, например, показанных в перечне последовательностей, в частности тех, которые упоминаются в данном документе, путем указания SEQ ID NO:, должно толковаться так, чтобы также относиться к вариантам указанных специфических последовательностей. Такие вариантные последовательности могут быть функционально эквивалентны указанным конкретным последовательностям, например аминокислотным последовательностям, обладающим свойствами, идентичными или сходными с таковыми для конкретных аминокислотных последовательностей. Одним из важных свойств является сохранение связывания антитела с его мишенью. Предпочтительно последовательность, которая является вариантом по отношению к определенной последовательности, когда она заменяет конкретную последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с CLDN18.2.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что, в частности, последовательности CDR, гипервариабельные и вариабельные области могут быть изменены без потери способности связывать CLDN18.2. Например, области CDR будут либо идентичными, либо высоко гомологичными областям антител, указанных в данном документе. Под «высоко гомологичным» подразумевается, что в CDR могут быть сделаны замены в количестве от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например, от 1 до 3 или 1 или 2 замены. Кроме того, гипервариабельные и вариабельные области могут быть модифицированы так, чтобы они демонстрировали существенную гомологию с областями антител, конкретно раскрытых в данном документе.

Термин «вариант» согласно изобретению относится, в частности, к мутантам, вариантам сплайсинга, конформациям, изоформам, аллельным вариантам, видовым вариантам и видовым гомологами, в частности к тем, которые встречаются в природе. Аллельный вариант относится к изменению нормальной последовательности гена, значение которого часто неясно. Секвенирование полного гена часто идентифицирует многочисленные аллельные варианты для данного гена. Видовой гомолог представляет собой нуклеиновую кислоту или аминокислотную последовательность, происходящие из другого вида, отличного от вида данной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Термин «вариант» должен охватывать любые посттрансляционно модифицированные варианты и конформационные варианты.

Для целей настоящего изобретения «варианты» аминокислотной последовательности включают варианты с аминокислотными вставками, варианты с добавлением аминокислот, варианты с делецией аминокислот и/или варианты с заменой аминокислот.Варианты с делециями аминокислот, которые включают делецию на N-конце и/или С-конце белка, также называются N-концевыми и/или С-концевыми укороченными вариантами.

Варианты аминокислотных вставок включают вставки одной или двух или более аминокислот в конкретной аминокислотной последовательности. В случае вариантов аминокислотной последовательности, имеющих вставку, один или несколько аминокислотных остатков вводят в конкретный участок в аминокислотной последовательности, хотя также возможна случайная вставка с соответствующим скринированием полученного продукта.

Варианты добавления аминокислот включают амино- и/или карбокси-концевые слияния одной или нескольких аминокислот, как например, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот.

Варианты аминокислотных делеций характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности, как например, удаление 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более аминокислот.Делеции могут быть в любом положении белка.

Варианты аминокислот характеризуются, по меньшей мере, одним остатком в удаляемой последовательности и другим остатком, вставленным на его место. Предпочтение отдается модификациям, которые находятся в положениях аминокислотной последовательности, которые не консервативны между гомологичными белками или пептидами и/или заменам аминокислот на другие, обладающие сходными свойствами. Предпочтительно, аминокислотные замены в вариантах белка представляют собой консервативные аминокислотные замены, то есть замены одинаково заряженных или незаряженных аминокислот. Консервативная аминокислотная замена включает замену на одну из семейства аминокислот, которые родственны по их боковым цепям. Природные аминокислоты обычно делятся на четыре семейства: кислотные (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин) аминокислоты. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты.

Предпочтительно, чтобы степень сходства, предпочтительно идентичность между данной аминокислотной последовательностью, такой как аминокислотная последовательность, обозначенная в данном документе путем указания SEQ ID NO:, и аминокислотной последовательностью, которая является вариантом указанной аминокислотной последовательности, будет составлять по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Степень сходства или идентичности дается предпочтительно для аминокислотной области, которая составляет, по меньшей мере, около 10%, по меньшей мере, около 20%, по меньшей мере, около 30%, по меньшей мере, около 40%, по меньшей мере, около 50%, по меньшей мере, около 60% %, по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мере, около 90% или около 100% всей длины эталонной аминокислотной последовательности. Например, если эталонная аминокислотная последовательность состоит из 200 аминокислот, степень сходства или идентичности дается предпочтительно для, по меньшей мере, около 20, по меньшей мере, для около 40, по меньшей мере, для около 60, по меньшей мере, для около 80, по меньшей мере, для около 100, по меньшей мере, для около 120, по меньшей мере, для около 140, по меньшей мере, для около 160, по меньшей мере, для около 180 или для около 200 аминокислот, предпочтительно непрерывных аминокислот. В предпочтительных воплощениях степень сходства или идентичности дается для всей длины эталонной аминокислотной последовательности. Выравнивание для определения сходства последовательностей, предпочтительно идентичности последовательности, может быть выполнено с помощью известных инструментов, предпочтительно с использованием наилучшего выравнивания последовательностей, например, с использованием Align, с использованием стандартных настроек, предпочтительно EMBOSS::needle, Матрица: Blosum62, штраф за пропуск 10,0, штраф за удлинение 0,5.

«Сходство последовательностей» обозначает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены. «Идентификация последовательности» между двумя аминокислотными последовательностями обозначает процент аминокислот, которые идентичны между последовательностями.

Термин «процентная идентичность» предназначен для обозначения процента аминокислотных остатков, которые идентичны между двумя последовательностями, которые следует сравнить, полученного после наилучшего выравнивания, причем этот процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом и по всей длине. Сравнения последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями обычно выполняются путем сравнения этих последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение проводят с помощью сегмента или «окна сравнения» для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть получено, кроме того, вручную с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, 1981, Ads App.Math. 2, 482, с помощью локального алгоритма гомологии Нидлмана и Вунша, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, с помощью метода поиска подобия Пирсона и Липмана, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 или с помощью компьютерных программ, которые используют эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, штат Висконсин).

Процент идентичности вычисляется путем определения количества идентичных положений между двумя сравниваемыми последовательностями, деля это количество на количество сравниваемых положений и умножая полученный результат на 100, с получением процентного выражения идентичности между этими двумя последовательностями.

Термин «трансгенное животное» относится к животному, имеющему геном, содержащий один или несколько трансгенов, предпочтительно трансгены тяжелой и/или легкой цепи, или трансхромосомы (либо интегрированные, либо неинтегрированные в естественную геномную ДНК животного) и которое предпочтительно способно экспрессировать трансгены. Например, трансгенная мышь может иметь трансген легкой цепи человека и либо трансген тяжелой цепи человека, либо трансхромосому тяжелой цепи человека, так что мышь продуцирует человеческие антитела против CLDN18.2 при иммунизации антигеном CLDN18.2 и/или клетками, экспрессирующими CLDN18.2. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как это имеет место для трансгенных мышей, например мышей HuMAb, таких как мыши HCo7 или HCol2, или трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться внехромосомно, как в случае трансхромосомных (например, KM) мышей, как описано в WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть способны продуцировать множественные изотипы человеческих моноклональных антител к CLDN18.2 (например, IgG, IgA и/или IgE) путем рекомбинации VDJ и переключения изотипа.

«Снизить», «уменьшить» или «ингибировать», при использовании в данном документе, означает общее уменьшение или способность вызвать общее уменьшение, предпочтительно на 5% или более, на 10% или более, на 20% или более, более предпочтительно на 50% или более и наиболее предпочтительно на 75% или более, уровня, например, уровня экспрессии или уровня пролиферации клеток.

Такие термины, как «увеличение» или «повышение», предпочтительно относятся к увеличению или повышению на около 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 100%, по меньшей мере, на 200%, по меньшей мере, на 500%, по меньшей мере, на 1000%, по меньшей мере, на 10000% или даже более.

Антитела, описанные в данном документе, могут быть получены различными способами, включая обычную методологию моноклональных антител, например, стандартную методику гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Хотя предпочтительны процедуры гибридизации соматических клеток, в принципе могут быть использованы другие способы получения моноклональных антител, например, вирусная или онкогенная трансформация B-лимфоцитов или методы фагового дисплея с использованием библиотек генов антител.

Предпочтительной животной системой для продуцирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, является мышиная система. Продуцирование гибридомы у мышей - очень хорошо зарекомендовавшая себя процедура. Протоколы иммунизации и способы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Также известны партнеры по слиянию (например, клетки миеломы мыши) и процедуры слияния.

Другими предпочтительными животными системами для получения гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, являются крысиная и кроличья система (например, описанная в Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), см. также Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

В еще одном предпочтительном воплощении человеческие моноклональные антитела могут быть получены с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не системы мыши. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, известных как мышей HuMAb и мышей KM, соответственно, и в совокупности упоминаются в данном документе как «трансгенные мыши». Получение человеческих антител в таких трансгенных мышах может быть выполнено, как подробно описано для CD20 в WO2004 035607.

Еще одна стратегия получения моноклональных антител заключается в прямом выделении генов, кодирующих антитела из лимфоцитов, продуцирующих антитела определенной специфичности, например, см. Babcock et al., 1996; Новая стратегия получения моноклональных антител из одиночных выделенных лимфоцитов, продуцирующих антитела определенных специфичностей. Подробные сведения о разработке рекомбинантных антител см. также Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 и Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Для генерирования антител мыши могут быть иммунизированы конъюгированными с носителем пептидами, полученными из последовательности антигена, то есть последовательности, против которой должны быть направлены антитела обогащенного препарата рекомбинантно экспрессированного антигена или его фрагментов и/или клеток, экспрессирующих антиген, как описано. Альтернативно, мыши могут быть иммунизированы с помощью ДНК, кодирующей антиген или его фрагменты. В том случае, если иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена не приводит к получению антител, мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими антиген, например клеточной линией, для стимулирования иммунных реакций.

Иммунный ответ можно контролировать в течение курса иммунизации с помощью образцов плазмы и сыворотки, получаемых из хвостовой вены или ретроорбитальным кровопусканием. Мыши с достаточным титром иммуноглобулина могут быть использованы для слияния. Мышей можно стимулировать внутрибрюшинно или внутривенно с помощью клеток, экспрессирующих антиген, за 3 дня до умервщления и удаления селезенки, чтобы увеличить процент гибридом, секретирующих специфические антитела.

Для генерирования гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, спленоциты и клетки лимфатических узлов могут быть выделены из иммунизированных мышей и слиты с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы затем могут быть скринированы для получения антигенспецифических антител. Затем индивидуальные лунки можно скринировать с помощью ИФА на предмет гибридом, секретирующих антитела. При анализе иммунофлуоресценции и FACS с использованием клеток, экспрессирующих антиген, можно идентифицировать антитела со специфичностью к антигену. Гибридомы, секретирующие антитела, могут быть реплицированы, снова скринированы и, если они еще положительны для моноклональных антител, то могут быть субклонированы путем лимитирующего разведения. Затем стабильные субклоны можно культивировать in vitro для получения антител в тканевой культуральной среде для характеризации.

Антитела также могут быть получены в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, комбинацию методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции генов, которые хорошо известны в данной области (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Например, в одном воплощении представляющий интерес ген (гены), например гены антитела, можно лигировать в экспрессирующий вектор, такой как эукариотическая экспрессирующая плазмида, такая как используемая системой экспрессии гена GS, раскрытая в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338 841 или другие системы экспрессии, хорошо известные в данной области. Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела можно вводить в эукариотические клетки-хозяева, такие как клетки СНО, NS/0 клетки, клетки HEK293T или клетки HEK293 или, в ином случае, в другие эукариотические клетки, такие как клетки, полученные из растений, грибов или дрожжей. Способ, используемый для введения этих генов, может быть способом, описанным в данной области, таким как электропорация, использование липофектина, липофектамина или другие. После введения этих генов антител в клетки-хозяева, клетки, экспрессирующие антитело, могут быть идентифицированы и отобраны. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые затем могут быть амплифицированы по их уровню экспрессии и наработаны для получения антител. Рекомбинантные антитела можно выделить и очистить из этих культуральных надосадочных жидкостей и/или клеток.

В ином случае, клонированные гены антитела могут быть экспрессированы в других экспрессирующих системах, включая прокариотические клетки, такие как микроорганизмы, например E.coli. Кроме того, антитела могут быть продуцированы в трансгенных животных, не относящихся к человеку, как например в молоке овец и кроликов или в яйцах кур или в трансгенных растениях; См., например, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; and Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Химеризация

Иммуногенность мышиных антител у человека может быть уменьшена или полностью исключена, если соответствующие антитела подвергаются химеризации или гуманизации. Химерные антитела представляют собой антитела, различные части которых получены из разных видов животных, таких как те, которые имеют вариабельную область, полученную из мышиного антитела, и константные области иммуноглобулина человека. Химеризация антител достигается путем соединения вариабельных областей тяжелой и легкой цепи мышиного антитела с константной областью тяжелой и легкой цепи человека (например, как описано Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). В предпочтительном воплощении химерные антитела образуются путем соединения константной области легкой цепи каппа человека с вариабельной областью легкой цепи мыши. В также предпочтительном воплощении химерные антитела могут быть получены путем соединения константной области цепи легкой цепи лямбда человека с вариабельной областью легкой цепи мыши. Предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgG1, IgG3 и IgG4. Другими предпочтительными константными областями тяжелой цепи для получения химерных антител являются IgG2, IgA, IgD и IgM.

Гуманизация

Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести областях, определяющих комплементарность, тяжелой и легкой цепей (CDR). По этой причине аминокислотные последовательности внутри CDR более разнообразны между индивидуальными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических встречающихся в природе антител, путем конструирования экспрессирующих векторов, которые включают CDR-последовательности из специфического встречающегося в природе антитела, привитого на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; и Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, которые включают зародышевые последовательности генов антител. Эти зародышевые последовательности будут отличаться от последовательностей генов зрелого антитела, поскольку они не будут включать полностью собранные вариабельные гены, которые образуются путем соединения V(D)J во время созревания В-клеток. Последовательности зародышевых генов также будут отличаться от последовательностей антител с высокой аффинностью к вторичному репертуару при индивидуальном равномерном распределении по вариабельной области.

Способность антител связывать антиген может быть определена с использованием стандартных анализов связывания (например, тИФА, Вестерн-блот, иммунофлуоресценция и проточный цитометрический анализ).

Для очистки антител выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых вращающихся колбах для очистки моноклональных антител. В ином случае, антитела могут быть получены в биореакторах на основе диализа. Надосадочные жидкости могут быть отфильтрованы и, при необходимости, сконцентрированы перед аффинной хроматографией на сефарозе с протеином G или на сефарозе с протеином А. Элюированный IgG можно проверить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для предмет чистоты. Буферный раствор можно заменить на PBS, и концентрацию можно определить с помощью OD280 с использованием коэффициента поглощения 1,43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить при -80°С.

Для того, чтобы определить, могут ли выбранные моноклональные антитела связываться с уникальными эпитопами, можно использовать сайт-направленный или мультисайт-направленный мутагенез.

Для определения изотипа антител может быть проведен изотипный тИФА с различными коммерческими наборами (например, Zymed, Roche Diagnostics). Лунки микропланшетов могут быть покрыты Ig к мышиному белку. После блокировки планшеты реагируют с моноклональными антителами или очищенными изотипическими контролями при температуре окружающей среды в течение двух часов. Затем содержимое лунок может реагировать с IgG1, IgG2a, IgG2b или IgG3, IgA или с мышиными IgM-специфическими конъюгированными с пероксидазой пробами. После промывки планшеты могут быть проявлены с субстратом ABTS (1 мг/мл) и проанализированы при OD 405-650. В качестве альтернативы, может быть использован набор изотипирования мышиных моноклональных антител к мыши IsoStrip (Roche, кат.№1493027), как описано изготовителем.

Чтобы продемонстрировать присутствие антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими антиген, можно использовать проточную цитометрию. Клеточные линии, экспрессирующие естественно или после трансфекции антиген, и отрицательные контроли, лишенные экспрессии антигена (выращенные в стандартных ростовых условиях), могут смешиваться с различными концентрациями моноклональных антител в надосадочных жидкостях гибридомы или в PBS, содержащем 1% FBS, и их можно инкубировать при 4°С в течение 30 минут. После промывания APC- или Alexa647-меченное антитело к IgG может связываться с антигенсвязанным моноклональным антителом в тех же условиях, что и окрашивание первичных антител. Образцы могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии с помощью прибора FACS с использованием свойств света и бокового рассеяния с пропусканием одиночных живых клеток. Чтобы отличить антигенспецифические моноклональные антитела от неспецифических связующих компонентов при единичном измерении, можно использовать способ котрансфекции. Клетки, транзиторно трансфецированные плазмидами, кодирующими антиген и флуоресцентный маркер, могут быть окрашены, как описано выше. Трансфецированные клетки могут быть обнаружены в другом канале флуоресценции, чем клетки, окрашенные антителами. Поскольку большинство трансфецированных клеток экспрессируют оба трансгена, антигенспецифические моноклональные антитела связываются преимущественно с клетками, экспрессирующими маркер флуоресценции, тогда как неспецифические антитела связываются в сопоставимом соотношении с нетрансфецированными клетками. Альтернативный анализ с использованием флуоресцентной микроскопии может быть использован в дополнение или вместо анализа проточной цитометрии. Клетки могут быть окрашены точно так, как описано выше, и исследованы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Чтобы продемонстрировать присутствие антител в сыворотке иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими антиген, можно использовать анализ иммунофлуоресцентной микроскопии. Например, клеточные линии, экспрессирующие либо спонтанно, либо после трансфекции антиген и отрицательные контрольные образцы, лишенные экспрессии антигена, выращивают на предметных стеклах с камерами при стандартных условиях роста в среде DMEM/F12, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), 2 мМ L-глутамином, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Затем клетки могут быть зафиксированы метанолом или параформальдегидом или оставлены необработанными. После этого клетки могут вступать в реакцию с моноклональными антителами против антигена в течение 30 мин. при 25°С. После промывания клетки могут вступать в реакцию с Alexa555-меченным антителом против мышиного IgG (Molecular Probes) в тех же условиях. Затем клетки могут быть исследованы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих антиген, и соответствующие отрицательные контрольные образцы, могут быть получены и подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS). После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют и исследуют моноклональные антитела, подлежащие тестированию. Связывание IgG может детектироваться с использованием пероксидазы IgG против мышиного белка, и проявлено с помощью ECL-субстрата.

Антитела могут быть дополнительно протестированы на реакционную способность с антигеном методом иммуногистохимии, хорошо известным специалисту, например, с использованием криосрезов, фиксированных параформальдегидом или ацетоном, или залитых парафином срезов, фиксированных параформальдегидом, из образцов неопухолевой ткани или опухолевой ткани, полученных от пациентов во время обычной хирургической процедуры, или от мышей, несущих ксенотрансформированные опухоли, инокулированные клеточными линиями, экспрессирующими антиген спонтанно или после трансфекции. Для иммуноокрашивания антитела, реакционноспособные к антигену, могут быть затем инкубированы с козьими антимышиными антителами или козьими антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (DAKO), в соответствии с инструкциями поставщика.

Конъюгаты антител, которые связываются с CLDN18.2, также могут быть протестированы в модели in vivo (например, у иммунодефицитных мышей, несущих ксенотрансплантированные опухоли, инокулированные клеточными линиями, экспрессирующими CLDN18.2, например, DAN-G, SNU-16 или KATO-III, или после трансфекции, например, HEK293), чтобы определить их эффективность в контроле роста экспрессирующих CLDN18.2 опухолевых клеток.

Конъюгаты антител можно вводить безопухолевым мышам с последующей инъекцией опухолевых клеток для измерения влияния конъюгатов антител на предотвращение образования опухолей или связанных с опухолями симптомов. Конъюгаты антител можно вводить мышам, несущим опухоль, для определения терапевтической эффективности соответствующих конъюгатов антител для уменьшения роста опухоли, метастазов или связанных с опухолями симптомов. Применение конъюгата антитела можно комбинировать с применением других веществ в качестве цистостатических препаратов, ингибиторов фактора роста, блокаторов клеточного цикла, ингибиторов ангиогенеза или других антител, для определения синергетической эффективности и потенциальной токсичности комбинаций. Для анализа токсических побочных эффектов, опосредованных конъюгатами антител, животных можно инокулировать конъюгатами антител или контрольными реагентами и тщательно исследовать наличие симптомов, которые могут быть связаны с терапией конъюгатом антител против CLDN18.2. Возможные побочные эффекты применения in vivo конъюгатов антител CLDN18.2, в частности, включают токсичность в CLDN18.2-экспрессирующей ткани, включая желудок.

Картирование эпитопов, распознаваемых антителами, может быть выполнено, как подробно описано в "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 и в "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

Соединения и агенты, описанные в данном документе, могут вводиться в форме любой подходящей фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции предпочтительно являются стерильными и содержат эффективное количество антительных конъюгатов, описанных в данном документе, и необязательно дополнительных агентов, как обсуждалось в данном документе, для получения искомой реакции или искомого эффекта.

Фармацевтические композиции обычно предоставляются в единой лекарственной форме и могут быть приготовлены известным образом. Фармацевтическая композиция может быть, например, представлена в форме раствора или суспензии.

Фармацевтическая композиция может содержать соли, буферные вещества, консерванты, носители, разбавители и/или вспомогательные вещества, каждое из которых предпочтительно является фармацевтически приемлемым. Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичности материала, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции.

Соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми, могут использоваться для получения фармацевтически приемлемых солей и включены в изобретение. Фармацевтически приемлемые соли этого типа включают неограниченно такие, которые получены из следующих кислот: соляной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, муравьиной, малоновой, янтарной кислот и тому подобных. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть получены в виде солей щелочных металлов или солей щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, соли калия или соли кальция.

Подходящие буферные вещества для применения в фармацевтической композиции включают уксусную кислоту в соли, лимонную кислоту в соли, борную кислоту в соли и фосфорную кислоту в соли.

Подходящие консерванты для использования в фармацевтической композиции включают хлорид бензалкония, хлорбутанол, парабен и тимеросал.

Состав для инъекций может содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, такое как лактат Рингера.

Термин «носитель» относится к органическому или неорганическому компоненту природного или синтетического характера, в котором активный компонент комбинирован для облегчения, усиления или возможности применения. Согласно изобретению термин «носитель» также включает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения пациенту.

Возможными веществами-носителями для парентерального введения являются, например, стерильная вода, раствор Рингера, Рингер-лактат, стерильный раствор хлорида натрия, полиалкиленгликоли, гидрированные нафталины и, в частности, биосовместимые лактидные полимеры, лактид-гликолидные сополимеры или полиоксиэтилен/полиоксипропиленовые сополимеры.

Используемый в данном документе термин «вспомогательное вещество» предназначен для обозначения всех веществ, которые могут присутствовать в фармацевтической композиции и которые не являются активными ингредиентами, такие как, например, носители, связующие, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные агенты, консерванты, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.

Агенты и композиции, описанные в данном документе, могут вводиться любым обычным способом, таким как парентеральное введение, в том числе путем инъекции или инфузии. Введение предпочтительно является парентеральным, например, внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутрикожным или внутримышечным.

Композиции, подходящие для парентерального введения, обычно содержат стерильный водный или неводный препарат активного соединения, которое предпочтительно является изотоническим по отношению к крови реципиента. Примерами совместимых носителей и растворителей являются раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, обычно в качестве раствора или суспензионной среды используются стерильные жирные масла.

Агенты и композиции, описанные в данном документе, вводят в эффективных количествах. «Эффективное количество» относится к количеству, которое достигает искомой реакции или искомого эффекта индивидуально или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания или конкретного состояния искомая реакция предпочтительно относится к ингибированию течения заболевания. Это включает замедление прогресса заболевания и, в частности, прекращение или отмену прогресса заболевания. Желаемая реакция при лечении заболевания или состояния может также представлять собой задержку начала или предотвращения начала заболевания или указанного состояния.

Эффективное количество агента или композиции, описанных в данном документе, будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, типа сопутствующей терапии (если имеется), конкретного пути введения и аналогичных факторов. Соответственно, дозы, вводимые агентами, описанными в данном документе, могут зависеть от различных таких параметров. В случае если реакция у пациента недостаточна при применении начальной дозы, могут применяться более высокие дозы (или эффективные более высокие дозы, достигаемые другим, более локализованным способом введения).

Агенты и композиции, представленные в данном документе, могут использоваться индивидуально или в комбинации с традиционными терапевтическими схемами, такими как операция, облучение, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологичная, изогенная, аллогенная или неродственная).

Лечение злокачественного новообразования представляет собой область, где комбинированные стратегии особенно желательны, поскольку часто комбинированное действие двух, трех, четырех или даже более противоопухолевых лекарственных/терапевтических средств создает синергические эффекты, которые значительно сильнее, чем воздействие монотерапевтического подхода. Таким образом, в другом воплощении настоящего изобретения лечение злокачественного новообразования может эффективно сочетаться с различными другими лекарственными средствами. К ним относятся, например, комбинации с обычными противоопухолевыми терапиями, стратегиями множественных эпитопов, дополнительной иммунотерапией и подходами к лечению, нацеленными на ангиогенез или апоптоз (обзор см., например, Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743). Последовательное введение различных агентов может ингибировать рост опухолевых клеток в разных контрольных точках, тогда как другие агенты могут, например, ингибировать неоангиогенез, выживаемость злокачественных клеток или метастазов, потенциально превращая злокачественное новообразование в хроническое заболевание.

Агенты и композиции, описанные в данном документе, могут вводиться пациентам, например in vivo, для лечения или предотвращения различных нарушений, таких как описанные в данном документе. Предпочтительные пациенты включают пациентов, страдающих расстройствами, которые могут быть исправлены или улучшены путем введения агентов и композиций, описанных в данном документе. Это включает нарушения, связанные с клетками, характеризующимися измененной моделью экспрессии CLDN18.2.

Например, в одном воплощении агенты и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы для лечения пациента с онкологическим заболеванием, например онкологическим заболеванием, таким как описанное в данном документе, характеризующегося наличием клеток злокачественных опухолей, экспрессирующих CLDN18.2.

Фармацевтические композиции и способы лечения, описанные в соответствии с изобретением, также могут быть использованы для иммунизации или вакцинации для предотвращения описанного в данном документе заболевания.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не могут быть истолкованы как ограничивающие объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Эндоцитоз

Эндоцитоз CLDN18.2-связанного IMAB362 определяли с использованием анализа эндоцитоза на основе цитотоксичности, который основывается на совместной интернализации связанного с мишенью антитела и конъюгированного с сапорином IgG против человеческого или мышиного Fab-фрагмента (Fab-ZAP человеческий, Advanced Targeting Systems, IT-51, лот: # 93-23; Мышиный Fab-ZAP, Advanced Targeting Systems, IT-48, лот: №93-21). Сапорин представляет собой белок, инактивирующий рибосомы, который при интернализации ингибирует биосинтез белка и, следовательно, приводит к клеточной смерти. Чтобы гарантировать оптимальный клеточный лизис, антитело Fab-ZAP применяли, по меньшей мере, в 6-кратной молярности по сравнению с целевым антителом.

Стабильно трансфецированные клетки HEK293~CLDN18.2 собирали с помощью 0,05% трипсина/EDTA (Gibco, 25300-054) и 2,5 × 10³ клеток/на лунку высевали в 50 мкл ростовой среды в 96-луночном культуральном планшете. Через 24 ч к клеткам добавляли 25 мкл Fab-ZAP и 25 мкл анти-CLDN18.2 mAB или изотипического контрольного антитела, разведенного в культуральной среде (таблица 1). Клетки культивировали еще 72 часа.

Таблица 1. Концентрация анти-CLDN18.2 mAB и Fab-ZAP для анализа эндоцитоза

Разбавление Конечная концентрация [нг/мл] Анти-CLDN18.2 Fab-ZAP D1 187,5 825 D2 75,0 825 D3 30,0 825 D4 12,0 825 D5 4,800 825 D6 1,920 825 D7 0,768 825 D8 0,307 825 D9 0,123 825

Молекулярная масса: 150 кДа для IMAB362 и 110 кДа для FabZAP.

Жизнеспособность клеток анализировали, как описано в 6. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные без антител в присутствии Fab-ZAP.

2. Картирование эпитопов

Антигенный эпитоп, ответственный за специфичность CLDN18.2, анализировали с помощью проточной цитометрии (см. 5) на клетках HEK293T, транзиторно сверхэкспрессирующих мутанты CLDN18.2. Всего получили с помощью ПЦР восемь мутантов CLDN18.2 с одиночными аминокислотными заменами в первом внеклеточном домене. Следовательно, аминокислоты CLDN18.2 были заменены аминокислотами гомологичного белка CLDN18.1 в соответствующих положениях. Клетки HEK293T трансфецировали плазмидами, кодирующими специфический мутант CLDN18.2 и EGFP в качестве репортерного гена. Очищенные антитела тестировали в концентрации 5 мкг/мл, тогда как антитела, полученные из надосадочной жидкости гибридомы, до испытания разбавляли 1:4. Чтобы определить, оказывает ли влияние на связывание антитела конкретная аминокислотная замена, среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), измеренную в популяции трансфецированных (EGFP-положительных) клеток, сравнивали между мутантом, демонстрирующим наивысшее значение MFI, и мутантом, представляющим интерес. Если MFI мутанта, представляющего интерес, ниже 50%, то аминокислотный остаток характеризовали как существенный для связывания антитела и специфичности CLDN18.2.

3. Конъюгаты лекарственного средства и антитела

Конъюгации DM4 и vcMMAE с моноклональным антителом IMAB362 (партия №p412118) и аналитическую характеризацию проводили в Piramal Healthcare (Гранджемут, Великобритания). Методы кратко описаны в следующем разделе:

DM4 присоединяли к IMAB362 через SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) бутират). Реагент SPDB представляет собой реакционноспособный по аминогруппе и сульфгидрильной группе гетеробифункциональный белковый сшивающий агент, который взаимодействует через эфир N-гидроксисукцинимида (NHS) с первичными аминами (как обнаружено в лизиновых боковых цепях или N-конце белка) антитела и через пиридинилдисульфидную группу с сульгидрильной группой DM4 с получением обратимой дисульфидной связи (фигура 1). Вкратце, для конъюгации DM4 IMAB362 подвергали диафильтрации в буфер PBS (pH 7,2) с использованием ультрацентрифужного фильтра и связывали с SPDB в молярном соотношении 1:6 (IMAB362:SPDB) в течение 1 часа при комнатной температуре. Модифицированное антитело диализовали против 35 мМ цитратного буфера (рН 5,5) и определяли отношение линкера к антителу. DM4 конъюгировали с IMAB362-SPDB при молярном отношении 1:6 (IMAB362-SPDB:DM4) в течение 19 ч при 2-8°С. Конъюгированное антитело приводили к условиям буфера для хранения (20 мМ His, 85 мг/мл сахарозы, рН 5,8) и хранили при -80°С. Отношение антител к лекарственным средствам анализировали с помощью УФ-спектрометрии, содержания мономера - с помощью SEC-HPLC, а содержания свободного лекарственного средства - с помощью RP-HPLC.

vcMMAE конденсировали с тиолированным IMAB362. Таким образом, IMAB362 изначально тиолировали гетеробифункциональным линкером 2-IT (2-иминотиолан), который реагирует со свободными аминами лизиновых остатков. Затем vcMMAE, содержащий расщепляемый катепсином пептидный линкер Val-Cit (vc), конъюгировали через валин с сульфгидрильной группой тиолированного антитела (фигура 1). Вкратце, IMAB362 подвергали диафильтрации в буфер PBS (pH 7,2) с использованием ультрацентрового фильтра и инкубировали с 2-IT при молярном отношении 1:20 (IMAB362: 2-IT) в течение 2 часов при комнатной температуре. Модифицированное антитело диализовали в 35 мМ цитратный буфер (рН 5,5) и определяли отношение линкера к антителу. После этого vcMMAE конъюгировали с тиолированным IMAB362 при молярном отношении 1: 6 (IMAB362-SH: vcMMAE) путем инкубации в течение 20 ч при 2-8°С. Конъюгированные антитела диализовали в буфер для хранения (20 мМ His, 85 мг/мл сахарозы, рН 5,8) и хранили при -80°С. Отношение антител к лекарственным средствам анализировали с помощью УФ-спектрометрии, содержания мономера - с помощью SEC-HPLC, а содержания свободного лекарственного средства - с помощью RP-HPLC.

4. Клеточная культура

Клеточные линии культивировали в соответствии с инструкциями поставщиков и сводки данных по клеточным линиям Ganymed в среде, специфической для данного типа клеток, при 37°С в увлажненных инкубаторах в присутствии 5% или 7,5% СО₂ (Таблица 2). Клеточные культуральные среды и добавки получали из Invitrogen, Gibco и Sigma.

Таблица 2. Клеточные модельные системы

Клеточная линия Виды/ткань/заболевание Среда Инкубация HEK293~контроль Человеческая эмбриональная почка DMEM/F12 (10% FCS, 1% пен/стреп, 1,5 мг/мл генетицина) 7,5% CO₂, 37°C HEK293~CLDN18.2 Человеческая эмбриональная почка (стабильно трансфецированная человеческим CLDN18.2) DMEM/F12 (10% FCS, 1% пен/стреп, 1,5 мг/мл генетицина) 7,5% CO₂, 37°C HEK293~CLDN18.1 Человеческая эмбриональная почка (стабильно трансфецированные человеческим CLDN18.1) DMEM/F12 (10% FCS, 1% пен/стреп, 1,5 мг/мл генетицина) 7,5% CO₂, 37°C BxPC-3 Аденокарцинома поджелудочной железы человека RPMI (10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10% FCS) 5% CO₂, 37°C BxPC-3~CLDN18.2 Аденокарцинома поджелудочной железы человека (стабильно трансдуцированная человеческим CLDN18.2) RPMI (10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы, 1 × бикарбонат натрия, 10% FCS, 0,5 мкг/мл бластицидин) 5% CO₂, 37°C NCI-N87 карцинома желудка человека RPMI (10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10% FCS) 5% CO₂, 37°C NCI-N87~CLDN18.2 карцинома желудка человека (стабильно трансдуцированный человеческим CLDN18.2) RPMI (10 мМ HEPES+1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы, 10% FCS, 1,5 мкг/мл бластицидина) 5% CO₂, 37°C DAN-G 1C5F2 аденокарцинома поджелудочной железы человека RPMI (10% FCS, 1% пен/ стреп) 5% CO₂, 37°C NUGC-4 10cF7-5 sort 3a аденокарцинома желудка человека RPMI (10% FCS, 1% пен/ стреп) 5% CO₂, 37°C NUGC-4 10cE8 аденокарцинома желудка человека RPMI (10% FCS, 1% пен/ стреп) 5% CO₂, 37°C PA-1 (Luc) тератокарцинома яичника человека EMEM (1 мМ пируват натрия, 0,1 мМ NEAA, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 10% FCS) 5% CO₂, 37°C

5. Проточная цитометрия

Относительные аффинности связывания и специфичности голых анти-CLDN18.2 антителам и конъюгатов антитело-лекарственное средство определяли с помощью проточной цитометрии с использованием положительных и отрицательных по CLDN18.2 клеточных линий.

Клетки из экспоненциально растущей культуры собирали с помощью 0,05% трипсина/EDTA (Gibco, 25300-054) и подсчитывали с использованием счетной камеры Нойбауэра. Клетки центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин (468 мкг), надосадочную жидкость отбрасывали и клетки ресуспендировали в буфере FACS (PBS, содержащий 2% FCS (Gibco, 10270-106) для анализа антителами, конъюгированными с токсином, PBS, содержащий 2% FCS и 2 мМ EDTA для скрининга CLDN18.2-реактивных «голых» антител) в количестве 2 × 10⁶ клеток/мл. 100 мкл клеточной суспензии на лунку (соответствует 2 × 10⁵ клеток/лунку) переносили в круглодонный 96-луночный микропланшет.После центрифугирования в течение 1 мин. при 1500 об/мин надосадочную жидкость отбрасывали и клетки ресуспендировали в буфере FACS, содержащем токсин-конъюгированные или «голые» антитела в соответствующих концентрациях (до 20 мкг/мл для измерения относительной аффинности или 50 мкг/мл для контроля экспрессии) и инкубировали в течение 30-45 мин. при 4°С (таблица 3). Клетки центрифугировали в течение 1 мин. при 1500 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали. После того, как клетки трижды промывали FACS-буфером, их ресуспендировали в FACS-буфере, содержащем APC-конъюгированные античеловеческие IgG (Jackson Immuno Research, 109-136-170) или APC-конъюгированные козьи антимышиные IgG (Jackson Immuno Research, 115-136-146) или Protein L-FITC (1 мкг/мл, анализ chim mAB294) и инкубировали в течение 30 мин. при 4°C (таблица 3). После инкубации к каждому образцу добавляли 100 мкл FACS-буфера, клетки центрифугировали в течение 1 мин. при 1500 об/мин и надосадочную жидкость отбрасывали. Стадию промывки буфером FACS повторяли дважды. Наконец, клетки ресуспендировали в 100 мкл FACS-буфера, и связывание определяли с использованием Bioanalyzer BD FACS Array Bioanalyzer.

Следует отметить, что токсин-конъюгированные и «голые» антитела применяли в равных концентрациях. Различиями между молекулярной массой антител пренебрегали.

Таблица 3. Экспериментальные данные проточной цитометрии

Анализ: Первичное антитело Вторичное антитело Сравнение IMAB362 с IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE - 100 мкл
- 0,1, 0,3, 0,9, 3,1, 10,9, 38,1 133,3, 466,5, 1632,7, 5714,3, 20000 нг/мл
- 45 мин. 4°C - 50 мкл
- разведение 1: 200
- 30 мин Сравнение IMAB362 с мышиными или химерными CLDN18.2 реактивными антителами - 50 мкл
- 19,5, 39,1, 78,1, 156,3, 312,6, 625, 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 нг/мл
- 30 мин. 4°C - 30 мкл
- разведение 1: 100
- 30 мин Сравнение IMAB362 с chim mAB294 - 50 мкл
- 19,5, 39,1, 78,1, 156,3, 312,6, 625, 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 нг/мл
- 30 мин. 4°C - 50 мкл
- 1 мкг/мл
- 30 мин

6. Анализ жизнеспособности

Эффект IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в отношении жизнеспособности клеток определяли с использованием колориметрического анализа, который обнаруживает клеточные метаболические активности. Анализ основан на способности метаболически активных клеток восстанавливать желтый XTT (2,3-Бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилид) до окрашенного в оранжевый цвет формазанового соединения, которое может быть обнаружено спектрофотометрией. Интенсивность красителя пропорциональна количеству живых клеток.

Клетки собирали с использованием 0,05% трипсина/EDTA (Gibco, 25300-054), ресуспендировали в культуральной среде (таблица 2), и 50 мкл суспензии клеток с соответствующим количеством клеток высевали в лунку в 96-луночные культуральные планшеты (таблица 4). Через 24 часа добавляли токсин-конъюгированный IMAB362 или контрольные антитела, разбавленные в 50 мкл среде в соответствующих концентрациях, и клетки культивировали еще 72 часа.

Таблица 4. Обзор клеточных линий, используемых в анализах на жизнеспособность

Клеточная линия Количество клеток
на 96 лунок NCI-N87~CLDN18.2 6000 NCI-N87 6000 NUGC-4 10cE8 3000 NUGC-4 10cF7-5 sort3a 3000 BxPC-3~CLDN18.2 3000 HEK293~CLDN18.2 2000 HEK293~CLDN18.1 2000 HEK293(CLDN6) 2000

Жизнеспособность клеток анализировали с использованием набора для анализа клеточной пролиферации AppliChem II (AppliChem, A8088, 1000) в соответствии с инструкциями производителя. Через 3-5 часов инкубации с реагентом XTT измеряли оптическую плотность при 480 нм (эталон 630 нм) с использованием спектрофотометра (Tecan). Снижение жизнеспособности рассчитывали по следующему уравнению:

Reduction of viability [%]: Снижение жизнеспособности [%]

blank: контроль среды

control: клетки без антител

sample: клетки с антителом

Значения EC₅₀ определяли с помощью GraphPad Prism 6 с использованием нелинейной регрессии.

7. Анализ «эффекта свидетеля»

Активность «эффекта свидетеля» токсин-конъюгированных антител IMAB362 на клетках без мишеней анализировали in vitro путем совместного культивирования CLDN18.2-отрицательной, экспрессирующей люциферазу клеточной линии PA-1 (Luc) в присутствие или отсутствие CLDN18.2-положительной клеточной линии NUGC-4 10cE8. Таким образом, 1,5 × 10³ PA-1 (Luc) клеток на лунку высевали для отдельной культуры или вместе с 1,5 × 10³ NUGC-4 10cE8 клетками на лунку для совместной культивирования в среде RPMI, дополненной 10% FCS и 1% пен/стреп.Через 24 ч добавляли IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE или неконъюгированный IMAB362 в качестве отрицательного контроля и клетки культивировали в течение еще 72 часов. Жизнеспособность клеток анализировали, как описано в 6. Лизис клеток без мишени определяли путем измерения биолюминесценции люциферазы, экспрессирующей клетки PA-1 (Luc). Таким образом, добавляли 50 мкл смеси люциферина (1,92 мг/мл D-люциферина (Sigma, 50227) и 160 мМ HEPES в ddH₂O) на лунку. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 90 мин. и измеряли биолюминесценцию с использованием люминометра (Infinite M200, TECAN). Результаты выражали как интегрированные цифровые относительные световые единицы (RLU). Снижение жизнеспособности рассчитывали, как описано в 6.

8. Эксперименты на животных

Все исследования ксенотрансплантации проводили в соответствии с национальными правилами регуляции и этическими принципами экспериментальных исследований на животных. Все животные поддерживались в особых условиях без патогенов в отдельных вентилируемых клетках и при 12-часовом искусственном цикле день-ночь. Корм и воду предоставляли ad libitium. Перед началом исследования мышам давали акклиматизироваться в течение как минимум 6 дней.

8.1. Исследование максимальной переносимой дозы (МПД)

Опухоли ксенотрансплантата инокулировали подкожной инъекцией 8,5 × 10⁶ BxPC-3~CLDN18.2 человеческих опухолевых клеток поджелудочной железы в 200 мкл PBS в бок самки мыши Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu. Для определения МПД и эффективности конъюгатов антител против CLDN18.2 и лекарственных средств у мышей, несущих опухоль, получали разные дозы IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE. Максимально применимая доза была ограничена концентрацией антител и объемом инъекции, рекомендованной GV-SOLAS для внутривенной инъекции мышам (~200 мкл). Оба антитела применяли в максимальной концентрации в виде однократной и повторной дозы (например, 15 и 16 мг/кг соответственно), а также половину этой концентрации (например, 7,5 и 8 мг/кг соответственно) или пустой контроль носителя (размер группы: n=5). Антитела вводили внутривенно на 14-й день после ксенотрансплантации и для повторной дозы дополнительно на 21-й день после ксенотрансплантации. Масса тела, здоровье животных, поведение и размер опухоли контролировали два раза в неделю с помощью циркуля, а объемы опухоли рассчитывали по следующей формуле: [длина х ширина х (ширина/2)]. Всех животных рассекали, когда первая опухоль группы носителя достигла максимума 1400 мм³ или когда опухоль становилась изъязвленной (49-й день после ксенотрансплантации для IMAB362-DM4, 37-й день после ксенотрансплантации для IMAB362-vcMMAE). Образцы крови для клинического анализа собирали под общей анестезией, инициированной с помощью 250 мкл раствора смеси, состоящей из 1,25 мл кетамина, 1 мл ксилазина (2%) и 7,75 мл H₂O. Затем мышей перфузировали с помощью PBS с последующей перфузией 4% формалина под общей анестезией. Отобранные органы и ткани (желудок, пищевод, мозг, сердце, почка, печень, легкие, поджелудочная железа, селезенка, двенадцатиперстная кишка, подвздошная кишка, ободочная кишка, матка и яичники) рассекали и фиксировали в 4% формалине, сохраняли при 4°С и, наконец, заливали парафином. Трехмикронные срезы ткани вырезали из каждого образца FFPE (фиксированного формалином, залитого парафином) и монтировали на адгезивные стекла (SuperFrost Ultra Plus, Thermo Fisher Scientific). После застывания в течение 60 мин. при 58°С срезы ткани FFPE депарафинизировали с использованием ксилола и регидратировали с использованием разных концентраций этанола (2x 100%, 2x 96%, 2x 70% этанола в течение 3 мин. каждый раз). Ядра окрашивали в течение 5 мин. при комнатной температуре с помощью гематоксилина Майера, с последующей промывкой под водопроводной H₂O. Затем цитоплазму докрашивали водным 0,5% эозином в течение 2 мин. при комнатной температуре. После обезвоживания с использованием различных концентраций этанола и срезы ксилола монтировали с использованием неводной среды для заливки X-TRA Kit.

8.2. Клиническая биохимия

Для проверки возможной токсичности в отношении органов соответствующие маркеры токсичности для поджелудочной железы, нефронотоксичности и гепатотоксичности анализировали в образцах сыворотки.

Уровни аланинаминотрансферазы/глутамино-пировиноградной трансаминазы (GPT), аспартатаминотрансферазы/глутаминовой оксалоуксусной трансаминазы (GOT), гамма-глутамилтрансферазы (гамма-GT), щелочной фосфатазы (AP), глутаматдегидрогеназы (GLDH), креатинина, креатининкиназы (CK), мочевины, холинэстеразы, билирубина, липазы, альфа-амилазы, лактатдегидрогеназы (LDH), альбумина и суммарного белка определяли в Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg Universität (Майнц, Германия). Образцы сыворотки получали из крови, полученной после окончательного кровотечения. Кровь собирали с помощью ретробульбарной венопункции после того, как мышей анестезировали кетамином/ксилазином.

8.3. Исследования эффективности

Для создания ксенотрансплантатов опухоли человека соответствующее количество клеток суспендировали в объеме 200 мкл PBS и вводили подкожно в бок самки мыши Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu. Мышей, несущих опухоль, обрабатывали с помощью одной внутривенной инъекции IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE в дозах, не превышающих МПД. Контроль «голого» антитела вводили дважды в неделю путем чередования инъекций IV/ip~8 мг/кг IMAB362. В ранних исследованиях обработок, их начинали через 3 дня после ксенотрансплантации. В современных исследованиях обработок опухоли выращивали до объема от 50 до 200 мм³, и перед обработкой мышей с гомогенными опухолями среднего объема перераспределяли по группам контроля и антитела. Массу тела, здоровье животных, поведение и размер опухоли контролировали два раза в неделю с помощью циркуля. Объемы опухолей рассчитывали по следующей формуле: [длина х ширина х (ширина/2)]. Критерием прерывания был размер опухоли >16 мм по длине или ширине или с расчетным объемом>1400 мм³. Другие критерии прерывания представляли собой изъязвление опухолей или когда животное потеряло более 10% массы тела. В случае полного ингибирования роста опухоли мышей наблюдали в течение 120 дней после обработки. Персистирующие опухоли готовили и фиксировали в 4% формалине для последующих исследований IHC.

9. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC)

Антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) определяли путем измерения содержания внутриклеточного ATP в нелизированных клетках после добавления РВМС человека к клеткам-мишеням в присутствии конъюгатов токсина IMAB362. Для количественной оценки ATP использовали биолюминесценцию, генерированную люциферазой.

Клетки-мишени NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151#10 высевали в определенном количестве клеток (8 × 10⁶ клеток) за два дня до анализа для получения воспроизводимой конфлюэнтности.

Клетки-мишени собирали с помощью 0,05% трипсина/EDTA (Gibco, 25300-054) и доводили до концентрации 1,6 × 10⁵ клеток/мл в ростовой среде, содержащей 20 мМ HEPES (Gibco, 15630-056). 8 × 10³ клеток на лунку высевали в белый 96-луночный PP-планшет и инкубировали в течение ~5 ч при 37°C и 5% CO₂.

РВМС готовили из свежих лейкоцитарных пленок, полученных от здоровых доноров. Около 20-25 мл крови разводили (1:2) PBS в 3 пробирках Falcon и тщательно наслаивали на 15 мл Ficol-Paque Plus (GE Healthcare, 17144003) в четырех пробирках Falcon объемом 50 мл. Градиенты центрифугировали (25 мин, 700 x g, без перерывов). После центрифугирования РВМС собирали из интерфазы, промывали в 50 мл PBS/2 мМ EDTA, центрифугировали (5 мин, 468 х g), снова ресуспендировали в 50 мл PBS/2 мМ EDTA и снова центрифугировали (10 мин, 208 x g) для удаления тромбоцитов. Осадки ресуспендировали в 50 мл PBS/2 мМ EDTA и подсчитывали клетки. Затем РВМС центрифугировали (5 мин, 468 x g), ресуспендировали в культуральной среде X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q), содержащей 5% сыворотки человека и культивировали в течение 1,5 ч при 37°С, 5% СО₂. PBMC собирали, центрифугировали (5 мин, 468 × g) и ресуспендировали в культуральной среде X-Vivo-15 (Lonza, BE04-418Q), регулируя концентрацию клеток (для отношения E:T от 40:1) до 1,28 × 10⁷ клеток/мл. IMAB362-DM4, IMAB362-vcMMAE и IMAB362 разводили серийно (4,5-кратные шаги разведения) 11 раз, с получением в результате концентрации от 160 мкг/мл до 0,05 нг/мл (конечная концентрация от 40 мкг/мл до 0,01 нг/мл). 25 мкл каждого разведения добавляли к клеткам-мишеням и для каждого условия использовали четыре повтора. PBS без антител добавляли в среду и в лунки контроля полного лизиса. Затем в каждую лунку добавляли 25 мкл готовых РВМС (3,2 × 10⁵ клеток) для достижения соотношения E:T 40:1 и планшеты инкубировали в течение 15 ч+1 ч при 37°С, 5% СО₂. После инкубации в течение ночи 10 мкл 8% раствора Triton X-100/PBS добавляли в лунки контроля максимального лизиса и 10 мкл PBS в другие лунки. Наконец, добавляли 50 мкл свежеприготовленного стокового раствора люциферина (160 мМ HEPES, 1x PBS, 3,84 мг/мл D-Luciferin (Sigma Aldrich, 50227)) в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 90 мин. при комнатной температуре в темноте. Биолюминесценцию измеряли с использованием люминометра (Infinite M200, TECAN). Результаты выражали в виде интегрированных цифровых относительных световых единиц (RLU).

Специфичный лизис рассчитывали как:

specific lysis [%] - специфический лизис [%]

sample - образец

total lysis - общий лизис

Max viable cells - макс. жизнеспособных клеток

(макс. жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител; общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Triton X-100 в PBS, без антител)

Все данные ADCC обрабатывали с помощью GraphPad Prism 6 с помощью функции «log(agonist) vs response - find EC anything». Максимальный лизис определяли как диапазон (разность сверху донизу) кривой доза-ответ, но максимально 100%.

10. Комплементзависимая цитотоксичность (CDC)

Комплементзависимую цитотоксичность (CDC) определяли путем измерения содержания внутриклеточного ATP в нелизированных клетках после добавления компонента человеческого комплемента к клеткам-мишеням в присутствии токсин-конъюгированных IMAB362. В качестве показания измеряли ATP-зависимую биолюминесценцию, генерируемую люциферазой.

NUGC-4 10cF7_5 sort3ap3151#10 или KATO-III FGF-BP#12 adM p3151#25 клеток-мишеней высевали в определенном количестве клеток (8 × 10⁶ и 9 × 10⁶ клеток соответственно) за два дня до анализа для получения воспроизводимой конфлюэнтности.

Клетки-мишени собирали с помощью 0,05% трипсина/EDTA и доводили до концентрации 1,6 × 10⁵ клеток/мл в их соответствующей культуральной среде, содержащей 10% (об./об.) FCS. 8 × 10³ клеток высевали в белый 96-луночный планшет и инкубировали при 37°С и 5% СО₂. Через 24 часа добавляли 50 мкл антител, серийно разбавленных в аналитической среде (60% RPMI, содержащей 20 мМ HEPES, 40% человеческой сыворотки, объединенной от нескольких здоровых доноров) (конечная концентрация от 80 до 78,13 нг/мл), и клетки инкубировали в течение 80 мин. при 37°С и 5% СО₂. Затем к контролям общего лизиса добавляли 10 мкл 8% (об./об.) Triton X-100 в PBS, тогда как 10 мкл PBS добавляли во все другие лунки (контроли макс. жизнеспособных клеток и фактические образцы). Реакцию люциферазы начинали с добавления 50 мкл смеси люциферина (3,84 мг/мл D-люциферина, 160 мМ HEPES в ddH₂O) на лунку. Планшет выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 90 мин и измеряли биолюминесценцию с использованием люминометра (Infinite M200, TECAN). Результаты выражали как интегрированные цифровые относительные световые единицы (RLU).

Специфичный лизис рассчитывали как:

specific lysis [%] - специфический лизис [%]

sample - образец

total lysis - общий лизис

max viable cells - макс. жизнеспособных клеток

(макс. жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител, общий лизис: 10 мкл 8% (об./об.) Triton X-100 в PBS, без антител)/

Все данные CDC обрабатывали с помощью GraphPad 6, с помощью функции «log(agonist) vs response - find EC anything». Максимальный лизис определяли как диапазон (разность сверху донизу) кривой отклика дозы, но максимально 100%.

Пример 2. скрининг эндоцитоза CLDN18.2-специфичных антител

Хотя при противоопухолевой терапии с «голыми» антителами интернализация антител, связанных с мишенью, может уменьшить количество антител, связанных с мембраной, доступных для основных механизмов действия, например ADCC и CDC, эндоцитоз является существенной особенностью для разработки конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC). Одним из важных свойств ADC является эндоцитоз комплекса мишень-ADC. Следовательно, скорость эндоцитоза «голого» антитела является одним из основных факторов разработки антител, конъюгированных с токсином.

Связывающие свойства, то есть относительная аффинность к CLDN18.2, перекрестная реактивность к CLDN18.1 и специфичность к CLDN18.2, опосредованная антигенным эпитопом, определяли для различных мышиных и химерных антител против CLDN18.2 с помощью анализа проточной цитометрии (таблица 5 и таблица 6). Антитела, демонстрирующие сильное связывание с CLDN18.2, отбирали для дальнейшего скрининга эндоцитоза.

Эффективность эндоцитоза различных CLDN18.2-специфичных и CLID18.2/CLDN18.1 реактивных антител тестировали in vitro путем совместной инкубации антител с сапорин-конъюгированными Fab-фрагментами (Fab-ZAP) вместе с CLDN18.2-экспрессирующими клетками HEK293-CLDN18.2. При совместной интернализации с антителом, связанным с мишенью, сапорин ингибирует биосинтез белка клетки, что приводит к клеточной смерти, которую можно отследить с помощью анализа жизнеспособности клеток. Этот способ является косвенным способом оценки эндоцитоза комплекса мишень-антитело. Антитела тестировали как химерные антитела, когда они были доступны, в противном случае скрининг эндоцитоза проводили с помощью мышиных антител.

chim mAb362 (IMAB362), а также chim mAB294 можно эффективно интернализовать при связывании CLDN18.2, что приводит к снижению жизнеспособности клеток HEK293~CLDN18.2 даже при очень низких концентрациях антител (IMAB362: EC₅₀=11 нг/мл; mAB294: EC₅₀=10 нг/мл). Напротив, chim mAB308 и chim mAB359 не уменьшали жизнеспособность клеток (фигура 2). Поскольку chim mAB294 и chim mAB359 проявляют сходные относительные аффинности связывания и показывают значительные расхождения в интернализации (chim mAB294: EC₅₀=10 нг/мл, chim mAB359: нет эндоцитоза), эффективность эндоцитоза, по-видимому, не только коррелирует с аффинностью связывания антитела, но также зависит от связывающего эпитопа.

Даже интернализация mu mAB362 превосходила все другие тестируемые мышиные CLDN18.2-реактивные антитела, которые не выявили существенного эндоцитоза в анализе Fab-Zap (фигура 3).

Таким образом, CLDN18.2-специфичные антитела IMAB362 и chim mAB294 эффективно интернализовались при связывании с CLDN18.2 и пригодны для дальнейшей оценки в качестве конъюгатов лекарственного средства и антитела.

Таблица 5. Относительная аффинность связывания и специфичность CLDN18.2-реактивных антител

aнтитело Изотип EC₅₀
[нг/мл] EC₅₀ нормали-зованная [%] Макс.связывание [MFI] Макс.связывание, нормализованное [%] CLDN18.1-реактивное Идентифицированные аминокислоты человеческого CLDN18.2, распознаваемые антителами IMAB
362 1 челове-ческий IgG1 520 100 15797 100 нет A42S, N45Q, E56Q IMAB
362 2 584 100 18496 100 IMAB
362 3 652 100 7952 100 IMAB
362 4 1242 100 5319 100 mu mAB
362 3 мыши-ный
IgG1 2238 343 8826 111 A42S, N45Q, E56Q Mu
mAB
362 4 4286 345 5913 111 mu mAB
362 4 мыши-ный IgG2a 654 53 4880 92 n.a. mu mAB
359 3 мыши-ный IgG2b 4474 686 4297 54 нет n.a. mu mAB
325 3 мыши-ный
IgG1 33263 5102 3672 46 нет A42S, E56Q, G65P, L69I mu mAB
62 3 мыши-ный IgG2a 27932 4284 2800 35 нет n.a. mu mAB
187 3 мыши-ный IgG2a 26597 4079 2428 31 нет N37D, N45Q, Q47E mu mAB
294 3 мыши-
ный IgG2a 348 53 989 12 нет A42S, E56Q mu mAB
370 1 мыши-
ный IgG2a 7877 1514 1405 9 нет n.a. mu mAB
330 2 мыши-
ный
IgG3 11054 1894 1707 9 нет n.a. mu mAB
374 1 мыши-ный IgG2a 8262 1588 468 3 нет n.a. mu mAB
385 1 мыши-ный
IgG1 8534 1640 471 3 нет A42S, N45Q, E56Q, G65P, L69I mu mAB
177 3 миши-ный
IgG1 50 8 136 2 нет N37D, A42S, N45Q, Q47E, E56Q, L69I mu mAB
55 3 мыши-ный IgG2a 1945 298 241 3 не доступно A42S, N45Q, E56Q, G65P, L69I mu mAB
317 3 мыши-
ный
IgG1 41 6 106 1 нет Q29M, A42S, N45Q, Q47E, E56Q, G65P, L69I mu mAB
279 3 мыши-ный IgG2a 27 4 118 1 нет n.a. mu mAB
363 3 мыши-
ный
IgG1 15405 2363 877 11 да N37D mu mAB
360 1 мыши-ный IgG2a 19319 3713 1405 9 да n.a. mu mAB
371 1 мыши-ный
IgG1 11361 2184 747 5 да - mu mAB
382 2 мыши-ный IgG2b 12424 2129 842 5 да - mu mAB
348 2 мыши-
ный IgG2a 13573 2326 703 4 да - mu mAB
322 2 мыши-
ный IgG2a 12770 2189 818 4 да - mu mAB
321 2 мыши-
ный IgG2a 8082 1385 505 3 да n.a. mu mAB
339 1 мыши-
ный IgG2a 608 117 180 1 да n.a. mu mAB
338 2 мыши-
ный IgG1 3966 680 244 1 да N37D

Связывание с CLDN18.2 (EC₅₀ нормализованная [%] и нормализованное макс. связывание [%], были нормализованы к IMAB362) и CLDN18.1-реактивность определяли проточной цитометрией на клетках HEK293, стабильно экспрессирующих соответствующий белок. Антигенный эпитоп, ответственный за специфичность CLDN18.2, анализировали с помощью проточной цитометрии на клетках HEK293T, транзиторно сверхэкспрессирующих соответствующий мутант CLDN18.2. n.a.: не анализировали. Антитела, отмеченные одинаковым числом (1, 2, 3 или 4), тестировали в одном и том же анализе связывания. 1-3: детектирование с использованием APC-конъюгированных вторичных антител; 4: детектирование с помощью Protein L-FITC; n.a.: не анализировали.

Таблица 6. Относительная аффинность связывания и эндоцитоз CLDN18.2-специфических антител

Антитело связывание Жизнеспособность клеток Идентифициро-ванные аминокислоты человеческого CLDN18.2, распознаваемые антителами EC₅₀
[нг/мл] EC₅₀ нормали-зованная [%] Макс. связы-вание [MFI] Макс. связы-вание нормали-зованое [%] EC₅₀
[нг/мл] EC₅₀
[%] макс. умень-шение жизне-способности [%] IMAB362¹ 584 100 18496 100 11 100 100 A42S,N45Q, E56Q IMAB362² 1242 100 5319 100 IMAB362³ 13 100 100 mu muAB362³ (IgG2a) 4286 345 5913 111 ~30 231 66 n.a. mu muAB362³ (IgG1) 654 53 4880 92 2,2 17 66 A42S, N45Q, E56Q chim mAB294² 5701 459 3089 58 10 91 86 A42S, N45Q, E56Q chim mAB359¹ 2752 472 11618 63 нет эффекта нет эффекта нет эффекта A42S, N45Q, E56Q chim mAB308¹ 18883 3236 15016 81 нет эффекта нет эффекта нет эффекта N37D, A42S, E56Q chim mAB62¹ 32313 5538 4079 22 нет эффекта нет эффекта нет эффекта n.a. chim mAB279¹ 60046 10291 4394 24 нет эффекта нет эффекта нет эффекта n.a.

Относительная аффинность связывания [%], макс. связывание [%] или макс. снижение жизнеспособности [%], нормализованное к IMAB362, показано для связывания и эндоцитоза с использованием проточной цитометрии и анализа Fab-ZAP, соответственно. Антитела, отмеченные одинаковым числом (1 или 2), тестировали в одном и том же анализе связывания. Косвенную оценку интернализации с антителами, отмеченными 1 или 2, проводили вместе в одном анализе и с антителами, отмеченными 3, во втором анализе жизнеспособности клеток. 1: детектирование с использованием APC-конъюгированных вторичных антител; 2 и 3: детектирование с помощью Protein L-FITC.

Пример 3. конъюгация ТоксинА и IMAB362

Конъюгацию токсинов проводили в Piramal Healthcare, включая конечную замену буфера. Были проведены исследования стабильности, чтобы показать, что ADC остаются в пределах спецификации в течение определенного периода времени, если они хранятся в конкретных условиях хранения. IMAB362 конъюгировали с MMAE через расщепляемый валин-цитруллиновый линкер (vc-линкер) или с DM4 через расщепляемый N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио) бутиратный линкер (SPDB-линкер). Конъюгаты токсинов и IMAB362 хранили в буфере для хранения (20 мМ гистидина и 85 мг/мл сахарозы, рН 5,8) при 2-8°С.

Таблица 7. 28-дневное тестирование стабильности IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE

Анализ Результат IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE День 1 День 28 День 1 День 28 DAR 3,2 3,2 4,5 4,0 Мономер [%] 96 95 95 93 Свободное лекарственное средство [%] 0,4 1,0 не детектируется 0,3

DAR: соотношение лекарственного средства и антитела.

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE оба демонстрировали высокое содержание мономера ≥95% и незначительное количество свободного лекарственного средства (≤1%). 28-дневное тестирование стабильности конъюгированных с токсином антител IMAB362 при температуре хранения 2-8°C показало лишь незначительное снижение содержания мономера и незначительное увеличение свободного лекарственного средства для обоих ADC. Оба антитела были эффективно конъюгированы и продемонстрировали отношение лекарственного средства к антителу, составляющее 3,2 для IMAB362-DM4, и 4,5 для IMAB362-vcMMAE (таблица 7).

Пример 4. Связывание IMAB362-ADC

Связывающие свойства IMAB362 были подробно протестированы ранее:

• IMAB362 связывается с первой внеклеточной петлей варианта сплайсинга 2 клаудина 18 (CLDN18.2).

• Аффинность к CLDN18.2 находится в низком наномолекулярном диапазоне.

• Не наблюдали перекрестной реактивности с любым CLDN18.2-отрицательным типом клеток или тканей.

• Не наблюдали перекрестной реактивности с ближайшим родственным членом семейства вариантом сплайсинга 1 клаудина 18 (CLDN18.1).

Относительные аффинности связывания DM4- и MMAE-конъюгированных антител IMAB362 сравнивали с неконъюгированным IMAB362 с помощью проточной цитометрии с использованием клеточных линий, эндогенно и эктопически экспрессирующих CLDN18.2. Связывающие свойства тестировали при различных концентрациях антител в диапазоне от 0,1 до 20 мкг/мл (фигура 4, таблица 8).

Таблица 8. Обзор анализов связывания конъюгатов IMAB362-токсин с CLDN18.2-положительными клеточными линиями

Клеточная линия IMAB362 IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE Bmax [MFI] EC₅₀ [нг/мл] Bmax [MFI] EC₅₀ [нг/мл] Bmax [MFI] EC₅₀ [нг/мл] HEK293~пустые - - - - - - HEK293~CLDN18.2 18318 1121 19481 1472 14159 1594 HEK293~CLDN18.1 - - - - - - DAN-G 1C5F2 - - - - - - NCI-N87 - - - - - - NCI-N87~CLDN18.2 33678 310 28605 274 16569 103 NUGC-4 10cF7-5 sort 3a 67484 1671 77500 2600 68009 2520 54277 2384 69633 3909 45597 4049 NUGC-4 10cE8 34805 1570 35799 3046 29103 2826 28336 3673 36049 7487 25785 5464 BxPC-3~CLDN18.2 51380 104 76629 507 47197 183 28664 113 35700 425 25404 261

Bmax: максимальное связывание, MFI: средняя интенсивность флуоресценции.

По сравнению с неконъюгированным IMAB362, DMB- и MMAE-конъюгированные IMAB362 показали слегка сниженную относительную аффинность связывания на клетках, эндогенно и эктопически экспрессирующих CLDN18.2 (фигура 4, таблица 8). Оба токсин-конъюгированных антитела имели очень похожие значения EC₅₀, но несколько отличались максимальными значениями связывания, в которых IMAB362-DM4 проявлял более высокое максимальное связывание (таблица 8).

CLDN18.2-опосредованное связывание токсин-конъюгированных антител IMAB362 тестировали на клетках, эктопически сверхэкспрессирующих CLDN18.2, и на соответствующих родительских CLDN18.2-отрицательных клеточных линиях (фигура 5, таблица 8).

Связывание IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE строго зависит от наличия их молекулы-мишени CLDN18.2 (фигура 5). Специфичность связывания анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием трансфектантов HEK293, сконструированных для сверхэкспрессии человеческого CLDN18.2 или высокогомологичного белка CLDN18.1 человека. HEK293~mock использовали в качестве отрицательных контролей (фигура 6, таблица 8).

IMAB362 и токсин-конъюгированные антитела IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE связывались с похожими относительными аффинностями с клетками HEK293~CLDN18.2, эктопически экспрессирующими CLDN18.2 человека (таблица 8). Более того, IMAB362, DM4- и MMAE-конъюгированные IMAB362 не проявляли перекрестной реактивности к человеческому CLDN18.1 или к нетрансфецированным клеткам (фигура 6B и C).

Пример 5. Эффективность и специфичность IMAB362-ADC in vitro

1. Влияние на жизнеспособность клеток

Влияние IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE на жизнеспособность клеток тестировали с помощью нескольких человеческих опухолевых клеточных линий рака желудка и поджелудочной железы, эндогенно и эктопически экспрессирующих CLDN18.2, с использованием колориметрического анализа на основе XTT для спектрофотометрической количественной оценки метаболически активных клеток. Противоопухолевую активность тестировали при различных концентрациях антител в диапазоне от 3 до 16875 нг/мл (фигура 7, таблица 9).

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE эффективно ингибировали in vitro жизнеспособность опухолевой клеточной линии рака желудка NUGC-4, NCI-N87~CLDN18.2 и клеточной линии клеток поджелудочной железы BxPC-3~CLDN18.2 (фигура 7). Оба конъюгата IMAB362-токсин ингибировали жизнеспособность клеток NUGC-4, эндогенно экспрессирующих CLDN18.2, (значения EC₅₀: 155 - 631 нг/мл, максимальное снижение жизнеспособности: ≥ 85%) и клеток BxPC-3-CLDN18.2, эктопически экспрессирующих CLDN18.2, (значения EC₅₀: 43 - 54 нг/мл, максимальное снижение жизнеспособности: ≥ 83%) и клеток NCI-N87~CLDN18.2 (значения EC₅₀: 75-180 нг/мл, максимальное снижение жизнеспособности: 45 - 61%) при сходных концентрациях (фигура 7, таблица 9).

Таблица 9. Обзор анализов жизнеспособности клеток, выполненных с использованием конъюгатов IMAB362-токсин на CLDN18.2-положительных клеточных линиях

Клеточная линия IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE EC₅₀ [нг/мл] Снижение жизнеспособность [%] EC₅₀ [нг/мл] Снижение жизнеспособности [%] NCI-N87~CLDN18.2 75 49 100 45 108 61 180 56 NUGC-4 10cF7-5 sort 3a 155 88 338 86 NUGC-4 10cE8 372 69 631 67 BxPC-3~CLDN18.2 43 83 48 86 54 87 43 84

Помимо всего прочего, опосредованную мишенью противоопухолевую активность конъюгата IMAB362-токсин тестировали in vitro с использованием CLDN18.2-отрицательной клеточной линии NCI-N87 и стабильно трансфецированной клеточной линии NCI-N87~CLDN18.2 (фигура 8). IMAB362-vcMMAE ингибировал жизнеспособность клеток только на CLDN18.2-положительных, но не на CLDN18.2-отрицательных клетках. Таким образом, активность IMAB362-vcMMAE строго зависит от экспрессии CLDN18.2 (фигура 8).

Специфичность токсин-конъюгированных антител IMAB362 анализировали с использованием трансфектантов HEK293, сверхэкспрессирующих человеческий CLDN18.2 или высокомологичный белок CLDN18.1 человека. В качестве отрицательных контролей использовали клетки HEK293, стабильно трансфецированные пустым вектором (фигура 9). IMAB362-vcMMAE снижает жизнеспособность клеток на CLDN18.2-положительных, но не на CLDN18.2-отрицательных клетках. Эффект строго зависит от CLDN18.2, потому что в клетках, экспрессирующих гомологичный белок 18.1 (фигура 9), не наблюдали ингибирования клеточной пролиферации.

Таким образом, IMAB362-vcMMAE и IMAB362-DM4 продемонстрировали сходную эффективность in vitro, и оба ADC очень эффективно ингибировали жизнеспособность клеток нескольких опухолевых клеточных линий рака желудка и поджелудочной железы человека. Эффект строго зависит от экспрессии мишени.

2. «Эффект свидетеля»

Активность «эффекта свидетеля» IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE in vitro определяли с использованием смешанных опухолевых клеточных культур, состоящих из CLDN18.2-положительных и CLDN18.2-отрицательных клеточных линий. Отрицательные по мишени клетки PA-1 (Luc), стабильно экспрессирующие люциферазу светлячков, использовали в качестве репортерных клеток для измерения клеточного лизиса.

Люциферазная активность совместных культур клеток PA-1 (Luc), экспрессирующих люциферазу, и клеток NUGC-4, отрицательных по люциферазе, показала, что обработка IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE эффективно удаляла отрицательные по мишени клетки PA-1 (Luc) в присутствии положительных по мишени клеток NUGC-4. Кроме того, клетки PA-1 (Luc) не подвергались воздействию при отсутствии CLDN18.2-экспрессирующих клеток (фигура 10).

Таким образом, IMAC362-DM4 и IMAB362-vcMMAE-ADC были способны индуцировать «эффект свидетеля» на соседние CLDN18.2-отрицательные опухолевые клетки. Оба токсина эффективно высвобождались из IMAB362 в CLDN18.2-положительных опухолевых клетках и, благодаря своей проницаемости сквозь мембраны, были способны оказывать цитотоксическую активность на «клетки-свидетели».

Пример 6. Противоопухолевая эффективность IMAB362-ADC in vivo

1. Исследования максимальных переносимых доз

В первом in vivo эксперименте максимальную переносимую дозу (МПД) IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE определяли у голых мышей с развитыми ксенотрансплантированными опухолями поджелудочной железы человека BxPC-3~CLDN18.2. МПД относится к самой высокой дозе при лечении, которая будет давать целевой эффект без неприемлемой токсичности.

1.1. МПД IMAB362-DM4

Клетки BxPC-3~CLDN8.2, эктопически экспрессирующие CLDN18.2 человека, вводили подкожно в бок самок мышей Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu. После того, как на 13-й день опухоли достигли среднего размера 75±13 мм³ (среднее значение±SD), мышей распределяли по группам контроля и антитела. Мыши получали однократную дозу 7,5 или 15 мг/кг IMAB362-DM4 с помощью болюсной в.в. инъекции на 14-й день или повторные дозы 15 мг/кг IMAB362-DM4 с помощью болюсной в.в. инъекции на 14-й день и 21-й день, соответственно. Мыши контрольной группы получали носитель на 14 день. На 49-й день после трансплантации животных умерщвляли. Для тестирования токсичности проводили забор образцов крови, и органы подготавливали и сохраняли для дальнейших гистопатологических исследований.

Опухолевый рост

IMAB362-DM4 ингибировал рост опухоли у мышей с развитыми ксенотрансплантированными опухолями человека BxPC-3~CLDN8.2. Однократная или повторная обработка IMAB362-DM4 приводила к почти полной регрессии опухоли у всех обработанных мышей в течение периода наблюдения исследования (49 дней) независимо от дозы. Таким образом, однократная доза 7 мг/кг IMAB362-DM4 может быть достаточной для полной ремиссии опухоли (фигура 11).

Состояние здоровья

Массу тела, поведение животных и общее состояние здоровья контролировали два раза в неделю. Все животные показали нормальную массу тела на протяжении экспериментов (фигура 12). Никаких поведенческих аномалий не наблюдали. Однако одно животное умерло после внутривенного введения второй дозы 15 мг/кг IMAB362-DM4 по неизвестной причине.

Клинические анализы

Мы определили уровни в сыворотке аланинтрансаминазы (GPT), аспартаттрансаминазы (GOT), щелочной фосфатазы (AP), глутаматдегидрогеназы (GLDH), α-амилазы, холинэстеразы, креатининкиназы (CK), лактатдегидрогеназы (LDH), липазы, мочевины, глюкозы, общего белка и альбумина. Не обнаружили никаких различий между группами носителя и группами IMAB362-DM4 (фигура 13). Креатинин и гамма-глутамилтрансфераза были ниже предела обнаружения во всех группах (данные не показаны). Все животные во всех группах показали нормальные сывороточные уровни тестируемых суррогатных маркеров для гепато-, нефро- или панкреатической токсичности даже после повторных доз 15 мг/кг IMAB362-DM4.

Таким образом, 15 мг/кг IMAB362-DM4 (эквивалент 45 мг/м² у человека) в виде однократного введения хорошо переносились мышами и демонстрировали высокую противоопухолевую эффективность при обработке CLDN18.2-положительных ксенотрансплантатов. Из-за ограничений по концентрации и объему инъекции, внутривенная инъекция более высоких доз была невозможна, и максимальная переносимая однократная доза не была определена.

Гистологический анализ

Для гистологического анализа парафиновые срезы головного мозга, сердца, почек, печени, поджелудочной железы, селезенки и желудка окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали с помощью микроскопии на предмет IMAB362-vcMMAE-опосредованных морфологических изменений. Никаких морфологических изменений не наблюдали в срезах тканей у животных, обработанных IMAB362-DM4, по сравнению с мышами, обработанными носителем. Примечательно, что желудок, единственная ткань, экспрессирующая мышиный Cldn18.2, не демонстрировала повреждения ткани, опосредованного обработкой антителом (фигура 14).

1.2. МПД IMAB362-vcMMAE

МПД IMAB362-vcMMAE тестировали с использованием той же мышиной модели, что и для IMAB362-DM4 (1.1). Мышей распределяли по группам после того, как опухоли достигали среднего значения 111±27 мм³ (среднее±SD) на 13-й день и обрабатывали однократной болюсной в.в. инъекцией 8 или 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE (эквивалент 24 и 48 мг/м² у человека) на 14 день или повторными дозами болюсных в.в. инъекций 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE на 14 и 21 день. Мыши контрольной группы получали контроль носителя на 14-й день. Животных умерщвляли на 37-й день. Проводили клинический биохимический анализ, и органы собирали и сохраняли для дальнейших гистопатологических исследований.

Опухолевый рост

Обработка IMAB362-vcMMAE индуцировала регрессию опухоли и дополнительно ингибировала рост опухоли у мышей с развитыми ксенотрансплантированными опухолями человека BxPC-3~CLDN8.2. В конце исследования (37 дней) однократная или повторная обработка IMAB362-vcMMAE приводила к почти полной регрессии опухоли у всех обработанных мышей независимо от дозы. Таким образом, однократная доза 8 мг/кг IMAB362-vcMMAE может быть достаточной для полной ремиссии опухоли (фигура 15).

Состояние здоровья

Массу тела, поведение животных и общее состояние здоровья контролировали два раза в неделю. Все животные показали нормальную массу тела на протяжении экспериментов (фигура 16). Два животных (одна мышь из группы SD и одна из группы RD) были апатичными в течение короткого времени непосредственно после первой инъекции 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE. Однако такого аномального поведения не наблюдали ни у одного другого животного или после второго применения IMAB362-vcMMAE.

Клиническая химия

Мы определили сывороточные уровни суррогатных маркеров для гепато-, нефро- или панкреатической токсичности (аланинтрансаминаза (GPT), аспартаттрансаминаза (GOT), глутаматдегидрогеназа (GLDH), альфа-амилаза, холинэстераза, креатининкиназа (CK), лактатдегидрогеназа (LDH), липаза, мочевина, глюкоза, общий белок и альбумин). По сравнению с контрольной группой носителя не наблюдали серьезных отклонений суррогатных маркеров в сыворотке животных, получавших IMAB362-vcMMAE (фигура 17). Креатинин и гамма-глутамилтрансфераза были ниже предела обнаружения во всех группах. Таким образом, никаких признаков токсичности в печени, поджелудочной железе или нефротоксичности не наблюдали в анализах клинической биохимии в оцененном диапазоне доз.

Гистологический анализ

Для гистологического анализа парафиновые срезы головного мозга, сердца, почек, печени, поджелудочной железы, селезенки и желудка окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали с помощью микроскопии на IMAB362-vcMMAE-опосредованные морфологические изменения.

Никаких морфологических изменений, связанных с IMAB362-vcMMAE, не наблюдали в срезах тканей у обработанных IMAB362-vcMMAE животных по сравнению с мышами, обработанными носителем, что указывает на то, что IMAB362-vcMMAE не вызывает ни повреждения ткани, ни воспаления. Примечательно, что даже желудок, единственная ткань, экспрессирующая мышиный Cldn18.2, не демонстрировала опосредованного антителом повреждения ткани (фигура 22).

2. Исследования эффективности

Противоопухолевые эффекты IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE дополнительно анализировали in vivo на бестимусных голых мышах Nude-Foxn1^nu, которым подкожно трансплантировали клетки карциномы человека, эндогенно или эктопически экспрессирующие CLDN18.2. Оптимальную терапевтическую дозу IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE в животных моделях опухолей определяли в исследованиях на основе диапазона доз (фигура 18 и фигура 20, соответственно). Дальнейшие исследования эффективности ксенотрансплантированных опухолей человека проводили с оптимальной дозой IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE (фигура 19 и фигура 21, соответственно).

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE сильно ингибировали рост опухоли и улучшали выживаемость мышей, несущих опухоль, в разных моделях ранних ксенотрансплантатов (начало терапии через 3 дня после имплантации опухоли), а также при обработках прогрессирующих солидных опухолей (начало терапии при размере опухоли~100 мм³).

Обработка прогрессирующих ксенотрансплантированных человеческих опухолей желудка NCI-N87~CLDN18.2

В исследовании, посвященном диапазонам доз, противоопухолевую эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE анализировали на мышах с прогрессирующими CLDN18.2-положительными ксенотрансплантированными опухолями NCI-N87~CLDN18.2. Через 13 дней после трансплантации животных обрабатывали 15,2, 7,6 или 3,8 мг/кг IMAB362-DM4 или 16, 8 или 4 мг/кг IMAB362-vcMMAE или контролем носителя, применяя в виде однократных болюсных в.в. инъекций. Животные из контрольной группы получали 8 мг/кг неконъюгированного IMAB362 (два раза в неделю, в.в./в.б.).

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE сильно ингибировали рост опухоли, опосредовали регрессию опухоли и продолжительную выживаемость мышей, несущих опухоль, дозозависимым образом, в то время как «голое» антитело IMAB362 в этой предпочтительной модели обработки не проявляло статистически значимых противоопухолевых эффектов (фигура 18). Оба токсин-конъюгированных антитела IMAB362 продлевали выживаемость мышей, несущих опухоль (средняя выживаемость: 73 дня в группе носителя по сравнению с 143 днями в группе IMAB362-vcMMAE 16 мг/кг и 136 дней в группе IMAB362-DM4 15,2 мг/кг) (фигура 18).

Лечение ранних ксенотрансплантированных человеческих опухолей желудка NUGC-4 10cF7-5 sort3a

Противоопухолевую эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE анализировали на мышах, которым подкожно трансплантировали клетки карциномы желудка NUGC-4 10cF7-5 sort3a, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2. Животных обрабатывали на 3-й день после трансплантации путем однократной в.в. инъекции 15,2 мг/кг IMAB362-DM4, 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE или контроля носителя.

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE предотвращали рост опухоли у обработанных животных, тогда как у всех мышей контрольной группы развивались опухоли (p<0,0001) (фигура 19). После предварительно определенного времени наблюдения 120 дней 9 из 10 животных, которые получали IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE, были живы и не имели опухоли, тогда как все животные из контрольной группы носителя должны были быть подвергнуты эвтаназии из-за критериев прерывания не позднее 41 дня после трансплантации (средняя выживаемость 34 дня, p<0,0003) (фигура 19).

Обработка развитых опухолей ксенотрансплантированных опухолей поджелудочной железы человека BxPC-3~CLDN18.2

Дозозависимую противоопухолевую активность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE in vivo анализировали в исследовании данных диапазона доз у мышей с развитыми ксенотрансплантированными опухолями поджелудочной железы BxPC-3~CLDN18.2. Животных обрабатывали на 14-й день с помощью 15,2, 7,6 или 3,8 мг/кг IMAB362-DM4, 16, 8 или 4 мг/кг IMAB362-vcMMAE, носителя, которые вводили в виде однократных болюсных в.в. инъекций или повторными дозами 8 мг/кг IMAB362 (дважды в неделю, в.в./в.б.).

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE значительно ингибировали рост опухоли, опосредовали регрессию опухоли и продолжительную выживаемость мышей, несущих опухоли, дозозависимым образом. Напротив, неконъюгированный IMAB362 не демонстрировал статистически значимых противоопухолевых активностей в этой модели развитой опухоли (фигура 20). Оба антитела, конъюгированные с токсинами IMAB362, значительно продлевали выживаемость опухолевых мышей (средняя выживаемость: 48 дней в группе транспортных средств по сравнению с 98,5 днями в IMAB362-vcMMAE 16 мг/кг и 81 день в группе IMAB362-DM4 15,2 мг/кг) (фигура 20).

Обработка ранних ксенотрансплантированных человеческих опухолей поджелудочной железы DAN-G 1C5F2

Противоопухолевую активность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE in vivo тестировали на мышах, которым подкожно трансплантировали клетки карциномы поджелудочной железы DAN-G 1C5F2, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2. Клетки DAN-G 1C5F2 содержат исключительно низкие количества CLDN18.2 на клеточной поверхности; при этом значительное количество белка или РНК детектируется иммуноблотом или qRT-PCR. ИГХ-анализы ксенотрансплантированных опухолей DAN-G 1C5F2 показали, что только субпопуляция опухолевых клеток демонстрирует окрашивание мембранно-ассоциированного CLDN18.2 от умеренного до сильного. Таким образом, ксенотрансплантированные опухоли DAN-G 1C5F2 могут быть пригодны для обработки конъюгатами антител и лекарственных средств, которые демонстрируют эффект гибели «свидетеля». Животных обрабатывали на 3-й день после трансплантации путем однократной в.в. инъекции 15,2 мг/кг IMAB362-DM4, 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE или контроля носителя.

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE значительно ингибировали рост опухоли и продолжительную выживаемость мышей, несущих опухоль, по сравнению с контролем носителя (фигура 21). У большинства мышей (>50%) рост опухоли был полностью предотвращен. После периода наблюдения 120 дней 2 из 7 животных в IMAB362-DM4 (медианная выживаемость 87 дней, p=0,0002) и 4 из 7 животных в группе обработки IMAB362-vcMMAE были еще живы (выживаемость не определена, p=0,0006), тогда как все животные группы носителя должны были быть подвергнуты эвтаназии в течение 31 дня из-за критериев отмены, таких как кахексия рака (средняя выживаемость 24 дня) (фигура 21). Оба конъюгата, IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE, значительно ингибируют рост опухоли и продлевают выживаемость мышей с ксенотрансплантированными опухолями, демонстрирующими гетерогенную экспрессию CLDN18.2.

Таким образом, опухоли с низкой и/или гетерогенной экспрессией CLDN18.2 (например, ксенотрансплантированные опухоли NUGC-4 и DAN-G) могут быть эффективно обработаны IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE, и большая часть животных, несущих опухоль, были излечены. Противоопухолевая активность обоих ADC может быть объяснена на основе наблюдаемого эффекта: высвобождение клеточных мембранно-проницаемых форм DM4 и MMAE после клеточного процессирования облегчает уничтожение соседних опухолевых клеток, даже если они являются отрицательными по мишеням. Таким образом, оба ADC очень эффективны в уничтожении опухолей, содержащих только фракции CLDN18.2-положительных клеток.

Пример 7. Индукция апоптоза

Цитотоксичность токсин-конъюгированного IMAB362 оценивали с помощью анализов апоптоза, измеряющего активность каспазы 3/7 и экстернализацию фосфатидилсерина. Активация каспазы представляет собой один из самых ранних измеряемых маркеров апоптоза, который важен для инициирования программируемой клеточной смерти (Henkart 1996). Активность каспазы 3/7 определяли в анализе на основе люциферазы расщеплением специфического пролюминогенного субстрата каспазы 3/7. Другое раннее событие в апоптозе отслеживали с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентно-конъюгированного аннексина V (Vermes et al. 1995). Аннексин V специфично связывается с фосфатидилсерином, который транслоцировался из внутреннего листа плазматической мембраны во внешний лист сразу после индукции апоптоза. Чтобы различать живые и мертвые клетки, клетки окрашивали ДНК-красителем иодидом пропидия (PI).

Для анализа индукции апоптоза CLDN18.2-положительные клетки NUGC4 обрабатывали однократной дозой конъюгатов IMAB362-токсин в течение нескольких дней. Необработанные клетки и клетки, обработанные неконъюгированным IMAB362, служили в качестве контролей (фигура 23). Через 3 дня клетки, обработанные IMAB362-DM4 или IMAB362-vcMMAE, продемонстрировали повышенную активность каспазы 3/7, тогда как инкубация с «голым» антителом не влияла на активность каспазы (фигура 23А). Совместное окрашивание с помощью аннексина V и PI использовали в качестве независимого параметра для проверки индукции апоптоза с помощью токсин-конъюгированных антител IMAB362. Через 4 дня после обработки было обнаружено, что ~50% клеток, обработанных IMAB362-DM4- или IMAB362-vcMMAE, являются положительными по аннексину V или по аннексину V/PI, что указывает на то, что клеточная смерть произошла путем индукции апоптоза. Напротив, «голое» IMAB362 без сшивок не вызывает апоптоза в применяемом диапазоне концентраций (фигура 23B).

Таким образом, обработка CLDN18.2-положительных опухолевых клеток с помощью IMAB362, конъюгированного с DM4 или vcMMAE, индуцирует апоптоз.

Пример 8. Обработка ПРОГРЕССИРУЮЩИХ ксенотрансплантированных человеческих опухолей желудка NUGC-4 10cF7-5

Противоопухолевую эффективность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE анализировали на мышах, которым подкожно трансплантировали клетки карциномы желудка NUGC-4 10cF7-5 sort3a, эндогенно экспрессирующие CLDN18.2. Животные с опухолями на поздней стадии (размер опухоли ~200 мм3) обрабатывали на 10-й день после трансплантации путем внутривенной инъекции 15,2 мг/кг IMAB362-DM4, 16 мг/кг IMAB362-vcMMAE или контроля носителя и после рецидива опухолей в группе обработки IMAB362-конъюгированным антителом путем второй инъекции соответствующего лекарственного средства (день 38).

IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE значительно ингибировали рост опухоли и опосредовали регрессию опухоли у всех обработанных животных (день 52), тогда как у всех мышей контрольной группы развивались опухоли (IMAB362-DM4: p<0,05, IMAB362-vcMMAE: p<0,001) (фигура 24). Через 28 дней после терапии (день 38 после трансплантации) рецидивирующий рост опухоли (размер опухоли ≥~100 мм³) наблюдали у 50% животных группы обработки IMAB362-DM4. Вторая инъекция соответствующих IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE снова приводила к частичной или полной ремиссии опухолей. Рецидивирующий рост опухоли, наконец, наблюдали у 7 из 8 животных в группе IMAB362-DM4 и у 4 из 8 животных в группе IMAB362-vcMMAE. После предопределенного времени окончания обработки (день 108 после трансплантации), 4 из 8 животных в группе IMAB362-vcMMAE и одно животное в группе IMAB362-DM4 и в группе IMAB362 были живы, в то время как все животные группы носителя умерли последними на 52 день после трансплантации (средняя выживаемость 32,5 дня для носителя, 90 дней для IMAB362-DM4 (p<0,0003 против носителя) и не определена для IMAB362-vcMMAE (p<0,0003 против носителя)) (фигура 24).

Пример 9. Индукция антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC)

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC):

Активность ADCC DM4- и MMAE-коньюгированных антител IMAB362 сравнивали с неконъюгированным IMAB362 с использованием человеческих клеток карциномы желудка NGGC-4 10cF7_5 sort3a p3151 # 10, эндогенно экспрессирующих CLDN18.2 (фигура 25, таблица 10).

Таблица 10. ADCC-активность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE на клетках NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151 # 10

Донор IMAB362 IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] Донор 1 75 1228 66 1151 73 1085 Донор 2 82 142 92 217 92 275

Оба токсин-конъюгированных антитела, IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE, продемонстрировали аналогичные значения EC50 и максимального лизиса по сравнению с неконъюгированным антителом IMAB362, что указывает на то, что ADCC-активность была сохранена после конъюгации лекарственного средства.

Комплементзависимая цитотоксичность (CDC)

Активность CDC IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE анализировали на человеческих клетках карциномы желудка, эндогенно экспрессирующих CLDN18.2, NGGC-4 10cF7_5 sort3A p3151 # 10 и KATO-III FGF-BP # 12 adM p3151 # 25 (фигура 26, таблица 11).

Таблица 11. CDC-активность IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE на эндогенно экспрессирующих CLDN18.2 клетках карциномы.

Клеточная линия IMAB362 IMAB362-DM4 IMAB362-vcMMAE Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] Макс.лизис [%] EC₅₀ [нг/мл] KATO-III FGF-BP # 12 adM p3151 # 25 43 19292 56 6439 51 7244 NUGC-4 10cF7_5 sort3a p3151 # 10 54 28043 48 15759 49 28338

Активность CDC не была затронута конъюгацией токсинов с антителом IMAB362. Оба токсин-конъюгированных антитела, IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE, продемонстрировали, по меньшей мере, аналогичные значения EC₅₀ и максимальный лизис по сравнению с неконъюгированным антителом IMAB362.

Таким образом, IMAB362-DM4 и IMAB362-vcMMAE сочетают токсин-опосредованную цитотоксичность с антителозависимой клеточной цитотоксичностью и комплементзависимой цитотоксичностью, основными режимами действия неконъюгированного IMAB362, тем самым улучшая общую терапевтическую активность.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ganymed Pharmaceuticals AG

<120> DRUG CONJUGATES COMPRISING ANTIBODIES AGAINST CLAUDIN 18.2

<130> 342-84 PCT

<150> PCT/EP2015/058206

<151> 2015-04-15

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser

115 120 125

Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val

130 135 140

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly

145 150 155 160

Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe

165 170 175

Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met

180 185 190

Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala

195 200 205

Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly

210 215 220

Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser

245 250 255

Lys His Asp Tyr Val

260

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly

35 40 45

Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg

50 55 60

Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg

65 70 75 80

Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val

85 90 95

Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser

115 120 125

Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val

130 135 140

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly

145 150 155 160

Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe

165 170 175

Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met

180 185 190

Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala

195 200 205

Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly

210 215 220

Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser

245 250 255

Lys His Asp Tyr Val

260

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 55

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala

1 5 10 15

Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser

20 25 30

Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala

35 40 45

Met Leu Gln Ala Val Arg Ala

50 55

<210> 9

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys

1 5 10 15

Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly

20

<210> 10

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr

1 5 10 15

Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe

20 25 30

Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp

35 40

<210> 11

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala

1 5 10 15

Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser

20 25 30

Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala

35 40 45

Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly

50 55 60

Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly

85 90 95

Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val

100 105 110

Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met

115 120 125

Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr

130 135 140

Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp

145 150

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 12

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 13

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 13

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

20 25 30

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

35 40 45

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

50 55 60

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

65 70 75 80

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

85 90 95

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

100 105 110

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

165 170 175

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 14

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 14

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 15

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 15

Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 16

<211> 465

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 16

Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

Lys

465

<210> 17

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 17

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 18

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 18

Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val

1 5 10 15

His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 19

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 19

Met Asp Trp Ile Trp Ile Met Leu His Leu Leu Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ile Gln Ser Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val

35 40 45

Phe Pro Phe Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly

50 55 60

Phe Glu Trp Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Gly Glu Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser

85 90 95

Asn Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

100 105 110

Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys

465

<210> 20

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 20

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr

20 25 30

Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

165 170 175

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 240

<210> 21

<211> 235

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 21

Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

20 25 30

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser

35 40 45

Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser

50 55 60

Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg

100 105 110

Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 22

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 22

Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Val Arg Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp

100 105 110

Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 23

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 23

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

165 170 175

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 240

<210> 24

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 24

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr

20 25 30

Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

165 170 175

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 240

<210> 25

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 25

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 26

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 26

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr

100 105 110

His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

165 170 175

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 240

<210> 27

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 27

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys

145 150 155 160

Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

165 170 175

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln

180 185 190

Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser

195 200 205

Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235 240

<210> 28

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody

<400> 28

Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser

20 25 30

Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr

100 105 110

Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 29

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 30

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 30

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 34

Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Phe

20 25 30

Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Lys

50 55 60

Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 35

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 36

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 36

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 37

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 38

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 39

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 39

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 40

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 41

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln

85 90 95

Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 42

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 42

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product

<400> 43

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 44

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 44

Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr

1 5 10 15

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 45

Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 46

Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu

1 5 10 15

<210> 47

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 47

Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys

1 5 10 15

<210> 48

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 48

Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser

1 5 10 15

<210> 49

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 49

Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr

1 5 10 15

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epitope

<400> 50

Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly

1 5 10 15

<210> 51

<211> 467

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric monoclonal antibody

<400> 51

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает конъюгаты антитела против CLDN18.2 с лекарственным средством, конкретно с цитотоксическим или цитостатическим агентом. Изобретение может быть применимо для лечения или профилактики онкологических заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CLDN18.2, включая рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак яичника, рак толстой кишки, рак печени, рак головы и шеи, рак желчного пузыря и их метастазы. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 9 пр., 11 табл., 26 ил.

1. Конъюгат антитела, связывающегося с CLDN18.2, и терапевтической составляющей для лечения или предотвращения онкологического заболевания, характеризуемого злокачественными опухолевыми клетками, экспрессирующими CLDN18.2,

где антитело включает:

(a) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, и легкую цепь, содержащую вариабельную область, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 39; или

(b) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и легкую цепь, содержащую вариабельную область, включающую CDR1, CDR2 и CDR3 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 35; и

где терапевтический фрагмент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент, ковалентно связанный с антителом.

2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что антитело включает:

(а) вариабельную область тяжелой цепи антитела, определенной в SEQ ID NO: 32, и вариабельную область легкой цепи антитела, определенной в SEQ ID NO: 39; или

(b) вариабельную область тяжелой цепи антитела, определенной в SEQ ID NO: 30, и вариабельную область легкой цепи антитела, определенной в SEQ ID NO: 35.

3. Конъюгат по п. 1 или 2, отличающийся тем, что антитело включает:

(а) последовательность тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24; или

(b) последовательность тяжелой цепи антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 51, и легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.

4. Конъюгат по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что цитотоксический или цитостатический агент представляет собой майтанзиноид или ауристатин.

5. Конъюгат по п. 4, отличающийся тем, что майтанзиноид выбран из группы, состоящей из DM1 и DM4, и где ауристатин выбран из группы, состоящей из монометилауристатина E (MMAE) и монометилауристатина F (MMAF).

6. Конъюгат по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что терапевтический фрагмент ковалентно присоединен к антителу линкером.

7. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер представляет собой расщепляемый линкер.

8. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер расщепляется во внутриклеточных условиях.

9. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер гидролизуется при pH менее 5,5.

10. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер расщепляется внутриклеточной протеазой.

11. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер представляет собой линкер, расщепляемый катепсином.

12. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что линкер содержит дипептид.

13. Конъюгат по п. 12, отличающийся тем, что дипептид представляет собой val-cit или phe-lys.

14. Способ лечения или предотвращения злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2, включающий введение конъюгата по любому из пп. 1-13 онкологическому пациенту, причем конъюгат вводят в количестве, эффективном для лечения или предотвращения злокачественного новообразования, экспрессирующего CLDN18.2.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что конъюгат вводят в дозе от 3 до 30 мг/кг массы тела.

16. Способ по п. 14 или 15, отличающийся тем, что конъюгат вводят в дозе от 9 до 90 мг/м² поверхности тела пациента-человека.

17. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что вводят разовую дозу конъюгата или две или более доз конъюгата.

18. Способ по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что конъюгат вводят внутривенной инъекцией.

19. Способ по любому из пп. 14-18, который дополнительно включает проведение хирургического вмешательства, химиотерапии и/или лучевой терапии.

20. Способ по любому из пп. 14-19, отличающийся тем, что экспрессия CLDN18.2 происходит на клеточной поверхности злокачественных опухолевых клеток.

21. Способ по любому из пп. 14-20, отличающийся тем, что злокачественное новообразование представляет собой аденокарциному, в частности аденокарциному на поздней стадии.

22. Способ по любому из пп. 14-21, отличающийся тем, что злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака легкого, такого как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рака молочной железы, рака яичников, рака толстой кишки, рака печени, рака головы и шеи, рака желчного пузыря и их метастаз, опухоли Крюкенберга, перитонеальных метастаз и/или метастаз в лимфатических узлах.

23. Способ по любому из пп. 14-22, отличающийся тем, что злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака желудка, рака пищевода, конкретно нижнего отдела пищевода, рака пищеводно-желудочного перехода и гастроэзофагеального рака.

24. Способ по любому из пп. 14–23, отличающийся тем, что пациент является пациентом, отрицательным по HER2/neu, или пациентом с положительным статусом HER2/neu, но не отвечающим требованиям для терапии трастузумабом.

25. Способ по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что CLDN18.2 имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1.

26. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения онкологического заболевания, характеризуемого злокачественными опухолевыми клетками, экспрессирующими CLDN18.2, где указанная фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из пп. 1-13 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.

27. Медицинский препарат для лечения или предотвращения онкологического заболевания, характеризуемого злокачественными опухолевыми клетками, экспрессирующими CLDN18.2, где указанный медицинский препарат содержит терапевтически эффективное количество конъюгата лекарственное средство-антитело по любому из пп. 1-12.

28. Медицинский препарат по п. 27, который присутствует в виде набора, содержащего контейнер, который включает конъюгат.

29. Конъюгат по любому из пп. 1-13, фармацевтическая композиция по п. 26 или медицинский препарат по п. 27 или 28 для применения в терапии, конкретно для применения в способе лечения или предотвращения злокачественного новообразования, конкретно, CLDN18.2-экспрессирующего злокачественного новообразования.

30. Медицинский препарат по любому из пп. 27-29, дополнительно включающий печатные инструкции для применения препарата в способе лечения или предотвращения злокачественного новообразования, в частности CLDN18.2-экспрессирующего злокачественного новообразования.

31. Конъюгат или фармацевтическая композиция по п. 29, или медицинский препарат по п. 27 или 28, где способ лечения или предотвращения онкологического заболевания представляет собой способ по любому из пп. 14-25.