Набор реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/53 G01N33/535 G01N33/543 G01N33/48 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к лабораторной диагностике.

Изобретение может быть использовано для количественной оценки гуморального иммунного ответа на текущую или перенесенную инфекцию, вызванную вирусом SARS-CoV-2, для определения уровня поствакцинального иммунитета, сформированного на S-белок (включая RBD) вируса SARS-CoV-2, а также для выявления вируснейтрализующей активности сывороток крови человека и животных, моноклональных антител различной видовой принадлежности.

В наборе реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 реализован двустадийный «конкурентный» вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Набор реагентов предназначен для количественного определения вируснейтрализующих антител к рецептор-связывающему домену - RBD поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке (плазме) крови человека и лабораторных животных методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Результаты количественного определения антител к вирусу SARS-CoV-2 имеют коэффициент корреляции с реакцией нейтрализации 0,84, в отличие от других наборов реагентов для количественного определения иммуноглобулинов класса G к поверхностному гликопротеину S SARS-CoV-2 в сыворотке (плазме) крови человека, для которых он составляет 0,7.

Набор предназначен для профессионального применения в клинической лабораторной диагностике и научно-исследовательских организациях.

Изобретение является новым, поскольку в общедоступных источниках в Российской Федерации отсутствуют сведения о наборе реагентов, позволяющем обеспечить проведение количественного анализа вируснейтрализующих антител методом двустадийного «конкурентного» твердофазного иммуноферментного анализа, в комплектности которого представлены калибровочные образцы, аттестованные относительно стандарта WHO International Standard First WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (human), NIBSC code: 20/136 IU - international units»).

В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбрали набор реагентов для иммуноферментного количественного определения иммуноглобулинов класса G к SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2-IgG количественный-ИФА-БЕСТ», предназначенный для количественного определения иммуноглобулинов класса G к поверхностному гликопротеину S SARS-CoV-2 в сыворотке (плазме) крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

Выбор оговоренного выше набора обусловлен схожестью состава набора реагентов, а также предназначением обоих наборов для количественного определения антител к рецептор-связывающему домену - RBD поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке (плазме) крови человека и лабораторных животных методом твердофазного иммуноферментного анализа

К признакам предлагаемого изобретения, отличающим ее от аналога, следует отнести:

- предлагаемый набор реагентов предназначен для количественного определения вируснейтрализующих антител, набор сравнения - для определения иммуноглобулинов класса G (IgG);

- в предлагаемом наборе метод определения основан на двустадийном «конкурентном» варианте твердофазного иммуноферментного анализа, в наборе сравнения - на двустадийном «непрямом» варианте твердофазного иммуноферментного анализа.

Предлагаемое изобретение промышленно применимо, поскольку для изготовления набора может быть использовано типовое биотехнологическое оборудование, а также широко распространенные в биотехнологической промышленности реактивы и материалы.

В комплект набора реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2-ВНА-ИФА-РХБЗ» входят:

1. Планшет разборный 96-луночный для проведения реакции с иммобилизованным рекомбинантным внеклеточным доменом человеческого ангиотензинпревращающего фермента АСЕ-2 - 1 шт;

2. Калибровочные образцы, содержащие известные количества IgG к SARS-CoV-2 - 0; 25; 100 IU/мл - 5 флаконов по 1,5 мл;

3. Контрольный образец (сыворотка крови, содержащая антитела к SARS-CoV-2 в концентрации 60-90 IU/)- 1 флакон 1,5 мл;

4. Конъюгат (конъюгат рекомбинантного S-белка виpyca SARS-CoV-2 с пероксидазой хрена) - 1 флакон 11 мл;

5. Концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином - 1 флакон 28 мл;

6. Раствор тетраметилбензидина - 1 флакон 13 мл;

7. Стоп-реагент (кислота серная 4,9%) - 1 флакон 12 мл;

8. Планшет разборный 96-луночный для предварительного разведения исследуемых образцов - 1 шт.;

9. Пленки для заклеивания планшета - 2 шт.;

10. Наконечники для дозаторов на 2-200 мкл - 16 шт.;

11. Ванночка для реагентов - 1 шт.

Анализ с использованием набора реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2-ВНА-ИФА-РХБЗ» проводят по следующей схеме.

В лунки флуориметра для проведения разведения вносят 135 мкл конъюгата и 15 мкл изучаемой пробы и инкубируют.

В лунки планшета с иммобилизованным рекомбинантным рецептором АСЕ-2 вносят 100 мкл 10-кратно разведенных образцов, включая калибровочные образцы 0; 25; 100 IU/мл и контрольный образец.

Измерение результатов анализа проводят при длине волны 450 нм.

Стрипы заклеивают пленкой и инкубируют 60 мин в термостатируемом шейкере при температуре (37±1)°С с интенсивностью перемешивания 300 об/мин.

По окончании инкубации снимают липкую пленку и помещают ее в сосуд с дезинфицирующим раствором. С помощью промывочного устройства промывают лунки планшета 5 раз промывочным раствором, чередуя аспирацию и немедленное заполнение лунок каждого стрипа. В каждую лунку вносят 350 мкл жидкости в процессе каждого цикла промывки. Время между заполнением и опорожнением лунок должно доставлять не менее 30 сек. По окончании промывки остатки влаги из лунок тщательно удаляют.

Вносят во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина и инкубируют в защищенном от прямого солнечного света месте 25 мин при температуре (18-26)°С.

Вносят во все лунки по 100 мкл стоп-реагента.

Взмерение результатов анализа проводят при длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-655 нм.

Время между остановкой реакции и измерением оптической плотности не должно превышать 5 мин.

Концентрацию вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2 IU/мл) в анализируемых образцах определяют по калибровочному графику (зависимость значения оптической плотности от концентрации), построенному в линейных координатах на основе показаний калибровочных образцов (IU/мл).

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к рецептор-связывающему домену - RBD поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека и лабораторных животных. Изобретение представляет собой набор реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к SARS-CoV-2, в котором реализован двустадийный «конкурентный» вариант твердофазного иммуноферментного анализа.

Набор реагентов для иммуноферментного количественного определения вируснейтрализующих антител к рецептор-связывающему домену - RBD поверхностного гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови человека и лабораторных животных, включающий в себя калибровочные образцы, содержащие известные количества IgG к SARS-CoV-2 - 0; 25; 100 IU/мл, контрольный отрицательный образец, конъюгат, концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, раствор тетраметилбензидина, стоп-реагент, планшет разборный на 96 лунок для проведения реакции и планшет для предварительного разведения исследуемых образцов, пленки для заклеивания планшетов, наконечники для дозаторов, ванночку для реагентов, отличающийся тем, что в лунках планшета для проведения реакции иммобилизирован рекомбинантный внеклеточный домен человеческого ангиотензинпревращающего фермента АСЕ-2, конъюгатом выступает рекомбинантный S-белок вируса SARS-CoV-2 с пероксидазой хрена, в качестве контрольного образца выступает разведение сыворотки крови, содержащей антитела к SARS-CoV-2 в концентрации 60-90 IU/мл.