СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ S-АНТИГЕНА В ЦЕЛЬНОВИРИОННЫХ ИНАКТИВИРОВАННЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ НА ГИДРООКИСИ АЛЮМИНИЯ, СУБЪЕДИНИЧНЫХ НА ОСНОВЕ S-БЕЛКА, РЕКОМБИНАНТНЫХ ИЛИ ПОЛИПЕПТИДНЫХ, СОДЕРЖАЩИХ ДОМЕН RBD SPIKE-БЕЛКА ВИРУСА SARS-COV ВАКЦИНАХ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ COVID-19 И/ИЛИ ДРУГИХ КОРОНАВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Заявленное изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и химико-фармацевтической промышленности и касается способа количественного определения концентрации S-антигена в цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV вакцинах для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19 и/или других коронавирусных инфекций. Предлагаемый способ может быть реализован при разработке и на производстве готовой лекарственной формы вакцины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Коронавирусы относятся к семейству Coronaviridae. Они делятся на четыре класса: альфа-коронавирусы и бета-коронавирусы, поражающие млекопитающих, гамма-коронавирусы и дельта-коронавирусы, поражающие преимущественно птиц.

Коронавирусы, которые являются заразными для человека, впервые были идентифицированы в середине 1960-х годов. К распространенным типам коронавируса, поражающим людей, можно отнести HCoV-229E (альфа-коронавирус), HCoV-NL63 (альфа-коронавирус), HCoV-OC43 (бета-коронавирус) и HCoV-HKU1 (бета-коронавирус).

Последние годы человечество столкнулось со вспышками заболеваний, вызванных типами коронавируса, которые обычно поражают животных и не представляют опасности для человека: MERS-CoV, бета-коронавирус, вызывающий ближневосточный респираторный синдром, или MERS; SARS-CoV, бета-коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром или SARS; и SARS-CoV-2, новый штамм бета-коронавируса, вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года, или COVID-19).

Новый штамм коронавируса SARS-CoV-2, впервые обнаруженный в декабре 2019 года в Китае, городе Ухань, менее чем за один год вызвал пандемию, которая нанесла серьезный ущерб здоровью населения и мировой экономике.

Вирус SARS-CoV-2 является возбудителем инфекционного заболевания - коронавирусной инфекции (COVID-19).

Согласно данным ВОЗ, большинство людей, инфицированных вирусом SARS-CoV-2, испытывают легкие и умеренные симптомы респираторного заболевания и выздоравливают без необходимости специального лечения. При этом у некоторых людей оно протекает в тяжелой форме, требующей медицинского вмешательства. Тяжелая форма заболевания чаще развивается у пожилых людей и лиц с фоновыми патологиями, в частности сердечно-сосудистыми, хроническими респираторными, онкологическими заболеваниями и диабетом. При этом риск заражения COVID-19, тяжелого течения болезни или смерти от нее угрожает любому человеку независимо от возраста (https://www.who.int/ru/health-topics/coronavirus#tab=tab_1).

На сегодняшний день вакцинация остается самой эффективной мерой в борьбе с распространением коронавируса.

В мире зарегистрировано более десятка вакцин против коронавирусной инфекции. Более сотни препаратов находятся на стадии клинических исследований (https://www.theguardian.com/world/2020/nov/18/CoVid-19-vaccine-who-are-countries-prioritising-for-first-doses).

Применяемые вакцины против коронавируса можно подразделить на следующие типы:

1. Цельновирионные

1.1. Инактивированные адсорбированные вакцины

Например: Corona Vac (Sinovac), CoVaxin (Bharat Biotech), Sinopharm (Sinopharm/Институт биологических препаратов Уханя), КовиВак (Центр Чумакова), BBIBP-CorV (Sinopharm/Институт биологических препаратов Пекина), COVIran Bareka (Иранская государственная компания Shifa Pharmed Industrial Group)

1.2. Живые аттенуированные вакцины

Например: CDX-005 (Codagenix и Институтом сыворотки Индии)

2. Вакцины на основе нуклеиновых кислот

2.1. ДНК-вакцины

Например: INO-4800 (Inocio Pharmaceuticals), AG0301-COVID19 (AnGes Inc.), ZyCoV-D (Zydus Cadila)

2.2. РНК-вакцины

Например: Comirnaty (Pfizer/BioNTech/Fosun Pharma) и Moderna (Moderna/NIAID)

3. Вирусные векторные вакцины

3.1. Реплицирующиеся

Например: DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPTl (Университет Сямынь, Китай) (в разработке)

3.2. Нереплицирующися

Например: Гам-КОВИД-Вак (Спутник V) (Центр Гамалеи); Ad5-nCoV (Convidicea) (CanSino Biologies); AZD1222 (ChAdOxl-S) (AstraZeneca/Оксфордский университет); COVID-19 Vaccine Janssen (Janssen-Cilag (Johnson & Johnson)

4. Субъединичные вакцины

Например: Novavax или NVX-CoV2373 (Novavax).

5. Рекомбинантные белковые вакцины

Например: ZF2001 (Anhui Zhifei Longcom/Институт микробиологии Китайской академии наук)

6. Полипептидные вакцины

Например: ЭпиВакКорона (Центр «Вектор»).

Представленный выше перечень вакцинных препаратов не является окончательным и может обновляться с развитием науки в данной области: так, например, в недавней статье, опубликованной в журнале Science, сообщается о проведении доклинических исследований в отношении вакцины нового типа, разработанной учеными из Калифорнийского технологического института. Универсальная вакцина, получившая название «мозаика-8» содержит в своем составе мозаичные наночастицы, включающие RBD восьми различных бета-коронавирусов (сарбековирусов). Данная вакцина обеспечивает защиту от различных SARS-подобных бета-коронавирусов, включая варианты SARS-CoV. Важным свойством вакцины является ее универсальность - вакцина применима для защиты от большинства существующих в настоящее время штаммов SARS-CoV, заразных для человека, а также от штаммов, циркулирующих в организме животных, способных потенциально мутировать в заразную для человека форму.

Вне зависимости от типа вакцин к их разработке и производству применяется единый ряд требований. Требования действующего законодательства разных стран и страновых объединений, рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения указывают на необходимость демонстрации способов производства вакцинных препаратов, обеспечивающих постоянное получение серий, сопоставимых с партиями, имеющими доказанную клиническую эффективность, иммуногенность и безопасность для человека. Необходимо также приводить спецификацию лекарственного средства, включающую испытания в процессе производства, подтверждающие стабильное качество производимого продукта.

При этом этапы разработки и производства биологических препаратов всех известных групп и классов, включая вакцины, до сих пор предполагают тесты in vivo, являющиеся неотъемлемой частью исследований и контроля качества. Тесты in vivo предоставляют важную информацию о физиологическом распределении и специфической активности, токсичности препаратов, механизме их действия, фармакокинетике и фармакодинамике. Подавляющее большинство известных на данный момент способов контроля качества вакцин, касающихся подлинности и иммуногенности биологические.

Такие тесты сопряжены со следующими сложностями:

- с обязательным наличием участков производства для работы с живыми вирусами по стандарту BSL3 «WHO Laboratory Biosafety Manual Fourth Edition dd 21 December 2020» (в Российской Федерации - с наличием участков производства, соответствующих требованиям работы с возбудителями второй группы патогенности в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»);

- с трудоемкостью и длительностью in vivo производственного контроля готовой лекарственной формы на поствакцинальный гуморальный (антительный) иммунный ответ, в особенности если речь идет о производстве в промышленном масштабе;

- с дороговизной лабораторных животных и высокой стоимостью их содержания в виварии.

Вместе с тем одной из значимых современных тенденций в разработке биопрепаратов, постлицензионной стадии жизненного цикла продукта для мониторинга его качества, эффективности или безопасности, в рамках рутинного выпуска серий в гражданский оборот, становится растущее применение тестов in vitro (на клетках и клеточных линиях млекопитающих, иммунологические, вкл. ELISA, протеомный анализ, молекулярно-биологические методы, математическое моделирование).

Методика применения тестов in vitro базируется на концепции 3R - «замена, уменьшение, совершенствование». Сущность концепта: replacement (замена) - применение релевантных методов без использования экспериментальных животных, reduction (уменьшение) - снижение числа животных в эксперименте как результат оптимизации дизайна тестов, refinement (совершенствование) применение технологий, снижающих или устраняющих боль, страдания, дистресс, длительность всех видов повреждений организма животных, в том числе базироваться на НЕлетальных конечных этапах исследования.

Концепт 3R обоснован в том числе набором существующих аспектов: научные результаты целевых тестов in vitro идентичны/коррелируют с релевантными при опытах на животных, более того, имеет место высокая вариабильность результатов тестов на животных, что часто требует повторных тестов, этические указаны, например, в Страсбургской Европейской Конвенции о защите позвоночных лабораторных животных (1986), экономические тесты in vivo высокозатратные, долговременные, требуют вовлечения значительных квалифицированных людских ресурсов.

В настоящее время издан ряд документов, реализующих принципы 3R:

В Российской Федерации имплементация принципов 3R в производстве вакцин закреплена в том числе в Государственной Фармакопее (ОФС.1.7.1.0004.15). Введение данных методов также является легальным требованием в Европе с 1986 в соответствии со следующими документами - прежняя Директива 86/609/ EEC; текущая Директива 2010/63/ EU, Директива 2001/83/ЕС Европейского Парламента/6 Ноября 2001 по Кодексу Сообщества о медицинских продуктах (Consolidated version: 05/10/2009), Директива 2010/63/EU о защите животных, используемых для научных целей 22 Сентября 2010.

Детализация применения принципов 3R обозначена в Методических указаниях (Европейского Агентства по Оценке Медицинских Продуктов / European Agency for the Evaluation of the Medicinal Products/ Replacement of Animal studies by In vitro Models (Замена Исследований на животных моделями In vitro), Лондон, 1997 год. В 2016, Лондон, Европейским Медицинским Агентством/ European Medicines Agency издана регуляторная панель по применению 3R.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в области развития и применения принципов 3R сотрудничает с более чем 50 крупными национальными и международными научными и регуляторными учреждениями (FDA (США), Национальный центр Великобритании по замене, усовершенствованию и сокращению количества животных в исследованиях (NC3R), Национальный Институт Биологических Стандартов и Контроля, Великобритания (NIBSC), Французское Агентство по Санитарной Безопасности Медицинских Продуктов (AFSSPS), Национальный Институт Инфекционных Болезней/ Япония) и др.), рядом ведущих компаний на рынке фармацевтических и биотехнологических продуктов (GlaxoSmithKline, Janssen Vaccines, Merck, Sanofi Pasteur и др.).

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено:

- на имплементацию принципов 3R, что позволит обеспечить ответственное и бережное отношение к животным при сохранении необходимого качества параметров исследований и стандартов производства вакцинных препаратов;

- на расширение круга возможных производителей вакцинных препаратов, направленных на профилактику коронавирусной инфекции COVID-19 и/или других коронавирусных инфекций;

- на существенное упрощение, ускорение и удешевление процессов разработки, производства и выпуска в гражданский оборот вакцинных препаратов;

- на возможность организации технически простых и эффективных способов контроля качества вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов по показателю «количественное содержание специфического антигена» (Фармакопея РФ Общая фармакопейная статья 1.7.1.0004.15 «Вакцины и анатоксины, специфическая активность») в процессах разработки; производства и выпуска в гражданский оборот; после выпуска в гражданский оборот, а также для контроля полноты сорбции адсорбированных препаратов и/или их полуфабрикатов (Фармакопея РФ Общая фармакопейная статья 1.7.1.0004.15 «Вакцины и анатоксины, полнота сорбции»).

Задачей настоящего изобретения является устранение проблем и недостатков, присущих известным решениям, путем создания простого, быстрого, высокоточного, эффективного, качественного, воспроизводимого, не требующего использования животных моделей, безопасного способа количественного определения концентрации S-антигена в цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV вакцинных препаратах и/или их полуфабрикатах, предназначенных для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19 и/или других коронавирусных инфекций.

На основе изобретения могут быть организованы контроли качества по показателю специфической активности для вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов на стадиях: разработки, производства и выпуска в гражданский оборот, после выпуска в гражданский оборот - в таких исследованиях, как: поствакцинальный гуморальный иммунный ответ, термостабильность, подлинность, стабильность в режиме реального времени, а также для исследования полноты сорбции адсорбированных вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов.

Серьезной проблемой, с которой сталкиваются ученые, производители и регуляторные органы при оценке качества вакцинных препаратов для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19 и/или других коронавирусных инфекций является отсутствие глобальных стандартов такой оценки. Например, существует множество типов иммуноанализа, которые можно использовать для измерения того или иного аспекта иммунного ответа, например, количество нейтрализующих антител, и для каждого варианта могут использоваться разные наборы реагентов и разные процессы скрининга.

Однако разнообразные методики тестирования, используемые в лабораториях по всему миру, в настоящее время не позволяют установить четкие показатели, которые бы указывали на наличие у различных вакцин защитного иммунного ответа. Разница в методиках и показателях означает, что в настоящее время ученые, производители и регуляторные органы не могут сравнивать или оценивать качество различных вакцин на основе соответствующих данных об их иммуногенности, поскольку для каждой вакцины данные получают на основании разных методик тестирования, в разных лабораториях и без использования единых стандартов для сравнения.

На основе предлагаемого изобретения для каждого из вышеперечисленных типов вакцинных препаратов можно установить собственные четкие критерии качества по показателю специфической активности (количественному содержанию специфического антигена).

На сегодняшний день при разработке нового вакцинного препарата на стадии доклинических исследований, разработчик определяет минимальное количество действующего вещества в вакцинном препарате, рассматриваемого в технологии разработчика как количество, способное индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации.

Если при отсутствии соответствующего инструментария вышеуказанные исследования проводятся только на животной модели путем опробования необходимого количества серий вакцины, изготовленной по технологии разработчика, то существует существенная вероятность того, что в качестве минимального количества действующего вещества будет принято не количество специфического антигена, а количество общего белка, содержащегося в исследуемых образцах.

Общий белок включает специфический антиген, а также иные белковые компоненты, содержащиеся в вакцине в связи с технологией, применяемой разработчиком, не вызывающие иммунный ответ в отношении возбудителя коронавирусной инфекции.

Приведенная стратегия имеет недостаток: определяемые количества белкового компонента не всегда должным образом коррелируют со способностью вакцинного препарата индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации, что в свою очередь может приводить к повышенной реактогенности вакцинного препарата, полному отсутствию или низкой эффективности вакцины на практике.

Также приведенная стратегия ввиду указанных выше причин, связанных с использованием животных моделей, неудобна для дальнейшего использования при разработке и производстве вакцины.

Настоящее изобретение ставит своей целью решение и данной проблемы.

В соответствии с существующими требованиями разработчик должен определять максимальное количество общего белка, допустимое для введения человеку.

Разработчики в рамках доклинических исследований и первой, и второй фазы клинических исследований определяют параметр максимально допустимого содержания общего белка в вакцине, в состав которого входят: специфический белок, а также вирусные и балластные белки. Данный параметр количества общего белка затем является обязательным для системы контроля качества при производстве препарата. Однако, при необходимости в рамках указанных исследований разработчики с помощью изобретения также могут определить максимально допустимое количество S-антигена в ранее определенном максимально допустимом количестве общего белка и затем с помощью изобретения контролировать этот параметр в процессе производства и при хранении.

Поставленные выше задачи решаются созданием способа количественного определения концентрации S-антигена методом иммуноферментного анализа в вакцине, выбранной из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке вируса SARS-CoV, предназначенной для профилактики коронавирусных инфекций, отличающийся тем, что иммуноферментный анализ проводят с использованием по меньшей мере одной пары специфических к рецептор-связывающему домену RBD S-белка вируса SARS-CoV моноклональных антител двух типов, распознающих различные не перекрывающиеся эпитопы рецептор-связывающего домена RBD S-белка вируса SARS-CoV, способных детектировать по меньшей мере один конкретный штамм вируса SARS-CoV, не взаимодействующих при этом с другими штаммами вируса SARS-CoV, где пара антител содержит одно антитело, которое сорбировано на полистироловом планшете и является антителом первого типа, и одно антитело, которое конъюгировано с лигандом и является антителом второго типа.

В частном варианте осуществления специфические моноклональные антитела двух типов, распознающие различные не перекрывающиеся эпитопы рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV, способны детектировать сразу несколько конкретных штаммов SARS-CoV.

В частном варианте осуществления специфические моноклональные антитела двух типов, распознающие различные не перекрывающиеся эпитопы рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV, не взаимодействуют с другими штамами вируса SARS-CoV, способны детектировать сразу несколько конкретных штаммов SARS-CoV.

Приведенные выше проблемы решаются также применением вышеуказанного способа для контроля качества вакцины, выбранной из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV и или/ее полуфабриката, предназначенной для профилактики коронавирусных инфекций в части обеспечения специфического гуморального иммунного ответа, достаточного для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации, в процессе ее разработки производства, выпуска в гражданский оборот и/или после выпуска в гражданский оборот.

Изобретение подходит для контроля качества цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов по показателю «количественное содержание S-антигена RBD-домена Spike-белка вируса SARS-CoV», а также для контроля качества полноты сорбции адсорбированных вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов по указанному показателю.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является значительное упрощение, существенное сокращение сроков производства вакцинных препаратов, удобство и удешевление проведения необходимых тестов и исследований с сохранением качества, характерного для in vivo тестов.

Например, сроки проведения контроля готовой лекарственной формы на поствакцинальный специфический гуморальный иммунный ответ сокращаются с более чем 30-ти дней до двух часов. При этом не используются участки производства и персонал для работы с живыми вирусами, не требуется использование дорогостоящих лабораторных животных.

Заявленное изобретение позволяет заменить производственный контроль готовой лекарственной формы вакцинного препарата на поствакцинальный специфический гуморальный иммунный ответ, проводимый in vivo, на аналогичный тест in vitro с сохранением качества.

Способ по изобретению является высокоточным и воспроизводимым. Способ эффективен для цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV вакцинных препаратов и/или их полуфабрикатов.

Способ обладает эффективностью, превышающую таковую для решений-аналогов.

Способ позволяет гарантированно выявлять в вышеуказанных вакцинных препаратах антигены, антитела к которым будут иметь нейтрализующую активность в отношении инфекционного вируса потому, что определяет исключительно те белки, которые обладают специфической активностью, исключая вклад балластных белков.

Предлагаемый подход позволяет существенно сократить сроки производственного контроля вакцинных препаратов на поствакцинальный специфический гуморальный иммунный ответ, в особенности, если речь идет о производстве в промышленном масштабе и, как следствие, существенно снизить итоговую себестоимость конечного продукта.

Настоящее изобретение может быть применено для сравнения вакцинных препаратов по установленному для каждого типа из вышеуказанного перечня единому параметру значению концентрации S-антигена SARS-CoV в готовой лекарственной форме.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1: Аминокислотная последовательность полноразмерного S-антигена коронавируса SARS-CoV-2. Серым выделена последовательность рецептор-связывающего домена (RBD).

Фиг. 2: Калибровочный график, построенный с использованием S-антигена фирмы MyBioSource (MBS2563881).

Фиг. 3: Калибровочный график, полученный с использованием набора реагентов «BHoCKaH-SARS-CoV-2 (S)». Ось ординат - оптическая плотность при 450 нм, ось абсцисс - концентрация S-антигена, нг/мл.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведены уточнения и раскрытия приведенных понятий, приведены варианты реализации изобретения.

Понятие вакцины в контексте изобретения включает в себя вакцинные препараты в готовой лекарственной форме, выбранные из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка; рекомбинантных или полипептидных, содержащих домен RBD Spike-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV, предназначенных для профилактики коронавирусной инфекции COVID-19 и/или других коронавирусных инфекций и/или их полупродукты.

Под специфическим антигеном понимается RBD-домен S-антигена вируса SARS-CoV, способный индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ у вакцинируемого.

Предлагаемый способ применим для определения способности у вакцинных препаратов индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации, в процессе их разработки и/или производства и выпуска в гражданский оборот и/или после выпуска в гражданский оборот.

Под коронавирусными инфекциями следует понимать инфекции, вызванные SARS-CoV 1, SARS-CoV2 и/или их мутантами.

Понятие «SARS-CoV» включает в себя SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 (Фиг. 1) и их мутанты, содержащие последовательность RBD-домена S-белка (SEQ ID NO: 1), либо последовательность RBD-домена, выделенная серым цветом на Фиг. 1 (SEQ ID NO: 2).

В заявленном способе применяются по меньшей мере одна пара специфических моноклональных антител к различным не перекрывающимся эпитопам рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV. В заявленном способе могут быть применены по меньшей две пары специфических моноклональных антител к различным не перекрывающимся эпитопам рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV. В заявленном способе могут быть применены по меньшей мере три пары специфических моноклональных антител к различным не перекрывающимся эпитопам рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV. В заявленном способе могут быть применены по меньшей мере четыре пары специфических моноклональных антител к различным не перекрывающимся эпитопам рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV. В заявленном способе могут быть применены по меньшей мере пять пар специфических моноклональных антител к различным не перекрывающимся эпитопам рецептор-связывающего домена RBD Spike-белка вируса SARS-CoV.

В заявленном способе без ограничения могут быть применены моноклональные антитела к следующим эпитопам: SVLYNSASFSTFKCYG, EVRQIAPGQTGKIAD, NLDSKVGGNYNYLYR, LFRKSNLKPFERDI, AGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQP, YGF QPTNGVGYQP YR.

Настоящее изобретение не может быть применено в отношении вакцин на основе нуклеиновых кислот таких, как производимые на сегодняшний день компаниями Пфайзер, Модерна, вирусных векторных вакцин таких, как Спутник института им. Гамалеи, вакцин компаний АстраЗенека и Янссен/Джонсон энд Джонсон и иных видов вакцин, не содержащих в своем составе аминокислотную последовательность RBD.

Заявленное изобретение основано на использовании по меньшей мере одной пары специфических антител к рецептор-связывающему домену RBD S-белка SARS-CoV.

Антитела, используемые в изобретении, можно подразделить на два типа: антитело первого типа характеризуется тем, что оно сорбируется на поверхности лунок полистироловых планшетов; антитело второго типа коньюгировано с лигандом.

В предлагаемом изобретении может использоваться одновременно по меньшей мере одна пара антител, из которых одно антитело является антителом первого типа, а второе явяляется антителом второго типа. При этом антитела обеих типов могут: как обладать нейтрализующей активностью, так и не обладать ею.

Антитела, используемые в предлагаемом изобретении, представляют собой как моноклональные, так и поликлональные антитела к S-антигену SARS-CoV-2 от различных хозяев, в частности, мышь, крыса, кролик, коза, овца, птица, лошадь, КРС, верблюд, человек и др., при этом используемые антитела являются специфичными к рецептор-связывающему домену (RBD) S-белка SARS-CoV (RBD, выделен серым на Фиг. 1).

Согласно заявленному изобретению могут быть использованы коммерчески доступные антитела, обладающие приведенными выше свойствами.

Антитела, используемые в предлагаемом изобретении, могут применяться в виде конъюгатов с ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.) или другим функциональным лигандом (например, биотин, коллоидное золото другие металлы и их производные, например: серебро, торий, оксиды железа).

Моноклональные антитела могут сорбироваться на полистироловый планшет для ИФА в диапазоне концентраций 0,5-10 мкг/мл. В частности, в диапазоне концентраций: 0,5-0,6 мкг/мл; 0,5-0,7 мкг/мл; 0,5-0,8 мкг/мл; 0,5-0,9 мкг/мл; 0,5-1 мкг/мл; 0,5-2 мкг/мл; 0,5-3 мкг/мл; 0,5-4 мкг/мл; 0,5-5 мкг/мл; 0,5-6 мкг/мл; 0,5-7 мкг/мл; 0,5-8 мкг/мл; 0,5-9 мкг/ мл; 1-9 мкг/мл; 2-9 мкг/мл; 3-9 мкг/мл; 4-9 мкг/мл; 5-9 мкг/мл; 6-9 мкг/мл; 7-9 мкг/мл; 8-9 мкг/мл.

Конъюгат используется в соответствии с рабочим разведением, которое зависит от концентрации антител в конъюгате, также может использоваться конъюгат готовый к использованию в рабочем разведении.

Для осуществления способа ИФА могут быть использованы калибровочные образцы, которые представляют собой разведения S-антигена SARS-CoV. Например, «COVID 19 Spike S1+S2 (ECD) Coronavirus Active Protein», # MBS2563881, MyBioSource, США или аналогичный по характеристикам. Антиген должен быть получен в эукариотической системе экспрессии белка, то есть быть гликозилированным, и содержать в своем составе полноразмерные S1 и S2 субъединицы S-белка.

Вакцина признается качественной по показателю специфической активности, если она способна индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации.

С помощью изобретения контроль качества по показателю специфической активности может быть организован in vitro: как для готовой лекарственной формы вакцины, так и для ее полупродуктов, начиная с этапа получения первичного вирусного сбора в процессах: разработки и/или производства и выпуска в гражданский оборот и/или после выпуска в гражданский оборот.

Для определения способности вакцины индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации проводят сравнение концентрации S-антигена в вакцине на контролируемом этапе с референтными минимальным и максимальным значениями концентрации S-антигена на этом же этапе. Вакцина и/или ее полупродукт признаются качественными по показателю специфической активности, если концентрация S-антигена на выбранном для контроля этапе равна или превышает минимальное референтное значение концентрации S-антигена для этого же этапа и не превышает максимальное значение концентрации S-антигена для этого же этапа.

Первоначальные референтные значения минимальной и максимальной концентраций S-антигена для вышеуказанных целей определяются разработчиком на этапе доклинических исследований из тех серий вакцины, которые в тестах in vivo были признаны обеспечивающими специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации.

Применение изобретения в одном из вариантов реализации одновременно с фиксацией вышеуказанных минимального и максимального значений белкового компонента на in vivo моделях на стадии доклинических исследований позволяет в дальнейшем заменить животную модель тестов по показателям специфической активности на тесты in vitro с контролем минимального и максимального значений S-антигена: как в готовой вакцине, так и в ее полупродуктах.

Изобретение также годится для организации контроля полноты сорбции для вакцин, адсорбированных на гидроокиси алюминия. Если определенное после стадии сорбции количество специфического антигена на гидроокиси алюминия, умноженное на объем первичного контейнера, меньше минимального количества специфического антигена в дозе вакцинного препарата, определенного на этапе доклинических исследований, оно может быть скорректировано.

Использование изобретения позволяет уменьшить количество брака при производстве вакцины.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены для понимания настоящего изобретения. Однако эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Приготовление иммуносорбента

Из моноклональных антител. Первое (не нейтрализующее) моноклональное мышиное антитело (ATI) разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) до конечной концентрации 1 мкг/мл, вносили по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета для ИФА с высокой связующей способностью (в примере использовался планшет Corning # 2592) и инкубировали в течение 16-18 ч при +4°С. После инкубации раствор удаляли и 3 раза промывали раствором фосфатно-солевого буфера с Твин-20 (ФСБ-Т), внося в каждую лунку по 300 мкл раствора, выдерживали его не менее 20 секунд. Промывали вручную или с использованием автоматического промывателя. Далее вносили по 150 мкл 1% раствора казеина в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-х часов. Раствор отбирали и сушили планшеты в ламинаре 1 час.

Из поликлопальпых антител. Для приготовления иммуносорбента из поликлональных антител их разводили до концентрации 5 мкг/мл в ФСБ и вносили по 100 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета для ИФА с высокой связующей способностью (в примере использовался планшет Corning # 2592) и инкубировали в течение 16-18 ч при +4°С. После инкубации раствор удаляли и 3 раза промывали раствором фосфатно-солевого буфера с Твин-20 (ФСБ-Т), внося в каждую лунку по 300 мкл раствора, выдерживали его не менее 20 секунд. Промывали вручную или с использованием автоматического промывателя. Далее вносили по 150 мкл 1% раствора казеина в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-х часов. Раствор отбирали и сушили планшеты в ламинаре 1 час.

Пример 2. Проведение иммуноферментного анализа в одностадийном формате

В первые 5 лунок планшета с иммобилизованными на его поверхности антителами к S-антигену (см. Пример 1) вносили по 50 мкл калибрантов, представляющих собой последовательные 2-х кратные разведения рекомбинантного S-антигена SARS-CoV-2 («COVID 19 Spike S1+S2 (ECD) Coronavirus Active Protein», # MBS2563881, MyBioSource, США): KOI (конечное разведение в лунке после добавления конъюгата 50 нг/мл), К02 (25 нг/мл), КО3 (12,5 нг/мл), КО4 (6,25 нг/мл). Во все последующие лунки, в которых в дальнейшем проводился анализ, вносили по 40 мкл ФСБ, в том числе те лунки куда добавляли контрольные образцы К+ и К-. Затем в 3 лунки вносили по 10 мкл К- (осветленная культуральная жидкость, полученная при выращивании культуры клеток Vero) и в 2 лунки по 10 мкл К+ (рекомбинантный S-антиген SARS-CoV-2), в остальные лунки вносили по 10 мкл исследуемых образцов (ИО1-ИО6) полуфабрикаты вакцины или готовая форма. См. схему.

Далее во все лунки планшета вносили по 50 мкл рабочего разведения конъюгата, который представляет собой нейтрализующее SARS-CoV-2 моноклональное мышиное антитело (АТ2-ПХ), конъюгированное с пероксидазой хрена. Планшет заклеивали пленкой и выдерживали в течение 45 мин. при температуре +37°С.

Удаляли жидкость из лунок с помощью аппарата для промывания планшетов. Промывали планшет пятикратно ФСБ-Т, внося в лунки по 300 мкл раствора и выдерживая раствор в лунках не менее 20 секунд.

Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл индикаторного раствора ТМБ (например, Sigma T0565-100ML или аналогичный). Планшет помещали в защищенное от света место на 20 мин. при температуре от +15°С до +25°С. Останавливали пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 50 мкл раствора 2М серной кислоты и немедленно проводили учет результатов в планшетном спектрофотометре (например, LisaScan, Erba Mannheim или аналогичный) при 450 нм, волна сравнения 620-650 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляли по воздуху.

Пример 3. Проведение иммуноферментного анализа в двухстадийном формате

Во все лунки планшета с иммобилизованными на его поверхности ATI (см. Пример 1), где проводилась реакция вносили по 90 мкл ФСБ, в первые 5 лунок планшета вносили по 10 мкл калибрантов, представляющих собой последовательные 2-х кратные разведения рекомбинантного S-антигена SARS-CoV-2 («COVID 19 Spike S1+S2 (ECD) Coronavirus Active Protein», # MBS2563881, MyBioSource, США): KO1 (конечное разведение в лунке после добавления ФСБ - 50 нг/мл), КО2 (25 нг/мл), КО3 (12,5 нг/мл), КО4 (6,25 нг/мл). В следующие 3 лунки вносили по 10 мкл К- (осветленная кулыуральная жидкость, полученная при выращивании культуры клеток Vero) и в 2 лунки - по 10 мкл К+ 17 (рекомбинантный S-антиген SARS-CoV-2), в остальные лунки вносили по 10 мкл исследуемых образцов (ИО1-ИО6) - полуфабрикаты вакцины или готовая форма. См. схему.

Планшет заклеивали и выдерживали в течение 45 мин при температуре +37°С. Удаляли жидкость из лунок с помощью аппарата для промывания планшетов. Промывали планшет трижды ФСБ-Т, внося в лунки по 300 мкл раствора и выдерживая раствор в лунках не менее 20 секунд.

Далее во все лунки планшета вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата АТ2-ПХ. Планшет заклеивали пленкой и выдерживали в течение 45 мин. при температуре +37°С.

Удаляли жидкость из лунок с помощью аппарата для промывания планшетов. Промывали планшет пятикратно ФСБ-Т, внося в лунки по 300 мкл раствора и выдерживая раствор в лунках не менее 20 секунд.

Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл индикаторного раствора ТМБ (например, Sigma T0565-100ML или аналогичный). Планшет помещали в защищенное от света место на 15-20 мин. при температуре от +15°С до +25°С. Останавливали пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки по 50 мкл раствора 2М серной кислоты и немедленно проводили учет результатов в планшетном спектрофотометре (например, LisaScan, Erba Mannheim или аналогичный) при 450 нм, волна сравнения 620-650 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляли по воздуху.

Схема расчета концентрации S-белка в образце

Для количественной оценки содержания S-белка и построения калибровочной прямой можно воспользоваться любым программным обеспечением планшетного спектрофотометра, согласно инструкции производителя или воспользоваться программным обеспечением MS Excel (изобретатели использовали спектрофотометр LisaScan ЕМ (Erba Mannheim и ПО MS Excel).

Для этого необходимо построить точечный график зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации S-белка в образце. После чего добавить линию тренда, выбрав линейный параметр, и поставить галочку напротив «показывать уравнение на диаграмме». На диаграмме появится формула вида:

у = ах + b, где

у - оптическая плотность образца, х - концентрация белка, а и b - постоянные коэффициенты, которые определяются программным обеспечением MS Excel для конвертации графиков в формулы при построении линии тренда.

Для расчета концентрации использовали формулу:

х=(у-b)/а*10, где

10 - это коэффициент, учитывающий 10-кратное разведение исследуемого образца в лунке планшета.

Пример 4. Определение содержания антигена SARS-CoV-2 в вакцине Ковивак

Для определения полноты сорбции проводили измерение концентрации S-антигена перед добавлением гидроокиси алюминия и после адсорбции: в супернатанте и после десорбции с гидроокиси алюминия (ФСЗ.3.1.0029.15 Государственной фармакопеи XIV). Согласно требованиям Государственной фармакопеи XIV, вакцины, содержащие гидроокись алюминия, должны иметь показатель качества «полнота сорбции». Концентрации антигена SARS-CoV-2 в препарате перед добавлением гидроокиси алюминия и в готовых сериях (с использованием десорбции), измеренные и рассчитанные в соответствии с предыдущими примерами, представлены в таблице 1.

Как следует из представленных в таблице 1 данных, в готовых сериях Ковивак Мечников СА в супернатанте антиген вируса SARS-CoV-2 не определяется. В то же время после десорбции антигена с гидроокиси алюминия антиген определяется, что свидетельствует об отсутствии потерь антигена при сорбции. Концентрации десорбированного антигена сопоставимы с концентрациями антигена до добавления гидроокиси.

Пример 5. Определение содержания антигена SARS-CoV-2 в вакцинах BBIBP-CorV и BBIBP-CorV

Для исследования были выбраны следующие вакцины:

BBIBP-CorV (Sinopharm COVID-19 Vaccine) вакцина против COVID-19 производства CNBG (Sinopharm), Китай; четыре серии. Одобрена в Китае, Бахрейне, Объединенных Арабских Эмиратах; CoronaVac - вакцина против COVID-19 производства Sinovac Biotech, Китай; три серии. Вакцина одобрена ВОЗ.

В качестве препаратов сравнения выбраны Альгавак®М - вакцина для профилактики вирусного гепатита А, производства АО «Вектор-БиАльгам», Россия. Разрешена к применению в Российской Федерации; Флю-М Тетра - вакцина гриппозная четырехвалентная инактивированная расщепленная производства ФГУП СПбНИИВС ФМБА России. Разрешена к применению в Российской Федерации.

Проведение десорбции вирусного антигена с гидроокиси алюминия

Приготовление раствора для проведения десорбции. Раствор десорбции (РД) готовили в соответствии с ФС.3.3.1.0029.15 ГФ РФ XIV. В мерный стакан из термостойкого стекла объемом 250 мл вносили 150 мл воды очищенной и подогревали до температуры 40°С. В подогретую воду вносили 200 мг желатина и на магнитной мешалке размешивали до полного его растворения. Затем добавляли 28,64 г Na₂HPO4 × 12Н₂О (Sigma-Aldrich, США) и 220 мг трилона Б (Sigma-Aldrich, США). После полного растворения к полученному раствору добавляли 200 мкл Твин-20 (Sigma-Aldrich, США). Доводили рН раствора до 8,5. Полученный раствор переливали в мерную колбу объемом 200 мл и доводили объем до метки водой очищенной. Для длительного хранения в полученный раствор в качестве консерванта добавляли мертиолят в количестве 0,02 г и переливали в емкость с притертой стеклянной пробкой. Раствор хранили при комнатной температуре не более 6 месяцев.

Подготовка исследуемого образца

Суспензию исследуемого препарата объемом 0,5 мл (доза) помещали в микропробирку объемом 1,5 мл и в течение 5 мин. центрифугировали на центрифуге ELMI СМ-50 (Elmi, Латвия) при 6000g при комнатной температуре. Отбирали 450 мкл надосадочной жидкости в чистую пробирку и оставляли на 18 ч в холодильнике при температуре 2-8°С для последующего анализа, а к осадку добавляли 450 мкл РД. Пробирку встряхивали на вортексе и оставляли на 18 ч при комнатной температуре (18-24°С). Спустя 18 ч пробирку центрифугировали в течение 10 с при 6000g и надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку для проведения иммуноферментного анализа. Таким образом было получено по 2 образца для анализа каждого из исследованных образцов вакцин: надосадочная жидкость и десорбированный образец.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Для количественного определения S-антигена нового коронавируса человека SARS- CoV-2 в исследуемых образцах применяли набор реагентов BHoCKaH-SARS-CoV-2 (S), основанный на одностадийном «сэндвич»-варианте метода ИФА. На поверхности лунок 96-луночного полистиролового планшета иммобилизованы специфические моноклональные антитела (МАТ) к рецептор-связывающему домену (receptor-binding domain, RBD) Spike-белка (S-антиген) вируса SARS-CoV-2. В лунки планшета вносили калибратор в соответствии с инструкцией производителя, положительный (К+) и отрицательный (К-) контрольные образцы, исследуемые образцы, а также конъюгат, представляющий собой МАТ к другому эпитопу RBD Spike-белка, меченные пероксидазой хрена. Если в исследуемом образце присутствовал S-антиген, то при инкубации происходило его связывание с МАТ на поверхности планшета и с конъюгатом. После отмывания несвязанных молекул в лунки планшета добавляли индикаторный раствор, включающий субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин с перекисью водорода. Ферментативная реакция пероксидазы с субстратом в присутствии перекиси водорода приводила к его окислению и образованию окрашенного продукта, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации антигена в образце. После остановки реакции стоп-реагентом интенсивность окрашивания раствора измеряли на планшетном спектрофотометре (LisaScan ЕМ, Erba Mannheim, Чехия) по оптическому поглощению при длине волны 450 нм (длина волны сравнения 620-650 нм). При построении калибровочной прямой использовали программное обеспечение спектрофотометра согласно инструкции производителя и программное обеспечение Microsoft Office Excel (Microsoft, США).

Количественное определение S-антигена SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа и построение калибровочного графика

Количественное определение S-антигена SARS-CoV-2 в исследуемых образцах проводили методом ИФА (одностадийный «сэндвич»-вариант ИФА) с использованием набора реагентов «BHoCKaH-SARS-CoV-2 (S)». Калибратор, используемый в наборе реагентов, представлял собой высокоочищенный рекомбинантный коммерческий S-антиген (MyBioSource MBS2563881, США), полученный в эукариотической системе экспрессии. Для количественной оценки содержания S-белка на основании полученных в результате ИФА оптических плотностей (ОП) для калибровочных образцов строили график зависимости ОП450 от концентрации S-белка в исследуемом препарате (Фиг. 3).

График описывается формулой:

где у - ОП образца, х - концентрация белка, а и b - постоянные коэффициенты.

Для расчета концентрации использовали формулу:

где 10 - коэффициент, учитывающий 10-кратное разведение исследуемого образца в лунке планшета.

Поскольку на поверхности каждого вириона SARS-CoV-2 располагается в среднем 90 пепломеров (тримеров S-белка), то есть 270 молекул S-антигена (молекулярная масса каждого 180 кДа), а масса 1 вириона составляет примерно 1 фг, то S-белок составляет около 8% от массы вириона вируса SARS-CoV-2. Таким образом, коэффициент пересчета массы S-антигена в массу цельновирионного препарата составляет 12,5 (100/8=12,5).

Для перевода количества S-антигена в общее количество вирусного белка в вакцине (мкг/мл) необходимо воспользоваться формулой:

где С - расчетная концентрация специфического белка в вакцине (мкг/мл), х - концентрация S-антигена (мкг/мл) в цельновирионной вакцине.

Доза специфического антигена в вакцинах CoronaVac и BBIBP-CorV оценивается в условных единицах - 600 SU и 6,5 U соответственно. Производитель не указывает, чему соответствует каждая из единиц. При проведении доклинических и клинических исследований фаз I II производители указывали концентрации антигена в микрограммах - от 1,5 до 10. Однако в публикациях о результатах клинических исследований III фазы доза вакцины указывается уже в условных единицах активности [Benjamanukul S, Traiyan S, Yorsaeng R, Vichaiwattana P, Sudhinaraset N, Wanlapakorn N, Poovorawan Y. Safety and immunogenieity of inactivated COVID-19 vaccine in health care workers. J Med Virol. 2022;94(4): 1442-9].

В вакцине КовиВак содержание антигена нормируется как не менее 3 мкг на дозу. В доклинических исследованиях было показано, что именно доза от 3 мкг обеспечивает формирование специфического гуморального и клеточного иммунитета [Kozlovskaya LI, Piniaeva AN, Ignatyev GM, Gord- eychuk IV, Volok VP, Rogova YV, et al. Long-term humoral immuno genie ity, safety and protective efficacy of inactivated vaccine against COVID-19 (CoviVac) in preclinical studies. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1790-806]. На этом основании можно предположить, что содержание S-антигена для вакцины КовиВак должно составлять на дозу не менее 240 нг (3 мкг/12,5 = 0,24 мкг = 240 нг) или 480 нг/мл.

Исследование чувствительности и специфичности набора реагентов «BHoCicaH-SARS-CoV-2 (S)»

Оценка аналитической чувствительности набора реагентов. Для оценки чувствительности набора реагентов были исследованы коммерческие рекомбинантные елки SARS-CoV-2: S-антиген и RBD (MyBioSource, США), с известной концентрацией аффинно-очищенного белка. Аналитическая чувствительность тест-системы составила: по S-антигену - 2 нг/мл, по RBD - 100 пг/мл, что согласуется с особенностями строения вируса и молекулярными массами белков. S-белок в нативном состоянии представляет собой пепломер, состоящий из трех молекул S-белка, то есть его молекулярная масса составляет примерно 540 кДа (180 кДа × 3). Рекомбинантный антиген RBD имеет молекулярную массу около 26 кДа, и, в отличие от S-белка, он не собирается в тримеры и в растворе представлен в виде мономеров. Исходя из соотношения молекулярных масс S-антигена и МАТ, с одним пепломером, вероятно, может провзаимодействовать только одна пара антител (МАТ на твердой фазе и МАТ конъюгата), также как и с RBD. Расчетное соотношение молекулярных масс пепломера и RBD составляет 20,8 (540 кДа/26 кДа = 20,8), что согласуется с аналитической чувствительностью, полученной при ее оценке набором реагентов «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)» - 2 нг/мл и 100 пг/мл для S-антигена и RBD соответственно, соотношение также составляет 20 раз (2 нг/0,1 нг = 20).

Оценка специфичности набора реагентов в отношении сорбированных вакцин

На первом этапе исследования использовали набор реагентов «ВГА-антиген-ИФА-БЕСТ», который применялся при оценке полноты сорбции антигена в вакцине Альгавак®М. Для исследования использовали образцы вакцин Альгавак®М, CoronaVac и BBIBP-CorV после десорбции антигена. Подготовку образца вакцины Флю-М, не содержащей гидроокись алюминия, проводили путем центрифугирования, отбора супернатанта и последующей подготовки «осадка», полученные исследуемые образцы вакцин (надосадочная жидкость и десорбированный материал) были проанализированы на наличие антигена вируса гепатита А методом ИФА с использованием набора реагентов «ВГА-антиген-ИФА-БЕСТ». Результаты качественного определения антигена в исследуемых образцах представлены в таблице 2.

Примечание. Нет - антиген не выявлен. Есть - подтверждено наличие антигена.

Было показано, что вакцина Альгавак®М содержит специфический антиген вируса гепатита А только в десорбированном образце. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в готовом препарате вакцины антиген сорбирован. Во всех остальных вакцинах антиген гепатита А не детектировался, что свидетельствует об отсутствии ложно положительных результатов. Поскольку авторы не располагали информацией о количестве антигена гепатита А, использованного для сорбции на гидроокиси алюминия при получении исследуемой серии вакцины Альгавак®М, невозможно было провести исследование на полноту сорбции, но производитель Альгавак®М такое исследование проводит в соответствии с нормативной документацией, оценивая концентрацию антигена до сорбции и после десорбции.

В дальнейших исследованиях вакцины Альгавак®М и Флю-М были использованы для контроля специфичности набора реагентов «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)» при определении содержания антигена S ARS-CoV-2 в препаратах вакцин.

На втором этапе работы проводили качественное определение антигена SARS-CoV-2 в исследуемых вакцинах. Для этого десорбировали антиген согласно методике, после чего определяли содержание специфического антигена вируса SARS-CoV-2 методом ИФА с использованием набора реагентов «БиоСкан-SARS-CoV-2 (S)» (табл.3).

26

Из представленных данных следует, что антиген вируса SARS-CoV-2 отсутствовал как в надосадочной жидкости (до десорбции), так и в десорбированных образцах вакцин Альгавак®М и Флю-М, что может свидетельствовать о специфичности набора реагентов. В десорбированных образцах инактивированных вакцин против COVID-19 специфический антиген определялся, а в надосадочной жидкости - нет. Это подтверждает, что в вакцинах BBIBP-CorV и CoronaVac антиген сорбирован на гидроокиси алюминия полностью.

Количественное определение антигена SARS-CoV-2 в вакцинах CoronaVac и BBIBP-CorV с использованием набора реагентов «EnoCKaH-SARS-CoV-2 (S)»

Вакцины CoronaVac и BBIBP-CorV являются адсорбированными - на гидроокиси алюминия сорбирован инактивированный антиген вируса SARS-CoV-2. Доза антигена в вакцине CoronaVac составляет 600 SU, а в вакцине BBIBP-CorV - 6,5 U. Нет никаких указаний на то, какому количеству антигена соответствуют условные единицы в каждой из вакцин. На этапе доклинических и клинических исследований фаз I II указывались дозы вакцин в микрограммах. Было отмечено, что доза должна быть не менее 2 мкг для вакцины BBIBP-CorV и 3 мкг для вакцины CoronaVac [Benjamanukul S, Traiyan S, Yorsaeng R, Vichaiwattana P, Sudhinaraset N, Wanlapakorn N, Poovorawan Y. Safety and immunogenicity of inactivated COVID-19 vaccine in health care workers. J Med Virol. 2022;94(4): 1442-9]. Эти результаты согласуются с данными о вакцине КовиВак, где доза определена как не менее 3 мкг [Kozlovskaya LI, Piniaeva AN, Ignatyev GM, Gordeychuk IV, Volok VP, Rogova YV, et al. Long-term humoral immunogenicity, safety and protective efficacy of inactivated vaccine against COVID-19 (CoviVac) in preclinical studies. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1): 1790-806].

Далее определяли концентрацию специфического антигена в образцах исследуемых вакцин с использованием набора реагентов «BHoCKaH-SARS-CoV-2 (S)» и проводили расчет соответствия условных единиц дозы вакцин CoronaVac и BBIBP-CorV весовым значениям содержания антигена в вакцинах.

Для определения количества S-антигена, адсорбированного на гидроокиси алюминия, использовали образцы четырех серий вакцины BBIBP-CorV и трех серий вакцины CoronaVac. При определении концентраций S-антигена использовали калибровочную прямую (Фиг. 3), полученную с использованием калибраторов, входящих в состав набора. Калибратор представляет собой рекомбинантный полноразмерный S-антиген. При оценке содержания специфического S-антигена каждый образец исследовали в трех повторах, определяя среднее значение и стандартное отклонение показателя. Результаты представлены в таблице 5.

Во всех исследуемых сериях вакцинных препаратов (табл.4) антиген адсорбирован на поверхности гидроокиси алюминия, поскольку в супернатанте антиген не был обнаружен. После десорбции S-антиген определялся во всех образцах, но его концентрация зависела от производителя и лота вакцины. В исследованных сериях вакцины BBIBP-CorV концентрация S-антигена в десорбированных образцах варьировала в среднем от 61 до 129 нг/мл. Полученные результаты свидетельствуют либо о неполной десорбции антигена с гидроокиси алюминия, либо об определении концентрации специфического антигена производителем не по S-белку, а, например, по содержанию общего белка. Также большой разброс концентраций S-антигена в разных лотах вакцины может свидетельствовать о проблемах логистики и хранения, из-за чего часть специфического белка могла разрушиться. Средняя расчетная концентрация специфического антигена (С) в четырех сериях вакцины BBIBP-CorV составила 1,25±0,20 мкг/мл (0,625 мкг на дозу), что не совпадает с заявленной производителем на этапах доклинического исследования и I-II фазы клинического исследования минимальной дозой 2,0 мкг [Wang Н, Zhang Y, Huang В, Deng W, Quan Y, Wang W, et al. Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2. Cell. 2020;182(3):713-21. e9. Xia S, Duan K, Zhang Y, Zhao D, Zhang H, Xie Z, et al. Effect of an inactivated vaccine against SARS- CoV-2 on safety and immunogenicity outcomes: Interim Analysis of 2 Randomized Clinical Trials. JAMA. 2020;324(10):951-60].

В исследованных сериях вакцины CoronaVac концентрация S-антигена в десорбированных образцах варьировала в среднем от 461 до 533 нг/мл. Среднее значение концентрации специфического S-антигена в трех сериях составило 504,20±24,33 нг/мл. Таким образом, значение расчетной концентрации специфического антигена составило 6,30±0,30 мкг/мл (3,15 мкг на дозу), что совпадает с заявленной производителем на этапах доклинического исследования и клинического исследования I II фазы дозой не менее 3 мкг.

Таким образом, можно сделать вывод, что производитель вакцины BBIBP-CorV использует для определения содержания антигена показатель общего белка, а производитель CoronaVac - концентрацию специфического антигена (S1 или RBD).

Показано, что разница в концентрациях S-антигена в десорбированных препаратах вакцин в разных сериях варьировала между двумя производителями (CNBG, Sinopharm и Sinovac Biotech) в диапазоне от 3,6 раза (129 и 461 нг/мл) до 8,7 раза (61 и 533 нг/мл) у BBIBP-CorV и CoronaVac соответственно, при этом в вакцине BBIBP-CorV значения концентраций S-антигена в двух разных лотах могли различаться более чем в 2 раза (61 и 129 нг/мл), что можно объяснить тем, что под условными единицами дозировки в вакцине BBIBP-CorV подразумевается показатель общего белка. В то же время разброс значений концентрации S-антигена между лотами вакцины CoronaVac не превышает 15% - это свидетельствует об оценке содержания антигена в вакцине по концентрации специфического антигена при изготовлении готовой лекарственной формы.

Предложенный способ оценки является универсальным и может быть рекомендован для контроля качества адсорбированных вакцин против COVID-19. Определение специфического S-антигена вируса SARS-CoV-2 для определения полноты сорбции при производстве вакцин. Предложенный способ расчета позволяет определить концентрацию специфического антигена исходя из концентрации S-антигена. Такой подход может применяться на разных этапах производственного цикла при изготовлении вакцин для более точной оценки специфического антигена в полуфабрикатах, так как при наработке вируса в вируссодержащей жидкости присутствует много других клеточных белков, и оценка общего белка не может в полной мере характеризовать качество и количество специфического антигена. Кроме того, продемонстрировано превосходство заявленного способа над известными.

Пример 6. Сравнение данных, полученных с помощью предлагаемого способа в примерах 1-5, с данными по результатам использования животной модели

Для оценки минимальной иммуногенной дозы антигена S-белка в препарате вакцины были исследованы 5 различных серий вакцины «Ковивак».

Определяли корреляцию между содержанием S-антигена и способностью вакцины индуцировать специфический иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител в реакции нейтрализации (РН) мышиных сывороток, взятых через 2 недели после второй иммунизации (сравнивались значения содержания S-антигена (нг/мл) после десорбции антигена с гидроокиси алюминия, измеренные предлагаемым способом, и значения титра вирус-нейтрализующих антител в сыворотке крови мышей, полученных в ответ на введение вакцины in vivo, в реакции нейтрализации).

Было показано, что имеется прямая положительная корреляция между количеством S-антигена в дозе и нейтрализующим титром антител в РН (табл.2).

Корелляционные связи определялись с использованием парного метода корелляционного анализа [Корреляционный анализ. Непараметрические методы/ А.М. Шихалев. - Казань: Казан. ун-т, 2015.-58 с].

Как следует из представленных в таблице 5 данных, в супернатанте всех использованных серий Ковивак антиген вируса SARS-CoV-2 не обнаружен. Напротив, при проведении десорбции антигена с гидроокиси алюминия в полученных образцах антиген SARS-CoV-2 был выявлен. Концентрации антигена колебалась от серии к серии от 250 нг/ доза до 733 нг/доза. В зависимости от концентрации антигена серии был присвоен ранг от 1 до 5 от большей концентрации к меньшей. По данным паспортов на серии использованных в исследовании показатели способности индуцировать иммунный ответ были разными. В зависимости от показателей иммунного ответа (от большего титра к меньшему) серии был присвоен ранг от 1 до 5. Как следует из таблицы 5 ранги концентраций и титров совпадают то есть была показана прямая зависимость между концентрацией S-антигена SARS-CoV-2 в вакцине, измеренной предлагаемым способом, и титром вирус-нейтрализующих антител формируемым в ответ на введение вакцины.

Из приведенного примера явно следует, что результаты целевых тестов in vitro коррелируют с результатами тестов in vivo. Наличие указанной корреляции может быть установлено в процессе доклинических и/или клинических исследований, что позволяет вносить применение тестов in vitro в нормативную документацию производителя вакцинного препарата для их дальнейшего использования в производственном процессе для определения соответствует ли вакцинный препарат требованию качества.

В то же время параметры содержания общего белка в вакцине не могут служить доказательством высокого качества вакцины, поскольку не коррелируют со способностью вакцинного препарата индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации должным образом, что, при использовании параметра общий белок в качестве референтного, может приводить к полному отсутствию или низкой эффективности вакцины.

Минимальная концентрация S-антигена в вакцинном препарате должна быть не менее 240 нг на дозу. Данное количество было определено путем расчета в соответствии с данными производителя вакцины Ковивак по минимальному содержанию вирусного антигена в дозе. Поскольку на поверхности SARS-CoV-2 располагается в среднем 90 пепломеров, то есть 270 молекул S-антигена (молл. масса 180 кДа), а масса 1 вириона составляет примерно 1 фг [Bar-On et al. eLife 2020;9:e57309. DOI: https://doi.org/10.7554/ eLife. 57309], то весь S-белок составляет 8% от массы вириона вируса SARS-CoV-2. Таким образом можно считать, что коэффициент пересчета массы S-антигена в массу цельновирионного препарата составляет 12,5 (100%/8%=12,5).

В нормативной документации на вакцину «Ковивак» указана минимальная допустимая концентрация антигена на дозу не менее 3 мкг, значит, содержание S-антигена должно составлять на 1 дозу вакцины не менее 240 нг (3 мкг/12,5=0,24 мкг=240 нг). Расчетная доза соответствует концентрации, определенной в серии Е вакцины Ковивак (табл.5), где был показан минимальный титр в РН - 1:50.

Контроль максимально допустимой концентрации специфического антигена стандартно не проводится. Разработчики в рамках доклинических исследований и первой, и второй фазы клинических исследований определяют параметр максимально допустимого содержания общего белка в вакцине, в состав которого входят: специфический белок, а также вирусные и балластные белки. Данный параметр количества общего белка затем является обязательным для системы контроля качества при производстве препарата. Однако, при необходимости в рамках указанных исследований разработчики с помощью изобретения также могут определить максимально допустимое количество S-антигена в ранее определенном максимально допустимом количестве общего белка и затем с помощью изобретения контролировать этот параметр в процессе производства и при хранении.

Таким образом, выявленная корреляция между количеством специфического антигена и способностью вакцинного препарата индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ, достаточный для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации в рамках заявленного способа, позволяет рекомендовать способ количественного определения концентрации RBD; S-антигена в качестве замены теста на животных моделях в готовых лекарственных формах вакцинных препаратах для определения их качества.

Кроме того, приведенный пример демонстрирует:

- возможность сокращения сроков проведения тестов при замене in vivo и in vitro (более одного месяца против двух часов);

- удобство проведения тестов in vitro в сравнении с тестами in vivo;

- уверенность в том, что специфический гуморальный иммунный ответ связан с выработкой вирус-нейтрализующих антител в количестве, достаточном для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител, а не антител на вирусные и/или балластные белки, которые не оказывают необходимого профилактического эффекта.

Проведенные исследования также позволяют сделать вывод о том, что способ может быть применен для сравнения всех вышеуказанных вакцин по единому стандартному для них параметру - количественному значению концентрации специфического антигена.

Использование настоящего способа существенно сокращает издержки при производстве вышеуказанных вакцинных препаратов за счет возможности минимизации брака, экономии времени и средств и, в конечном итоге, приводит к существенному снижению себестоимости препарата.

Использование настоящего изобретения позволяет производить вышеуказанные вакцинные препараты предприятиям, у которых отсутствуют участки производства для работы с живыми вирусами по стандарту BSL3 «WHO Laboratory Biosafety Manual Fourth Edition dd 21 December 2020» (в Российской Федерации участки производства, соответствующие требованиям работы с возбудителями второй группы патогенности в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»), что особенно важно в периоды эпидемий.

Заявленная группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности. Описан способ количественного определения концентрации S-антигена методом иммуноферментного анализа в вакцине, выбранной из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка, рекомбинантных или полипептидных, содержащих рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке вируса SARS-CoV, предназначенной для профилактики коронавирусных инфекций. При этом иммуноферментный анализ проводят с использованием специфических к рецептор-связывающему домену RBD S-белка вируса SARS-CoV моноклональных антител двух типов, распознающих различные не перекрывающиеся эпитопы рецептор-связывающего домена RBD S-белка вируса SARS-CoV, способных детектировать по меньшей мере один конкретный штамм вируса SARS-CoV, не взаимодействующих при этом с другими штаммами вируса SARS-CoV. По меньшей мере одно антитело сорбировано на полистироловом планшете и является антителом первого типа, по меньшей мере одно антитело конъюгировано с лигандом и является антителом второго типа. Также описано применение указанного способа для контроля качества вакцины. Изобретение позволяет значительно упростить, существенно сократить сроки производства вакцинных препаратов, удешевить проведение необходимых тестов и исследований с сохранением качества, характерного для in vivo тестов. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 7 пр.

1. Способ количественного определения концентрации S-антигена методом иммуноферментного анализа в вакцине, выбранной из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка, рекомбинантных или полипептидных, содержащих рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке вируса SARS-CoV, предназначенной для профилактики коронавирусных инфекций, отличающийся тем, что иммуноферментный анализ проводят с использованием специфических к рецептор-связывающему домену RBD S-белка вируса SARS-CoV моноклональных антител двух типов, распознающих различные не перекрывающиеся эпитопы рецептор-связывающего домена RBD S-белка вируса SARS-CoV, способных детектировать по меньшей мере один конкретный штамм вируса SARS-CoV, где по меньшей мере одно антитело сорбировано на полистироловом планшете и является антителом первого типа, по меньшей мере одно антитело конъюгировано с лигандом и является антителом второго типа.

2. Способ определения по п.1, в котором SARS-CoV представляет собой SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 или их мутанты, содержащие последовательность рецептор-связывающего домена RBD S-белка.

3. Способ определения по п.1 где на полистироловом планшете сорбируется по меньшей мере одно моноклональное антитело в концентрации от 0,5 до 10 мкг/мл.

4. Способ определения по п.1, в котором моноклональное антитело второго типа конъюгировано с лигандом, представляющим собой пероксидазу хрена, биотин, щелочную фосфатазу, коллоидное золото или другие металлы и их производные.

5. Способ определения по п.1, который характеризуется тем, что по меньшей мере одно моноклональное антитело первого типа не обладает нейтрализующей активностью, а моноклональное антитело второго типа обладает нейтрализующей активностью.

6. Способ определения по п.1, который характеризуется тем, что по меньшей мере одно моноклональное антитело первого типа обладает нейтрализующей активностью, а моноклональное антитело второго типа не обладает нейтрализующей активностью.

7. Способ определения по п.1, который характеризуется тем, что антитела первого и второго типов не обладают нейтрализующей активностью.

8. Способ определения по п.1, который характеризуется тем, что антитела первого и второго типов обладают нейтрализующей активностью.

9. Способ определения по п.1, в котором моноклональные антитела представляют собой антитела от хозяев, выбранных из группы: мышь, крыса, кролик, коза, овца, птица, лошадь, КРС, верблюд, обезьяна, человек.

10. Способ определения по п.1, в котором коронавирусная инфекция представляет собой COVID-19.

11. Способ определения по п.1, в котором эпитопы выбраны из группы SVLYNSASFSTFKCYG, EVRQIAPGQTGKIAD, NLDSKVGGNYNYLYR, LFRKSNLKPFERDIS, AGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQP, YGFQPTNGVGYQPYR.

12. Применение способа по п.1 для контроля качества вакцины, выбранной из группы цельновирионных инактивированных адсорбированных на гидроокиси алюминия, субъединичных на основе S-белка, рекомбинантных или полипептидных, содержащих рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV отдельно, в составе S1 субъединицы или в полноразмерном S-белке SARS-CoV и или/ее полуфабриката, предназначенной для профилактики коронавирусных инфекций в части обеспечения специфического гуморального иммунного ответа, достаточного для выработки защитного титра вирус-нейтрализующих антител у субъекта после вакцинации, в процессе ее разработки производства, выпуска в гражданский оборот и/или после выпуска в гражданский оборот.