Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека и ее применение Российский патент 2020 года по МПК C07K14/165 C12N15/50 C07K1/36 C07K1/16 C07K16/10 

Область техники.

Изобретение относится к биотехнологии и касается создания нового штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей.

Уровень техники.

В конце 2019 года в Китайской Народной Республике (КНР) произошла вспышка новой инфекции с эпицентром в городе Ухань (провинция Хубэй). Через некоторое время был обнаружен возбудитель данной инфекции, которым оказался неизвестный ранее коронавирус, получивший название SARS-CoV-2. В течение нескольких месяцев SARS-CoV-2 распространился по всему миру, став причиной пандемии, затронувшей более 200 стран. К 1 мая 2020 года количество заболевших превысило 3 млн человек, а количество погибших - 220 тыс.человек. При этом прогнозируется дальнейший рост заболеваемости и смертности, поскольку в большинстве стран эпидемия еще не достигла своего пика.

SARS-CoV-2 вызывает потенциально тяжелую острую респираторную инфекцию, которая получила название COVID-19. Для данного заболевания характерно наличие таких клинических симптомов, как повышение температуры тела (более чем в 90% случаев); кашель - сухой или с небольшим количеством мокроты (более чем в 80% случаев); отдышка (в 55% случаев); утомляемость (в 44% случаев); ощущение заложенности в грудной клетке (более чем в 20% случаев). Наиболее тяжелыми осложнениями COVID-19 являются пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др.

В настоящее время не зарегистрировано специфических средств лечения и профилактики COVID-19. В основном производится симптоматическое лечение. 1 апреля 2020 года Департамент здравоохранения Москвы издал приказ «О внедрении технологии использования свежезамороженной плазмы от доноров-реконвалесцентов COVID-19» для лечения пациентов с COVID-19 в терминальной стадии заболевания.

Реконвалесценты - это люди, организм которых успешно справился с заболеванием, и они выздоровели без осложнений. Это произошло, в частности, и потому, что их иммунная система выработала антитела, которые нейтрализуют вирус.Если ввести плазму крови реконвалесцентов, которая содержит такие антитела, другим пациентам, это может смягчить течение их болезни.

Однако, не все образцы плазмы реконвалесцентов содержат одинаковое количество вируснейтрализующих антител. Поэтому актуальным вопросом является разработка метода, который позволил бы проводить масштабный скрининг плазмы и сывороток крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 с целью отбора наиболее перспективных для терапии образцов.

Известен способ оценки сыворотки реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител (Ch. Shen et al. Treatment of 5 Critically Ill Patients With COVID-19 With Convalescent Plasma. JAMA. 2020;323(16):1582-1589. doi:10.1001). Данный способ основан на том, что к клеткам Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим заражают их коронавирусом SARS-CoV-2. Далее клетки инкубируют 37°С, 5% СО₂ в течение 5 дней, затем оценивают цитопатическое действие вируса. Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, которое показало ингибирующую активность SARS-CoV-2). К недостатком данного способа можно отнести длительный срок постановки анализа (5 дней) и необходимость придерживаться правил работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) II группы патогенности. Все это влечет за собой низкую производительность и высокую себестоимость данного анализа.

Кроме того, известен способ оценки плазмы реконвалесцентов путем определения титра вируснейтрализующих антител, в котором вместо коронавируса используются псевдотипированные лентивирусные частицы (PsV) (F.Wu Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications, medRxiv 2020.03.30.20047365). Данный способ включает в себя культивирование клеток 293Т/АСЕ2, к которым добавляют образцы сыворотки крови в различных разведениях и одновременно с этим вносят PsV, содержащие ген люциферазы. Через 48 часов оценивают активность люциферазы стандартным набором (Promega). Результат представляют как титр вируснейтрализующих антител (самое большое разведение сыворотки, при добавлении которого активность люциферазы уменьшается на 50%). Недостатками данного способа являются длительность процесса (48 часов), трудоемкость, необходимость в дорогом оборудовании и высококвалифицированном персонале.

Из литературных данных известно, что рецептор-связывающий домен (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV, является основной мишенью для вируснейтрализующих антител. В публикации Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)) описан способ обнаружения антител к RBD в сыворотке крови пациентов, перенесших инфекцию SARS-CoV. Способ реализуется следующим образом: к адсорбированному в лунках планшета RBD-His добавляют серию разведений образцов сывороток пациентов и контрольные образцы. Связавшиеся с RBD антитела детектируют с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP). Затем добавляют субстрат для HRP и оценивают титр антител к RBD. Данный способ как наиболее близкий к заявляемому был выбран за прототип.Недостатком данного способа является то, что он не позволяет детектировать антитела к коронавирусу SARS-CoV-2 в плазме крови реконвалесцентов COVID-19.

Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке быстрого способа анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19.

Раскрытие изобретения.

Задачей заявленного изобретения является создание эффективной тест-системы и способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для определения образцов сывороток и плазмы крови наиболее перспективных для терапии пациентов с COVID-19, а также способа для быстрого анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.

Технический результат представляет собой получение быстрой и эффективной тест системы для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в сокращении времени и упрощении процедуры анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.

Технический результат также представляет собой высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

Кроме того, технический результат заключается в неожиданно проявленном эффекте для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 отсутствии ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание.

Технический результат достигается за счет разработки генетическая конструкции для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающий SEQ ID NO:1

Также технический результат достигается за разработки штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащего генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1

Также технический результат достигается за счет разработки способа получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, включающий:

- получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1;

- введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции;

- селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.

Также технический результат достигается за счет разработки рекомбинантного белока RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2, являющийся продуктом штамма клеток яичника китайского хомячка.

Также технический результат достигается за счет разработки способа получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающего:

- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;

- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;

- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.

Также технический результат достигается за счет разработки тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющей собой набор реагентов, включающий:

- планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2;

- положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;

- отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;

- конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

- 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;

- буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата;

- раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;

- раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;

- стоп-реагент.

Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, где:

- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят предварительно разведенные испытуемые образцы сывороток или плазмы крови человека;

- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С;

- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;

- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;

- проводят интерпретацию результатов.

Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы, в соответствии с которым:

- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят серии 2х-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека;

- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С;

- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;

- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;

- проводят интерпретацию результатов.

Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 (вариант 1).

Также технический результат достигается за счет разработки способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS - CoV-2 (вариант 2).

Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг.1 - 4 представлены результаты исследования.

Осуществление изобретения.

Краткое описание фигур.

На фиг.1

представлено схематическое изображение генетической конструкции для экспрессии рецептор-связывающего домена (RBD) вируса SARS-CoV2, где

SP - сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость;

RBD - рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV2;

His-tag - гистидиновая метка, обеспечивающая очистку белка методом аффинной хроматографии.

На фиг.2

Представлена схема плазмидного вектора р1-RBD-CoV-2, где

CMV- промотор/энхансер ранних генов цитомегаловируса человека;

генетическая конструкция - разработанная генетическая конструкция SEQ ID NO:1, экспрессирующая рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV2;

poly(A) - сигнал полиаденилирования;

EBV ori - последовательность начала репликации вируса Эпштейна-Барра;

AmpR promoter- промотор гена устойчивости к ампициллину;

Amp - ген устойчивости к ампициллину, который кодирует фермент β-лактамазу, который расщепляет β-лактамное кольцо ампициллина и некоторых других антибиотиков;

ori- последовательность начала репликации;

TK promoter - промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека;

HygroВ - ген устойчивости к Hygromicin B, который кодирует фермент фосфатазу, которая инактивирует этот антибиотик путем его фосфорилирования.

HindIII, XhoI - сайты узнавания для соответствующих рестриктаз.

На фиг.3

представлена электрофореграмма белкового препарата RBD после аффинной очистки, где

М - маркер молекулярного веса;

1.- образец белка RBD 0.75 мкг/мкл;

2.- образец белка RBD 1 мкг/мкл;

3.- образец белка RBD 0.5 мкг/мкл;

4.- образец белка RBD 0.25 мкг/мкл.

На фиг.4

представлены результаты масс спектрального анализа белкового препарата RBD после аффинной очистки, где

[М]+- распределение молекулярных масс однозарядного иона;

[М]2+- распределение молекулярных масс двузарядного иона.

В экспериментальных исследованиях установлено, что большинство антител, обладающих вируснейтрализующей активностью в отношении вида коронавируcов (MERS, SARS и др.) специфически связываются с различными эпитопами рецептор-связывающего домена белка S (spike) (Hofmann H. et al. S protein of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus mediates entry into hepatoma cell lines and is targeted by neutralizing antibodies in infected patients. Journal of Virology. 2004, 78(12):6134-42; He Y. Receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependent epitopes that induce highly potent neutralizing antibodies. Journal of Immunology. 2005, 174(8):4908-15; He Y. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 324(2):773-81.). Установлено, что нейтрализующей активностью обладают антитела, препятствующие связыванию белка S вируса SARS-CoV-2 с рецептором ангиотензин-превращающий фермент 2 (ACE2) на клетках человека. Рецептор-связывающий домен (RBD) является структурным доменом белка S, образующим сайт связывания с рецептором ACE2, поэтому антитела способные связываться с белком RBD могут блокировать контакт с рецептором и, как следствие, препятствовать проникновению вируса в клетки человека. Поэтому введение сыворотки или плазмы доноров-реконвалесцентов COVID-19, содержащей антитела к белку RBD вируса SARS-CoV-2, пациентам с COVID-19 является перспективным средством терапии.

Таким образом, анализ сыворотки или плазмы крови доноров-реконвалесцентов COVID-19 на наличие антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 позволит отбирать наиболее перспективные образцы сыворотки или плазмы, которые обладают терапевтическим эффектом.

В результате проведенной работы была создана генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO:1.

Данная конструкция включает лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека слитый с геном RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновой меткой.

Лидерные пептиды - это сигнальные последовательности, которые играют центральную роль в нацеливании и транслокации почти всех секретируемых белков и многих интегральных мембранных белков как у прокариот, так и у эукариот.От выбора сигнального пептида напрямую зависит секреция рекомбинантного белка. Использование лидерного пептида тяжелой цепи иммуноглобулина G человека позволяет обеспечить высокие уровни продукции рекомбинантного белка RBD в культуральную среду.

Гистидиновая метка - это нуклеотидная последовательность, кодирующая 6 аминокислотных остатков гистидина. Данная метка необходима для последующей очистки белка на иммобилизованных металл-аффинных сорбентах. В данном методе используется способность гистидина связываться с хелатным ионом переходного металла, таким, как никель (Ni2+). Главными преимуществами использования гистидиновой метки является ее небольшой размер, легкость синтеза и отсутствие влияния на функции белка, его специфическую активность и структуру.

Кроме того, в результате проведенной работы была создан штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1 и разработан способ его получения, включающий: получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.

Также, был создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2 и способ его получения, включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.

Кроме того, была создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющая собой набор реагентов, включающий: планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2; положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2; конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена; 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов; буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата; раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина; раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода; стоп-реагент.

Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также предварительно разведенных испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.

Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 является то, что для интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают с отсекающим значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле:

Cut off=А₄₅₀К^-_ср+3 х SD А₄₅₀К^-,

где: Cut off - отсекающие значения оптической плотности,

А₄₅₀К^-_ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,

SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,

при этом образец считают положительным, если после проведения анализа оптическая плотность в лунках планшета с опытным образцом при длине волны 450 нм в 2,5 раза превышает отсекающие значения оптической плотности Cut off.

Также был разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий: внесение в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2 положительного контроля, отрицательного контроля, а также серии 2х-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека; проведение инкубации указанных образцов при температуре от+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение 1-кратного раствора конъюгата с последующей инкубацией при температуре+36°С до+38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа; промывку лунок не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера; внесение хромоген-субстратного раствора в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от+15°С до+25°С; остановку пероксидазной реакции путем добавления в каждую лунку стоп-реагента; измерение оптической плотности на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм; проведение интерпретации результатов.

Особенностью данного способа для анализа сыворотки или плазмы крови человека является то, что при интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают со значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле

Cut off=А₄₅₀К^-_ср+3 х SD А₄₅₀К^-,

где: Cut off - отсекающие значения оптической плотности,

А₄₅₀К^-_ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,

SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,

при этом титр антител определяют как наибольшее разведение образца сыворотки или плазмы крови человека, при анализе которого получают оптическую плотность при длине волны 450 нм в 2 раза превышающую отсекающие значения оптической плотности Cut off.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Разработка дизайна генетической конструкции, содержащей лидерный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, ген RBD вируса SARS-CoV-2 и гистидиновую метку.

На первом этапе работы авторы разработали дизайн генетической конструкции, позволяющей эффективно экспрессировать рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих и выполнять его хроматографическую очистку.

Для этого был выбран ген рецептор-связывающего домена (RBD) белка S коронавируса SARS-CoV-2, слитый с сигнальным пептидом тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, обеспечивающий секрецию белка в культуральную жидкость и гистидиновой меткой для очистки рекомбинантного белка методом аффинной хроматографии. Таким образом, была разработана генетическая конструкция SEQ ID NO:1.

Схема генетической конструкции и представлена на Фиг.1. Разработанная генетическая конструкция была синтезирована в ЗАО «Евроген». Таким образом, была получена конструкция pAL-TA-RBD-CoV-2.

Далее с помощью методов генной инженерии разработанная генетическая конструкция из pAL-TA-RBD-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII и XhoI в плазмидный вектор для эписомальной экспрессии в клеточных линиях млекопитающих, и полученная плазмида была названа p1-RBD-CoV-2 (Фиг.2). Далее полученную плазмиду нарабатывали в препаративных количествах и очищали при помощи коммерческого набора Plasmid Midiprep 2.0 (Евроген /кат.№BC124).

Таким образом, в результате проведенной работы была получена плазмида p1-RBD-CoV-2, обеспечивающая экспрессию гена RBD вируса SARS-CoV-2.

Пример 2. Получение штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 был получен на основе клеточной линии CHO-S. Это коммерческая клеточная линия на основе клеток яичника китайского хомячка СНО, адаптированная к культивированию в плотной суспензии в специальной культуральной среде для повышенной экспрессии белка.

Клетки CHO-S культивировали в шейкер-инкубаторе при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин в питательной среде HyClone HyCell TransFx-C transfection media (GE Healthcare, США) с добавлением 8 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), до достижения плотности 2*10⁶ кл/мл 1 литр суспензии. Далее полученную суспензию трансфицировали плазмидным вектором p1-RBD-CoV-2, содержащим генетическую конструкцию SEQ ID NO:1, при помощи 1 мг/мл реагента Polyethylenimine (Polyscience, США) согласно инструкции производителя. Затем в течение 2 недель проводили селекцию трансфицированных клеток на антибиотике гигромицин Б. Данный антибиотик был выбран, поскольку плазмидный вектор p1-RBD-CoV-2 содержит ген устойчивости к антибиотику Hygromycin B.

Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. При этом продукция указанного белка составляет от 5 мг/л до 10 мг/л.

Пример 3. Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 с помощью созданного штамма-продуцента.

Разработанный способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 включает следующие этапы:

1) культивирование штамма-продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2

2) отбор культуральной среды

3) хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

4) подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

Культивирование клеток штамма-продуцента проводили в течение 7 дней в Шейкер-инкубаторе Multitron (Infors HT, Швейцария) при 5% содержания CO2, 80%-ной влажности и скорости качания 120 об/мин. Ежедневно определяли выживаемость клеток в суспензии при помощи счетчика клеток TC20 Automated Cell Counter (Bio-Rad, США). По истечении 7 дней культивирования клеточную суспензию осаждали центрифугированием 5000 об/мин. Культуральную жидкость осветляли при помощи фильтрации через шприцевые фильтры Millipore Express (PES) HP 0.45 мкм (Merckmillipore, Германия).

Далее проводили хроматографическую очистку белка из осветленной культуральной жидкости на приборе AKTA start (GE Healthcare, США). К прибору подключали хроматографическую колонку HisTag HP protein purification column (5 мл) и уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4). Далее осветленную культуральную жидкость (100 мл) разбавляли в несколько раз буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) и наносили на уравновешенную колонку со скоростью 5 мл/мин. После окончания нанесения, колонку промывали 100 мл буфера (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 20 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 5 мл/мин. После окончания промывки связавшийся белок элюировали с колонки буфером (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ хлорид натрия, 500 мМ иммидазол, рН=7.4) со скоростью 1 мл/мин. Так проводили 10 очисток по 100 мл. Фракции после очистки замораживали при температуре -20°С.Фракции после первичной очистки размораживали при комнатной температуре и концентрировали при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra -50, -10K (Millipore, Ирландия) до концентрации белка 1-2 мг/мл. Концентрацию белка измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000c. Далее колонку HiTrap desalting column уравновешивали буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) на скорости 5 мл/мин. После уравновешивания скорость потока снижали до 1 мл/мин. Препарат с концентрацией 1-2 мг/мл наносили на колонку через шприц в объеме 1 мл. Собирали первый пик по UV280 соответствующий целевому рекомбинантному белку RBD. Суммарно проводили 5-10 циклов очистки. Полученные после второй стадии очистки фракции препарата объединяли и измеряли концентрацию белка на спектрофотометре Nanodrop 2000c. Далее препарат доводили буфером (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия) до концентрации 1 мг/мл, разливали по 1 мл и хранили при температуре -20°С.

Выход рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 после хроматографической очистки составил от 5 мг до 10 мг с литра культуральной среды (по результатам трех независимых экспериментов). Что является показателем эффективности разработанного способа получения, так как белки коронавируса относятся к группе сложнополучаемых в традиционных системах бактериальной экспрессии.

Подтверждение подлинности полученного рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводили при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа.

Для проведения белкового электрофореза готовили 12%-ный разделяющий полиакриламидный гель и 6%-ный фокусирующий полиакриламидный гель. Образцы очищенного рекомбинантного белка RBD разводили до различной концентрации (1 мкг/мкл, 0.75 мкг/мл, 0.5 мкг/мкл, 0.25 мкг/мл) буфером образца с содержанием В-меркаптоэтанола. Далее образцы прогревали при температуре 98°С в течении 5 мин и вносили в гель. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad, США, кат.№165-8000). Далее гель окрашивали реагентом EZBlue™ Gel Staining Reagent (Sigma-Aldrich, США, кат.№G1041) и проявляли при помощи гель-документирующей системы Gel Doc EZ system (Bio-Rad, США). Результаты электрофореграммы представлены на Фиг.3.

По результатам электрофореграммы подвижность рекомбинантного белка RBD в денатурирующих условиях соответствовала ≈30 кДа, что обусловлено его гликозилированием (масса аминокислотной последовательности без учета гликозилирования составляет около 25кДа). Таким образом, при первичном анализе препарата были подтверждена его ожидаемая молекулярная масса.

Более детальное подтверждение подлинности препарата осуществляли при помощи масс-спектрометрического анализа по следующей схеме:

1. Гидролиз белка трипсином в растворе.

25 мкг рекомбинантного белка RBD растворяли в 20 mM бикарбонате аммония и добавляли до 100 мкл 25 мМ бикарбоната аммония (рH 8,3). В полученную реакционную смесь добавляли последовательно 1 мкл 1M ДТТ и 10 мкл 110 mM йодацетамида. После проведения реакции (56°С, 30 мин в темноте) к смеси добавляли 4 мкл 1M ДТТ для нейтрализации не связавшегося иодацетамида. К оставшейся части добавляли только трипсин, при этом, в обоих случаях соотношение белок: фермент составляло 25: 1. Реакцию вели при 37°С в течение 17 ч. Полученную реакционную смесь высушивали досуха с помощью вакуумного концентратора (Savant SPD121P, Thermo Scientific, США) и растворяли в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Образец обессоливали на колонках, содержащих обращено фазовую мембрану (аналог С18), образец элюировали 90% раствором ацетонитрила в воде. Для нанесения брали 4 мкл образца в 90% ацетонитриле и смешивали их с 1 мкл насыщенного раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты в 30%-ном растворе ацетонитрила, содержащем 0,5% ледяной уксусной кислоты по объему, на стальной мишени, которую затем подсушивали на воздухе при комнатной температуре.

2. MALDI-масс-спектрометрический анализ.

Анализ пептидов проводили на время-пролетном MALDI-масс-спектрометре Ultraflextreme («Bruker Daltonics», Германия). Детектирование положительных ионов проводили в режиме рефлектрона при напряжениях: на ионном источнике IS1 – 20,12 кВ, IS2 – 17,82 кВ; на линзах – 7,47 кВ, рефлектроне Ref1 – 21,07 кВ, Ref2 – 10,80 кВ. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 650 до 5000 Th. В качестве внутреннего стандарта использовали пики автолитических фрагментов трипсина и кератина, которые исключались из окончательных списков детектируемых масс.

3. Анализ данных масс-спектрометрии.

Обработка масс-спектров проводилась с помощью программного обеспечения Flex Analysis 3.4 (Bruker Daltonik GMBH, Германия). К масс-спектрам применялись сглаживание по алгоритму Savizky Golay (ширина 0,2 m/z, 1цикл), и вычитание базовой линии согласно алгоритму TopHat. Использовались следующие параметры детекции пиков: алгоритм детекции пиков - SNAP2, соотношение сигнал/шум - 3, максимальное число пиков в спектре - 500). Поиск и идентификация белков методом «пептидного отпечатка» («peptide mass fingerprint») осуществляли с помощью программного комплекса Proteinscape (версия 4, «Bruker Daltonik GMBH, Германия), использовались следующие параметры поиска: точность определения массы - 50 ppm; возможные посттрансляционные модификации - окисление метионина, гистидина, триптофана.

В результате масс-спектрального анализа было продемонстрировано, что рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 присутствует в растворе в виде одно и двухзарядного иона, и имеет молекулярную массу 31кДа, что четко коррелирует с данными электрофореза (Фиг.4).

Результаты исследования рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 при помощи белкового электрофореза в полиакриламидном геле, а также масс-спектрометрического анализа убедительно доказали его подлинность.

Таким образом, в результате проведенной работы впервые был получен рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2. Данный белок образует стабильную складчатую структуру.

Пример 5. Тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с использованием рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2.

Авторами впервые была создана тест-система на основе иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, в которой рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2, полученный с помощью штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (примеры 1-3), является мишенью для антител, выявляемых в крови реконвалесцентов COVID-19.

Тест-система представляет собой набор реагентов, включающий:

1) планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2;

2) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;

3) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2;

4) конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

5) 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;

6) буфер для разведения, содержащий буферный раствор для разведения сыворотки или плазмы и конъюгата;

7) раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;

8) раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;

9) стоп-реагент, содержащий 1 М раствор серной кислоты.

Пример 6. Способ применения тест-системы для иммуноферментного анализа для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.

В данном примере описан способ использования разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.

Наиболее перспективными для терапии являются образцы сыворотки или плазмы крови, которые содержат вируснейтрализующие антитела. Из литературных данных известно, что белок RBD коронавирусов является одной из основных мишеней для вируснейтрализующих антител Z. Cao et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virol J 7, 299 (2010)).

В данном исследовании был проведен сравнительный анализ 218 образцов реконвалесцентной плазмы и сыворотки крови пациентов, перенесших COVID-19. Каждый образец был исследован с помощью разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа (описанной в примере 5) и проанализирован на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации вируса SARS-CoV-2 на культуре клеток.

Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест системы был проведен согласно следующему протоколу.

1. Приготовление рабочих растворов.

Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.

Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).

Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать. (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).

1. Проведение анализа.

1.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток

Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.

В остальные лунки планшета внести по 90 мкл буфера для разведения, а затем добавить по 10 мкл, предварительно разведенных в 20 раз испытуемых образцов (по две лунки на каждый образец).

Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

2.2 Промывание.

После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

2. 3 Внесение конъюгата.

В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

2.4 Промывание.

После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.

2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.

В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от+20°С.

2.6 Остановка пероксидазной реакции.

Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.

2.8. Регистрация результатов

Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А₄₅₀) в течение 10 мин после остановки реакции.

Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А₄₅₀К^-) и положительного (А₄₅₀К⁺) контролей по формулам 1 и 2.

А₄₅₀ К^-_ср=(А₄₅₀ К^-₁+А₄₅₀А К^-₂)/2 (1)

где:

- А₄₅₀ К^-₁ - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,

- А₄₅₀ К^-₂ - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.

А₄₅₀ К⁺_ср=(А₄₅₀ К⁺₁+А₄₅₀А К⁺₂)/2 (2)

где:

- А₄₅₀ К⁺₁ - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,

- А₄₅₀ К⁺₂ - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.

Вычислить среднее значение А₄₅₀ для каждой опытной пробы (А₄₅₀ОП_ср) по формуле 3:

А₄₅₀ОП_ср=(А₄₅₀ОП₁+А₄₅₀ОП₂)/2 (3)

где:

- А₄₅₀ОП₁ - значение оптической плотности пробы 1,

- А₄₅₀ОП₂ - значение оптической плотности пробы 2.

При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:

1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А₄₅₀К⁺_ср) - не менее 0,6;

2. Значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А₄₅₀К^-_ср) - менее 0,2.

При получении иных показателей исследование необходимо повторить.

2.9 Интерпретация результатов.

Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А₄₅₀ (Cut off).

Значение Cut off вычисляют по формуле:

Cut off=А₄₅₀К^-_ср+3 х SD А₄₅₀К^-,

где:

- SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается положительным, если А₄₅₀ОП_ср выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А₄₅₀ОП_ср не превышает значение значение Cut off в 2,5 раза.

Реакцию вируснейтрализации ставили в варианте: постоянная доза вируса - разведения сыворотки или плазмы крови.

В лунки планшета вносили 2х-кратные разведения сыворотки или плазмы крови начиная с разведения 1/20 до 1/1280 в объеме 50 мкл/лунку в 3 повторах.

В отдельные лунки вносят контрольные образцы:

- разведения контрольной плазмы с известным титром ВНА по 50 мкл/лунку (контроль проведения) в 3 повторах.

- по 50 мкл контрольной негативной плазмы (не обладающей вируснейтрализующей активностью) в разведении 1/20, в 3 повторах (контроль плазмы).

- по 100 мкл ростовой среды в 3 повторах (РС) (контроль клеток).

- по 50 мкл РС и 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID(tissue culture infective dose 50/мл (контроль дозы вируса) в 3 повторах.

Далее во все лунки, кроме контроля клеток, вносили по 50 мкл вируссодержащей суспензии с концентрацией 2000 TCID50/мл.

В качестве контроля вирусной активности (Контроль вируса) в отдельные лунки планшета вносили разведения вируссодержащей суспензии (внутренний контроль вносимых доз вируса при исследования нейтрализующей активности плазмы).

Далее планшет инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 60 минут.

Затем во все лунки планшета инокулировали по 20000 клеток Vero E6 в объеме 100 мкл/лунку (концентрация клеток 2×10⁵ клеток/мл) в свежеприготовленной РС. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37°С в течение 96 часов до полного проявления цитопатического действия вируса в вирусном контроле в ожидаемом диапазоне.

Оценку вирусной продукции по цитопатическому действию (ЦПД) осуществляли на основе анализа жизнеспособности клеток при помощи микроскопирования, с целью визуального определения границы вирусного повреждения клеток.

Вируснейтрализующую активность плазмы/сыворотки оценивали визуально под микроскопом через 96 часов после инфицирования по ингибированию ЦПД вируса в культуре клеток Vero E6. Каждое из разведений плазмы/сыворотки испытывали в трех параллельных лунках. Результатом исследования являлось заключение о нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток Vero E6 при воздействии плазмы/сыворотки крови. За титр ВНА исследуемой плазмы/сыворотки принимали высшее ее разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2 лунках из 3.

Результаты сравнительного анализа образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 с помощью двух методов: иммуноферментного анализа на антитела к рекомбинантному белку RBD с помощью разработанной тест-системы и на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) методом прямой вируснейтрализации коронавируса SARS-CoV-2 на культуре клеток представлены в таблице 1. Результаты зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА распределились следующим образом (Таблица 2).

Таблица 1. Результаты сравнительного анализа образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19

Таблица 1.

№ Титр вируснейтралиующих антител, 1/ Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450) 1 320 2,87 2 1280 2,85 3 320 2,78 4 1280 2,75 5 640 2,72 6 640 2,70 7 128 2,34 8 1024 2,26 9 40 2,02 10 128 1,93 11 512 1,88 12 640 1,87 13 40 1,83 14 1024 1,80 15 320 1,76 16 80 1,75 17 320 1,74 18 320 1,74 19 128 1,69 20 128 1,56 21 160 1,56 22 128 1,51 23 320 1,49 24 160 1,47 25 1024 1,46 26 80 1,45 27 40 1,43 28 80 1,43 29 80 1,42 30 1024 1,42 31 160 1,34 32 256 1,39 33 1280 1,38 34 64 1,33 35 160 1,32 36 320 1,32 37 160 1,30 38 80 1,17 39 160 1,16 40 256 1,15 41 128 1,14 42 128 1,13 43 160 1,12 44 160 1,10 45 16 1,09 46 256 1,09 47 160 1,08 48 256 1,08 49 640 1,06 50 256 1,06 51 320 1,05 52 80 1,05 53 256 1,04 54 160 1,03 55 128 1,02 56 128 1,00 57 64 0,99 58 40 0,98 59 20 0,97 60 64 0,97 61 40 0,97 62 512 0,95 63 256 0,94 64 32 0,93 65 40 0,91 66 40 0,89 67 20 0,85 68 20 0,84 69 80 0,84 70 128 0,83 71 16 0,82 72 64 0,82 73 64 0,81 74 256 0,81 75 320 0,80 76 40 0,78 77 128 0,78 78 20 0,78 79 16 0,78 80 20 0,75 81 256 0,74 82 256 0,74 83 16 0,72 84 20 0,72 85 20 0,72 86 64 0,72 87 20 0,71 88 20 0,71 89 16 0,70 90 40 0,70 91 20 0,68 92 1024 0,68 93 32 0,68 94 80 0,68 95 20 0,65 96 16 0,65 97 20 0,64 98 64 0,64 99 20 0,64 100 20 0,63 101 16 0,63 102 40 0,63 103 32 0,62 104 20 0,62 105 20 0,61 106 64 0,61 107 40 0,60 108 32 0,60 109 640 0,59 110 64 0,59 111 40 0,57 112 20 0,57 113 20 0,57 114 20 0,56 115 128 0,55 116 32 0,55 117 320 0,54 118 64 0,52 119 16 0,51 120 256 0,51 121 20 0,51 122 20 0,51 123 64 0,50 124 16 0,50 125 20 0,50 126 64 0,49 127 80 0,49 128 20 0,48 129 32 0,48 130 20 0,46 131 16 0,45 132 20 0,45 133 640 0,45 134 20 0,44 135 20 0,44 136 80 0,44 137 20 0,43 138 64 0,43 139 20 0,42 140 20 0,42 141 20 0,42 142 20 0,41 143 20 0,41 144 80 0,41 145 20 0,39 146 160 0,39 147 20 0,38 148 16 0,38 149 160 0,35 150 32 0,35 151 20 0,35 152 32 0,35 153 20 0,34 154 16 0,33 155 20 0,32 156 16 0,32 157 16 0,32 158 32 0,32 159 16 0,32 160 16 0,31 161 16 0,31 162 20 0,30 163 20 0,30 164 32 0,30 165 16 0,30 166 32 0,29 167 32 0,27 168 128 0,27 169 32 0,27 170 20 0,26 171 16 0,26 172 64 0,25 173 20 0,24 174 32 0,24 175 32 0,23 176 16 0,23 177 16 0,22 178 16 0,21 179 16 0,21 180 32 0,21 181 16 0,21 182 16 0,21 183 20 0,21 184 20 0,20 185 16 0,20 186 32 0,20 187 16 0,19 188 1024 0,19 189 16 0,19 190 40 0,18 191 16 0,18 192 20 0,18 193 16 0,18 194 16 0,18 195 16 0,17 196 16 0,16 197 32 0,16 198 16 0,15 199 32 0,14 200 16 0,13 201 16 0,13 202 32 0,13 203 32 0,13 204 0 0,13 205 16 0,12 206 32 0,12 207 64 0,12 208 32 0,11 209 16 0,11 210 0 0,10 211 16 0,08 212 16 0,08 213 16 0,08 214 32 0,07 215 160 0,07 216 128 0,07 217 16 0,07 218 0 0,06

Таблица 2. Распределение зависимости оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА.

Таблица 2.

Значение оптической плотности образца при разведении в 200 раз (OD450) Титр ВНА от 1/64 и выше Титр ВНА ниже 1/64 1,1 - 2,8 94% 6% 0,72 - 1 65% 35% 0,3-0,7 29% 71% До 0,2 3,8% 96,2

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови пациентов, перенесших COVID-19 и обладающих вируснейтрализующей активностью (титр 1/64 и выше), составляет от 96,8%. Установлена корреляция между уровнем оптической плотности (OD450) образца при разведении в 200 раз от титра ВНА, представленная в таблице 2. А время проведения анализ составляет 2,5 часа.

Пример 7. Способ применения разработанной тест-системы для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.

В данном примере описан способ применения разработанной тест-системы (пример 5) для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.

Для исследования было отобрано 10 образцов плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19.

Иммуноферментный анализ с использованием разработанной тест системы был проведен согласно следующему протоколу.

1. Приготовление рабочих растворов.

Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.

Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).

Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать. (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).

2. Проведение анализа.

2.1 Внести контрольные и испытуемые образцы сывороток

Освободить планшет из упаковки и внести в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.

В остальные лунки планшета внести серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).

Планшет заклеить пленкой и выдержать в течение 1 ч при температуре от+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

2.2 Промывание.

После окончания инкубации удалить жидкость из лунок и промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов, на автоматическом промывочном устройстве или вручную, доверху заполняя лунки (по 300 мкл/лунку). Затем жидкость окончательно удалить и подсушить планшет постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

2. 3 Внесение конъюгата.

В каждую лунку внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшет закрыть липкой пленкой и инкубировать в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

2.4 Промывание.

После окончания инкубации промыть планшет 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.

2.5 Внесение хромоген-субстратного раствора.

В каждую лунку внести по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировать в течение 15 минут в темном месте при температуре от+20°С.

2.6 Остановка пероксидазной реакции.

Остановить реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провести учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.

2.8. Регистрация результатов

Измерить величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А₄₅₀) в течение 10 мин после остановки реакции.

Вычислить среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А₄₅₀К^-) и положительного (А₄₅₀К⁺) контролей по формулам 1 и 2.

А₄₅₀К^-_ср=(А₄₅₀К^-₁+А₄₅₀А К^-₂)/2 (1)

где:

- А₄₅₀К^-₁ - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,

- А₄₅₀К^-₂ - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.

А₄₅₀К⁺_ср=(А₄₅₀К⁺₁+А₄₅₀А К⁺₂)/2 (2)

где:

- А₄₅₀К⁺₁ - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,

- А₄₅₀К⁺₂ - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.

Вычислить среднее значение А₄₅₀ для каждой опытной пробы (А₄₅₀ОП_ср) по формуле 3:

А₄₅₀ОП_ср=(А₄₅₀ОП₁+А₄₅₀ОП₂)/2 (3)

где:

- А₄₅₀ОП₁ - значение оптической плотности пробы 1,

- А₄₅₀ОП₂ - значение оптической плотности пробы 2.

При этом результаты измерения, полученные на контрольных образцах, должны удовлетворять следующим требованиям:

1. Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А₄₅₀К⁺_ср) - не менее 0,6;

2. Сзначение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А₄₅₀К^-_ср) - менее 0,2.

При получении иных показателей исследование необходимо повторить.

2.9 Интерпретация результатов.

Для интерпретации результатов вычисляют отсекающие значения оптической плотности А₄₅₀ (Cut off).

Значение Cut off вычисляют по формуле:

Cut off=А₄₅₀К^-_ср+3 х SD А₄₅₀К^-,

где:

- SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.

Титр антител вычисляли как последнее разведение образца, в котором А₄₅₀ОП_ср выше, чем значение Cut off в 2 раза

Результаты проведенного исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3. Титры антител к RBD в образцах плазмы и сыворотки крови реконвалесцентов COVID-19.

Таблица 3.

Номер пациента Титр антител к RBD 1 1:512 2 1:256 3 1:64 4 1:32 5 1:256 6 1:128 7 1:512 8 1:256 9 1:128 10 1:256

Таким образом, результаты проведенного исследования, доказывают, что разработанная тест-система может быть использована для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2.

Специалисту среднего уровня понятно, что данная тест система может также использоваться для детекции антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, для оценки напряженности иммунного ответа после введения вакцины, содержащей своем составе рецептор-связывающий домен RBD вируса SARS-CoV-2 или его ген.

Пример 8 Сравнение тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.

Задача данного эксперимента заключалась в сравнении нескольких тест-систем для иммуноферментного анализа, основанных на использовании рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 (разработанная тест-система), или рекомбинантного полноразмерного белка S вируса SARS-CoV-2, или разрушенного вируса SARS-CoV-2, по их способности неспецифически связываться с антителами к сезонному коронавирусу ОС43, который циркулирует в популяции человека.

На первом этапе полноразмерный белок S вируса SARS-CoV-2, или вирус SARS-CoV-2, инактивированный нагреванием при температуре 56°С в течении 30 мин и разрушенный воздействием УЗ (в течение 1 минуты на ультразвуковом гомогенизаторе soniprep 150 Plus, MSE), наносили в лунки планшетов для иммуноферментного анализа в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл и адсорбировали ночь при температуре+4°С.

Таким образом, к началу эксперимента было подготовлено 3 планшета:

1. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2, являющийся частью разработанной тест-системы (пример 5);

2. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2;

3. планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука.

Затем подготовили рабочие растворы необходимые для анализа (тест-система пример 5).

Для приготовления рабочего раствора буфера для промывания планшетов концентрат промывочного буфера развести в 25 раз дистиллированной водой.

Для приготовления рабочего раствора конъюгата, конъюгат развести в 20 раз буфером для разведения и тщательно перемешать пипетированием (раствор готовили непосредственно перед использованием).

Для приготовления рабочего хромоген-субстратного раствора к 1,0 мл раствора хромогена добавить 9,0 мл раствора субстрата и тщательно перемешать (раствор готовить непосредственно перед использованием, хранению не подлежит).

Далее в лунки каждого из 3 планшетов нанесли:

1) положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример 5) в 2 повторах по 100 мкл;

2) отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD коронавируса SARS-CoV-2 (тест-система, пример5) в 2 повторах по 100 мкл;

3) образцы сыворотки крови пациентов, которые перенесли заболевание, вызванное сезонным коронавирусом ОС43, но при этом не болели COVID-19 (10 образцов), разведенные в 200 раз в 2 повторах по 100 мкл.

Далее все планшеты заклеили пленкой и выдержали в течение 1 ч при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

После окончания инкубации удалили жидкость из лунок и промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов. Затем жидкость окончательно удалили и подсушили планшеты постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

Далее в каждую лунку внесли по 100 мкл рабочего раствора конъюгата моноклональных антител, планшеты закрыли липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре+37°С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.

После окончания инкубации промыли планшеты 4 раза рабочим раствором буфера для промывания планшетов.

Затем в каждую лунку всех 3 планшетов внесли по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от 20°С

После этого остановили реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты) и провели учет результатов на спектрофотометре в течение 10 мин после остановки реакции.

Далее измерили величину оптической плотности субстратной смеси на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А₄₅₀) в течение 10 мин после остановки реакции.

Вычислили среднее арифметическое значение оптической плотности отрицательного (А₄₅₀К^-) и положительного (А₄₅₀К⁺) контролей для каждого планшета по формулам 1 и 2.

А₄₅₀ К^-_ср=(А₄₅₀ К^-₁+А₄₅₀А К^-₂)/2 (1)

где:

- А₄₅₀ К^-₁ - значение оптической плотности пробы 1 отрицательного контроля,

- А₄₅₀ К^-₂ - значение оптической плотности пробы 2 отрицательного контроля.

А₄₅₀ К⁺_ср=(А₄₅₀ К⁺₁+А₄₅₀А К⁺₂)/2 (2)

где:

- А₄₅₀ К⁺₁ - значение оптической плотности пробы 1 положительного контроля,

- А₄₅₀ К⁺₂ - значение оптической плотности пробы 2 положительного контроля.

Вычислили среднее значение А₄₅₀ для каждой опытной пробы (А₄₅₀ОП_ср) по формуле 3:

А₄₅₀ОП_ср=(А₄₅₀ОП₁+А₄₅₀ОП₂)/2 (3)

где:

- А₄₅₀ ОП₁ - значение оптической плотности пробы 1,

- А₄₅₀ ОП₂ - значение оптической плотности пробы 2.

Для интерпретации результатов вычислили отсекающие значения оптической плотности А₄₅₀ (Cut off).

Значение Cut off вычислили по формуле:

Cut off=А₄₅₀К^-_ср+3 х SD А₄₅₀К^-,

где:

- SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля.

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А₄₅₀ОП_ср выше, чем значение Cut off в 2,5 раза.

Для планшета с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 2 SEQ ID NO:2:

Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А₄₅₀К⁺_ср) составило 1,960.

Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А₄₅₀К^-_ср) составило 0,052.

Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.

Значение Cut off составляет:

Cut off=0,052+3 х 0,0000125=0,052038

В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А₄₅₀ОП_ср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А₄₅₀ОП_ср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,052038=0,13).

Для планшета с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2:

Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А₄₅₀К⁺_ср) составило 2,008.

Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А₄₅₀К^-_ср) составило 0,064.

Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.

Значение Cut off составляет:

Cut off=0,064+3 х 0,0001805=0,064542

В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А₄₅₀ОП_ср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А₄₅₀ОП_ср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,064542=0,16).

Для планшета с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука:

Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контролем (А₄₅₀К⁺_ср) составило 2,081

Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем (А₄₅₀К^-_ср) составило 0,061.

Средние значения оптической плотности позволяют говорить о том, что исследование прошло успешно и его результаты достоверны.

Значение Cut off составляет:

Cut off=0,061+3 х 0,0001325=0,0613975.

В данном тесте исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считался положительным, если А₄₅₀ОП_ср было выше, чем значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).

Исследуемый образец сыворотки или плазмы крови считается отрицательным, если А₄₅₀ОП_ср не превышало значение Cut off в 2,5 раза (2,5*0,0613975=0,15).

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Средняя оптическая плотность опытных и контрольных образцов, полученная в результате проведения сравнительного анализа тест-систем для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека с различными вариантами адсорбированных белков коронавируса по их способности неспецифически определять антитела против сезонного коронавируса человека ОС43.

Таблица 4.

Исследуемый образец RBD Полноразмерный белок S Вирус SARS-CoV-2 1 0,055 0,159 0,132 2 0,060 0,493 0,519 3 0,053 0,152 0,414 4 0,054 0,142 0,117 5 0,055 0,268 0,436 6 0,055 0,143 0,134 7 0,048 0,065 0,136 8 0,048 0,351 0,581 9 0,049 0,130 0,090 10 0,049 0,159 0,281 K- 0,052 0,064 0,061 K+ 1,960 2,008 2,081

Неожиданно было выявлено, что использование разработанной тест-системы для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (тест-система по примеру 5) для анализа сыворотки и плазмы крови человека на наличие антител к вирусу SARS-CoV-2 не дает ложноположительных результатов у пациентов перенесших заболевание, вызванное сезонным коронавирусом человека ОС43, тогда как при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках полноразмерным белком S наблюдалось 30% ложноположительных результатов, а при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека с адсорбированным в лунках вирусом SARS-CoV-2, инактивированным нагреванием и разрушенным с помощью ультразвука наблюдалось 50% ложноположительных результатов.

Результаты проведенного исследования можно объяснить тем, что полученный авторами рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 имеет низкий процент гомологии с вирус-связывающим доменом белка S вируса ОС43. Таким образом, использование рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:2 (по сравнению с полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2 или разрушенным вирусом SARS-CoV-2) в тест-системе для иммуноферментного анализа сыворотки и плазмы крови человека для определения антител к вирусу SARS-CoV-2 приведет к получению более точных и достоверных результатов.

Пример 9. Оценка результатов, полученных при использовании тест-системы для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека в различных экспериментальных условиях.

В данном исследовании использовали тест-систему для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека (пример 5), в качестве исследуемого образца выбрали плазму крови человека с известным титром антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 (1:512). Была проведена серия экспериментов, в которых анализ титра антител против белка RBD вируса SARS-CoV-2 проводился по протоколу, описанному в примере 7, за исключением 1 параметра, который был изменен.

Эксперимент №1. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7 (контроль).

Эксперимент №2. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+36°С.

Эксперимент №3. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+38°С.

Эксперимент №4. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила+36°С.

Эксперимент №5. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с коньюгатом, которая составила+38°С.

Эксперимент №6. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила+15°С.

Эксперимент №7. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+25°С.

Эксперимент №8. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.

Эксперимент №9. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.

Эксперимент №10. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.

Эксперимент №11. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 7, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.

Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Титр антител к белку RBD вируса SARS-CoV-2, полученный в экспериментах №1-11.

Таблица 5.

Эксперимент № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Титр
IgG к
белку
RBD 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512 1:512

Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат.

Кроме того, была проведена серия экспериментов, в котором разработанная тест система (пример 5) использовалась для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов, наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Эксперименты проводили по протоколу, описанному в примере 6, за исключением 1 параметра, который был изменен.

Эксперимент №12. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6 (контроль).

Эксперимент №13. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+36°С.

Эксперимент №14. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+38°С.

Эксперимент №15. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с конъюгатом, которая составила+36°С.

Эксперимент №16. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с коньюгатом, которая составила+38°С.

Эксперимент №17. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации с хромогеном, которая составила+15°С.

Эксперимент №18. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме температуры инкубации исследуемых образцов, которая составила+25°С.

Эксперимент №19. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 250 оборотов/минуту.

Эксперимент №20. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации исследуемых образцов, которая составила 350 оборотов/минуту.

Эксперимент №21. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 250 оборотов/минуту.

Эксперимент №22. Исследование выполнено по протоколу, описанному в примере 6, кроме скорости перемешивания при инкубации с конъюгатом, которая составила 350 оборотов/минуту.

Полученные результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Среднее значение оптической плотности опытного образца (A₄₅₀ОП_ср) при длине волны 450 нм, полученное в серии экспериментов №12-22.

Таблица 6.

Эксперимент № 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 A₄₅₀ 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69

Как видно из представленных данных, изменение температуры, скорости перемешивания при инкубации с исследуемыми образцами и антителами, а также температуры при инкубации с хромогеном в указанном диапазоне значений, не влияет на полученный результат.А время проведения анализ составляет 2,5 часа.

Таким образом, разработаны генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 и способ его получения, а также тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, которая позволяет быстро и эффективно проводить тест для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2.

Изобретение относится к биотехнологии. Созданы генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцирующего рекомбинантный белок - рецептор-связывающий домен (RBD) вируса SARS-CoV-2, который может быть использован для диагностических целей. Описан способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD продуцента рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1; введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции; селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B. Создан штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Разработан способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 включающий: культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD; подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. Создан рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2. Создана тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека. Разработан способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Разработан способ анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2. Изобретение предоставляет быструю и эффективную тест-систему для определения наиболее перспективных образцов сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Изобретение позволяет сократить время и упростить процедуру анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2. Также изобретение позволяет осуществить высокую и стабильную экспрессию рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2. 8 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 8 пр.

1. Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, включающая SEQ ID NO:1.

2. Штамм клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD, продуцент рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, содержащий генетическую конструкцию, включающую SEQ ID NO:1.

3. Способ получения штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD по п. 2, включающий:

- получение генетической конструкции, включающей SEQ ID NO:1;

- введение указанной генетической конструкции в клетки путем липофекции;

- селекцию клеток на антибиотике Hygromycin B.

4. Рекомбинантный белок RBD вируса SARS-CoV-2 для выявления антител к SARS-CoV-2, имеющий SEQ ID NO:2, являющийся продуктом штамма по п. 2.

5. Способ получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 по п. 4, включающий:

- культивирование штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD по п. 2;

- хроматографическую очистку рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2 из культуральной среды штамма клеток яичника китайского хомячка CHO-S-RBD;

- подтверждение получения рекомбинантного белка RBD вируса SARS-CoV-2, имеющего SEQ ID NO:2.

6. Тест-система для иммуноферментного анализа сыворотки или плазмы крови человека, представляющая собой набор реагентов, включающий:

- планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2;

- положительный контроль, включающий инактивированный образец сыворотки крови человека, содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;

- отрицательный контроль, представляющий собой инактивированный образец сыворотки крови человека, не содержащий IgG к белку RBD вируса SARS-CoV-2;

- конъюгат, содержащий 20-кратный концентрат моноклональных мышиных антител к IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена;

- 25-кратный концентрат промывочного буфера, содержащий концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов;

- буфер для разведения сыворотки или плазмы и указанного конъюгата;

- раствор хромогена, содержащий раствор тетраметилбензидина;

- раствор субстрата, содержащий раствор перекиси водорода;

- стоп-реагент.

7. Способ для анализа сыворотки или плазмы крови реконвалесцентов COVID-19 для отбора образцов наиболее перспективных для терапии пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы по п. 6, где:

- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2, вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят предварительно разведенные испытуемые образцы сывороток или плазмы крови человека;

- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15°С до +25°С;

- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;

- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;

- проводят интерпретацию результатов.

8. Способ для анализа сыворотки или плазмы крови человека для определения титра антител к вирусу SARS-CoV-2, включающий применение тест-системы по п. 6, в соответствии с которым:

- в лунки планшета для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным белком RBD вируса SARS-CoV-2, имеющим SEQ ID NO:2, вносят положительный контроль, отрицательный контроль, а также вносят серии 2-кратных разведений испытуемых образцов сывороток или плазмы крови человека;

- проводят инкубацию указанных образцов при температуре от +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят 1-кратный раствор конъюгата с последующей инкубацией при температуре +36°С до +38°С при перемешивании со скоростью 300 (±50) об/минуту не менее 1 часа;

- промывают лунки не менее 3 раз 1-кратным раствором промывочного буфера;

- вносят хромоген-субстратный раствор в каждую лунку с инкубацией в течение 15 минут в темном месте при температуре от +15ºС до +25ºС;

- останавливают пероксидазную реакцию путем добавления в каждую лунку стоп-реагента;

- измеряют оптическую плотность на спектрофотометре в каждой лунке при длине волны 450 нм;

- проводят интерпретацию результатов.

9. Способ по п. 7, в котором для интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают с отсекающим значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле

Cut off = А₄₅₀К^-_ср + 3 х SD А₄₅₀К^-,

где:

Cut off - отсекающие значения оптической плотности,

А₄₅₀К^-_ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,

SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,

при этом образец считают положительным, если после проведения анализа оптическая плотность в лунках планшета с опытным образцом при длине волны 450 нм в 2,5 раза превышает отсекающие значения оптической плотности Cut off.

10. Способ по п. 8, в котором при интерпретации результатов, исследуемый образец сыворотки или плазмы крови человека сравнивают со значением оптической плотности Cut off, которое вычисляют по формуле

Cut off = А₄₅₀К^-_ср + 3 х SD А₄₅₀К^-,

где:

Cut off - отсекающие значения оптической плотности,

А₄₅₀К^-_ср - cреднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контролем,

SD А₄₅₀К^- - среднеквадратичное отклонение значений оптической плотности отрицательного контроля,

при этом титр антител определяют как наибольшее разведение образца сыворотки или плазмы крови человека, при анализе которого получают оптическую плотность при длине волны 450 нм, в 2 раза превышающую отсекающие значения оптической плотности Cut off.