Способ получения ветеринарного препарата на основе неспецифических иммуноглобулинов и коллоидных частиц селена для коррекции иммунной системы Российский патент 2023 года по МПК A61K33/04 A61K39/395 A61P37/02 

Изобретение относится к области фармацевтики и может быть использовано при нарушении обмена веществ и снижении иммунитета организма животного.

Основной проблемой в животноводстве является сохранность молодняка сельскохозяйственных животных. Нарушенный обмен веществ и низкий уровень иммунитета - основная причина развития заболеваний инфекционной природы и гибели молодняка сельскохозяйственных животных.

Для повышения сохранности молодняка сельскохозяйственных животных в настоящее время используются препараты, относящиеся к группе иммуномодуляторов, которые в определенной степени стимулируют рост и развитие животных. Препараты вводят внутримышечно или перорально. Существенными недостатками большинства этих препаратов являются их дороговизна и трудоемкость массовой обработки животных в случае выпаивания перорально.

Расширение круга патологических состояний сопровождается нарушением иммунных функций, что побуждает поиск новых методов иммунопрофилактики и иммунотерапии. В данном направлении важно не только создание новых фармакологических иммуностимулирующих средств, но и оптимизация лечебно-профилактических схем их использования, в частности, путей введения в организм, обеспечивающих максимальную биодоступность препаратов. Одним из иммуномодулирующих веществ являются неспецифические иммуноглобулины.

Основные компоненты предлагаемого препарата -иммуноглобулины и коллоидные частицы селена - обладают целым рядом биоактивных свойств, обнаруженных in vitro. Так, они являются фактором усиления завершенности фагоцитоза, обладают антимикробной, антивирусной, противогрибковой и противогельминтной активностью, тормозят адгезию бактерий на клетках макроорганизма.

Наночастицы в препарате необходимы для снижения токсичности, повышения биоактивности, биодоступности, а также сама наночастица должна обладать биологической активностью. Селен является важным микроэлементом, который включается в селенопротеины такие, как селеноцистеин, представляющий наиболее важную часть активного центра ферментативной активности. Селен имеет очень узкое терапевтическое применение, и низкие пределы токсичности, а наночастицы селена обладают еще меньшей токсичностью.

Наночастицы селена являются хорошей платформой-носителем для доставки различных лекарственных веществ к месту их действия.

Большим преимуществом наночастиц является их различная терапевтическая активность, они проявляют противоопухолевое, антиоксидантное, и противовоспалительное действие.

Селен является основным действующим веществом некоторых продуктов на современном рынке, таких как: Е-селен, Селемаг, Габивит-Se.

Препарат Е-селен, представляет собой комплекс витамина Е и селена в форме инъекций для лечения и профилактики заболеваний, вызванных дефицитом данных компонентов. Препарат представляет собой бесцветную или слабо-желтого цвета жидкость. Применяют для профилактики и лечения заболеваний, вызванных недостатком витамина Е и селена (беломышечной болезни, травматического миозита и кардиопатии, токсической дистрофии печени).

Селемаг является идентичным препаратом, лекарству Е-селен и относится к фармакотерапевтической группе: витамин с микроэлементами. Селемаг применяют для профилактики и лечения заболеваний у сельскохозяйственных животных, развивающихся на фоне недостаточности витаминов; беломышечной болезни, развития плода, лечения - мышечной дистрофии у молодняка, миопатии телят, лечения токсической дистрофии печени у животных; при задержке роста и недостаточных привесах.

Габивит - Se лекарственное средство в форме раствора для инъекций, который в своем составе содержит витамины, а также селенит натрия, гидрализат белка и консервант нипагин. Препарат является профилактикой гиповитаминозов, а также назначается при нарушении минерального обмена в организме.

Однако данные лекарственные препараты не обладают иммуностимулирующим, иммуномодулирующим свойствами, селен находится в форме селенита натрия, а не в форме наночастиц, что повышает его токсичность.

Иммуноглобулины имеют в своем составе центры специфического нековалентного связывания антигена, основанного на принципе комплиментарности. Существует несколько форм иммуноглобулинов: жидкие и мембранные. Иммуноглобулины содержаться в крови и некоторых секреторных жидкостях, и вырабатываются, как ответ на контакт с антигенами. Дефицит или избыток антител может быть признаком патологии.

Препарат оказывает иммуностимулирующее и иммуномодулирующее действие. В его составе содержится много нейтрализующих антител. Их наличие обеспечивает эффективное противостояние бактериям, вирусам и ряду других возбудителей.

Под воздействием этого средства восполняется количество недостающих IgG антител. Как следствие, снижается риск развития инфекции при диагностировании первичного и вторичного иммунодефицита. Иммуноглобулин восполняет и замещает природные антитела в сыворотке крови.

Известен иммуномодулятор Форвет (https://www.eapteka.ru/goods/zootovary/vetapteka/immunostimulyatory/forvet/) который ускоряет синтез интерферонов - особых белков, которые защищают клетку от вирусной агрессии. В результате повышается уровень лейкоцитов и иммунных «клеток-киллеров», а возбуждающие болезнь вирусы угнетаются и разрушаются на всех этапах своего развития. Механизм саморегуляции начинает работать направлено и эффективно, быстрее происходит выздоровление и восстановление. Назначают телятам и поросятам в целях профилактики и в комплексной терапии желудочно-кишечных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, собакам и кошкам при вирусных инфекциях, включая чуму плотоядных, инфекционный гепатит, парвовирусный энтерит, аденовирусные инфекции, а также при воспалительных заболеваниях кожи и в хирургической практике. Недостатками данного препарата является его дороговизна, и то что данный препарат нужно использовать быстро и держать в открытом состоянии не более двух недель.

Известен препарат Фоспренил (https://www.eapteka.ru/goods/id322072/), обладающий противовирусным действием по отношению к вирусу чумы плотоядных, парвовирусам, аденовирусам, коронавирусам и ряду других вирусов животных. Препарат модулирует в физиологических пределах функционирование системы естественной резистентности, обладает противовоспалительной активностью, является гепатопротектором и детоксикантом. Основным недостатком Фоспренила является наличие в его составе этанола, который при попадании в организм в большом количестве может вызвать отравление животного, а так же падение артериального давления и температуру, дыхательную недостаточность

Известен препарат Ронколейкин (Патент RU №2354401 С1, опубликован 10.05.2007), который является иммуностимулятором и обладает противогрибковой, противоопухолевой, противовирусной и противобактериальной активностью.

Недостатками данного препарата является высокая стоимость и токсичность, а так же сложность выпаивания в случае массовой обработки.

Технической задачей являлась разработка препарата на основе неспецифического иммуноглобулина и коллоидных частиц селена для коррекции, иммунной системы животных с пониженной токсичностью, а так же невысокой стоимостью.

Техническая задача решается тем, что для получения 100 мл композиции производится коньюгация неспецифического иммуноглобулина и наночастиц селена, полученных при восстановлении из селенита натрия солянокислым гидразином 25 мМоль, с последующим диализом против фосфатносолевого буфера для очищения от посторонних примесей, и дальнейшей лиофильной сушкой полученной инъекционной лекарственной формы при следующем сочетании компонентов, мас. %:

нано селен 0,01-0,10 иммуноглобулины 0,10-0,20 дистиллированная вода остальное

В качестве сырья для приготовления препарата применяются иммуноглобулины, селенит натрия, вода (дистиллированная), а также диализная мембрана и фосфатно солевой буфер для очищения препарата от посторонних примесей. Точность дозирования сырья при выработке продукции: +0,5%.

Иммуноглобулины выделялись из сыворотки крови методом высаливания с использованием сульфата аммония до 45% насыщения. Иммуноглобулины очищали хроматографией среднего давления, их чистота определялась электрофорезом в полиакриламидном геле. В дальнейшем сыворотка крови использовалась для последующего синтеза наночастиц селена и иммуноглобулинов.

Предполагаемое изобретение иллюстрируется фигурой, на которой изображен диаметр синтезированных конъюгатов SeNPs, определенный методами ТЕМ и DLS, размер наночастиц составляет - 20 нм до 60 нм (Фиг. 1 ТЕМ).

Наиболее перспективным является применение SeNPs (размер 20-70 нм), основное преимущество которых, по сравнению с другими формами, заключается в низкой токсичности, что позволяет применять их в дозах, значительно превышающих суточную потребность, что подтверждается результатом ТЭМ.

Определение белка без предварительного осаждения проводили в соответствии с методикой, указанной в ОФС «Определение белка» по методу Лоури. (Величко Н.А., Пищевая химия: учеб. Пособие/ Н.А. Величко, Е.В. Шанина; Краснояр. гос. аграр. ун-т. - Красноярск, 2010. - 204 с. Стр. 19-20). В качестве контрольного раствора использовали раствор выделенного иммуноглобулина с известной концентрациейдо 45% насыщения сульфата аммония.

Диаметр синтезированных наночастиц был определен методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) и динамического светорассеяния (DLS) на трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (CarlZeiss, Germany), а также анализаторе размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK).

Концентрация иммуноглобулинов определялась методом Лоури, на программируемом фотометре Genesys 10S UV-Vis.

Концентрация селена в препарате определялась флуориметрическим методом на спектрофлюориметре ФЛЮОРАТ.

В Таблице 1 содержаться физико-химические показатели препарата.

Концентрация иммуноглобулина составила 16 мг/мл, элементарного селена - 4 мг/мл, что соответствует вносимым в препарат субстанциям.

Проводилась оценка острой токсичности препарата на белых линейных мышах согласно ГОСТ 32644-2014.

Нормы расхода определялись, исходя из номинальной производительности технологического оборудования и усредненных объемов продукции, и не превысили:

- селенита Na (Na2SeO3) 55%; - солянокислый гидразин (N2H4(HCl)2) 2,5%; - иммуноглобулины 1,5%; - вода дистиллированная 55%

Как видно из примеров (Таблицы 1-3) введение в фармакокомпозицию наночастиц селена в концентрации ниже, чем 0,5 масс. %, приводит к тому, что в результате нехватки компонента в реакционной смеси происходит образование избытка незащищенных частиц селена и селен выпадает в осадок в виде аморфного селена. Введение в фармкомпозицию наночастиц селена выше, чем 5% приводит к тому, что данная концентрация наночастиц близка к насыщенному раствору, начальный раствор не стабилен и наночастицы выпадают в осадок.

Синтез препарата осуществлялся следующим образом.

Селен восстанавливался из селенита натрия солянокислым гидразином. Полученные наночастицы селена стабилизировались раствором иммуноглобулинов. Для избавления от низкомолекулярных соединений проводился диализ против фосфатносолевого буфера. Конечный препарат, в котором содержится Nano - Se и иммуноглобулин, подвергался лиофильной сушке.

Оценка острой токсичности препарата проводилась согласно ГОСТ 32644-2014 года.

Было взято 3 лабораторные мыши весом 23 грамма, им было введено 2000 мг/кг препарата (согласно ГОСТ 32644-2014 года), внутрибрюшинно. При введении болевой реакции не наблюдалось, первые признаки интоксикации появились спустя час, мыши сбились в угол, появилось учащенное дыхание. Спустя 24 часа 2 мыши чувствуют себя в пределах нормы, одна мышь в состоянии угнетения, погибла через 8 часов. Далее состояние мышей не менялось, реакции на звук и на прикосновение у мышей не изменилась, болезненности не наблюдается.

Для второго введения было взято 3 лабораторные мыши весом 20 грамм, и им было введено 2000 мг/кг препарата (согласно ГОСТ 32644-2014 года), внутрибрюшинно. При введении болевой реакции не наблюдалось, первые признаки интоксикации появились спустя час: у подопытных наблюдалось учащенное и глубокое дыхание. Спустя еще 35 минут признаки интоксикации остались неизменны. Через 50 минут мыши стали дышать реже, 2 мыши лежат в углу, одна питается. Спустя 24 часа мыши пришли в норму, никаких изменений в поведении и состоянии не наблюдалось.

Было проведено конструирование препарата на основе неспецифического иммуноглобулина и наночастиц селена для коррекции иммунной системы у животных.

Препарат, согласно ГОСТ 32644-2014 года, относится к 5 классу опасности, и имеет относительно низкую опасность острой токсичности.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способу получения ветеринарного препарата на основе неспецифических иммуноглобулинов и коллоидных частиц селена для коррекции иммунной системы. Способ получения ветеринарного препарата на основе неспецифических иммуноглобулинов и коллоидных частиц селена для коррекции иммунной системы, характеризующийся наличием наночастиц селена, заключается в том, что в дистиллированной воде производят конъюгацию неспецифического иммуноглобулина и наночастиц селена, полученных при восстановлении из селенита натрия солянокислым гидразином 25 мМоль, с последующим диализом против фосфатносолевого буфера и дальнейшей лиофильной сушкой полученной инъекционной лекарственной формы, при следующем сочетании компонентов, мас.%: коллоидные частицы селена 0,01-0,10; неспецифические иммуноглобулины 0,10-0,20; дистиллированная вода остальное. Вышеописанное изобретение позволяет получить препарат на основе неспецифического иммуноглобулина и коллоидных частиц селена для коррекции иммунной системы животных с пониженной токсичностью. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ получения ветеринарного препарата на основе неспецифических иммуноглобулинов и коллоидных частиц селена для коррекции иммунной системы, характеризующийся наличием наночастиц селена, заключающийся в том, что в дистиллированной воде производят конъюгацию неспецифического иммуноглобулина и наночастиц селена, полученных при восстановлении из селенита натрия солянокислым гидразином 25 мМоль, с последующим диализом против фосфатносолевого буфера и дальнейшей лиофильной сушкой полученной инъекционной лекарственной формы, при следующем сочетании компонентов, мас.%:

коллоидные частицы селена 0,01-0,10 неспецифические иммуноглобулины 0,10-0,20 дистиллированная вода остальное