Наночастица селена, покрытая мультикиназным ингибитором сорафенибом, с противофиброзным действием и способ ее получения Российский патент 2024 года по МПК A61K31/44 A61K33/04 A61P35/00 B01J19/08 B82Y5/00 

Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам и способам, предназначенным для терапии фиброза печени. В качестве основных составляющих выступают наночастицы селена сферической формы диаметром 50-250 нм, полученные методом лазерной абляции и сорбированного на их поверхности мультикиназного ингибитора сорафениба слоем толщиной 10-20 нм. Диаметр нанокомплекса селена с сорафенибом 60-270 нм. Комплексные исследования показали высокую эффективность терапевтического применения наночастиц селена, покрытых сорафенибом для лечения тяжелого фиброза печени и возможности регрессии микронодулярного цирроза

Уровень техники

Фиброз печени является результатом практически любых воспалительных процессов в печени. Это процесс замещения гепатоцитов соединительной тканью, приводящий к развитию печеночной недостаточности и ряда других тяжелейших патологий. Известно, что клетки печени способны к самовосстановлению после тяжелых поражений токсинами, однако при фиброзе способность клеток к регенерации постепенно теряется, так как паренхима заменяется рубцовой тканью, которая не может поддерживать функции органа, такие ¹ как обезвреживание токсинов и продуктов клеточного метаболизма, синтез желчных кислот, накопление необходимых микроэлементов и соединений, участвующих в кроветворных функциях и др. Сорафениб (So) рекомендован управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FAD, США) в качестве препарата первой линии для терапии рака печени и почек. Он представляет собой молекулу, обладающую высокой степенью таргетности, эффективно способствующей выживанию онкобольных через механизмы подавления пролиферации, ангиогенеза и индукции апоптоза. Однако существует ряд серьезных ограничений для применения сорафениба и его известных аналогов - плохая растворимость, необходимость применения высоких доз с вытекающими из этого осложнениями на здоровые ткани и органы (кожная токсичность, диарея, гипертензия, ладонно-подошвенный синдром, формирование резистентности клеток к препарату (Li and Wang, 2016; Llovet et al., 2008; Wilhelm et al., 2004; Vogel and Saborowski, 2020).

В то же время появляется все больше убедительных доказательств противоракового действия селен-содержащих соединений и наночастиц, созданных на основе селена (Se) (Cheng et al., 2009; Kudo et al., 2018; Braix et al., 2017; Zhu et al., 2015; Abou-Alfa et al., 2018). Противораковые свойства Se зависят от его химической формы, терапевтических доз и типа опухоли. При низких концентрациях селен-содержащие соединения стимулируют клеточный рост и индуцируют синтез селенопротеинов, тогда как высокие концентрации этих агентов ингибируют рост клеток и предотвращают химически-индуцированный канцерогенез. Более высокие питательные дозы Se могут стимулировать иммунную систему человека. Известно, что множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), невосприимчивость клеток или организма к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разными механизмами действия, является серьезной клинической проблемой, которая часто является причиной, ограничивающей эффективность противораковой химиотерапии. Более ранние работы показали, что Se способен ингибировать рост устойчивых к лекарственным препаратам клеток, также, как и предотвращать развитие такой устойчивости (Sui et al, 2008). Известна заявка на патент WO 2012/077135 (14.06.2012) «Замещенные 4-(ариламино) селенофенопиримидиновые соединения и способы их применения», в которой предлагают широкий ряд активных соединений-аналогов сорафениба и способы их применения для лечения псориаза, эндометриоза, фиброзных и пролиферативных нарушений мезангиальныхклеток и солидных опухолей (рак молочной железы, рак дыхательных путей, рак мозга, рак репродуктивных органов и др.). Однако, указанные в патенте активные соединения предполагают использование высоких доз, сопоставимых с применением самого сорафениба. разработанный нами нанокомплекс селен-сорафениб строго направлен на лечение фиброза печени с целью снижения высоких доз активного соединения при сохранении высокого противофиброзного потенциала сорафениба.

Известна заявка на изобретение AU 2022203761 (А1), которая предполагает комбинированную терапию рака печени сорафенибом или его аналогом регорафенибом совместно с троксацйтабйном (бета-L-диоксолан цитидин), который является более цитотоксическим аналогом дезоксицитидина. В данном патенте показаны убедительные доказательства противоракового действия комбинированной терапии. Однако представленный подход обладает стандартными для химиотерапии недостатками - очень ограниченной таргетностью (за счет сорафениба или регорафениба) и повышенной нагрузкой на здоровые ткани организма при использовании высоких доз высокотоксичного троксацитабина. Следует также сказать, что троксацитабин вступил в фазу III клинических испытаний в 2008 г. по показаниям для лечения острого миогенного лейкоза и не прошел их.

Среди известных препаратов на основе селен-содержащих соединений в последнее время все большей популярностью пользуются лекарственные препараты на основе наночастиц Se (SeNPs), которые очень часто используются в комбинированной терапии, что повышает эффективность лечения, а также в качестве носителей химиотерапевтических средств, таких как цисплатин, 5-фторурацил, доксорубицин и иринотекан (Colagrande et al., 2015; Wang et al., 2015; Abou-Alfa et al., 2010), что демонстрирует наличие синергетического эффекта между противораковыми препаратами и Se. Известно, что SeNPs обладают поливалентной поверхностью, что позволяет им вступать во взаимодействие с различными химическими соединениями посредством ковалентных и нековалентных связей. Имеющиеся на их поверхности заряды могут конъюгировать с различными положительно и отрицательно заряженными группами (NH, С=О, СОО-, C-N и др.), что говорит об их высокой адсорбционной способности, что позволяет сорбировать на поверхности наночастиц селена активное противораковое соединение - So и доставлять к пораженным фиброзом тканям печени. Что касается наночастиц селена, то появляются патенты не столько на способ получения, сколько направленные на доставку лекарственных препаратов, нацеленных на лечение рака (US 8445026 B2), где в качестве химиотерапевтических агентов выступают 5-фторурацил, доксорубицин и иринотекан. В еще одной заявке на изобретение (JP 2018012713 (А)) показана технология получения полимерных наночастиц в состав которых входит противораковый агент - нилотиниб (ингибитор протеинтирозинкиназы Bcr-Abl онкопротеина). Данный нанокомплекс показал более высокую эффективность в лечении рака печени и метастазирования, по сравнению с самим нилотинибом. Однако, данные наночастицы обладают сложной и дорогостоящей технологией производства, могут характеризоваться ограниченной стабильностью, тогда как созданный нами нанокомплекс селена с сорафенибом существенно дешевле в производстве и каждый из компонентов нанокомплекса (как наноселен, так и сорафениб, нанесенный на наночастицу) обладают противораковым действием затрагивая различные сигнальные механизмы клеток. В научной литературе имеются убедительные данные, показывающие усиление противоракового действия сорафениба за счет совместного действия с наночастицами селена при ТАА-индуцированном раке печени. Было установлено, что совместное пероральное введение наночастиц селена и сорафениба снижало окислительный стресс, ангиогенез и подавляло метастазирование (Al-Noshokaty et al., 2022). Однако, в данной работе использовались отдельные препараты наночастиц селена и сорафениба, а не в виде нанокомплекса, что не позволяет снижать дозу введения сорафениба. Синтез гидрогелей (SOR-LUF-SeNPs) для контролируемого выделения сорафениба и наночастиц селена к клеткам опухоли при лучевой терапии также представляется перспективным подходом для лечения рака печени и противостояния хеморезистентности клеток к сорафенибу (Zheng et al., 2019.). Однако, синтез подобных гидрогелей в достаточных количествах в медицинских целях существенно затруднен в виду сложности и дорог. Созданные нами наночастицы селена и нанокомплекс селен-сорафениб обладают уникальностью, во-первых, что активным соединением является сорафениб, а во-вторых - сами SeNPs представляют собой чистые стабильные частицы размером 50-250 нм, полученные методом лазерной абляции. Наши исследования показали, что именно такой диаметр частиц позволяет активировать все возможные пути их эффективного проникновения в клетки и ткани при нивелировании токсических эффектов (Varlamova et al., 2022). Исследования на клеточных культурах рака печени (линия гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2) и рака мозга (глиобластома человека А-172) показали, что созданные наночастицы селена диаметром 100 нм и нанокомплекс селен-сорафениб диаметром 130 нм оказывают комплексный противораковый эффект. Эффективность наночастиц селена и нанокомплекса SeSo в индукции апоптоза раковых клеток многократно превышает эффективность сорафениба. Сравнительный анализ противораковой эффективности SeNPs и SeSo показал, что нанокомплекс SeSo на 20-30% эффективнее и вызывает гибель даже наиболее устойчивых к терапии и агрессивных клеток глиобластомы, не вызывая токсических эффектов на «здоровые» астроциты (Varlamova et al., 2022, 2023).

Технический результат изобретения заключается в создании наночастицы селена с мультикиназным ингибитором сорафенибом, обладающей противофиброзным действием на ткань печени, снижающей уровень экспрессии генов-маркеров фиброза и количество коллагеновых волокон, а также приводящей к уменьшению их протяженности в ткани печени.

Раскрытие сущности изобретения

Для получения и характеристики наночастиц селена использовали спектр современного оборудования - волоконный иттербиевый лазер, гальваномеханический сканатор LScanH (Атеко-ТМ, Россия), электрокинетический потенциал оценивали с помощью Zetasizer UltraRed Label (Malvern, UK), центрифугу Sigma 3-18KS, электронный микроскоп 200FE (CarlZeiss, Германия), прецизионный многоволновой рефрактометр Abbemat MW (AntonPaar, Austria), спектрометр FP-8300 (JASCO Applied Sciences, Канада).

Для исследования противофиброзного действия наночастиц селена и нанокомплекса селен-сорафениб использовали: виварий, соответствующий всем требованиям содержания лабораторных животных; флуоресцентную станции «Axio Observer Z1» со встроенным микроинкубатором, электрофизиологической установкой «patch clamp», оснащенную камерой Hamamatsu ORCA-Flash 2.8; прямой конфокальный сканирующий микроскоп LSM 510 МЕТА NLO; инвертированный конфокальный сканирующий микроскоп Leica TCS SP5; флуоресцентную станцию Zeiss «Cell Observer», оснащенную системой высокоскоростного переключения возбуждающих светофильтров и камерами Hamamatsu ORCA-Flash и AxioCam HSm; флуоресцентную станцию Leica AF 6000 LX, оснащенную системой сверхбыстрой смены светофильтров и высокоскоростной и высокочувствительной CCD-камерой Hamamatsu; многофункциональный планшетный ридер Spark 10М (Tecan); стереомикроскопы Leica EZ 40 D. Оборудование для проведения исследований в области молекулярной биологии и иммуноцитохимии: система регистрации (ДНК-Амплификатор) полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени ДНК-Технология (Россия); центрифуга 5810R настольная с охлаждением в комплекте с бакет-ротором А-4-62 и адаптерами 36×15 мл, 12×50 мл (Eppendorf, Германия); термошейкер TS-100 для перемешивания образцов в микропробирках в условиях термостатирован'йй (BioSan, Латвия); камера для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT System (BioRad, США); камера для горизонтального электрофореза Wide Mini Sub-Cell GT System (BioRad, США).

Получение наночастиц селена (SeNPs) и нанокомплекса селен-сорафениб (SeSo)

Существует 3 основных способа получения наночастиц селена - биологические (экстрагирование из растений, выращивание бактерий на обогащенных селеном средах), химические (электролиз, редокс-реакции) и физические (ультразвук, конденсация, лазерная абляция). Химические и биологические способы характеризуются высокой стоимость производства, получением наночастиц с примесями других соединений и сложность стабилизации наночастиц. В свою очередь, метод лазерной абляции, который был применен Нами, позволяет получать в большом количестве стабильные наночастицы со строго заданными параметрами без примесей.

Наночастицы селена были получены методом лазерной абляции массивных мишеней селена в деионизированной воде (Ω = 18 МОм×см) (рис. 1) Массивная мишень из селена (2×2 см высотой 4-5 мм) с полированной верхней поверхностью располагалась на дне экспериментальной кюветы таким образом, чтобы слой между поверхностью жидкости и мишенью составлял примерно 1 мм. Объем используемой воды составляет примерно 25-30 мл. В процессе абляции твердой мишени селена использовался волоконный иттербиевый лазер с длиной волны 1064 нм, частотой следования импульсов 20 кГц, длительностью импульса 80 не, средней мощностью 20 Вт. Излучение лазера перемещается вдоль поверхности мишени при помощи сканатора с F-Theta объективом. Скорость перемещения излучения составляет 1500 мм/с. Время абляции составляло 25-30 минут. Скорость генераций наночастиц селена составляло около 0,8 мг/мин. Для получения нужного объема раствора процедура абляции при необходимости повторялась. Массивная мишень облучалась лазерным лучом через тонкий слой воды (λ = 532 nm; Т = 8 ns; f = 10 kHz; P = 20 W; E_p = 5 mJ). Смещение лазерного луча на мишени осуществлялось с помощью гальваномеханический сканатор LScanH (Атеко-ТМ, Россия) по заданной траектории в виде параллельных прямых вписанных в квадрат с шагом 10 мкм. Полученный описанным образом коллоидный раствор наночастиц селена обладает бимодальным распределением по размерам: в коллоиде присутствует фракция частиц с размерами порядка 100 нм и фракция частиц с размерами около 200-300 нм. Все наночастицы имеют сферическую форму.

Изменяя характеристики лазерного излучения, скорость смешения и траекторию лазерного луча можно контролировать геометрические параметры наночастиц селена. Размер наночастиц, их концентрацию в коллоидном растворе и электрокинетический потенциал оценивали с помощью Zetasizer UltraRed Label (Malvern, UK). Полученный коллоидный раствор наночастиц Se затем отстаивается в течение 1 дня, чтобы выделить вторую фракцию. Вторую фракцию наночастиц выделяют с помощью лазерной фрагментации коллоидного раствора наночастиц Se. Используется коллоидный раствор наночастиц селена, полученный в результате абляции и после процедуры отстаивания. Используемый коллоид подвергается воздействию ультразвука в течение 10 минут. Объем используемого коллоидного раствора наночастиц селена используемый для фрагментации частиц составлял 300 мл. Чтобы минимизировать поглощение в объеме, лазерное излучение при помощи отражающих зеркал заводилось в кювету снизу через прозрачное дно. В процессе фрагментации полученных наночастиц Se использовался импульсный лазер на парах меди с длиной волны излучения 510,6 нм, длительностью импульса 15 наносекунд, частотой повторения 15 кГц. Средняя мощность излучения составляла 7 Вт. Лазерное излучение фокусируется вблизи дна кюветы (расстояние между дном кюветы и фокусом составляет 1 см) при помощи длиннофокусной линзы (f=30 см). Облучение коллоидного раствора происходило в течение 270 минут.Основная доля наночастиц Se после фрагментации имеет размеры приблизительно 100-120 нм. Таким образом получался препарат наночастиц селена (SeNPs) с мономодальным распределением по размерам и концентрацией частиц 10¹¹ мл^-1.

Мультикиназный ингибитор Сорафениб (Bayer HealthCare AG, Leverkusen, Germany) наносили на наночастицы селена. Сорафениб до конечной концентрации 30 мг/мл растворяли в 0,1 М цитратном буфере (рН 4,1), так как растворимость сорафениба в воде зависит от рН. При низких рН растворимость сорафениба увеличивается. В водный раствор сорафениба в цитратном буфере добавляли наночастицы селена, инкубировали в течение 25-35 минут. После этого для отделения наночастиц от исходного раствора, проводили центрифугирование. Использовали центрифугу Sigma 3-18KS, температура 4°С, скорость вращения ротора 18000 об/мин, при включенной системе управления Spincontrol S. Процедуру проводили трижды. Количество сорафениба ассоциированного с наночастицами определяли по изменению спектра поглощения раствора до добавления наночастиц и после осаждения наночастиц. Препарат наночастиц селена с концентрацией 10¹¹ мл^-1 может содержать на поверхности наночастиц порядка 12 мг/мл сорафениба. После присоединения сорафениба к наночастицам селена наблюдается увеличение гидродинамического диаметра комплекса SeSo на 10-20 нм, т.е. слой нанесенного на наночастицу сорафениба составляет 10-20 нм.

Противофиброзное действие наночастиц селена (SeNPs) и нанокомплекса селен-сорафениб (SeSo).

На рис. 7А показана морфология печени контрольной группы мышей (окраска гематоксилином и эозином) с нормальной архитектоникой тканей, при которой печеночные пластинки радиально расходятся от центральной вены, паренхима печени однородная и мелкозернистая, признаки фиброза отсутствуют.Через 3 месяца инъекций тиоацетамида (ТАА) наблюдались глобальные архитектурные искажения печени (Рис. 7Б, В, Г). Фиброзные изменения на микрофотографиях выглядят как темные полосы по ткани, разделяя печень на септы, что приводит к нарушению долькового строения печени. Выражены диффузные изменения паренхимы печени с признаками отека, отмечена дискомплексация печеночных балок, баллонная дистрофия гепатоцитов (21) (многие в состоянии некроза), выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация портальных трактов. Встречаются участки внутриклеточного холестаза, тельца Мэллории (22) и тельца Каунсильмена (23) (апоптоз гепатоцитов).

Краткое описание рисунков

Рис. 1. Схема получения наночастиц селена (SeNPs) методом лазерной абляции и их допированиемультикиназным ингибитором - сорафенибом (SeSo). Обозначения: 1 -лазерный луч; 2 - вода без нуклеаз; 3 - абляция наночастиц; 4 - селеновая подложка; 5 -сферические наночастицы из нульвалентного селена диаметром 100 нм и ζ = -30 мВ. 6 - мультикиназный ингибитор сорафениб в растворе (часть молекулы сорафениба заряжена положительно, а другая часть - отрицательно); 7 - сорафениб сорбируется на поверхность наночастиц селена (допирование наночастиц); 8 - нанокомплекс селен-сорафениб диаметром 120 нм, поскольку сорафениб покрывает наночастицу селена. Наночастицы селена в водном растворе имеют насыщенный оранжевый цвет (рис. 2 - SeNPs), а после нанесения на их поверхность сорафениба, цвет раствора полученного нанокомплекса становится менее насыщенным (рис. 2 - SeSo). Мультикиназный ингибитор сорафениб (BayerHealthCareAG, Leverkusen, Germany), который наносили на наночастицы селена, является бесцветным прозрачным веществом (рис. 2 - So). Сорафениб до конечной концентрации 30 мг/мл растворяли в 0,1 М цитратном буфере (рН 4,1), так как растворимость сорафениба в воде зависит от рН. При низких рН растворимость сорафениба увеличивается. В водный раствор сорафениба в цитратном буфере добавляли наночастицы селена, инкубировали в течение 30 минут (рис. 1). После этого для отделения наночастиц от исходного раствора, проводили центрифугирование. Использовали центрифугу Sigma 3-18KS, температуру 4°С, скорость вращения ротора 18000 об/мин, при включенной системе управления Spincontrol S. Процедуру проводили трижды. Количество сорафениба ассоциированного с наночастицами определяли по изменению спектра поглощения раствора до добавления наночастиц и после осаждения наночастиц. Препарат наночастиц селена с концентрацией 10 мл может содержать на поверхности наночастиц порядка 12 мг/мл стабилизированного сорафениба.

Рис. 2 Наночастицы селена (SeNPs), сорафениб (So) и нанокомплекс селен-сорафениб (SeSo). Морфологию наночастиц изучали с помощью просвечивающем электронном микроскопе 200FE (CarlZeiss, Германия). Согласно данным электронной микроскопии наночастицы селена (рис. 1А) и нанокомплекс селен-сорафениб (рис. 1Б) имеют сферическую форму. ТЕМ укомплектован приставкой для энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии. С помощью данного метода показано, что наночастицы состоят из селена в нульвалентном состоянии. Средний гидродинамический диаметр наночастиц селена составляет порядка 100 нм, полуширина находится в пределах 70-130 нм (рис. 3В). После присоединения сорафениба к наночастицам селена наблюдается увеличение гидродинамического диаметра комплекса SeSo на 10-20 нм. Средний дзета потенциал наночастиц селена был порядка -30 мВ (рис. 3Г). Дзета потенциал комплекса наночастиц селена с сорафенибом был несколько больше, порядка -20-25 мВ.

Рис. 3. Основные физико-химические характеристики коллоидного раствора наночастиц селена (А) и комплекса наночастиц селена с сорафенибом (Б). А, Б - ТЕМ микрофотографии наночастиц селена (А) и комплекса наночастиц селена с сорафенибом (Б). В - Гидродинамический диаметр наночастиц селена и комплекса наночастица селена с сорафенибом. Г - электро-кинетический потенциал наночастиц селена (SeNPs) и комплекса наночастица селена с сорафенибом (SeSo). Обозначения: 9 - число наночастиц в растворе (%); 10 - диаметр наночастиц в нм; 11 - общее количество наночастиц в растворе; 12 - дзета-потенцйал в мВ; 13 - наночастицы селена (SeNPs); 14 - нанокомплекс селен-сорафениб (SeSo). Нужно отметить, что водный коллоидный раствор наночастиц селена имел слабый рыже-красноватый оттенок и довольно слабо поглощал в диапазоне длин волны 240-300 нм (рис. 4). При этом комплекс наночастицы селена с сорафенибом интенсивно поглощает в диапазоне длин волн 240-300 нм. Спектр поглощения SeSo довольно характерный, имеет 4 локальных максимума. Такой спектр придают комплексу молекулы сорафениба, при этом характер спектра качественно не изменился при присоединении сорафениба к наночастицам селена.

Рис. 4. Спектральные свойства наночастиц селена, комплекса наночастица селена с сорафенибом и химически чистого сорафениба. Обозначения: 13 - наночастицы селена (SeNPs); 14 - нанокомплекс селен-сорафениб (SeSo); 15 - мультикиназный ингибитор сорафениб; 16 - оптическая Плотность; 17 - длина волны в нм. С помощью прецизионного многоволнового рефрактометра Abbemat MW (AntonPaar, Austria) измерен показатель преломления сред. Цифровой рефрактометр Abbemat MW с помощью гибкого программирования позволяет быстро и полностью автоматически измерять показатель преломления на различных длинах волн. Показано, что при всех длинах волн использованных для измерения, показатель преломления является минимальным для наночастиц селена, максимальным для комплекса наночастицы селена с сорафенибом (рис. 5). При этом показатель преломления комплекса наночастиц селена с сорафенибом был выше, чем у раствора химически чистого сорафениба такой же концентрации и коллоидного раствора наночастиц селена той же концентрации.

Рис. 5. Исследование показателя преломления водных растворов наночастиц селена, комплекса наночастица селена с сорафенибом и химически чистого сорафениба. А - Измерение показателя преломления при длине волны 435.8 nm. Б - Измерение показателя преломления при длине волны 589.3 nm. В - Измерение показателя преломления при длине волны 632.9 nm. Обозначения: 13 - наночастицы селена (SeNPs); 14 - нанокомплекс селен-сорафениб (SeSo); 15 - мультикиназный ингибитор сорафениб; 18 - показатель преломления. Флуоресценцию образцов изучали на спектрометре FP-8300 (JASCO Applied Sciences, Канада). Измерения проводили с включенным шаттером в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при комнатной температуре (~22°С). Каждый образец измеряли трижды. На рисунке 6 представлены типичные 3D-спектры. При повторных измерениях максимумы интенсивности меняются не более чем на несколько процентов. Показано, что коллоидный раствор наночастиц селена почти не флуоресцирует (рис. 6А). Водный раствор сорафениба (рис. 6Б) интенсивно флуоресцирует при возбуждении в диапазоне длин волн 230-280 нм, при этом эмиссия наблюдается в диапазоне 275-300 нм, также есть два отдельных слабо выраженных пика эмиссии на 405 нм. Максимумы флуоресценции наблюдаются при возбуждении на 266 нм и на 236 нм. Флуоресценция комплекса наночастица селена с сорафенибом (рис. 6В), по-видимому, обусловлена флуоресценцией сорафениба. Флуоресцентный спектр является аналогичным, но имеет почти в 2 раза меньшую интенсивность.

Рис. 6. Исследование флуоресценции водных растворов наночастиц селена (А), химически чистого сорафениба (Б) и комплекса наночастиц селена с сорафенибом (В). Обозначения: 13 - наночастицы селена (SeNPs); 14 - нанокомплекс селен-сорафениб (SeSo); 15 - мультикиназный ингибитор сорафениб; 19 - длина волны возбуждения флуоресценции в нм; 20 - длина волны регистрации флуоресценции в нм.

Рис. 7. Окраска срезов ткани печени с помощью гематоксилина и эозина. А -изображение интактной (здоровой) ткани. Б, В, Г - изображения ткани печени с ТАА-индуцированньгм фиброзам. Обозначения: 21 - дискомплексация печеночных балок (некроз) гепатоцитов; 22 - тельца Мэллории; 23 - тельца Каунсильмена. Для выявления фиброзных структур в печени применяли краситель пикро-сириус красный (Picro-Sirius Red), который селективно окрашивает коллаген I и III типов. Микроскопия препаратов контрольной группы (нормальная печень) показала окраску в красный цвет только стенок сосудов, что является нормальным местом отложения коллагена (рис. 8А). После 3-месячной индукции фиброза с помощью ТАА в срезах печени мышей обнаруживается широкий диапазон морфологических стадии патологического процесса. На рис. 8Б показан слабо выраженный очаговый портальный и перипортальный фиброз, расширенные портальные триады. Наблюдается ярко выраженное концентрическое разрастание коллагена вокруг желчных протоков (перидуктальный фиброз), что может указывать на формирование первичного склерозирующего холангита. Чаще встречаются участки умеренно выраженного венулярного и перивенулярного фиброза, структура паренхимы печени нарушена, начинают ярко прорисовываться некоторые фиброзные перегородки, соединяющие центролобулярные вены с портальными трактами (рис. 8 В). Тяжелая степень фиброза характеризуется широкими соединительнотканными септами, формирующими порто-портальные и центро-портальные септы, образуя ложные дольки печени и регенеративные узелки, которые нарушают архитектонику печени (рис. 8Г).

Рис. 8. Окраска срезов ткани печени с помощью пикро-сириус красного. А - изображение интактной (здоровой) ткани. Б, В, Г - изображения ткани печени с ТАА-индуцированным фиброзом. Последующее экспериментальное применение препаратов SeNPs, So и SeSo в качестве терапевтических средств, предполагало корректировку фиброзного состояния и микронодулярного цирроза, полученных с помощью инъекций ТАА. В группах, получавших лечение SeNPs и SeSo в течение 2 и 4 месяцев, заметно снижение количества коллагеновьгх волокон, а также уменьшение их протяженности, по сравнению с группой ТАА, на что указывает окрашивание пикро-сириус красным (Рис. 9). При этом, противофиброзное действие SeNPs и нанокомплекса SeSo обнаруживалось уже при низких концентрациях (0,1 мкг/гр) и через 2 месяца применения препаратов. Тогда как чистый сорафениб, в схожих концентрациях, практически не влиял на индуцированный фиброз, который оставался на уровне самовосстановления ткани.

Рис.9. Терапевтический эффект наночастиц селена (SeNPs) и нанокомплекса селен-сорафениб (SeSo) при введении в течение 2 и 4 месяцев мышам с ТАА-индуцированным фиброзом печени. Окрашивание ткани печени пикро-сириус красным. Обозначения: 24 - контроль; 25 - ТАА-индуцированный фиброз (3 месяца инъекций); 26 -лечение; 27 - самовосстановление печени; 28 - лечение в течение 2-х месяцев; 29 -лечение в течение 4-х месяцев; 30 - ткань печени после лечения наночастицами селена в концентрации 0.1 мкг/гр; 31 - ткань печени после лечения наночастицами селена в концентрации 1 мкг/гр; 32 - ткань печени после лечения сорафенибом в концентрации 0.1 мкг/гр; 33 - ткань печени после лечения сорафенибом в концентрации 1 мкг/гр; 34 - ткань печени после лечения нанокомплексом селен-сорафениб в концентрации 0.1 мкг/гр; 35 -ткань печени после лечения нанокомплексом селен-сорафениб в концентрации 0.1 мкг/гр.

Подсчет площади окрашенного коллагена показал достоверное ее снижение в группах лечения SeNPs и SeSo, который наблюдался уже через 2 месяца применения, но усиление противофиброзных эффектов регистрировался при использовании нанокомплекса8е8о к 4 месяцу лечения (рис. 10). Противофиброзный эффект сорафениба (So) наблюдался при длительном применении и в концентрации 1 мкг/гр (рис. 10).

Рис. 10. Эффект лечения фиброза наночастицами селена (SeNPs), сорафенибом (So) и нанокомплексом селен-сорафениб в течение 2 и 4 месяцев. Показан анализ общей площади коллагеновых волокон в срезах печени. Обозначения: 24 - контроль; 27 -самовосстановление печени; 28 - лечение в течение 2-х месяцев; 29 - лечение в течение 4-х месяцев; 30 - ткань печени после лечения наночастицами селена в концентрации 0.1 мкг/гр; 31 - ткань печени после лечения наночастицами селена в концентрации 1 мкг/гр; 32 - ткань печени после лечения сорафенибом в концентрации 0.1 мкг/гр; 33 - ткань печени после лечения сорафенибом в концентрации 1 мкг/гр; 34 - ткань печени после лечения нанокомплексом селен-сорафениб в концентрации 0.1 мкг/гр; 35 - ткань печени после лечения нанокомплексом селен-сорафениб в концентрации 0.1 мкг/гр; 36 - площадь коллагеновых волокон, выраженная в условных единицах.

Рис. 11. Терапевтичсекий эффект наночастиц селена (SeNPs) и нанокомплекса селен-сорафениб (SeSo) при введении в течение 2 и 4 месяцев мышам с ТАА-индуцированным фиброзом печени. Окраска срезов ткани печени с помощью гематоксилина и эозина. Обозначения: 24 - контроль; 25 - ТАА-индуцированный фиброз (3 месяца инъекций); 29 - лечение в течение 4-х месяцев; 31 - ткань печени после лечения наночастицами селена в концентрации 1 мкг/гр; 33 - ткань печени после лечения сорафенибом в концентрации 1 мкг/гр; 35 - ткань печени после лечения нанокомплексом селен-сорафениб в концентрации 0.1 мкг/гр. Таким образом, последствия индуцированного тяжелого токсического фиброза печени у мышей существенно снижались на фоне применения препаратов SeNPs и SeSo. Показан антифибротический эффект наночастиц селена, сопоставимый с биологическим действием нанокомплекса селен-сорафениб, но противофиброзный эффект SeSo усиливался с увеличением времени лечения. Помимо сокращения площади коллагеновых волокон, патоморфологическое исследование тканей печени мышей показало, что введение препаратов SeNPs и SeSo приводит к значительному улучшению гистологических показателей печени (рис. 11). В группах лечения наблюдали уменьшение отека (что отражалось в более равномерном просвете синусоид), восстановление целостности печеночных балок, в перипортальной зоне отмечалось значительное число регенерирующих гепатоцитов в состоянии митоза, возросло количество функционально активных клеток печени. По сравнению с группой ТАА, выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация портальных трактов практически полностью сменилась на умеренную диффузную инфильтрацию паренхимы печени (Рис. 11).

Примеры

Применение наночастиц селена диаметром 50 нм и менее приводит к менее выраженным эффектам, поскольку данные наночастицы проникают внутрь клеток за счет исключительно микропиноцитоза. Так, SeNPs диаметром 50 нм имеют величину ЕС50 для активации Са2+-сигнализации астроцитов коры мозга 1 мкг/мл. В то же время, применение SeNPs диаметром 100 нм приводит к активации Са2+-сигнальной системы клеток с ЕС50 0,58 мкг/мл, проникая внутрь клеток через 2 пути эндоцитоза - микропиноцитоза и клатрин-зависимого эндоцитоза. Применение SeNPs диаметром 400 нм приводит к активации только клатрин-зависимого эндоцитоза и ЕС 50 для активации Са2+-сигнальной системы клеток составляет 2.4 мкг/мл. Нанесение слоя сорафениба 10-20 нм на наночастицу селена диаметром 100 нм приводит к незначительному увеличению диаметра наночастицы, что не отражается на ее эффективности проникать внутрь клеток и тканей. При этом, слой сорафениба 10-20 нм позволяет переносить внутрь опухолевых клеток достаточное количество активного вещества. Увеличение слоя сорафениба до 50 и более нм приводит к увеличению диаметра самой наночастицы и как следствие, такие наночастицы хуже проникают в ткань. Кроме этого, как показали наши исследования, наночастицы с слоем сорафениба 10-20 нм более стабильны в коллоидном растворе и растворителях для инъекций, не агрегируют и не осаждаются.

На рисунке 12 показана зависимость противоракового действия наночастиц селена от их диаметра. Наночастицы селена диаметром 30-50 нм вызывают гибель 15-19% клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 после 2-х часового воздействия. Наночастицы диаметром 70-150 нм вызывают гибель 79-97% клеток, но увеличение диаметра наночастиц до 200-250 нм приводит к гибели 52% и 11% раковых клеток, соответственно. Следовательно, защитные эффекты наночастиц селена строга зависят от их диаметра.

Рис. 12. Эффект наночастиц селена различного диаметра на активацию гибели клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека (линия HepG2) при использовании в одинаковой концентрации (3 мкг/мл). Обозначения: 10 - диаметр наночастиц; 37 - процент погибших клеток HepG2, выраженное в процентах.

Литература.

1. Li L, Wang H. Heterogeneity of liver cancer and personalized therapy. Cancer Lett. 2016;379:191-197.

2. Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, Blanc JF, de Oliveira AC, Santoro A, Raoul JL, Forner A, Schwartz M, Porta C, Zeuzem S, Bolondi L, Greten TF, Galle PR, Seitz JF, Borbath I, Haussinger D, Giannaris T, Shan M, Moscovici M, Voliotis D, Bruix J; SHARP Investigators Study Group.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 2008 Jul 24;359(4):378-90.

3. Wilhelm SM, Carter C, Tang L, Wilkie D, McNabola A, Rong H, Chen C, Zhang X, Vincent P, McHugh M, Cao Y, Shujath J, Gawlak S, Eveleigh D, Rowley B, Liu L, Adnane L, Lynch M, Auclair D, Taylor I, Gedrich R, Voznesensky A, Riedl B, Post LE, Bollag G, Trail PA. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2004 Oct 1;64(19):7099-109.

4. Vogel A, Saborowski A. Current strategies for the treatment of intermediate and advanced hepatocellular carcinoma. Cancer Treat. Rev. 2020; 82:101946.

5. Cheng AL, Kang YK, Chen Z, Tsao С J, Qin S, Kim JS, Luo R, Feng J, Ye S, Yang TS, Xu J, Sun Y, Liang H, Liu J, Wang J, Так WY, Pan H, Burock K, Zou J, Voliotis D, Guan Z. Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma: a phase III randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet Oncol. 2009 Jan;10(l):25-34.

6. Kudo M, Finn RS, Qin S, Han KH, Ikeda K, Piscaglia F, Baron A, Park JW, Han G, Jassem J, Blanc JF, Vogel A, Komov D, Evans TRJ, Lopez C, Dutcus C, Guo M, Saito K, Kraljevic S, Tamai T, Ren Mj, Cheng AL. Lenvatinib versus sorafenib in first-line treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: a randomised phase 3 non-inferiority trial. Lancet. 2018 Mar 24;391(10126):1163-1173.

7. Bruix J, Qin S, Merle P, Granito A, Huang YH, Bodoky G, Pracht M, Yokosuka O, Rosmorduc O, Breder V, Gerolami R, Masi G, Ross PJ, Song T, Bronowicki JP, Ollivier-Hourmand I, Kudo M, Cheng AL, Llovet JM, Finn RS, LeBerre MA, Baumhauer A, Meinhardt G, Han G; RESORCE InVestigators.'Rbgorafenib for patients with hepatocellular carcinoma who progressed on sorafenib treatment (RESORCE): a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 2017 Jan 7;389(10064):56-66.

8. Zhu AX, Park JO, Ryoo BY, Yen CJ, Poon R, Pastorelli D, Blanc JF, Chung HC, Baron AD, Pfiffer ТЕ, Okusaka T, Kubackova K, Trojan J, Sastre J, Chau I, Chang SC, Abada PB, Yang L, Schwartz JD, Kudo M; REACH Trial Investigators. Ramucirumab versus placebo as second-line treatment in patients with advanced hepatocellular carcinoma following first-line therapy with sorafenib (REACH): a randomised, double-blind, multicentre, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2015 Jul; 16(7):859-70.

9. Abou-Alfa GK, Meyer T, Cheng AL, El-Khoueiry AB, Rimassa L, Ryoo BY, Cicin I, Merle P, Chen Y, Park JW, Blanc JF, Bolondi L, Klumpen HJ, Chan SL, Zagonel V, Pressiani T, Ryu MH, Venook AP, Hessel C, Borgman-Hagey AE, Schwab G, Kelley RK. Cabozantinib in Patients with Advanced and Progressing Hepatocellular Carcinoma. N Engl J Med. 2018 Jul 5;379(1):54-63.

10. Sui ZG, et al. Sorafenib plus capecitabine for patients with advanced hepatocellular caicinoma. China Pharm. 2008; 19:848-849.

11. Colagrande S, Regini F, Taliani GG, Nardi C, Inghilesi AL. Advanced hepatocellular carcinoma and sorafenib: Diagnosis, indications, clinical and radiological follow-up.World J Hepatol. 2015 May 18;7(8):1041-53.

12. Wang Z, Zhao Z, Wu T, Song L, Zhang Y. Sorafenib-irinotecan sequential therapy augmented the anti-tumor efficacy of monotherapy in hepatocellular carcinoma cells HepG2. Neoplasma. 2015;62(2):172-9.

13. Abou-Alfa GK, Johnson P, Knox JJ, Capanu M, Davidenko I, Lacava J, Leung T, Gansukh B, Saltz LB. Doxorubicin plus sorafenib vs doxorubicin alone in patients with advanced hepatocellular carcinoma: a randomized trial. JAMA. 2010 Nov 17;304(19):2154-60.

14. Al-Noshokaty TM, Mesbah NM, Abo-Elmatty DM, Abulsoud Al, Abdel-Hamed AR. Selenium nanoparticles overcomes sorafenib resistance in thioacetamide induced hepatocellular carcinoma in rats by modulation of mTOR, NF-кВ pathways and LncRNA-AF085935/GPC3 axis. Life Sci. 2022 Aug 15;303:120675

15. Zheng L, Li C, Huang X, Lin X, Lin W, Yang F, Chen T. Thermosensitive hydrogels for sustained-release of-sorafenib and selenium nanoparticles for localized synergistic chemoradiotherapy. Biomaterials. 2019 Sep;216:119220.

16. Varlamova EG, Khabatova VV, Gudkov SV, Turovsky EA. Ca²⁺-Dependent Effects of the Selenium-Sorafenib Nanocomplex on Glioblastoma Cells and Astrocytes of the Cerebral Cortex: Anticancer Agent and Cytoprotector. Int J Mol Sci. 2023 Jan 26;24(3):2411.

17. Varlamova EG, Goltyaev MV, Simakin AV, Gudkov SV, Turovsky EA. Comparative Analysis of the Cytotoxic Effect of a Complex of Selenium Nanoparticles Doped with Sorafenib, "Naked" Selenium Nanoparticles, and Sorafenib on Human Hepatocyte Carcinoma HepG2 Cells. Int J Mol Sci. 2022 Jun 14;23(12):6641.

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапевтическому применению наночастиц селена, покрытых сорафенибом. Предлагается применение наночастиц селена, покрытых мультикиназным ингибитором сорафенибом, для лечения фиброза печени, где наночастицы селена получены методом лазерной абляции и имеют размер 100-120 нм, при этом толщина слоя сорафениба составляет 10-20 нм. Указанное применение обеспечивает снижение уровня экспрессии генов-маркеров фиброза и количество коллагеновых волокон, а также приводит к уменьшению протяженности коллагеновых волокон в ткани печени. Комплексные исследования показали высокую эффективность терапевтического применения наночастиц селена, покрытых сорафенибом, для лечения тяжелого фиброза печени и возможности регрессии микронодулярного цирроза. 12 ил., 1 пр.

Применение наночастиц селена, покрытых мультикиназным ингибитором сорафенибом, для лечения фиброза печени, где наночастицы селена получены методом лазерной абляции и имеют размер 100-120 нм, при этом толщина слоя сорафениба составляет 10-20 нм.