ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСОВ СВИНЕЙ Российский патент 2023 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к составам и способам лечения или профилактики заболеваний, вызываемых цирковирусами свиней.

Цирковирусы - это основной класс вирусов, поражающих свиней. Сообщалось о нескольких типах ЦВС, включая ЦВС-1, ЦВС-2 и ЦВБ-3. Эти вирусы присутствуют во всем мире и заражают подавляющее большинство стад свиней, особенно ЦВС-2. Некоторые из них не являются патогенными, но другие могут вызывать заболевания (ЦВСБ), включая ЦВС-2a, ЦВС-2b, ЦВС-2d, предположительно также ЦВС-3. Заболевания, связанные с ЦВС, включают, среди прочего, синдром мультисистемного истощения после отъема (PMWS), синдром дерматита и нефропатии поросят (PDNS), комплекс респираторных заболеваний у свиней (PRDC), репродуктивные расстройства, гранулематозный энтерит, экссудативный эпидермит, некротизирующий лимфаденит и врожденный тремор.

Поэтому борьба с инфекцией ЦВС и связанными с ней заболеваниями (ЦВБС) в стадах свиней является основной задачей разводчиков. На сегодняшний день она основана на вакцинации. В настоящее время доступны различные вакцины против ЦВС для использования у поросят, в частности вакцины против ЦВС-2. Такие вакцины представляют собой либо инактивированные (например, убитые) вакцины, либо субъединичные вакцины. Вакцины против ЦВС, например, против ЦВС-2, способны снизить вирусную нагрузку и контролировать ЦВБС, например, за счет уменьшения вызванных вирусами поражений в лимфоидной ткани. Таким образом, в зависимости от условий и получения вакцинации эти вакцины могут быть полностью эффективными. Однако сообщалось о том, что у поросят материнский иммунитет может отрицательно влиять на эффективность таких вакцин. В частности, было упомянуто, что такое вмешательство может быть связано с возрастом поросят на момент вакцинации, со сроками вакцинации и, например, с уровнем материнского иммунитета. Согласно исследованиям, высокие уровни материнских антител влияют на гуморальный иммунный ответ после вакцинации против ЦВС-2 у поросят [22]. У поросят с высоким уровнем пассивного иммунитета после вакцинации наблюдалось снижение антител. Кроме того, Хааке и др. [11] предположили, что вакцинация в возрасте одной недели может привести к изменению индукции активного гуморального иммунитета у поросят.

Точная причина интерференции МАТ все еще является предметом исследований, но существует потребность в оптимизированных стратегиях или схемах вакцинации против ЦВС, которые могут обеспечить надежную защиту стад свиней.

В настоящей заявке представлены такие новые способы вакцинации свиней против ЦВС и для борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стадах свиней.

Более конкретно, изобретение относится к способу борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стаде свиней, и включает (i) вакцинацию свиноматок против ЦВС при отъеме и (ii) вакцинацию их поросят против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

В соответствии со способом по настоящему изобретению необходимо понимать, что свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме от поросят.

Авторы изобретения исследовали клиническую защиту (эффективность вакцины) такой новой схемой вакцинации, и обнаружили, что она может обеспечить надлежащую защиту с помощью уникальной дозы вакцины без необходимости оценивать пассивно приобретенный иммунитет, полученный от свинок и свиноматок. Комбинация вакцинации свиноматок при отъеме и их поросят в возрасте 2-7 недель очень эффективна для борьбы с инфекцией ЦВС и связанными с ней заболеваниями в стадах свиней и, по-видимому, не подвергается влиянию материнского иммунитета.

В частности, изобретение относится к способу борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС у свиней, и включает вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Данное изобретение также относится к способу вакцинации свиней против инфекции или заболевания ЦВС, и включает вакцинацию свиноматок и их поросят, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Изобретение также, в частности, относится к способу получения защитного иммунитета против ЦВС у свиней, который включает вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Изобретение также относится к способу борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стаде свиней, который включает (i) вакцинацию свиноматок против ЦВС при отъеме и (ii) вакцинацию поросят против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель; предпочтительно, способ включает вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 3 до 6 недель.

Изобретение также относится к вакцине против ЦВС для использования в способе борьбы с инфекцией ЦВС или заболеванием в стаде свиней, причем способ включает (i) вакцинацию свиноматок против ЦВС при отъеме и (ii) вакцинацию поросят против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель. В основном способ включает вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 3 до 6 недель.

Изобретение также относится к вакцине против ЦВС для вакцинации свиней от инфекции или заболевания ЦВС, включая вакцинацию свиноматок и их поросят, при этом (i) свиноматки вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Изобретение также относится к вакцине против ЦВС для использования для получения защитного иммунитета против ЦВС у свиней, предполагая вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Изобретение также относится к применению антигена ЦВС для производства вакцины для борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стаде свиней посредством (i) вакцинации свиноматок против ЦВС при отъеме и (ii) вакцинации поросят против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель. Предпочтительно применение включает вакцинацию свиноматок и их поросят против ЦВС, причем (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 3 до 6 недель.

Изобретение также относится к применению антигена ЦВС для производства состава для вакцинации свиней против инфекции или заболевания ЦВС путем вакцинации свиноматок и их поросят, где (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Изобретение также относится к применению антигена ЦВС для производства вакцины ЦВС, дающей защитный иммунитет против ЦВС у свиней путем вакцинации свиноматок и их поросят против ЦВС, при этом (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отъеме, а (ii ) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель.

Авторы изобретения обнаружили, что, когда свиноматок вакцинируют при отъеме (т.е. при отъеме их поросят), поросята следующего поколения будут очень чувствительны к вакцинации в возрасте 2-7 недель. В результате поросят можно эффективно защитить с помощью однократной вакцинации, а свиноматку можно вакцинировать при каждом отъеме.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления поросят вакцинируют в возрасте 3 недели или 6 недель.

В типичном варианте осуществления свиноматок и их поросят вакцинируют при отъеме, то есть по существу в один и тот же день.

В конкретном и предпочтительном варианте вакцинация свиноматок и поросят включает однократную инъекцию вакцины против ЦВС, например однократную внутримышечную инъекцию вакцины против ЦВС.

Данное изобретение может быть использовано в отношении любой вакцины против ЦВС и особенно подходит для вакцинации против ЦВС-2, более конкретно - в отношении инактивированных вакцин против ЦВС-2.

Вакцинные композиции

Используемый здесь термин «вакцина» включает любую композицию, которая может быть использована для того, чтобы вызвать, стимулировать или усилить иммунный ответ у животного (например, свиней) против ЦВС.

Таким образом, вакцины содержат по меньшей мере один антиген целевого вируса. Антигеном может быть, без ограничения, целый вирус (в инактивированной или аттенуированной форме), его экстракт или фракция, выделенный вирусный белок или другой вирусный компонент, нуклеиновая кислота, кодирующая его, или их фрагменты или производные.

Вакцины могут содержать, помимо антигена (или иммуногена), другие ингредиенты, известные сами по себе среднему специалисту в данной области, такие как фармацевтически приемлемые носители, наполнители, разбавители, адъюванты, стабилизаторы сублимационной сушки, смачивающие или эмульгирующие агенты, pH-буферные агенты, желирующие добавки или добавки, повышающие вязкость, или консерванты, в зависимости от пути введения.

Примеры фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или разбавителей включают, но не ограничиваются ими, деминерализованную или дистиллированную воду; физиологический раствор; масла на растительной основе, такие как ореховое масло, арахисовое масло, сафлоровое масло, оливковое масло, хлопковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло или кокосовое масло; силиконовые масла, включая полисилоксаны, такие как метилполисилоксан, фенилполисилоксан и метилфенилполисолпоксан; летучие силиконы; минеральные масла, такие как легкое жидкое парафиновое масло или тяжелое жидкое парафиновое масло; сквален; производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или гидроксипропилметилцеллюлоза; низшие алканолы, например, этанол или изопропанол; низшие аралканолы; низшие полиалкиленгликоли или низшие алкиленгликоли, например, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этиленгликоль, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль или глицерин; сложные эфиры жирных кислот, такие как изопропилпальмитат, изопропилмиристат или этилолеат; поливинилпирролидон; агар; каррагинан; камедь трагаканта или камедь акации и вазелин. Обычно носитель или носители составляют от 10% до 99,9% от веса вакцинной композиции и могут быть забуферены обычными способами с использованием реагентов, известных в данной области, таких как гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидрофосфат калия, их смеси и тому подобное.

Примеры адъювантов включают, но не ограничиваются ими, эмульсии типа "масло в воде", гидроксид алюминия (квасцы), иммуностимулирующие комплексы, неионные блок-полимеры или сополимеры, цитокины (такие как IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ и т.д.), сапонины, монофосфориллипид A (MLA), мурамилдипептиды (MDP) и т.п. Другие подходящие адъюванты включают, например, сульфат алюминия-калия, термолабильный или термостабильный энтеротоксин (ы), выделенные из Escherichia coli, холерный токсин или его B-субъединицу, дифтерийный токсин, столбнячный токсин, коклюшный токсин, неполный или полный адъювант Фрейнда. и т.д. Адъюванты на основе токсинов, такие как токсин дифтерии, токсин столбняка и токсин коклюша, могут быть инактивированы перед применением, например, обработкой формальдегидом.

Примерами стабилизатора сублимационной сушки могут быть, например, углеводы, такие как сорбит, маннит, крахмал, сахароза, декстран или глюкоза, белки, такие как альбумин или казеин, и их производные.

Вакцины также могут содержать антигены других патогенов, таких как Actinobacillus pleuropneunomia; Аденовирус; Альфавирусы, такие как вирусы энцефаломиелита восточных лошадей; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., Предпочтительно B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, предпочтительно биовары 1, 2 и 3; Вирус классической чумы свиней, вирус африканской чумы свиней; Хламидии и Chlamydophila sp. и предпочтительно C. pecorum и C. abortus; Clostridium spp., Предпочтительно Cl. difficile, кл. perfringens типов A, B и C, Cl. novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; Пищеварительный и респираторный коронавирус; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis в настоящее время называется Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Кишечная палочка; Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипы 1, 7 и 14; Вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита; lsospora suis; Вирус японского энцефалита; Лоусония внутриклеточная; Leptospira spp., Предпочтительно Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona и Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. предпочтительно M. avium, M. внутриклеточный и M.bovis; Mycoplasma hyponeumoniae; Парвовирус; Pasteurella multocida; Цитомеголовирус свиней; Паровирус свиней; Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; Вирус псевдобешенства; Ротавирус; Вирус Сагияма; Salmonella spp. предпочтительно S.tyhimurium и S.choleraesuis; Staphylococcus spp. предпочтительно S. hyicus; Streptococcus spp., Предпочтительно Strep, suis; Цитомегаловирус свиней; Вирус герпеса свиней; Вирус гриппа свиней; Вирус оспы свиней; Toxoplasma gondii; Вирус везикулярного стоматита и/или вирус экзантемы свиней.

Вакцинные композиции по изобретению могут быть жидкими препаратами, такими как водный раствор, водно-жировая эмульсия или эмульсия типа "масло в воде", сироп, эликсир, настойка, препарат для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционное введение), например, стерильные суспензии или эмульсии. Такие составы известны в данной области и обычно их получают растворением антигена и других типичных добавок в подходящих системах носителя или растворителей. Жидкие составы также могут включать суспензии и эмульсии, содержащие суспендирующие или эмульгирующие агенты.

Режим введения

Изобретение обеспечивает улучшенную схему вакцинации свиней против ЦВС, которая включает, по существу, одно введение свиноматкам при отъеме и одно введение поросятам в возрасте 3-6 недель. В типичном варианте осуществления свиноматок и их поросят вакцинируют в один и тот же день при отъеме. Такая вакцинация эффективно защищает поросят без необходимости оценки МАТ. Такой режим вакцинации эффективно защищает свиноматку до следующего отъема. Такая вакцинация обеспечивает эффективную вакцинацию поросят следующего поколения однократной вакцинацией в возрасте 3-6 недель.

Путь введения может быть чрескожным, через слизистую оболочку или другими парентеральными путями (внутрикожным, внутримышечным, подкожным, внутривенным или внутрибрюшинным). Вакцину по изобретению можно удобно вводить интраназально, трансдермально (т.е. наносить на поверхность кожи или на нее для системного всасывания), парентерально, окулярно и т.д. Парентеральный путь введения включает, но не ограничивается, внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшинный пути и тому подобное. Внутримышечный путь является предпочтительным.

Вакцины по изобретению можно вводить в виде однократных доз. Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить отдельно или можно вводить одновременно или последовательно с одной или несколькими дополнительными композициями, такими как, например, другие иммуногенные или вакцинные композиции для свиней.

На практике точное количество, необходимое для иммунологически эффективной дозы, может варьироваться от субъекта к субъекту в зависимости от таких факторов, как возраст и общее состояние субъекта, природы композиции и способа введения. Соответствующее «эффективное количество» может определить средний специалист в данной области, используя при этом только рутинные эксперименты. Например, в данной области известны способы определения или титрования подходящих доз вакцины для определения минимальных эффективных доз на основе веса животного (отличного от человека), концентрации вакцины и других типичных факторов. В типичном варианте осуществления разовая доза вакцины составляет 0,5-5 мл. Наиболее предпочтительно свиноматкам вводят 2-4 мл, а поросятам - 0,5-3 мл.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способу борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стадах. Борьба с инфекцией или заболеванием ЦВС означает, среди прочего, предотвращение, снижение или ограничение инфекции ЦВС и связанных заболеваний, предотвращение, сокращение или ограничение распространения ЦВС в стаде; предотвращение, уменьшение или ограничение возникновения или тяжести заболевания, связанного с ЦВС; или снижение вирусной нагрузки ЦВС.

Вакцинация против ЦВС-2

В предпочтительном варианте осуществления изобретение используется для вакцинации свиней против ЦВС-2 или для борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС-2. Таким образом, в изобретении используется вакцина против ЦВС-2.

Разработанные в настоящее время вакцины против ЦВС-2, такие как Circovac® (Ceva), Ingelvac®, CircoFLEX (Boehringer Ingelheim Vetmedica) или Suvaxyn®, представляют собой либо инактивированные вакцины против ЦВС-2, либо субъединичные вакцины. В субъединичных вакцинах против ЦВС-2 обычно используют очищенный рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2a, продуцируемый рекомбинантной экспрессией гена ORF2 ЦВС-2a. В этом отношении белок, кодируемый ORF2 изолятов ЦВС-2 Imp 1011, описан в EP 1741785. О белке, кодируемом ORF2 изолята ЦВС-2 ЦВС-2Rm, сообщалось в W02010/061000. Белок, кодируемый ORF2 изолята 412 ЦВС-2, описан в EPl 816200. Другой белок, кодируемый ORF2 другого изолята ЦВС-2, описан в EP 1036180 или EP2225367. Улучшенные синтетические белки типа ORF2 описаны в WO2013/030320 и W02014/167060.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение использует вакцину против ЦВС-2, которая представляет собой инактивированную вакцину против ЦВС-2. Вакцина может включать любой инактивированный штамм ЦВС-2, например инактивированный ЦВС-2a, инактивированный ЦВС-2b или инактивированный ЦВС-2d. Конкретный пример - Circovac.

В другом конкретном варианте осуществления в изобретении используется вакцина против ЦВС-2, которая представляет собой субъединичную вакцину, содержащую (или экспрессирующую) полипептид ORF2 ЦВС-2 или его фрагмент. В конкретном варианте осуществления ORF2 выбрано из ORF2 изолятов ЦВС-2 Imp1011, ЦВС-2Rm или 412, или ORF2, здесь наблюдается по меньшей мере 80% идентичность последовательности с такими белками, или их иммуногенным фрагментом, содержащим по меньшей мере 10, 15, более предпочтительно не менее 20 их смежных аминокислотных остатков.

Дополнительные аспекты и преимущества изобретения будут раскрыты в следующем экспериментальном разделе, который иллюстрирует заявленное изобретение.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 показан протокол иммунизации клинического исследования B.

На фигуре 2 показаны уровни IgG к ЦВС-2 у свиноматок.

На фигуре 3 показаны уровни IgG к ЦВС-2 у поросят.

Примеры

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ А

Дизайн исследования

Исследование проводится на одной итальянской свиноферме с подтвержденным диагнозом ЦВБС у свиней в соответствии с критериями консорциума ЕС по исследованиям ЦВБС. Данное исследование рандомизированное, контролируемое и слепое.

Предварительный набор свиноматок : у 150 свиноматок берут кровь в середине срока беременности для выявления антител к ЦВС-2 с помощью ELISA и расчета соотношения S/P. Организованы три группы по 50 свиноматок в каждой, которые распределяются по трем различным группам, уравновешенным в соответствии с: a) средней численностью свиноматок; б) среднее значение S/P.

Включение свиноматок: Три группы по 50 свиноматок обрабатываются следующим образом:

группа A: вакцинированы при отъеме (В1);

группа B: вакцинированы только за пять и три недели до предполагаемой даты опороса (В2);

группа C: невакцинированные (НВ)/контрольная группа

За неделю до предполагаемой даты опороса у всех свиноматок берут кровь на анализ.

Включение поросят: в исследование включено около 900 поросят-сосунов в возрасте трех недель (не менее 100 поросят на исследуемую группу).

При включении в исследование поросят от вышеупомянутых свиноматок (группы A, B и C) идентифицируют индивидуально с помощью ушных меток, 40% животных взвешивают и у 20% отбирают кровь при каждом отборе проб.

Затем поросята случайным образом распределяются в одну из трех исследуемых групп в пределах отдельных пометов. Все поросята получают внутримышечную инъекцию CIRCOVAC (слева), одна группа (A) в возрасте 3 недель, а другая группа (B) в возрасте 6 (шесть) недель. Одной группе (C) вводят физиологический раствор (плацебо) и оставляют в качестве отрицательного контроля.

Вакцинация свиноматок Вакцинация поросят 3-недельный возраст (А) 6-недельный возраст (B) Невакцинированные/Контрольные (C) При отъеме (40) (В1) 100 (В1-A) 100 (В1-B) 100 (20*) (В1-C) 5+3 недели до опороса (40) (В2) 100 (В2-A) 100 (В2-B) 100 (20*) (В2-C) Контрольная группа, - невакцинированные (40) (НВ) 100 (НВ-А) 100 (НВ-B) 100 (20*) (НВ-C) *взвешивание в разные моменты времени

Живую массу поросят измеряют при включении, в конце фазы доращивания и в возрасте 6 месяцев. Если возможно, регистрируют вес туш при убое. Индивидуальные обработки, которые проводят поросятам, регистрируются как мера заболеваемости. Для определения причины смерти каждого поросенка проводится патологоанатомическое исследование, за исключением случаев, когда причина смерти ясна и не связана с ЦВС-2 (например, поросята раздавлены свиноматкой, сломаны ноги и т. д.).

Среднесуточные прибавки в весе, заболеваемость и смертность, а также виремия ЦВС-2 сравниваются между исследуемыми группами как основные параметры эффективности схемы вакцинации.

Образцы крови берут у 20 поросят на группу в соответствии со сроками, указанными в таблице 1. Время взвешивания также указано в таблице 1.

У всех поросят наблюдают за реакциями на вакцинацию сразу после вакцинации и через 1 день, через 1 неделю, а затем еженедельно до исчезновения всех реакций.

Исследуемый препарат

Следственная статья

Препарат: CIRCOVAC (CEVA)

Состав/Титр: НЕАКТИВИРОВАННАЯ вакцина против ЦВС-2

Форма выпуска: ПЭТ флаконы по 100 мл

Животные

В исследование включены девять сотен здоровых поросят (по 100 в каждой группе) примерно трехнедельного возраста. Все поросята происходят от свиноматок, вакцинированных молодыми поросятами и повторно вакцинированных при первом разведении. Свиноматок вакцинируют при отъеме от предыдущей лактации или за 5 и 3 недели до опороса (2 ГРУППЫ СВИНОМАТОК) по схеме, представленной в пункте 2.

Животноводство

Исследуемые животные (все группы смешанные) содержатся на ферме стандартно.

Подопытных животных кормят на ферме стандартно.

"Ослепление"

Исследование слепое. Флаконы с вакцинами будут идентифицироваться только по коду на этикетке.

Обработка

доза: 2 мл свиноматкам и 0,5 мл поросятам

путь введения: внутримышечно

место введения инъекции: в левой части шеи

группа А в 3-недельном возрасте

группа В в 6-недельном возрасте

группа C - невакцинированная

Оценка эффектов

Для оценки эффективности различных протоколов вакцинации используются следующие параметры.

Среднесуточная прибавка в весе (ADWG)

Смертность, включая выбракованных животных, и причины смерти

Заболеваемость (индивидуальные процедуры/инъекции)

Отношение PCR -положительных животных к ЦВС-2

Вирусная нагрузка (Q-PCR) ЦВС-2 из образцов крови

Серологическое профилирование вируса РРСС и M hyo.

Вскрытие и микробиологические исследования самопроизвольно умерших животных, умерщвленных гуманно.

Оценка поражений легких при вскрытии

Кинетика гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа измеряется серологическим методом ELISA (INGENASA) и ELISpot для IFN-гамма SC соответственно. Эти исследования проводятся на хранящихся образцах крови и мононуклеарных клетках периферической крови.

Кроме того, определяют титры антител к ЦВС-2, чтобы оценить уровень материнского антитела и иммунный ответ на вакцинацию, а также время полевого инфицирования.

Вирусная нагрузка (Q-PCR) ЦВС-2 из образцов крови Согласно стандартным процедурам Q-PCR для ЦВС-2.

Серология

Серологический ответ на вакцинацию и инфекцию измеряется с использованием имеющихся в продаже наборов [лаборатории IDEXX (PRRS и Mhyo) и INGENASA (ЦВС-2) IgM+IgG]

После свертывания сыворотку разделяют на 2 пробирки, а образцы хранят при температуре ≤ - 18°C до анализа.

Клеточно-опосредованный иммунный ответ

Клеточно- опосредованный иммунный ответ измеряют с помощью анализа ELISpot для определения SC IFN-гамма.

Анализ IFN-γ ELISpot. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяют с помощью градиента плотности в растворе Histopaque-1077® на стадии центрифугирования при 420xg (1800 об/мин) в течение 30 минут.

В конце PBMC выделяют путем аспирации и ресуспендируют в среде RPMI-1640 для посева при плотности 200000 клеток/200 мкл RPMI-1640 с добавлением 10% FCS в 96-луночных планшетах, покрытых моноклональным антителом против IFN-γ (P2G10 - BD Pharmingen). Стимуляция антигена in vitro выполняется антигеном ЦВС-2 (вирус: 0,1-1 MOI; порядок величины: мкг/мл) в течение не менее 20 часов. Секрецию IFN-γ с помощью PBMC обнаруживают с использованием конъюгированного с биотином моноклонального антитела против IFN-γ (P2C11 - BD Pharmingen), вторичного антитела, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Vector), и раствора проявляющего субстрата NBT/BCIP (BioRad). Реакция визуализируется в виде синих пятен из-за осаждения субстрата, на котором клетки секретируют IFN-γ, с помощью AID® ELISpot Reader.

Поражения легких при вскрытии

При вскрытии повреждение легких проверяется в соответствии с сеткой Madec и SPES.

Результаты этих экспериментов позволяют подтвердить клиническую защиту (эффективность вакцины) такой новой схемой вакцинации, и то, что она может обеспечить надлежащую защиту с помощью уникальной дозы вакцины без необходимости проводить оценку пассивно приобретенного иммунитета от свинок и свиноматок.

КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ B

Три группы свинок, по 10 животных в каждой, были вакцинированы Circovac (2 мл) в соответствии со схемой вакцинации, представленной в следующей таблице:

Для оценки вирусемии и иммунного ответа у каждого животного на протяжении всего исследования брали по 12 проб крови в даты, указанные стрелками на фиг.1. Среднее значение IgG к ЦВС-2 у свиноматок и поросят представлено на фиг. 2 и 3.

Согласно результатам на фиг. 2 ясно отмечено, что вакцинация индуцировала выработку специфических антител у свиноматок. Поразительно, что у свиноматок группы В титры были более однородными, чем у свиноматок группы А. У свиноматок группы А всегда были высокие титры перед каждым опоросом в ответ на ревакцинацию перед опоросом. Мы не наблюдаем этих пиков у свиноматок группы B. Это означает, что у свиноматок группы B не было таких высоких концентраций антител незадолго до опороса, которые могли бы быть переведены в молозиво и, следовательно, появиться в крови поросят в виде МАТ.

Точно так же согласно фиг.3 можно сказать, что у поросят, рожденных от свиноматок группы А, отмечаются гораздо более высокие титры антител на 1-й неделе и также на 3-й неделе жизни. Кроме того, в группе A наблюдается очень высокий разброс титров. В отличие от этого поросята, рожденные от свиноматок первого опороса B (первый опорос), имеют умеренные титры на 1-й неделе и относительно низкие титры на 3-й неделе, а поросята от свиноматок второго опороса в группе B (второй опорос) имеет очень высокие титры на 1-й неделе (что не мешает, поскольку мы не вакцинируем в этом возрасте) и умеренные титры на 3-й неделе во время вакцинации. Кроме того, титры на 3-й неделе намного более однородны, чем у поросят группы А, а также группы С (контрольные, невакцинированные свиноматки). Некоторые поросята группы C также имеют высокие титры, вероятно, потому, что их матери были инфицированы и вырабатывали постинфекционные антитела. Их титры гораздо более изменчивы, чем у поросят группы B.

Таким образом, профиль иммунизации группы B является преимуществом, поскольку мы хотели достичь гомогенного уровня иммунного статуса у свиноматок, чтобы защитить их, а также подходящего (не слишком высокого), гомогенного иммунного статуса (уровня МАТ) у поросят, чтобы защитить их, не вызывая помех для вакцинации.

Таким образом, результаты этих экспериментов дополнительно подтверждают клиническую защиту (эффективность вакцины) такой новой схемой вакцинации, и то, что она может обеспечить надлежащую защиту с помощью уникальной дозы вакцины без необходимости оценки пассивно приобретенного иммунитета от свинок и свиноматок.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к способу вакцинации против цирковируса свиней (ЦВС). В изобретении, в частности, описаны способы борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стаде свиней, включая (i) вакцинацию свиноматок против ЦВС при отъеме и (ii) вакцинацию поросят против ЦВС в возрасте от 2 до 7 недель. улучшение клинической защиты (улучшение профиля вакцинации) от ЦВС свиноматок и их поросят. 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Способ вакцинации против цирковируса свиней (ЦВС) с использованием вакцины против ЦВС в иммунологически эффективной дозе, включающий вакцинацию свиноматок и их поросят с использованием вакцины против ЦВС,

при этом (i) свиноматок вакцинируют при отлучении, а (ii) поросят вакцинируют в возрасте от 2 до 7 недель для борьбы с инфекцией или заболеванием ЦВС в стаде свиней.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что (i) свиноматок вакцинируют против ЦВС при отлучении, а (ii) поросят вакцинируют против ЦВС в возрасте от 3 до 6 недель.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает вакцинацию против ЦВС свиней для получения ответного иммунитета против ЦВС.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что вакцинацию поросят проводят в возрасте 3 недели.

5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что вакцинацию поросят проводят в возрасте 6 недель.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вакцинацию свиноматок и их поросят проводят при отлучении, по существу, в один и тот же день.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ЦВС представляет собой ЦВС-2.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что вакциной против ЦВС является указанная инактивированная вакцина ЦВС-2.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что включает одноразовую инъекцию вакцины против ЦВС-2 свиноматкам и поросятам.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает вакцинацию свиноматок и поросят с помощью однократной внутримышечной инъекции вакцины против ЦВС.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что включает вакцинацию свиноматок при каждом отлучении от них поросят.