ЖИВАЯ СУХАЯ ВАКЦИНА "ИС" ПРОТИВ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ДИАРЕИ СВИНЕЙ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/00 A61P31/12 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики эпизоотической диареи свиней (ЭДС). ЭДС является острым и высоко контагиозным заболеванием свиней, характеризующимся высокой смертностью новорожденных поросят. ЭДС вызывает коронавирус, реплицирующийся в эпителиальных клетках ворсинок тонкого отдела кишечника свиней [2].

ЭДС встречается во многих странах с высоко развитым свиноводством. Она регистрируется в Европе и широко распространена в Южной Корее и Японии [6]. В последнее время случаи ЭДС отмечаются в крупных свиноводческих хозяйствах России.

Так как поросята заболевают в первые дни после рождения, их защита может быть обеспечена только колостральными антителами от иммунизированных свиноматок [1].

Для профилактики ЭДС в Южной Корее и Японии применяют живые вакцины [3, 5], которые в полевых условиях не обладают выраженной защитой. В последнее время испытание проходит вакцина из штамма DR13, которая вызывает протективный иммунитет после орального и внутримышечного введения [7].

Целью данного исследования являлось получение аттенуированного штамма вируса ЭДС и испытание его безвредности, антигенности и иммуногенности на свиньях в экспериментальных и производственных условиях.

Технический результат изобретения заключается в создании живой сухой вакцины против ЭДС на основе аттенуированного штамма «ИС» вируса ЭДС, утратившего вирулентность и сохранившего выраженные иммуногенные свойства для свиней в результате длительного последовательного пассирования в культуре клеток Vero.

Сущность изобретения заключается в следующем. Сухая вакцина против ЭДС содержит аттенуированный штамм «ИС» вируса ЭДС и стабилизатор (среду высушивания) в соотношении 7:3. Вакцина ЭДС представляет собой сухую пористую массу светло-розового цвета, полученную в результате лиофилизации смеси вируссодержащей культуральной жидкости со средой высушивания. Массовая доля влаги в сухой вакцине находится в пределах 1-4%. В течение 12 месяцев хранения при 2-8°С сухая вакцина в вакуумированных флаконах теряет инфекционную активность не более чем на 0,7 lg ТЦД₅₀/мл по сравнению с исходной.

Вакцинный штамм «ИС» получен из полевого вирулентного вируса ЭДС путем серийного пассирования в культуре клеток Vero (около 30 пассажей).

Вакцину вводят основным и ремонтным свиноматкам внутримышечно двукратно на 75-80 и 90-95 днях супоросности. Разовая прививочная доза вакцины равна 4,0 lg ТЦД₅₀. Свиноматки, привитые таким способом, становятся иммунными и обеспечивают защиту поросят-сосунов против ЭДС.

В случае возникновения ЭДС в хозяйстве помимо основных и ремонтных свиноматок вакцинируют хряков-производителей, которых прививают внутримышечно двукратно с интервалом 15-20 дней в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение оптимальных условий накопления вакцинного штамма вируса в культуре клеток

Изучали зависимость накопления вируса в культуре клеток Vero от дозы заражения (пример 1а) и способа культивирования (пример 1б). Культуру клеток заражали вирусом (пассажи 50 и 90, 5,5 lg ТЦД₅₀/мл), используя разные дозы: 0,1, 0,01, 0,001 и 0,0001 ТЦД₅₀/клетка.

Пример 1а. Накопление вируса в зависимости от дозы заражения

Пассаж вируса Заражающая доза вируса (ТЦД₅₀/клетка) 0,0001 0,001 0,01 0,1 Накопление вируса (lg ТЦД₅₀/мл) 50 4,7 5,0 5,3 5,7 90 4,3 5,0 5,7 6,0

Установлена прямая зависимость накопления вируса от дозы заражения. Оптимальная доза заражения равна 0,1 ТЦД₅₀/клетка.

Сравнивали накопление вируса в статической (матрасы 1,5 л) и роллерной (сосуды 1-3 л) культуре клеток Vero. Вирус вносили в дозе 0,1 ТЦД₅₀/клетка.

Пример 16. Накопление вируса в статической и роллерной культурах клеток Vero в период выраженного ЦПЭ

Титр вируса (lg ТЦД₅₀/мл) через 18 ч после заражения (0,1 ТЦД₅₀/клетка) В статической культуре В роллерной культуре 5,0-5,5(5,3) 5,3-5,5(5,4)

В скобках указан средний титр вируса в 5 опытах.

Таким образом, максимальное накопление вакцинного вируса в культуре клеток Vero происходит при множественности заражения 0,1 ТЦД₅₀/клетка и не зависит от способа культивирования.

Пример 2. Сохранность вакцинного штамма вируса в процессе лиофилизации и в сухой вакцине при хранении

В процессе лиофилизации вакцины определяли титр вируса до смешивания со стабилизатором, после смешивания со стабилизатором перед сушкой, сразу после сушки и после испытания сухой вакцины методом ускоренного старения (37°С, 168 часов).

Пример 2а. Активность экспериментальных серий живой сухой вакцины ЭДС в процессе лиофилизации

В процессе лиофилизации титр вируса снижается на 0,6-0,8 lg ТЦД₅₀/мл. При ускоренном старении титр вируса снижается на 1,7-2,0 lg ТЦД₅₀/мл (пример 2а).

Пример 2б. Активность сухой вакцины ЭДС в процессе хранения (2-8°С)

В процессе хранения сухой вакцины при 2-8°С ее инфекционная активность в среднем снижалась следующим образом: через 3 месяца на 0,3; через 6 месяцев на 0,6; через 9 месяцев на 0,7 и через 12 месяцев на 0,7 lg ТЦД₅₀/мл (пример 2б).

Пример 3. Авирулентность вакцинного штамма и безопасность вакцины

Снижение вирулентности штамма «ИС» в процессе аттенуации в культуре клеток Vero проверяли на безмолозивных поросятах, которых кормили стерилизованным коровьим молоком каждые 4-6 часов. Вирус вводили орально на второй день жизни в объеме 2 мл. За поросятами наблюдали 7 дней. Через 16 часов после введения вируса 15 пассажа в дозе 3,0 lg ЛД₁₀₀ у поросят наблюдали слабовыраженную диарею, которая прекратилась через 48 часов. После введения вируса 36 пассажа в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀ отклонений от нормального состояния не отмечали. Наличие вируса в фекалиях привитых поросят определяли методом ПЦР. Выделение вируса с фекалиями обнаружено только у поросят первой группы в период слабовыраженной диареи.

Безвредность аттенуированного штамма «ИС» и сухой вакцины проверяли на морских свинках массой 350-400 г.Испытуемые препараты вводили однократно внутримышечно в область бедра. Вакцинный вирус и сухую вакцину вводили морским свинкам в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀ в объеме 1 см³. За морскими свинками наблюдали в течение 10 дней. Все испытуемые препараты: вакцинный вирус 36 пассажа и 2 серии сухой вакцины, оказались безвредными при контроле на морских свинках.

Супоросные свиноматки и 30-35-дневные поросята, вакцинированные по разным схемам, не проявили каких-либо отклонений от физиологической нормы в течение длительного наблюдения. Супоросность и опоросы вакцинированных свиноматок протекали нормально. За один опорос свиноматки приносили в среднем по 10-11 поросят. Новорожденные поросята в течение всего периода наблюдения развивались нормально.

Таким образом, штамм ИС вируса ЭДС, используемый для изготовления живой сухой вакцины (прошедший 50 и более пассажей в культуре клеток Vero), является полностью авирулентным и безвредным для животных.

Пример 4. Антигенную активность вакцины определяли по уровню специфических вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотке крови свиней до и после вакцинации, а также в молозиве и сыворотке крови новорожденных поросят.

Свиноматок прививали двукратно в дозе 10⁴ ТЦД₅₀ на 75-80 и 90-95 днях супоросности. Поросят в возрасте 30-35 и 60-70 дней прививали двукратно в той же дозе.

Пример 4а. Антигенная активность прототипной серии сухой живой вакцины против ЭДС

Группа животных Титр ВНА в сыворотке крови Перед вакцинацией 3 недели после первой вакцинации 2 недели после второй вакцинации Свиноматки основные (группа 1) <1:4 1:240; 1:320; 1:240; 1:160; 1:160 (1:224) 1:240; 1:320; 1:320; 1:320; 1:240 (1:288) Ремонтные свинки (группа 2) <1:4 1:80; 1:120; 1:160; 1:160; 1:160 (1:136) 1:240; 1:160; 1:320; 1:240; 1:320 (1:256) Поросята 30-35 дней (группа 3) <1:4 1:160; 1:120; 1:80; 1:120; 1:160 (1:124) 1:160; 1:160; 1:120; 1:120; 1:160; 1:160; 1:120; 1:160 (1:145)

В скобках указан уровень ВНА в среднем по группам животных.

Пример 4б. Колостральные антитела у двукратно вакцинированных свиноматок

Установлено, что сухая вакцина вызывала выраженную сероконверсию у всех трех групп свиней (1:120-1:320), особенно после двукратного применения (пример 4а).

В молозиве двукратно вакцинированных свиноматок также обнаружены ВНА в высоком титре (1:120-1:320) (пример 4б).

Пример 5. Колостральный иммунитет у поросят

Определяли устойчивость трехдневных поросят к экспериментальному оральному заражению поросят вирулентным вирусом ЭДС (3,0 lg ЛД₅₀). Все поросята под вакцинированными свиноматками не заболели ЭДС, не проявили каких-либо отклонений от физиологической нормы и не выделяли вирус с фекалиями в течение периода наблюдения (2 недели).

Данные экспериментального заражения поросят (пример 5), а также выраженный титр колостральных антител в сыворотке крови поросят-сосунов (пример 5а) свидетельствуют о надежном пассивном (колостральном) иммунитете у поросят, полученных от дважды вакцинированных свиноматок.

Предварительные расчеты показали, что период полураспада колостральных антител при ЭДС составляет около 7 дней (пример 5а).

Пример 5а. Титр материнских ВНА в сыворотке крови поросят-сосунов

Пример 6. Изучение иммунизирующего эффекта в зависимости от кратности и дозы введения вакцины показало, что наиболее выраженный эффект достигается при двукратном введении вакцины в дозе 10⁴ ТЦД₅₀ с интервалом 2 недели.

Пример 7. Эффективность применения вакцины в производственных условиях

Всего в период с 12.2008 г. по 04.2010 г. изготовлено более 70 тысяч доз живой вакцины против ЭДС. Вакцину применяли в 5 неблагополучных по ЭДС хозяйствах промышленного типа (20-140 тысяч свиней в одном хозяйстве), в которых наблюдали массовую гибель новорожденных поросят (~40%) и свиней на откорме. Всего в 5 хозяйствах вакцинированы около 12300 свиноматок. В результате применения вакцины удалось ликвидировать заболевание во всех хозяйствах в течение 2-4 недель после начала вакцинации. Сохранность поросят, родившихся от вакцинированных свиноматок, составила 91-97%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сергеев В.А., Федорова Е.С., Алипер Т.И., Мишин A.M. Инактивированная культуральная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (вакцина ТГИ) // Ветеринария, 2006, №5, 20-24.

2. DeBouck P., Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine epidemic enteric coronavirus CV777 // Am. J. Vet. Res. - 1980. - Vol.41. - P.219-223.

3. Kadoi К., Sugioka H., Satoh T. et al. The propagation of a porcine diarrhea virus in swine cell lines // New Microbiol. - 2002. - Vol.25. - P.285-290.

4. Kweon C.H., Kwon B.J., Kang Y.B. et al. Cell adaptation of KPEDV-9 and serological survey on porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea // Korean J. Vet. Res. - 1994. - Vol.34. - P.321-326.

5. Kweon C.H., Kwon B.J., Lee J.G. et al. Derivation of attenuated porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) as vaccine candidate // Vaccine. - 1999. - Vol.17. - P.2546-2553.

6. Pensaert M., Yeo S.G. Porcine epidemic diarrhea // Diseases of Swine. 9^th edition. - 2006. - P.367-372.

7. Song D.S., Oh J.S., Kang B.K. et al. Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain // Res. Vet. Sci. - 2007. - Vol.82. - P.134-140.

8. Song D.S., Yang J.S., Oh J.S. et al. Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strain by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF 3 // Vaccine. - 2003. - Vol.21. - P. 1833-1842.

Изобретение относится к области вирусологии. Вакцина содержит культуральную жидкость аттенуированного штамма «ИС» вируса эпизоотической диареи свиней с титром 4,7-5,5 lg ТЦД₅₀ и среду высушивания при соотношении 7:3. Вакцину вводят свиноматкам двукратно на 75-80 и 90-95 днях супоросности в дозе 10⁴ ТЦД₅₀ для профилактики эпизоотической диареи свиней. Вакцина безвредна, ареактогенна, обладает выраженными защитными свойствами. 2 н.п. ф-лы, 7 табл.

1. Живая сухая вакцина против эпизоотической диареи свиней, содержащая культуральную жидкость аттенуированного штамма вируса эпизоотической диареи свиней и среду высушивания, отличающаяся тем, что содержит культуральную жидкость аттенуированного штамма «ИС» вируса эпизоотической диареи свиней с титром 4,7-5,5 lg ТЦД₅₀ и среду высушивания при соотношении 7:3.

2. Способ профилактики эпизоотической диареи свиней, включающий внутримышечное введение вакцины, отличающийся тем, что свиноматкам двукратно на 75-80 и 90-95 днях супоросности вводят вакцину по п.1 в дозе 10⁴ ТЦД₅₀.