ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/225 A61P31/12 

Изобретение относится к биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) - инфекционная высококонтагинозная болезнь, главным образом поросят до 3-месячного возраста, характеризующаяся катарально-геморрагическим гастроэнтеритом, рвотой, дегидратацией организма и сопровождающаяся атрофией ворсинок верхнего отдела тонкого кишечника и высокой смертностью (часто до 100%) среди поросят до 2-недельного возраста.

Известна вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и способ ее применения (см. патент РФ №2306951, МПК A61K 39/225, опуб. 27.09.2007), содержащая инактивированный вирулентный штамм «ТВ» вируса ТГС в титре 7,0-8,5 lg ТЦД_50/мл и адъювант. Вакцины вводят основным и ремонтным свинкам внутримышечно двукратно на 75-80 и 90-100 дней супоросности.

Однако инактивированные вакцины, наряду с положительным действием, в ряде случаев могут вызывать аллергические реакции из-за добавления к ним адъювантов. Их использование трудоемко, предусматривает многократную иммунизацию животных. Кроме этого, они не обеспечивают эффективной защиты из-за отсутствия антигенной идентичности вирулентному возбудителю.

Известна живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней на основе штамма «Горский-95» и способ ее применения (см. патент РФ №2140982, МПК C12N 7/00, опуб. 10.11.1999). Данный штамм обозначен как штамм «Горский-95» и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ) инв. №1941.

Вакцину вводят дважды супоросным свиноматкам перорально соответственно за 6-8 и 2-3 недели до опороса.

Однако эффективность вакцины невысока ввиду невысокой активности штамма, который способен накапливаться только до 10⁵ ТЦД 50/см³, обладает не очень высокой стабильностью (до 50 пассажа), не пригоден для профилактики трансмиссивного гастроэнтерита у поросят всех возрастных групп, включая отъемышей.

Наиболее близкой к заявляемой является живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и способ ее применения (см. патент РФ №2347585, МПК A61K 39/225, опуб. 27.02.2008), содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5, сахарозу, пептон, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2. Биологическая активность препарата составляет не ниже 6,0 lg ТЦД _50/мл. Вакцину вводят супоросным свиноматкам путем скармливания с сухим кормом перед утренним кормлением в дозе 10 г на голову в течение 3-х дней подряд за 10-14 дней до опороса. На 10-14 день после опороса вакцину дают и поросятам также перед утренним кормлением в дозе 5 г на голову.

Однако данная вакцина предназначена для орального применения. Кроме этого, она требует значительных трудозатрат в изготовлении и применении, так как предусматривает использование сухого корма и трехкратное введение животным. Механизм действия направлен на активизацию только клеточного иммунитета, что обеспечивает лишь колостральную защиту новорожденных поросят и не предотвращает развитие инфекционного процесса у вакцинированных свиноматок.

Изобретение направлено на решение задачи создания авирулентной эффективной живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, простого в эксплуатации способа ее применения, направленных одновременно на активизацию у свиноматок клеточного иммунитета, обеспечивающего колостральную защиту новорожденных поросят, и активизацию у свиноматок гуморального иммунитета, обеспечивающего защиту их от заражения.

Для решения поставленной задачи вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал и наполнитель, согласно изобретению в качестве вирусного материала содержит материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл, а в качестве наполнителя - физиологический раствор при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Вирусный материал из штамма «ВН-96» - 0,09-0,1%

Физиологический раствор - остальное.

Способ применения живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней заключается во внутримышечной однократной иммунизации супоросных свиноматок за 40-45 дней до опороса в дозе 4,5-5 мл на голову, при этом в качестве вакцины используют вакцину, содержащую вирусный материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов (мас.%): вирусный материал из штамма «ВН-96» - 0,09-0,1%, физиологический раствор - остальное.

Для обеспечения дополнительной зашиты поросят в послеотъемный период осуществляют иммунизацию поросят-сосунов в возрасте 23-27 дней однократно внутримышечно в дозе 3,0-3,5 мл.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано живой вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и простого в эксплуатации способа ее применения, обеспечивающих эффективную профилактику заболевания за счет одновременной активизации у свиноматок клеточного и гуморального иммунитетов, что способствует колостральной защите новорожденных поросят и самих свиноматок от заражения.

Однократное введение вакцины на основе смеси вирусного материала из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл с физиологическим раствором в соотношениях (1-0,9):(999-999,1).

Известные на сегодняшний день вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней направлены, в основном, на активизацию клеточного иммунитета. Ни одна из известных вакцин не позволяет осуществлять одновременную активизацию клеточного (в большей степени) и гуморального (в меньшей степени) иммунитетов.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии изобретательского уровня в данном изобретении.

Штамм, предназначенный для изготовления вакцины, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ВГНКИ) (справка о депонировании №1103/19 от 27 мая 2009).

Штамм «ВН-96» выделен в 1988 году из вакцины «Римс» (ГДР) путем 30-кратного пассирования в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи и методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек исходного вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, всего проведено 96 пассажей.

Место хранения производственного штамма «ВН-96»-ДЕП вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней - Коллекция микроорганизмов Государственного научного учреждения Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии).

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки

При электронно-микроскопическом исследовании вируссодержащего материала установлено, что вирус штамма «ВН-96» является оболочечным, плеоморфным, диаметром 80-150 нм, имеет один слой булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм, т.е. штамм морфологически тождественен представителям рода Coronavirus семейства Coronaviridae.

Культуральные признаки

Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножается в перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи - СПЭВ (ГНУ ВНИИВВиМ). Допустимое количество пассажей - 10.

Инфекционная активность штамма в культуре СПЭВ составляет 5,25±0,25 lg ТЦЦ _50/см ³. После 7-го пассажа титр вируса ТГЭС штамма «ВН-96» составляет 7,0-7,2 lg ТЦЦ _50/см ³, дальнейшее пассирование к повышению титра вируса не приводит.

Антигенные свойства

Штамм «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней вызывает образование вируснейтрализующих и преципитирующих антител к вирусу ТГЭС в организме свиней и кроликов в титрах 4-6 log₂.

Вирулентные свойства

Не вирулентен.

Патогенность для естественно-восприимчивых и лабораторных животных

Штамм «ВН-96» апатогенен для поросят всех возрастных групп при пероральном и подкожном методах введения в дозах 5,0-6,5 lg ТЦЦ _50/см ³.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами

Не контаминирован.

Молекулярно-генетическая особенность штамма

Штамм «ВН-96» является РНК-содержащим вирусом. Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса ТГЭС, включающий 800 н.о. на 5'-конце S-гена.

Вирус содержит 3 главных структурных белка: крупный поверхностный гликопротеин (S) с молекулярной массой 170-200 кДа, нуклеокапсидный белок (N) с молекулярной массой 50-62 кДа и мелкий оболочечный гликопротеин (М) с молекулярной массой 25-35 кДа.

ПЦР-анализ показал, что в треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величиной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в достаточно большом количестве.

Условия хранения

Штамм «ВН-96» хранят в лиофилизированном виде в герметически закрытых ампулах при температуре минус 20-40°С в течение 5 лет. В течение срока хранения допускается снижение активности не более чем на 1,5 lg ТЦЦ _50/см ³.

Стабильность основных свойств штамма

Штамм «ВН-96» стабилен в течение 10 серийных пассажей в культуре клеток СПЭВ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Для получения вирусного материала из штамма «ВН-96» используют культуру СПЭВ, выращенную в течение 3-х дней при температуре 37°C со сформированным монослоем клеток с посевной дозой 150 тыс./мл. Ростовую среду заменяют поддерживающей средой того же состава, но без сыворотки, и добавляют вирус в соотношении 1:10. Инфицированную культуру выдерживают в течение 3 суток при температуре 37°C, затем трехкратно замораживают и оттаивают. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость отбирают и титруют. Отбирают тот вирусный материал, титр которого составляет 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл.

Вирусный материал хранят при температуре минус 18-20°C.

Пример 2

Вакцину готовят следующим образом.

Берут 1 мл вирусного материала с титром 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл.

Добавляют его в 999 мл физиологического раствора. Смесь перемешивают и используют для профилактики ТГЭ.

Готовая вакцина представляет собой прозрачную жидкость, без цвета и запаха.

Пример 3

Обоснование титра вируса трансмиссивного гастроэнтерита и процентного соотношения компонентов вакцины против ТГЭ.

Эксперименты проводили в неблагополучном по ТГЭ хозяйстве. Вакцину вводили свиноматкам за 40-45 дней до опороса в разных титрах вируса. Первой группе (174 свиноматки) - в титре 6,0-6,2 lg ТЦД _50/мл, второй (195 свиноматок) - в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл, третьей (270 свиноматок) - в титре 8,0-8,2 lg ТЦД _50/мл. Контрольными являлись 311 свиноматок.

Эффективность вакцинации оценивали по количеству деловых поросят, полученных на одну опоросившуюся свиноматку.

Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы 1 следует, что наибольший выход деловых поросят на одну опоросившуюся свиноматку (6,5) получен в группе, которая подвергалась однократной иммунизации за 40-45 дней до опороса вакциной с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл и при соотношении компонентов 1:999. Уменьшение или увеличение титра вируса и соотношения компонентов вакцины снижали ее эффективность.

Таблица 1 Результаты эффективности вакцинации свиноматок при разных титрах вируса ТГЭ и соотношениях компонентов вакцины Характеристика групп свиноматок Кол-во свиноматок в группе Титр вируса lg TЦД _50/мл Соотношение компонентов вакцины (вес. части) Получено деловых поросят всего на одну свином. 1 опытная 174 6,0-6,2 1:99 820 4,7 2 опытная 195 7,0-7,2 1:999 1274 6,5 3 опытная 270 8,0-8,2 1:9999 1526 5,7 Контрольная 311 - - 1451 4,7

Пример 4

Обоснование кратности введения вакцины проводили на трех группах свиноматок (по 80 голов в каждой), одна из которых являлась контрольной, а две другие - опытными. Первую опытную группу свиноматок иммунизировали однократно, вторую - двукратно с интервалом 14 дней.

Вакцину с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл вводили свиноматкам внутримышечно за 40-45 дней до опороса в дозе 5 мл на голову. Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 2.

Таблица 2 Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от кратности введения вакцины. Характеристика групп свиноматок Кол-во поросят в группе Заболело Пало голов % голов % 1 Опытная (вакцинированы двукратно) 528 528 100,0 327 61,7 2 Опытная (вакцинированы однократно) 542 125 23,1 72 13,3 Контрольная 532 532 100,0 394 74,1

Из таблицы 2 следует, что все поросята от невакцинированных свиноматок заболели ТГЭ, из них пало 394 головы (74,1%).

В опытной группе свиноматок, вакцинированных двукратно, также заболели все поросята, из них пало 327 голов (61,9%). В опытной группе свиноматок, вакцинированных однократно, из 542 поросят заболело только 125 (23,1%), пало 73 (13,3%).

Таким образом, однократное введение вакцины обеспечивает наибольшую защиту поросят-сосунов от заболевания.

Пример 5

Обоснование дозы введения вакцины проводили на двух группах свиноматок (по 50 голов в каждой), при этом одной группе свиноматок вводили вакцину в дозе 4,5-5 мл на голову, а второй группе - по 6-8 мл на голову.

Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 3.

Таблица 3 Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от дозы введения вакцины Доза вакцины Кол-во поросят в группе Заболело Пало голов % голов % 4,5-5 мл 357 105 29,4 57 16,0 6-8 мл 363 295 81,3 151 41,6

Из таблицы 3 следует, что от первой группы свиноматок, которым вводили вакцину в дозе 4,5-5 мл, было получено 357 поросят, из которых 105 (29,4%) заболело и 57 (16,0%) пало. От второй группы свиноматок, которым вакцину вводили в дозе 6-8 мл, было получено 363 поросенка, из которых 295 (81,3%) заболело и 151 (41,6%) пало.

Таким образом, увеличение дозы вакцинации (более 5 мл) уменьшает защиту поросят-сосунов от трансмиссивного гастроэнтерита в неблагополучных хозяйствах. Аналогичные результаты получены при дозе, меньшей 4,5 мл.

Пример 6

Обоснование сроков вакцинации свиноматок

Для этого было сформировано 5 групп свиноматок, из которых 4 были опытными и одна - контрольная. Все свиноматки первых четырех групп подвергались иммунизации вакциной с титром вируса 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл. Вакцину вводили внутримышечно в дозе 5 мл на голову. Первую опытную группу (48 свиноматок) иммунизировали за 9-10 дней до опороса. Вторую (46 голов) - за 22-25 дней до опороса, третью (41 голова) - за 30-32 дня до опороса, четвертую (43 головы) - за 40-45 дней до опороса.

Эффективность вакцинации оценивали по количеству полученных поросят. За поросятами вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падеж до отъемного возраста. Результат представлен в таблице 4.

Таблица 4 Эффективность вакцинации свиноматок в зависимости от сроков введения вакцины до опороса Характеристика групп свиноматок Кол-во свиноматок Кол-во поросят в группе Заболело Пало голов % голов % 1 Опытная (вакц. за 9-10 дней до опороса) 48 432 303 70,1 230 53,2 2 Опытная (вакц. за 22-25 дней до опороса) 46 414 81 19,6 27 6,5 3 Опытная (вакц. за 30-32 дня до опороса) 41 369 20 5,4 8 2,2 5 Опытная (вакц. за 40-45 дней до опороса) 43 387 10 2,6 2 0,5 Контрольная 25 225 135 60,0 103 45,8

Из таблицы 4 следует, что наименьшее количество заболевших (2,6%) и павших (0,5%) поросят наблюдалось при вакцинации свиноматок за 40-45 дней до опороса.

Пример 7

Обоснование сроков и дозы вакцинации поросят

Экспериментальным путем доказано, что для обеспечения дополнительной защиты поросят в послеотъемный период осуществляют их иммунизацию в возрасте 23-27 дней. Данные сроки являются обоснованными, поскольку в первые 3 недели жизни у поросят превалирует естественная - колостральная защита, передающаяся им через молоко свиноматок. К 21-30-дневному возрасту происходит значительное снижение колостральной защиты, а в возрасте 35-40 дней поросята становятся незащищенными от заражения.

Доза вакцинации поросят 3-3,5 мл также была подобрана экспериментальным путем с учетом массы животных.

Пример 8

Изучение антигенной активности вакцины проводилось на первоопоросках и свиноматках, опоросившихся два и более раз. Вакцину вводили внутримышечно однократно за 40 дней до опороса в дозе 5 мл на голову. Титр антител определяли: в сыворотке крови за 1-2 дня до опороса, молозиве - в первые 12 часов после рождения, молоке - на 5-6 сутки после начала лактации.

Таблица 5 Титр антител в сыворотке крови, молозиве и молоке вакцинированных и невакцинированных свиноматок № группы Характеристика свиноматок Кол-во исследов. проб Титр антител (Ig₂) в сыворотке крови молозиве молоке   Первоопороски         1 - вакцинированные 12 4,4±0,40 7,5±0,56 5,8±0,74 2 - контрольные 17 0,9±0,29 4,3±0,47 1,3±0,24   Опоросившиеся два и более раз         3 - вакцинированные 12 4,6±0,47 7,6±0,48 6,6±0,40 4 - контрольные 23 2,8±0,33 4,5±0,29 2,4±0,15

Как видно из таблицы 5, средний титр антител у вакцинированных свиноматок в сыворотке крови, молозиве, молоке достоверно выше аналогичных показателей невакцинированных животных.

А именно у вакцинированных животных происходит повышение гуморального и клеточного иммунитетов. О повышении гуморального иммунитета свидетельствует изменение титра в сыворотке крови с 0,9±0,29 до 4,4±0,40 у первоопоросок и с 2,8±0,33 до 4,6±0,47 у свиноматок, опоросившихся два и более раз. Это обеспечивает защиту вакцинированных свиноматок от заражения ТГЭ.

О повышении клеточного иммунитета свидетельствует изменение титра в молозиве и молоке также у всех свиноматок. К примеру, у первоопоросок титр повышается с 4,3±0,47 до 7,5±0,56. Это обеспечивает защиту новорожденных поросят от заражения ТГЭ.

Пример 9

Изучение иммуногенной активности вакцины проводилось на свиноматках, которым вводили вакцину внутримышечно однократно за 45 дней до опороса в дозе 5 мл на голову.

Определяли титры специфических иммуноглобулинов различных классов в молозиве всех свиноматок в первые сутки после опороса. Титры иммуноглобулинов определяли путем постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфического эритроцитарного дагностикума против трансмиссивного гастроэнтерита свиней и специфических антител к определенным классам иммуноглобулинов. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6 Титры специфических иммуноглобулинов различных классов в молозиве свиноматок к вирусу ТГЭ Характеристика свиноматок Титр иммуноглобулинов (Ig₂) в реакции иммунофлуоресценции IgA SIgA IgG IgM Опытные 1,44±0,60 5,33±0,76 6,11±0,65 3,78±0,30 Контрольные 1,56±0,58 2,60±0,76 7,89±0,48 0,78±0,40

Из таблицы 6 следует, что после вакцинации свиноматок в первые сутки после опороса наблюдается активизация секреторных иммуноглобулинов SIgA (с 2,60±0,76 до 5,33±0,76) и иммуноглобулинов IgM (с 0,78±0,40 до 3,78±0,30). Достоверное увеличение данных показателей свидетельствует об усилении колостральной защиты новорожденных поросят.

Таким образом, заявляемая живая вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней эффективна, проста в эксплуатации, позволяет одновременно активизировать у свиноматок клеточный и гуморальный иммунитета, при этом клеточный иммунитет обеспечивает колостральную защиту новорожденных поросят, а гуморальный - защиту самих свиноматок от заражения трансмиссивным гастроэнтеритом.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изготовления и применения вакцины для специфической профилактики трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Описанная вакцина содержит вирусный материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл, а в качестве наполнителя - физиологический раствор. Способ применения представленной вакцины заключается в иммунизации супоросных свиноматок внутримышечно однократно за 40-45 дней до опороса в дозе 4,5-5 мл на голову, также дополнительно осуществляют иммунизацию поросят-сосунов в возрасте 23-27 дней однократно внутримышечно в дозе 3,0-3,5 мл. Представленные изобретения позволяют одновременно активизировать у свиноматок клеточный иммунитет, обеспечивающий колостральную защиту новорожденных поросят, и гуморальный иммунитета, обеспечивающий защиту свиноматок от заражения. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 9 пр.

1. Вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал и наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве вирусного материала она содержит материал из штамма «ВН-96» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в титре 7,0-7,2 lg ТЦД _50/мл, а в качестве наполнителя - физиологический раствор при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Вирусный материал из штамма «ВН-96» 0,09-0,1 Физиологический раствор Остальное

2. Способ применения вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней по п.1, заключающийся в иммунизации супоросных свиноматок, внутримышечно однократно за 40-45 дней до опороса в дозе 4,5-5 мл на голову.

3. Способ применения вакцины по п.2, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют иммунизацию поросят-сосунов в возрасте 23-27 дней однократно внутримышечно в дозе 3,0-3,5 мл.