Способ моделирования язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника при болезни Крона на минипигах Российский патент 2023 года по МПК A61B17/94 A61B17/00 G09B23/28 A61B1/05 A61B17/3205 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования на минипигах язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника при болезни Крона.

Воспалительные заболевания кишечника - язвенный колит и болезнь Крона - неизлечимые хронические идиопатические болезни, характеризующиеся эрозивно-язвенными поражениями желудочно-кишечного тракта. Несмотря на достигнутые успехи в противовоспалительном лечении, особенно генно-инженерными препаратами, остро стоит вопрос о развитии осложнений, обусловленными развитием структур, стенозов на месте заживления язвенных дефектов, что требует хирургического вмешательства. Операция - новый возможный триггер обострения заболевания, что крайне нежелательно. Эта проблема наиболее актуальна для болезни Крона.

В связи с ростом заболеваемости болезнью Крона, утяжелением его течения, а также увеличением частоты пациентов, которые нуждаются в хирургическом лечении встает вопрос о необходимости изучения альтернативных методов терапии данного заболевания. Для этой цели актуальным является создание моделей болезни на животных, особенно крупных, которым возможно создание язвенных дефектов, апробация новых методов лечения и оценка их эндоскопической и морфологической эффективности.

В литературе описаны методики создания модели воспалительных заболеваний кишечника, преимущественно химическим путем и по эндоскопической картине они в большей степени могут соответствовать язвенному колиту.

Было разработано несколько типов фармакологически индуцированных моделей колита у животных, таких как модели, индуцированные декстрансульфатом (DSS-), тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS-) или уксусной кислотой (AA-) [1, 2]. Для этой цели широко используется DSS, как и TNBS, обычно в сочетании с этанолом. Однако эти методики недоступны из-за дороговизны и отсутствия препаратов на российском рынке.

В отличие от них использование уксусной кислоты вызывает язвенный колит (далее именуемый «колит») путем повреждения эпителия слизистой оболочки кишечника и представляет собой недорогую и удобную методику [3]. Использование уксусной кислоты - один из наиболее широко применяемых методов моделирования эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки кишечника. В результате ректального введения на глубину 8 см 1 мл 4% уксусной кислоты в полость кишечника наблюдаются клинические признаки: кровавая диарея, потеря веса; морфологические признаки: интенсивный воспалительный ответ, характеризующийся масштабным кровотечением, изъязвлениями, истончением кишечной стенки, уменьшением количества крипт, нейтрофильной инфильтрацией [4]. Однако, как и при других методиках химического воздействия получается модель, характеризующаяся непрерывным поражением, что более характерно для язвенного колита. Кроме того, моделирование язвенных дефектов применялось у мелких животных, в основном грызунов, что делало невозможным проведение прижизненного эндоскопического обследования и оценки эффективности предлагаемых методов лечения, в том числе морфологической, заживления язвенных дефектов в динамике.

Задача - создание на минипигах модели язвенных дефектов кишечной стенки, характерных для болезни Крона и возможность наблюдения за процессом заживления в течение трех недель.

Технический результат - формирование у минипигов язвенных дефектов кишечной стенки, соответствующих типичной картине язвенных дефектов кишечной стенки при болезни Крона; обеспечение возможности испытаний лекарственных средств и препаратов, а также наблюдения на протяжении трех недель после моделирования.

Технический результат достигается тем, что выполняют механическую очистку прямой кишки от содержимого на глубину 8-10 см; выполняют эндоскопическое вмешательство; выбирают участок нативной слизистой оболочки прямой кишки; производят захват эндоскопической петлёй участка стенки кишки диаметром не менее 10 мм на максимальной эксуффляции воздуха; в смешанном режиме электроэксцизии силой тока 5,0-6,0 А, производят отсечение и коагуляцию кишечной стенки глубиной до мышечного слоя.

Способ осуществляют следующим образом.

Без предварительной подготовки минипига (обычный режим еды и питья, без очистки кишечника с помощью клизм) выполняют анестезиологическое пособие. Ручным способом (с помощью пальцев) выполняют механическую очистку прямой кишки на глубину 8-10 см. Заводят эндоскоп. Под эндоскопическим контролем выбирают участок нативной слизистой. Производят захват слизистой при помощи эноскопической петли на перистальтике. В смешанном режиме электроэксцизии силой тока 5,0-6,0 А, производят отсечение и коагуляцию кишечной стенки глубиной до мышечного слоя.

Пример № 1

Самец минипига, помесь породы Визенау с Вьетнамской черной вислобрюхой, возраст 6 месяцев, кастрированный. Вес минипига 28900 г.

Без предварительной подготовки животного проводят премедикацию: внутримышечно 0,04 мл/кг смеси «Золетил 100» («Virbac Sante Animale», Франция), «КсилаВет» (Pharmamagist Ltd, Венгрия) в соотношении 2:1, соответственно. Ручным способом произведено очищение прямой кишки на глубину 10 см (удаление каловых масс ручным способом). Введен эндоскоп. При эндоскопическом исследовании очищение прямой кишки удовлетворительное (фиг. 1). Произведен забор биопсии с выбранного участка нативной слизистой (фиг. 2). Произведен захват слизистой диаметром 10 мм при помощи петли на перистальтике. Осуществлено затягивание петли, отсечение участка слизистой оболочки и последующее воздействие силой тока в 5,0 А (фиг. 3). Произведен осмотр слизистой оболочки толстой кишки с целью обнаружения полученного язвенного дефекта (фиг. 4), а также удаления отсеченного участка. Размер язвенного дефекта - 1 см. На следующий день после моделирования язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника взят биопсийный материал для морфологической оценки полученной модели.

Биоптат слизистой оболочки после формирования дефекта: поверхностный эпителий отсутствует. Крипты с нерегулярным расположением, число их уменьшено. Количество бокаловидных клеток в части крипт резко снижено, вплоть до полного их исчезновения. В собственной пластинке слизистой оболочки диффузная резко выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с присутствием значительного числа нейтрофильных лейкоцитов, формирующих фокусы скопления, в т.ч. с их интраэпителиальным распространением в эпителий многих крипт с формированием множественных крипт-абсцессов, разрушением части крипт. Сосуды микроциркуляции с набухшими эндотелиоцитами, часть сосудов с инфильтрацией сосудистой стенки полиморфноядерными лейкоцитами, просвет некоторых сосудов заполнен нейтрофильными лейкоцитами. Мышечная пластинка фрагментирована, с фокусами нейтрофильной инфильтрации. Подслизистая оболочка с выраженной диффузной воспалительной инфильтрацией, преимущественно нейтрофильными лейкоцитами. Сосуды микроциркуляции подслизистой основы с расширенным просветом, часть сосудов с набухшими эндотелиоцитами, в просвете некоторых полиморфноядерных лейкоцитов. На фиг. 5 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×4) выраженная нейтрофильная инфильтация всех слоев кишечной стенки. На фиг. 6 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видна перфорация мышечной пластинки нейтрофильными лейкоцитами и проникновение воспалительной инфильтрации в подслизистый слой. На фиг. 7 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видны сосуды микроциркуляции со значительным содержанием полиморфноядерных лейкоцитов. На фиг. 8 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) виден набухший эндотелий, утолщенная сосудистая стенка сосудов микроциркуляции в окружении резкой воспалительной инфильтрации. На фиг. 9 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) виден Крипт-абсцессв одной из крипт, отёк собственной пластинки слизистой оболочки. На фиг. 10 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видна разрушенная крипта нейтрофильными лейкоцитами, окруженная массивом нейтрофильных гранулоцитов.

Морфологическая картина соответствует морфологической картине язвенным дефектам при болезни Крона по всем параметрам [6].

Затем контроль дефекта проводился на 7 сутки (фиг. 11), 14 сутки (фиг. 12) и 21 сутки (фиг. 13). На фиг. 13 видно, на месте язвенного дефекта образовался нежный рубчик.

Состояние животного за период эксперимента было удовлетворительным, ухудшения аппетита, характера стула не наблюдалось.

Пример № 2

Самец минипиг, помесь породы Визенау с Вьетнамской черной вислобрюхой, возраст 6 месяцев, кастрированный. Вес минипига 22850 г.

Без предварительной подготовки животному дан общий наркоз при помощи препарата «Золетил 100». Производилось очищение прямой кишки на глубину 8 см (удаление каловых масс ручным способом). При эндоскопическом исследовании очищение прямой кишки. Произвели захват эндоскопической петлей (фиг. 14). В смешанном режиме электроэксцизии силой тока 6,0 А, производят отсечение и коагуляцию кишечной стенки глубиной до мышечного слоя. Получен дефект 11 мм (Фиг. 15).

На следующий день после моделирования язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника взят биопсийный материал для морфологической оценки полученной модели.

Биоптат слизистой оболочки после формирования дефекта: Покровный эпителий резко уплощен, бокаловидных клеток нет. Крипты правильной формы с регулярным расположением. В собственной пластинке слизистой оболочки диффузная слабо выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с небольшим присутствием полиморфноядерных лейкоцитов, клеточный состав представлен преимущественно клетками фибробластического ряда. Сосуды микроциркуляции расширены, часть сосудов с набухшим эндотелием, просвет некоторых содержит единичные полиморфноядерные лейкоциты.

В подслизистой основе отмечается диффузная выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с присутствием значительного числа полиморфноядерных лейкоцитов, в одном из полей зрения с проникновением в мышечную пластинку. На фиг. 16 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видны слизистая оболочка, мышечная пластинка и подслизистая основа толстой кишки свиньи. На фиг. 17 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видны клетки поверхностного отдела толстой кишки свиньи. На фиг. 18 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видна подэпителиальная зона толстой кишки свиньи. На фиг. 19 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видна воспалительная инфильтрация подслизистой основы с проникновением в мышечную пластинку. На фиг. 20 (окраска гематоксилином и эозином Ув. 10×40) видны сосуды микроциркуляции подслизистой основы толстой кишки свиньи.

Морфологическое заключение по биоптату картине язвенным дефектам при болезни Крона по следующим признакам: покровный эпителий резко уплощен, бокаловидных клеток нет, в подслизистой основе отмечается диффузная выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с присутствием значительного числа полиморфноядерных лейкоцитов с проникновением в мышечную пластинку [6].

Эндоскопический и морфологический контроль проводили на 7 (фиг.21), 14 (фиг. 22), 21 день (фиг. 23). Через 3 недели после моделирования: рубчик на месте язвенного дефекта.

Состояние животного за период эксперимента было удовлетворительным, ухудшения аппетита, характера стула не наблюдалось.

Таким образом, предложенный способ моделирования язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника при болезни Крона на минипигах имеет формирование язвенных дефектов кишечной стенки, соответствующих по глубине (до мышечной стенки), наличию четких границ (за счет петли границы четкие, что облегчает его определение при последующих исследованиях (фиг. 24)), типичной картине язвенных дефектов кишечной стенки при болезни Крона (изолированные язвы с четкими краями, иногда подрытые, на неизмененной слизистой оболочке; характерные морфологические признаки: покровный эпителий резко уплощен, бокаловидных клеток нет, в подслизистой основе отмечается диффузная выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с присутствием значительного числа ПЯЛ с проникновением в мышечную пластинку) [6], дефект диаметром не менее 10 мм достаточен (пригоден) для испытаний лекарственных средств и препаратов на протяжении трех недель после моделирования (фиг. 13, 23), а также эндоскопическое и морфологическое динамическое наблюдение за дефектом с оценкой эффективности манипуляций (на фиг. 25 показано введение препарата через эндоскопический инъектор в край язвы), язвенный дефект сохраняется в течение 3 недель, в течение которых можно проводить оценку состояния (фиг. 13, 23).

Список источников

1. Luana BERNARDICarlos Henrique Marques dos SANTOSVerônica Assalin Zorgetto PINHEIRORodrigo Juliano OLIVEIRAAndreia Milan Brochado ANTONIOLLI-SILVA. TRANSPLANTATION OF ADIPOSE-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS IN REFRACTORY CROHN’S DISEASE: SYSTEMATIC REVIEW. Arq Bras Cir Dig 2019 Dec 20;32(4).

2. Liu Y., Wang X., Hu C. A. Therapeutic potential of amino acids in inflammatory bowel disease. Nutrients. 2017;9(9):p. 920.

3. Low D., Nguyen D. D., Mizoguchi E. Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research. Drug Design, Development and Therapy. 2013;

4. Jérôme C. Martin, Gaëlle Bériou, Régis Josien Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Acute Colitis in the Rat. Suppression and Regulation of Immune Responses pp 197-203. 2016.

5. Ainsley M. Robinson, Sarah Miller, Natalie Payne, Richard Boyd, Samy Sakkal, Kulmira Nurgali. Neuroprotective Potential of Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy in Acute Stages of TNBS-Induced Colitis in Guinea-Pigs.

6. Воспалительные заболевания кишечника: клинические, эндоскопические, морфологические аспекты диагностики, принципы современной терапии / О.В.Головенко, С.Г.Хомерики, Е.В.Иванова [и др.] - 2-е издание, доп. и перераб. - М.: Прима Принт, 2022. - 258 с.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной колопроктологии. Выполняют механическую очистку прямой кишки от содержимого на глубину 8-10 см. Вводят эндоскоп и выбирают участок нативной слизистой оболочки прямой кишки. Производят захват эндоскопической петлёй участка стенки кишки диаметром не менее 10 мм на максимальной эксуффляции воздуха. В смешанном режиме электроэксцизии силой тока 5,0-6,0 А производят отсечение и коагуляцию кишечной стенки глубиной до мышечного слоя. Способ позволяет сформировать у минипигов язвенные дефекты кишечной стенки, соответствующие типичной картине язвенных дефектов кишечной стенки при болезни Крона; обеспечить возможность испытаний лекарственных средств и препаратов, а также возможность наблюдения на протяжении трех недель после моделирования. 25 ил., 2 пр.

Способ моделирования язвенных дефектов слизистой оболочки кишечника при болезни Крона на минипигах, характеризующийся тем, что выполняют механическую очистку прямой кишки от содержимого на глубину 8-10 см; выполняют эндоскопическое вмешательство; выбирают участок нативной слизистой оболочки прямой кишки; производят захват эндоскопической петлёй участка стенки кишки диаметром не менее 10 мм на максимальной эксуффляции воздуха; в смешанном режиме электроэксцизии силой тока 5,0-6,0 А производят отсечение и коагуляцию кишечной стенки глубиной до мышечного слоя.