СПОСОБ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ РАКА ПЕЧЕНИ НА ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ МЫШАХ Российский патент 2023 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии и может быть применено для создания модели рака печени на иммунодефицитных мышах.

Злокачественные новообразования печени занимают лидирующие позиции по распространенности и смертности в структуре онкологических заболеваний. Данная патология характеризуется высокой частотой рецидивов и низким процентом полного выздоровления. Статистические данные свидетельствуют о том, что выживаемость пациентов составляет от 30 до 40 %, а средняя продолжительность жизни после оперативного вмешательства достигает 5 лет (см. He L. et al. Mouse models of liver cancer: Progress and recommendations // Oncotarget. – 2015. –Vol.6. – №. 27. – С. 23306.).

В связи с этим существует необходимость в проведении различных доклинических исследований для разработки новых терапевтических стратегий, улучшения диагностики, предотвращения и лечения опухолей печени, проводимых с использованием тест-систем in vitro и in vivo. Наиболее часто используемыми для доклинических исследований тест-системами in vivo являются модели ксенографтов рака печени, созданные путем инъекции или имплантации человеческого опухолевого материала иммунодефицитным животным.

Известен способ подкожной инъекции клеточных линий опухоли печени в бок иммунодефицитным мышам (см. Zhao G. J. et al. Establishment of an orthotopic transplantation tumor model of hepatocellular carcinoma in mice //World Journal of Gastroenterology: WJG. – 2012. – Т. 18. – №. 47. – С. 7087.; Reiberger T. et al. An orthotopic mouse model of hepatocellular carcinoma with underlying liver cirrhosis //Nature protocols. – 2015. – Т. 10. – №. 8. – С. 1264-1274.). Данный способ позволяет получить модель, преимущество которой состоит в удобстве мониторинга динамики роста опухолевого узла. Однако, согласно ряду литературных источников, гетеротопические модели не несут в себе тождественного отражения поведения опухоли печени, так как помещены в чужеродное микроокружение (см. Kageyama K. et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanoma hepatic metastasis //Journal of translational medicine. – 2017. – Т. 15. – С. 1-19.)

Согласно литературным источникам известен способ инъекции опухолевых клеточных линий рака печени в печень иммунодефицитным мышам. Данный способ позволяет получить модель, преимуществом которой является ее сходство с микроокружением опухоли (см. Sugase T. et al. Development and optimization of orthotopic liver metastasis xenograft mouse models in uveal melanoma //Journal of Translational Medicine. – 2020. – Т. 18. – №. 1. – С. 1-14). Однако, в связи с тем, что паренхима печени очень тонкая и предрасположена к разрывам, у данного способа есть ряд недостатков: высока степень распространения суспензии опухолевых клеток на другие органы, что влечет за собой потерю заданного сайта, формирование опухолей сложной геометрии, что вызывает сложности при выполнении замеров, а также обширные кровотечения в области инъекции, что впоследствии может привести к неблагоприятному исходу.

Кроме того, одним из способов создания ортотопического ксенографта является модель внутрипеченочной имплантации фрагмента опухоли печени (см. Czekaj P. et al. Assessment of animal experimental models of toxic liver injury in the context of their potential application as preclinical models for cell therapy //European Journal of Pharmacology. – 2019. – Т. 861. – С. 172597). Известен способ, при котором опухолевый материал в формате фрагмента опухоли подшивают к левой доле печени (см. Tan K. V. et al. Non-invasive PET/MR Imaging in an Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma //Journal of Visualized Experiments: Jove. – 2022. – № 186). Данный способ основан на выполнении надреза размером 2 мм² и погружении в него опухолевого материала, который фиксируется наложением шва в виде восьмерки для обеспечения фиксации фрагмента опухоли. Однако печень мышей тонкая и склонна кровоточить при любом механическом повреждении, в частности при наложении швов. В связи с этим данный способ фиксации опухолевого материала для создания ортотопической модели является травматичным и несет в себе риск обширного кровотечения в печени, что может привести к летальному исходу.

Известен способ фиксации фрагмента опухоли печени путем создания печеночного кармана у иммунодефицитных мышей (см. Nishino H. et al. Sutureless surgical orthotopic implantation technique of primary and metastatic cancer in the liver of mouse models // in vivo. – 2020. – Т. 34. – №. 6. – С. 3153-3157; Kageyama K. et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanoma hepatic metastasis //Journal of translational medicine. – 2017. – Т. 15. – С. 1-19. ). Данный способ основан на размещении в подготовленный надрез в печени мыши фрагмента опухоли. Предполагается, что в связи отсутствием необходимости наложения швов, возможно минимизировать кровотечение и механическое повреждение печени, что повышает выживаемость животных после процедуры, но, однако, не гарантирует, что фрагмент опухолевого материала останется в ткани печени. Данный способ не всегда может обеспечить нахождение опухоли в заданном сайте, связанно это с анатомической особенностью паренхимы печени, которая склонна к обширному кровотечению, тем самым способствуя перемещению опухолевого материала из печени, что в дальнейшем может приводить к другой локации опухолевого узла.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа создания модели рака печени на иммунодефицитных мышах, позволяющего фиксировать фрагмент опухоли печени в печень мыши со значительным уменьшением травматизма, с минимизацией кровопотери при выполнении данной процедуры, с достижением высокого процента приживаемости ксенографта.

Технический результат изобретения достигается тем, что осуществляют трансплантацию фрагмента опухоли в печень иммунодефицитных мышей линии Balb/c Nude, их наркотизацию, стерилизацию операционного поля, послойное рассечение кожи и брюшной стенки длинной 20 мм вдоль нижней апертуры грудной клетки, далее от центра образовавшейся операционной раны выполняют надрез длиной 10 мм вверх по направлению к мечевидному отростку. Для лучшего доступа к печени желудок и двенадцатиперстную кишку смещают каудально, обнажая левую долю печени, в которой при помощи хирургического скальпеля производят надрез размером 2 мм и имплантируют опухолевый фрагмент размером 1 мм³, после чего накладывают гемостатическую губку Тахокомб, размером 4х4 мм. Дождавшись полного гемостаза, печень осторожно возвращают в ее анатомическое положение в брюшную полость. Брюшную стенку и кожу послойно ушивают непрерывным хирургическим швом.

Способ осуществляется следующим образом.

Хирургические манипуляции проводят с соблюдением стерильных условий с использованием заранее простерилизованных инструментов. Мышей линии Balb/c Nude наркотизируют с помощью внутримышечного введения таких ветеринарных препаратов как Ксила (Ксилазин) и «Золетил 100» согласно протоколу (см. патент на изобретение RU № 2712916, опубл. 05.02.2020, Бюл. № 4).

Достигая необходимой глубины наркоза, производят послойное рассечение кожи и брюшной стенки длинной 20 мм в области грудного отдела вдоль нижней апертуры грудной клетки, далее от центра образовавшейся операционной раны выполняют надрез длиной 10 мм вверх по направлению к мечевидному отростку. Желудок и двенадцатиперстную кишку смещают каудально с помощью влажного ватного тампона и аккуратно проводят обнажение левой доли печени, в которой производят надрез размером 2 мм. Анатомическим пинцетом производят трансплантацию опухолевого фрагмента, размером 1 мм³ в созданный надрез печени. В связи с особенностями анатомического строения печени, которая предрасположена к обширным кровотечениям при создании ортотопической модели, имплантируемый фрагмент фиксируют гемостатической губкой ТахоКомбом, размером 4х4 мм, которая предотвращает кровопотерю и гарантирует нахождение опухолевого материала в заданном сайте. Брюшную стенку и кожу ушивают непрерывным хирургическим швом.

Данным способом был зафиксирован фрагмент опухоли печени при разработке ортотопической модели рака печени 6 мышам линии Balb/c Nude.

Способ иллюстрируется следующими фигурами

На фигуре 1 изображена имплантация опухолевого материала в печень мыши.

На фигуре 2 изображена фиксация опухоли ТахоКомбом.

На фигуре 3 изображена мышь с развившимся опухолевым узлом в печени.

Приводим пример применения, предлагаемого нами способа.

Мышей линии Balb/c Nude вводили в наркоз путем внутримышечной инъекции таких препаратов как Ксила (Ксилазин) и «Золетил 100» согласно протоколу (см. патент на изобретение RU № 2712916, опубл. 05.02.2020, Бюл. № 4). По достижению оптимальной глубины наркоза произвели иссечение кожи и брюшной стенки длинной 20 мм в области грудного отдела вдоль нижней апертуры грудной клетки, далее от центра образовавшейся операционной раны выполняли надрез длиной 10 мм вверх по направлению к мечевидному отростку. Желудок и двенадцатиперстную кишку сместили каудально с помощью стерильного ватного тампона, предварительно смоченного раствором NaCl (0.9%), для лучшей визуализации левой доли печени, в которой сделали надрез размером 2 мм. Анатомическим пинцетом произвели трансплантацию опухолевого фрагмента, размером 1 мм³ в подготовленную лунку в печени мыши (см. фиг.1). Возникшее в результате надреза печени кровотечение способствовало смещению образца опухолевого материала из сформированного надреза; для предотвращения этого выполняли наложение гемостатической губки ТахоКомбом размером 4х4 мм сверху фрагмента опухоли, что позволило его зафиксировать в заданном сайт и остановить кровотечение (см. фиг.2). По достижению гемостаза печень возвратили в брюшную полость согласно ее анатомическому положению, затем вводили теплый физиологический раствор для восполнения потерянной жидкости во время хирургической манипуляции. Брюшную стенку и кожу послойно ушили непрерывным хирургическим швом.

По достижению 10 дней мышам линии Balb/c Nude осуществили диагностическую лапаротомию с целью определения наличия новообразования и его роста. У всех 6 мышей в заданном сайте, установленном в начале эксперимента, были обнаружены опухолевые узлы (см. фиг. 3). Новообразования измерили при помощи штангенциркуля. По истечению 20 дней с момента начала эксперимента выполнили повторную диагностическую лапаротомию для проверки динамики роста опухоли (см. табл. 1).

Таблица 1

Характеристики результатов ксенотрансплантации фрагмента опухоли печени иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude

№
животного Сайт имплантации Локализация Объем опухолевого материала на 10 сутки Объем опухолевого материала на 15 сутки 1 Ортотопический Левая доля печени 9,76 х 5,91 12,5 х 7,59 2 Ортотопический Левая доля печени 7,25 х 4,49 10,9 х 5,99 3 Ортотопический Левая доля печени 7,00 х 4,31 9,85 х 6,02 4 Ортотопический Левая доля печени 6,93 х 4,03 9,05 х 5,89 5 Ортотопический Левая доля печени 8,63 х 5,06 10,3 х 6,91 6 Ортотопический Левая доля печени 9,02 х 5,19 12,99 х 7,01

Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что его применение позволяет создать модель рака печени на иммунодефицитных мышах, при этом надёжно зафиксировать фрагмент опухоли в печени, минимизировать кровопотерю при выполнении данной процедуры, достичь приживаемости ксенографта с созданием необходимого для опухоли микроокружения.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть применено для создания модели рака печени на иммунодефицитных мышах. Осуществляют послойное рассечение кожи и брюшной стенки длиной 20 мм вдоль нижней апертуры грудной клетки. Далее от центра образовавшейся операционной раны выполняют надрез длиной 10 мм вверх по направлению к мечевидному отростку. Желудок и двенадцатиперстную кишку смещают каудально, обнажая левую долю печени, в которой при помощи хирургического скальпеля производят надрез размером 2 мм и имплантируют опухолевый фрагмент размером 1 мм³. Накладывают гемостатическую губку Тахокомб, размером 4×4 мм, затем послойно ушивают стенку брюшной полости и кожу непрерывным швом. Способ позволяет надежно зафиксировать опухолевый материал, остановить кровотечение в печени, возникающее в результате хирургических манипуляций при создании модели опухолевого поражения печени, достичь приживаемости ксенографта с созданием необходимого для опухоли микроокружения за счет использования оптимального доступа к печени и фиксации фрагмента опухоли губкой Тахокомб. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ создания модели рака печени на иммунодефицитных мышах, включающий наркотизацию мышей линии Balb/c Nude, стерилизацию операционного поля, отличающийся тем, что послойное рассечение кожи и брюшной стенки длиной 20 мм выполняют вдоль нижней апертуры грудной клетки, далее от центра образовавшейся операционной раны выполняют надрез длиной 10 мм вверх по направлению к мечевидному отростку, для доступа к печени желудок и двенадцатиперстную кишку смещают каудально, обнажая левую долю печени, в которой при помощи хирургического скальпеля производят надрез размером 2 мм и имплантируют опухолевый фрагмент размером 1 мм³, после чего накладывают гемостатическую губку Тахокомб, размером 4×4 мм, затем послойно ушивают стенку брюшной полости и кожу непрерывным швом.