Способ создания ортотопической модели саркомы мягких тканей человека, прорастающей в кость, на иммунодефицитных мышах линии BALB/C NUDE Российский патент 2024 года по МПК A61B17/56 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для создания ортотопической модели саркомы мягких тканей человека, прорастающей в кость, на иммунодифицитных мышах линии Balb/с Nude.

Саркома – это злокачественное новообразование, которое образуется из различных типов соединительной ткани. Их делят на 2 большие группы - это саркомы мягких тканей и саркомы костей. Саркомы мягких тканей (СМТ) являются относительно редкими злокачественными новообразованиями, составляя 1% опухолей у взрослых и 7–15% у детей. Это гетерогенная группа опухолей мезенхимального происхождения, которые могут возникать в любом месте тела, при этом конечности организма являются наиболее распространенной первичной локализацией, на их долю приходится 60% (см. Феденко А.А., Тарарыкова А.А. Роль трабектедина в лечении сарком мягких тканей: обзор современных данных. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. 2021;13(3):16-26. https://doi.org/10.17650/2782-3687-2021-13-3-16-27). Согласно текущей классификации ВОЗ, в настоящее время существует более 50 различных подтипов СМТ, и наиболее распространенными агрессивными опухолями являются липосаркома, лейомиосаркома и недифференцированная плеоморфная саркома (см. Poon E., Quek R. Soft tissue sarcoma in Asia //Chin Clin Oncol. – 2018. – Т. 7. – №. 4. – С. 46). Наиболее распространёнными саркомами костей являются саркомы Юинга или остеосаркомы (ОС). Общей чертой этих видов рака является чрезвычайно низкая выживаемость пациентов с метастатическими заболеваниями или рецидивами (см. Cillo AR, Mukherjee E, Bailey NG, Onkar S, Daley J, Salgado C, Li X, Liu D, Ranganathan S, Burgess M, Sembrat J, Weiss K, Watters R, Bruno TC, Vignali DAA, Bailey KM. Ewing Sarcoma and Osteosarcoma Have Distinct Immune Signatures and Intercellular Communication Networks. Clin Cancer Res. 2022 Nov 14;28(22):4968-4982. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-1471. PMID: 36074145; PMCID: PMC9669190).

Таким образом, существует необходимость в изучении особенностей сарком для лучшего понимания течения заболевания. Для изучения биологии данного заболевания используют животные модели, что является важной частью фундаментальных и трансляционных исследований в онкопатологии. Основной задачей таких моделей является воспроизведение течения заболеваний человека. В настоящие время саркомы до конца не изучены, поэтому остается необходимость создания экспериментальных моделей отражающих более точную картину развития заболевания.

Известен способ создания модели СМТ у мышей линии BALB/c путем подкожной инъекции клеток саркомы мягких тканей мыши CCRF S-180II в спину мышам в количестве 2-4×105 клеток в объеме 0,2 мл питательной среды (см. Kasama F, Tsuchie H, Nagasawa H, Hongo M, Kasukawa Y, Nozaka K, Kudo D, Shoji R, Igarashi S, Harata S, Okamoto K, Oya K, Miyakoshi N. Effects of Soft Tissue Sarcoma and Doxorubicin on Bone Metabolism in Mice. In Vivo. 2023 Jul-Aug;37(4):1532-1539. doi: 10.21873/invivo.13238. PMID: 37369484; PMCID: PMC10347941). Преимуществом данного способа является получение большого количества животных-опухоленосителей. Недостатком метода является сайт трансплантации и опухолевые клетки, которые являются мышиными, а не человеческими, что может нести не информативную характеристику опухоли для дальнейших клинических исследований.

Известен способ подкожной трансплантации фрагмента опухоли остеосаркомы человека мышам линии Balb/c Nude (см. Wu N. F. et al. The first mouse model of primary osteosarcoma of the breast //in vivo. – 2021. – Т. 35. – №. 4. – С. 1979-1983). Операционный образец размером приблизительно 2 мм3 трансплантировали по методу Hozumi, а именно на спинной стороне тела мыши делали разрез кожи длиной 1 см и создавали карман путем отделения кожи от дермы, далее был помещен фрагмент первичной опухоли вместе с окружающей нормальной тканью, после чего рана была ушита. Преимуществом данного способа является высокий процент приживляемой опухоли, который составил 90,2%, то есть из 51 у 46 мышей наблюдался рост опухолевого узла. Однако недостатком метода является неестественный сайт имплантации опухолевого материала, предполагающий влияние на опухоль чужеродного микроокружения.

Известен способ создания ортотопической трансплантации остеосаркомы человека в большеберцовую кость мышам линии Balb/c Nude (см. Inoue M. et al. Trabectedin suppresses osteosarcoma pulmonary metastasis in a mouse tumor xenograft model //Journal of Orthopaedic Research®. – 2022. – Т. 40. – №. 4. – С. 945-953). Для достижения поставленной цели мышам либо на правом, либо на левом бедре делали разрез кожи размер 8 мм, далее лапу сгибали в коленном суставе, для того чтобы обнажить четырехглавую мышцу и икроножную мышцу через разрез. Мышцы также были рассечены. Затем лезвием диаметром 5 мм прокалывали проксимальный отдел большеберцовой кости. После того как был сделан прокол вводили лезвие в кость на 2,5 мм, вращали в несколько оборотов для создания отверстия в кости. Таким образом, образовывалось отверстие диаметром 1 мм и далее помещали фрагмент опухоли, размером соответствующему образованному отверстию. Последним этапом проводили послойное ушитие операционной раны. Преимуществом способа является отражение более точной клинической картины модели опухоли, имитируя заболевание человека с ОС. Однако недостатками является трудоёмкий процесс трансплантации, небольшой объем опухолевого фрагмента, что может снизить процент его приживления, а вследствие этого и роста опухолевого узла, сложность определения объемов роста опухоли.

Известен способ создания ортотопической трансплантации остеосаркомы человека мышам линии Balb/c Nude (см. Blattmann C. et al. Establishment of a patient-derived orthotopic osteosarcoma mouse model //Journal of translational medicine. – 2015. – Т. 13. – С. 1-10.). Операцию проводили под общей анестезией ингаляционно изофлюраном. Образцы опухоли, взятые от пациента, разделяли на кусочки размером 1×1×1 мм³. Затем проводили разрез в правой большеберцовой кости мыши в медиальной части, далее путем сверления бормашиной диаметром 0,5 мм создавали дефект костной ткани и закладывали фрагмент опухоли, который контактировал с костным мозгом. После этого операционная рана была ушита. Преимуществом служит процент успеха, который составил 92%, а также сайт имплантации является естественным для опухолевого материала. Но способ обладает существенным недостатком. Опухолевый фрагмент не был зафиксирован, что может в процессе ушивания операционной раны изменить местоположение опухолевого фрагмента, также размер кусочков опухоли малы и, таким образом, может оказать существенное влияние на приживление материала.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего создать ортотопическую модель саркомы мягких тканей человека, прорастающей в кость, у мышей линии Balb/c Nude.

Технический результат достигается тем, что осуществляют разрез кожи и мышц бедра послойно параллельно тазобедренной кости на протяжении 15 мм, начало разреза проводят на 20 мм ниже крестцовой области спины, заканчивая на неподвижной области лапы, так чтобы разрез был на всей бедренной области лапы мыши, далее делают разрез мышцы, напрягающей широкую фасцию на том же расстоянии, отодвигая хирургическим пинцетом подкожную мышцу большеберцовой кости и при помощи хирургического шаровидного бора диаметром 2 мм ниже на 1 мм от третьего вертела и на 5 мм выше от подколенной поверхности проводят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани длиной 1,5 мм и глубиной 1 мм на теле бедренной кости, поверх дефекта помещают фрагмент опухоли саркомы мягкой ткани человека размером 4×1×1 мм³, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Способ осуществляется следующим образом.

Эксперимент проводился на мышах линии Balb/c Nude.После иссечения опухоли ее фрагмент помещают в среду Хенкса. Перед трансплантацией вырезают фрагмент размером 25 мм³ и разделяют на равные кусочки для трансплантации каждому животному. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в тело бедренной кости мыши не должно превышать 15 минут. Для проведения хирургической манипуляции животных вводят в наркоз. Для премедикации используют препарат ксилазин концентрацией 20 мг/кг. Наркотизируют мышей золетилом в концентрации 50 мг/кг (см. Патент на изобретение RU № 2712916, опубл. 03.02.2020, Бюл. №4 ).

Для обеспечения трансплантации фрагмента опухоли СМТ человека в диафизарную область кости, делают разрез кожи и мышц бедра послойно параллельно тазобедренной кости на протяжении 15 мм. Начало разреза проводят на 20 мм ниже крестцовой области спины, и продолжают так, чтобы разрез был на всей бедренной области лапы мыши. Далее делают разрез мышцы, напрягающую широкую фасцию на том же расстоянии. Отодвигая хирургическим пинцетом подкожную мышцу большеберцовой кости и при помощи хирургического шаровидного бора диаметром 2 мм ниже на 1 мм от третьего вертела и на 5 мм выше от подколенной поверхности проводят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани длиной 5 мм и глубиной 1 мм на теле бедренной кости, поверх дефекта помещают фрагмент опухоли СМТ человека размером 4 мм на 1 мм на 1 мм, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Изобретение иллюстрируется фигурами (1-5).

На Фиг.1 изображен доступ к бедренной кости мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 2 изображено повреждение верхнего слоя костной ткани на теле бедренной кости мыши линии Balb/c Nude при помощи хирургического бура.

На Фиг. 3 изображена трансплантация опухолевого фрагмента СМТ человека на поврежденную бедренную кость мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 4 изображена фиксация опухолевого фрагмента СМТ человека на поврежденной бедренной кости мыши линии Balb/c Nude.

На Фиг. 5 изображен окончательный вид зафиксированного фрагмента СМТ человека на поврежденную бедренную кость мыши линии Balb/c Nude.

Данным способом была проведена трансплантации фрагмента опухоли СМТ человека на бедренной кости 18 мышам линии Balb/c Nude.

Пример применения способа.

Проведение трансплантация самцу мыши линии Balb/c Nude весом 26 г., возраст 10 недель.

После иссечения опухоли ее фрагмент помещают в среду Хенкса. Перед трансплантацией вырезают фрагмент опухоли размером 25 мм³ и разделяют на равные кусочки для трансплантации каждому животному. Время от момента резекции опухолевого материала у человека до имплантации в тело бедренной кости мыши не должно превышать 15 минут.

Для проведения хирургической манипуляции животных вводят в наркоз. Для премедикации используют препарат ксилазин концентрацией 20 мг/мл. Наркотизируют мышей золетилом в концентрации 22,57 мг/кг.

Для обеспечения трансплантации фрагмента опухоли СМТ человека проводили в диафизарную область кости, делают разрез кожи и мышц бедра проводят послойно параллельно тазобедренной кости на протяжении 15 мм. Начало разреза проводят на 20 мм ниже крестцовой области спины, и продолжают так, чтобы разрез был на всей бедренной области лапы мыши Далее делают разрез мышцы, напрягающую широкую фасцию на том же расстоянии. Отодвигая хирургическим пинцетом подкожную мышцу большеберцовой кости и при помощи хирургического шаровидного бора диаметром 2 мм ниже на 1 мм от третьего вертела и на 5 мм выше от подколенной поверхности проводят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани длиной 1,5 мм и глубиной 1 мм на теле бедренной кости, поверх дефекта помещают фрагмент опухоли СМТ человека размером 4 мм на 1 мм на 1 мм, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.

Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в возможности создания ортотопической пациентоподобной модели СМТ человека, прорастающей в кость, на мышах линии Balb/c Nude, для дальнейшего изучения патогенеза заболевания. Данная модель наиболее точно отражает особенности онкогенеза, и является необходимой тест-системой для доклинических исследований различных способов лечения СМТ.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для создания ортотопической модели саркомы мягких тканей человека, прорастающей в кость, на иммунодефицитных мышах линии Balb/c Nude. Осуществляют разрез кожи и мышц бедра послойно параллельно тазобедренной кости на протяжении 15 мм, начало разреза проводят на 20 мм ниже крестцовой области спины, и продолжают так, чтобы разрез был на всей бедренной области лапы мыши. Делают разрез мышцы, напрягающей широкую фасцию на том же расстоянии, отодвигая хирургическим пинцетом подкожную мышцу большеберцовой кости, и при помощи хирургического шаровидного бора диаметром 2 мм ниже на 1 мм от третьего вертела и на 5 мм выше от подколенной поверхности проводят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани длиной 1,5 мм и глубиной 1 мм на теле бедренной кости. Поверх дефекта помещают фрагмент опухоли саркомы мягкой ткани человека размером 4 мм × 1 мм × 1 мм. Закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом. Способ обеспечивает наиболее точное отображение особенностей онкогенеза и является необходимой тест-системой для доклинических исследований различных способов лечения саркомы мягких тканей. 5 ил.

Способ создания ортотопической модели саркомы мягких тканей человека, прорастающей в кость, на иммунодефицитных мышах линии Balb/c Nude, заключающийся в том, что осуществляют разрез кожи и мышц бедра послойно параллельно тазобедренной кости на протяжении 15 мм, начало разреза проводят на 20 мм ниже крестцовой области спины, и продолжают так, чтобы разрез был на всей бедренной области лапы мыши, далее делают разрез мышцы, напрягающей широкую фасцию на том же расстоянии, отодвигая хирургическим пинцетом подкожную мышцу большеберцовой кости, и при помощи хирургического шаровидного бора диаметром 2 мм ниже на 1 мм от третьего вертела и на 5 мм выше от подколенной поверхности проводят повреждение надкостницы и верхнего слоя костной ткани длиной 1,5 мм и глубиной 1 мм на теле бедренной кости, поверх дефекта помещают фрагмент опухоли саркомы мягкой ткани человека размером 4 мм × 1 мм × 1 мм, закрепляют одним узлом лигатуры в центре, сшивают двуглавую мышцу бедра, ушивают послеоперационную рану непрерывным обвивным швом.