Способ исследования PDX-модели колоректального рака Российский патент 2025 года по МПК G16H50/50 G16H15/00 G09B23/28 

Способ относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается валидации ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с колоректальным раком, сгенерированных путем имплантации опухолевого материала пациентов иммунодефицитным мышам, для подтверждения достоверности и надежности получаемой опухолевой модели.

Онкологические заболевания являются одной из главных причин преждевременной смертности в мире, уступая только сердечно-сосудистым заболеваниям. По оценкам Всемирной организации здравоохранения на 2022 год во всем мире произошло 20 миллионов новых случаев возникновения злокачественных опухолей и почти 10 миллионов смертей, связанных с раком (см. Титов А. А., Агарков Н. М., Митихина М. С. Проблемы онкологов и онкологических больных, связанные с пандемией COVID-19 //Вопросы онкологии. - 2022. - Т. 68. - №. 3. - С. 245-250).

Колоректальный рак (КРР) является вторым по распространенности видом рака у взрослых женщин и третьим по распространенности у мужчин, а также четвертой по значимости причиной смертности от рака, на которую приходится 9,2% смертей во всем мире (см. Li J, Ma X, Chakravarti D, Shalapour S, DePinho RA. Genetic and biological hallmarks of colorectal cancer. Genes Dev. 2021 Jun;35(11-12):787-820. doi: 10.1101/gad.348226.120. PMID: 34074695; PMCID: PMC8168558).

Сложная биология онкологических заболеваний требует разработки таргетных методов лечения и создания новых цитотоксических препаратов, направленных против ключевых проонкогенных сигнальных путей (см. см. Shin AE, Giancotti FG, Rustgi AK. Metastatic colorectal cancer: mechanisms and emerging therapeutics. Trends Pharmacol Sci. 2023 Apr;44(4):222-236. doi: 10.1016/j.tips.2023.01.003. Epub 2023 Feb 23. PMID: 36828759; PMCID: PMC10365888). Изучение таких препаратов остается областью активных исследований с использованием доклинических моделей. Стандартными доклиническими моделями являются клеточные линии рака мышей и человека, культивируемые в монослое и полученные из них аллотрансплантаты и ксенотрансплантаты. Помимо стандартных опухолевых моделей in vivo также используют ксенотрансплантаты, полученные от пациентов - PDX (Patient-Derived Xenograft), сгенерированные путем прямой имплантации свежих образцов опухолевой ткани от отдельных пациентов иммунодефицитными мышам (см. Amirkhah R, Gilroy K, Malla SB, Lannagan TRM, Byrne RM, Fisher NC, Corry SM, Mohamed NE, Naderi-Meshkin H, Mills ML, Campbell AD, Ridgway RA, Ahmaderaghi B, Murray R, Llergo AB, Sanz-Pamplona R, Villanueva A, Batlle E, Salazar R, Lawler M, Sansom OJ, Dunne PD. MmCMS: mouse models' consensus molecular subtypes of colorectal cancer. Br J Cancer. 2023 Mar;128(7):1333-1343. doi: 10.1038/s41416-023-02157-6. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36717674; PMCID: PMC10050155).

В многочисленных исследованиях PDX-модели рассматриваются как лучшие предикторы терапевтического ответа, так как они на ранних стадиях развития способны сохранять гетерогенность и молекулярные характеристики исходной опухоли и считаются более подходящими инструментами как для проведения фундаментальных исследований в области онкологии, так и для доклинических испытаний (см. Jung, J. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research / J. Jung, H.S. Seol, S. Chang // Cancer research and treatment. - 2018. - Vol. 50. - №. 1. - P. 1-10; Xenograft and organoid model systems in cancer research / M. Bleijs, M. van de Wetering, H. Clevers et al. // The EMBO journal. - 2019. - Vol. 38. - №. 15).

Тем не менее, на сегодняшний день существует проблема подтверждения достоверности и надежности получаемых PDX-моделей, выражающаяся в отсутствии единообразного подхода к валидации PDX-моделей.

Известен систематический обзор «A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine», в котором проанализировано более 6 тысяч оригинальный статей. Оценивались следующие критерии: подтверждение происхождения опухолевой ткани животной модели от опухоли пациента; подтверждение того, что PDX был получен из опухолевых, а не нормальных клеток, гистопатологическое сравнение донорского материала с материалом, полученным при помощи животной модели. Однако большинство исследований были классифицированы как неясные, так как один или несколько критериев валидации не были продемонстрированы или исследователи не смогли предоставить данные об их моделях.

В связи с этим особое внимание следует уделить проверке и разработке критериев, характеризующих используемые модели. Таким образом, для получение более точных PDX-моделей необходима их валидация.

Известен способ валидации PDX-модели колоректального рака человека, которую получили путем имплантации самкам мышам линии Swiss-nude и CB17-SCID, а также крысам линии NIH подкожно в область лопатки. После успешного приживления проводили серию последующих имплантаций опухолевого фрагмента. Максимально описанное количество пассажей для мышей - 3. Для дальнейшей имплантации материала использовали крыс линии NIH и для успешного приживления проводили облучение всего тела животного дозой 7 Гр γ-источником за 24-48 часов до трансплантации опухоли. Количество пассажей достигало 12. После достижения опухолевых узлов размера 300 мм³ фрагменты тканей замораживали в криомиксе и хранили при температуре -80°С. Через 3 месяца проводили исследование на жизнеспособность опухолевых клеток, а также проводилась имплантация опухолевого материала. Совместно с последующим приживлением проводили валидацию модели гистологическими и молекулярными способами. Необходимо отметить, что в данной работе было выполнено исследование опухолевого материала, как для пациента-донора, так и животной модели-реципиента. Однако недостатком работы является применение транспортной среды, содержащей большое количество антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, гентамицин, ципрофлоксацин, ванкомицин, метронидазол, фунгизон), что может повлиять на транскриптомный профиль и привести к значительным отличиям ксеногенной опухоли от оригинальной. В исследовании не проводилась оценка динамики роста опухолевых узлов на каждом этапе, которая является крайне важной характеристикой и необходима для определения контрольных точек в планируемых доклинических исследованиях. Также выполняемое облучение животных влечет логистические сложности и увеличивает срок проведения экспериментов (см. Julien S, Merino-Trigo A, Lacroix L, Pocard M, Goeé D, Mariani P, Landron S, Bigot L, Nemati F, Dartigues P, Weiswald LB, Lantuas D, Morgand L, Pham E, Gonin P, Dangles-Marie V, Job B, Dessen P, Bruno A, Pierré A, De Thé H, Soliman H, Nunes M, Lardier G, Calvet L, Demers B, Prévost G, Vrignaud P, Roman-Roman S, Duchamp O, Berthet C. 2012. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research 18:53145328 DOI 10.1158/1078-0432.CCR-12-0372).

Известен протокол, разработанный в клинике «Mayo» по созданию PDX-моделей и восстановлению после криозаморозки опухолевого материала, полученного от пациента. Фрагмент опухоли 1 см³ помещают в криосреду, при t -80⁰С (см. Mayo Clinic Brain Tumor Patient-Derived Xenograft (PDX) National Resource. Instructions for Establishment, Restoration, and Passaging of PDX Flank Tumor Lines), после чего трем иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude в возрасте 6-8 недель имплантируют опухолевый материал в заднюю, латеральную часть нижней грудной клетки. Данный протокол детально описывает получение PDX-моделей в нескольких поколениях, в том числе после криоконсервирования.

Однако недостатком протокола является отсутствие процесса валидации PDX-модели, что может привести к недостоверной информации в процессе выполнения дальнейших исследований.

Техническим результатом предлагаемого способа является разработка способа, позволяющего валидировать PDX-модель колоректального рака.

Технический результат способа валидации PDX-модели достигается тем, что выполняют наркоз животным, имплантацию опухолевого фрагмента, полученного от пациента, размером 3 мм 3 мм 3 мм в ортотопический сайт иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude, проводят оценку приживления опухолевого материала на основании количества, полученных PDX-моделей, выполняют оценку динамики роста опухолевых узлов и по достижению опухолевого узла объема 100 мм³, иссекают опухолевый узел и делят на 9 фрагментов: 1 фрагмент размером 3 мм 3 мм 3 мм для гистологического исследования, с целью определения гистотипа, 4 фрагмента размером 2 мм 2 мм 2 мм для молекулярно-генетического исследования методом полимеразной цепной реакции клинически значимых маркёров, а именно статус мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и статус MSI, еще 4 фрагмента размером 3 мм 3 мм 3 мм, помещают в криопробирку с криомиксом, затем в протоколе валидации заполняют графы: уникальный ID-ксенотрансплантата, включающий указание типа ксенотрансплантанта - PDX, название нозологии в виде аббревиатуры, фамилию пациента - первые три буквы, номер пассажа, год операции пациента - ГГГГ, дата взятия образца - ДД.ММ.ГГГГ, название криомикса, в котором заморожен образец, дополнительно указывают: линию мышей-реципиентов опухолевого материала, сайт имплантации, гистологическую и молекулярно-генетическую характеристику ксенотрансплантата; затем фрагменты подвергают криоконсервации и хранят в морозилке 90 суток при температуре -80°С.

Способ иллюстрируется фигурами.

На фиг. 1 изображена имплантация опухолевого фрагмента PDX колоректального рака человека в ортотопический сайт иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.

На фиг. 2 изображен процесс криозаморозки опухолевых фрагментов PDX модели колоректального рака человека

На фиг. 3 изображен гистологический снимок опухоли мыши Р1, опухоль соответствует аденокарциноме G2

На фиг. 4 изображен гистологический снимок опухоли пациента, являющегося донором опухолевого фрагмента, опухоль соответствует аденокарциноме G2

Способ валидации ксенотрасплантатов, полученных от пациентов с колоректальным раком, осуществляется следующим образом.

Имплантацию опухолевого фрагмента колоректального рака человека в толстую кишку мыши проводят под общим наркозом ветеринарными препаратами «Ксила» в дозе 20 мг/кг, «Золелил-100» в дозе 50 мг/кг (см. патент на изобретение RU 2712916, опубл. 03.02.2020, Бюл. № 1). Мыши проводится послойное рассечение кожи, мышц и тканей брюшной стенки, извлекают прямую кишку, производят продольное рассечение серозно-мышечного слоя толстой кишки и при помощи лигатуры фиксируют фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³ над сделанным раннее разрезом, послойно ушивают стенку брюшной полости и кожу мыши (см. патент на изобретение RU 2727868, опубл. 24.07.2020, Бюл. № 21).

Один раз в 7 дней проводят лапаротомию и измерение ОУ при помощи штангельциркуля, определяют объем опухолевого фрагмента мыши по формуле V = LW2/2, где L, W - линейные размеры опухоли (длина, ширина). Оценивают процент приживления опухолевых фрагментов, на основании полученных PDX-моделей.

По достижению объема 100 мм³ ОУ извлекают и разделяют на 9 фрагментом: 1 фрагмент размером 3 мм 3 мм 3 мм для гистологического исследования, с целью определения гистотипа, 4 фрагмента размером 2 мм 2 мм 2 мм для молекулярно-генетического исследования методом полимеразной цепной реакции клинически значимых маркёров, а именно статус мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и статус MSI, еще 4 фрагмента размером 3 мм × 3 мм × 3 мм, помещают в криопробирку с криомиксом содержащий 80% RPMI или DMEM, или другой питательной среды для культивирования клеток, 10% фетальной бычий сыворотки (FBS), 10% диметилсульфоксид (DMSO).

Затем в протоколе валидации заполняют графы: уникальный ID-ксенотрансплантата, включающий: указание типа ксенотрансплантанта - PDX, название нозологии в виде аббревиатуры, фамилию пациента - первые три буквы, номер пассажа, год операции пациента - ГГГГ, дата взятия образца - ДД.ММ.ГГГГ, название криомикса, в котором заморожен образец, дополнительно указывают: линию мышей-реципиентов опухолевого материала, сайт имплантации, гистологическую и молекулярно-генетическую характеристику ксенотрансплантата; затем фрагменты подвергают криоконсервации и хранят в морозилке 90 суток при температуре -80°С.

Пример применения валидации PDX-модели.

Данным способом была проведена валидация PDX-модели колоректального рака, полученная на 8 самках мышей линии Balb/c Nude весом 25 г., возраст составил 10 недель.

Хирургическую манипуляцию проводили под общим наркозом ветеринарными препаратами «Ксила» в дозе 20 мг/кг, «Золелил-100» в дозе 50 мг/кг.

Мышам проводили послойное рассечение кожи, мышц и тканей брюшной стенки, извлекали прямую кишку, производили продольное рассечение серозно-мышечного слоя толстой кишки и при помощи лигатуры фиксировали фрагмент опухоли толстой кишки человека объемом 27 мм³ над сделанным раннее разрезом, послойно ушивали стенку брюшной полости и кожу мыши.

Один раз в 7 дней проводили лапаротомию и измерение ОУ при помощи штангельциркуля, провели оценку приживления опухолевого материала из 10 животных рост опухоли наблюдали у 8 голов: 80%; делали оценку динамики роста опухолевых узлов: в первом пассаже объем 100 мм³ достиг к 58 суткам. Далее ОУ извлекали и разделяли на 9 фрагментом: 1 фрагмент размером 3 мм 3 мм 3 мм для гистологического исследования, 4 фрагмента размером 2 мм 2 мм 2 мм для молекулярно-генетического исследования, еще 4 фрагмента размером 3 мм 3 мм 3 мм, помещали в криопробирку с криомиксом. В протоколе присваивали уникальный ID-ксенотрансплантата: PDX-КРР-Кис-Р1-2020-01.02.2020-Криомикс, указывали линию мышей-реципиентов опухолевого материала: Balb/c Nude, указывали наименование сайта имплантации: ортотопический (восходящая ободочная кишка), указывали гистологическую характеристику: аденокарцинома G2 и молекулярно-генетическую характеристику: мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF не обнаружены, статус MSI/MSS определен как MSS (см. таблица 1).

Таблица 1

Протокол валидации

ID-ксенотрансплантата Линия мышей Сайт имплантации Гистологическая характеристика Молекулярно-генетическая характеристика PDX-КРР-Кис-Р1-2020-01.02.2020-Криомикс Balb/c Nude ортотопический (восходящая ободочная кишка) аденокарцинома G2 мутации в генах KRAS, NRAS, BRAF не обнаружены, статус MSI/MSS определен как MSS

Технико-экономическая эффективность способа заключается в том, что его применение позволит валидировать PDX-модель колоректального рака, а именно подтвердить достоверность и надежность получаемой опухолевой модели.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для исследования patient-derived xenograft (PDX) модели колоректального рака. Осуществляют забор опухолевого фрагмента колоректального рака человека. Проводят наркоз иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude, имплантацию указанного опухолевого фрагмента размером 3 мм × 3 мм × 3 мм в ортотопический сайт наркотизированным мышам. Иссекают опухолевый узел по достижении объема 100 мм³, делят на 9 фрагментов: 1 фрагмент для гистологического исследования, 4 фрагмента для молекулярно-генетического исследования статуса мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и статуса MSI, еще 4 фрагмента помещают в криопробирку с криомиксом, затем фрагменты подвергают криоконсервации и хранят в морозилке 90 суток при температуре -80°С. Способ позволяет исследовать PDX-модель колоректального рака за счет определения гистотипа опухоли и статуса мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и статуса MSI. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ исследования patient-derived xenograft (PDX) модели колоректального рака, заключающийся в том, что осуществляют забор опухолевого фрагмента колоректального рака человека, проводят наркоз иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude, имплантацию указанного опухолевого фрагмента размером 3 мм × 3 мм × 3 мм в ортотопический сайт наркотизированным мышам, иссекают опухолевый узел по достижении объема 100 мм³, делят на 9 фрагментов: 1 фрагмент размером 3 мм × 3 мм × 3 мм для гистологического исследования с целью определения гистотипа, 4 фрагмента размером 2 мм × 2 мм × 2 мм для молекулярно-генетического исследования статуса мутации генов KRAS, NRAS, BRAF и статуса MSI методом полимеразной цепной реакции, еще 4 фрагмента размером 3 мм × 3 мм × 3 мм помещают в криопробирку с криомиксом, затем фрагменты подвергают криоконсервации и хранят в морозилке 90 суток при температуре -80°С.