Средство белково-пептидной природы, обладающее восстанавливающим структуру ткани действием, используемое в качестве субстанции для фармацевтических и пищевых продуктов Российский патент 2023 года по МПК A61K38/02 A61K36/00 A61K36/68 A61K36/45 A61K36/886 A61P17/02 A61P37/02 

Изобретение относится к пищевой, биотехнологической и медицинской промышленности, а именно к области получения из растений биологически активных веществ, в частности получения средства белково-пептидной природы, обладающей восстанавливающим структуру ткани действием, используемой в дальнейшем в качестве субстанции для фармацевтических и пищевых продуктов.

Известен способ получения лекарственного средства, обладающего противовоспалительной и ранозаживляющей активностью, путем водной экстракции биологически активных веществ из высушенного измельченного растительного сырья, при этом в качестве растительного сырья используют растение рода первоцветов Ciclamen ibericum, причем водную экстракцию осуществляют заливкой высушенных и измельченных частей растения водой с температурой 85-100°С при массовом соотношении растительного сырья и воды 0,7:(1- 500,0) соответственно и последующим настаиванием полученной смеси при естественном ее охлаждении до температуры окружающей среды (RU 2098113, 10.12.1997).

Известно средство из крапивы двудомной (трава) Urtica dioica L. гликозид, содержащее уртицин, дубильные и белковые вещества, муравьиную кислоту, витамины - аскорбиновая кислота (до 0,15-017% в свежем сырье и до 0,6% в сухом), витамин К, пантотеновую кислоту, каротиноиды (до 13-14% в свежих листьях и до 50 мг/% в сухих листьях), хлорофилл (2-5%), ситостерин, гистамин, виолаксантин, флавоноиды, никотин, ацетилхолин, гистамин, кумарины, соли железа, марганец, медь, калий, кальций, барий, полученное в виде настоя и обладающее ранозаживляющим действием, а также способствует регенерации и эпителизации пораженных тканей (Володина Т.А. Разработка состава, технологии и норм качества фитогеля репаративного действия. Автореферат дисс.на соиск. учен. степ. канд. фарм. наук, Омск, 2014, 23 с.).

В отношении данных средств следует отметить, что лекарственные растения издревле используют в народной медицине. В настоящее время существует большое количество сухих сборов для заваривания, настоев на различных основах, экстрактов, спиртовых настоек, водных настоек и т.д. Все они обладают восстанавливающим и оздоравливающим действием на организм человека и животных, а также как описано в указанных выше источниках информации ранозаживляющей активностью, способствующей регенерации и эпителизации пораженных тканей.

Но, главным недостатком данных веществ является то, что они находятся в состоянии низкой очистки и там присутствуют побочные вещества, которые могут быть токсичны и нежелательны для человека.

Известно средство белковой природы, обладающее ранозаживляющим и восстанавливающим ткани действием, полученное путем экстракции измельченных свежих листьев подорожника солевым раствором при температуре 8-10°С. Полученный экстракт фильтровали через несколько слоев марли, центрифугировали (3000 g, 30 мин.), образовавшийся осадок отделяли от основного раствора, который далее очищали методом высаливания белков, получая при этом пептидную компоненту.(Краснов М.С., Богданов В.В., Куликова О.Г. и др. Исследование ранозаживляющего действия биорегуляторов новой группы, выделенных из тканей моллюска (Margaritifera margaritifera) ирядарастений. Журнал Фундаментальные исследования. - 2014. - №5 (часть 1) - С. 63-70). Недостатками данного средства является использование только пептидной компоненты, что обеспечивает меньшую скорость и низкую эффективность ранозаживления и восстановления тканей. Данный источник информации рассмотрен в качестве ближайшего аналога.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств белково-пептидной природы, обладающих эффективным восстанавливающим структуру ткани действием.

Технический результат достигается тем, что создано средство белково-пептидной природы, обладающее восстанавливающим структуру ткани действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки: пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно, полученную путем экстракции измельченных частей растений, где растения выбраны из листьев подорожника большого, алоэ вера, листьев лещины и ягод черники обыкновенной, до размера частиц от 1×1 см до 2×2 см водно-солевым раствором состава (г/л): NH₄NO₃ - 0,4-4, KNO₃ - 0,51-4,04, СаСl₂ × 2Н₂O - 0,07-7, MgSO₄ × 7Н₂O - 0,123-1,23, KН₂РO₄ - 0,068-0,68, выдерживания в холодильнике при температуре 0-15°С в течение 1-5 часов, центрифугирования экстракта для удаления остатков тканей, осаждения белково-пептидной фракции 50-100% сульфатом аммония, очищением фракции супернатанта с использованием электрофореза и диализа, при этом электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААГ, далее фракции белков и пептидов элюируют с помощью физиологического раствора в течение 1-4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды в течение 1-4 суток при +4°С и затем полученные очищенные биологически активные фракции объединяют, разводят до концентраций 10^-7-10^-19 мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции.

Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, в которых описан способ получения средства белково-пептидной природы (примеры 1, 2, 3, 4) и определена специфическая активность заявленного средства (примеры 5-9), а также фиг. 1-8.

Фиг. 1 Электрофорез в неденатурирующих условиях в 12, 5% ПААГ. Окрашивание нитратом серебра. Электрофореграмма разделения средство белково-пептидной природы, полученного по примеру 1-1 (стрелками указаны белки с молекулярной массой около 66 кДа и пептиды с молекулярной массой менее 3,5 кДа), маркеры молекулярной массы - 2 (стрелками указаны: 94 кДа - фосфорилаза b; 77 кДа - овотрансферрин; 66 кДа - бычий сывороточный альбумин; 45 кДа - овальбумин; 30 кДа - угольная ангидраза; 17 кДа - миоглобин; 12 кДа - цитохром с; 3,5 кДа - В-цепь инсулина поджелудочной железы быка).

Фиг 2. Состояние кожи при ранозаживлениии восстановлении структуры ткани у мыши: а - нативная кожа, б - в контроле при заживлении раны первичным натяжением, в - при добавлении физиологического раствора в рану (контроль), г - при добавлении в рану средства белково-пептидной природы, полученной по примеру 1. Э - эпидермис, д - дерма, ж - подкожная жировая ткань, ф - фиброз, ов - очаг воспаления, пж - потовые железы.

Фиг. 3. Состояние кожи при ранозаживлениии восстановлении структуры ткани у мыши: а - нативная кожа, б - в контроле при заживлении раны первичным натяжением, в - при добавлении физиологического раствора в рану (контроль), г - при добавлении в рану средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 2. Э - эпидермис, д - дерма, пж - подкожная жировая ткань, ф - фиброз, ов - очаг воспаления, пж - потовые железы.

Фиг. 4. Гистологическая структура состояния артерий крысы: а, б - нативная, в, г - при культивировании в контроле, д, е - при культивировании с добавлением средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 3. а, в, д - окраска гематоксилином- эозином; б, г, е - окраска по Ван-Гизону.

Фиг. 5. Влияние средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 4 на жизнеспособность биполяров при культивировании эксплантатов сетчатки в составе заднего сектора глаза тритона - б, культивирование в контроле, без добавления каких-либо факторов в культуральную среду - а.

Фиг. 6. Процент жизнеспособных биполярных клеток на единицу площади в сетчатке при культивировании ее в составе заднего сектора глаза в опыте и в контроле. По оси абсцисс: 1 - средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 4; 2 - контроль. По оси ординат: относительное количество выживших биполяров (%) на единицу длины (0.125 мм).

Фиг. 7. Данные по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) через 24 часа после разрешающей инъекции.

Фиг. 8. Данные по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) через 48 часов после разрешающей инъекции.

Указанные ниже растения используемые для получения заявленного «средства белково-пептидной природы» не являются признаками сужающими объем правовой защиты, поскольку могут меняться в процессе создания данного средства в виде смеси фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки:пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно.

Листья, стебли или корни растений нарезают на маленькие фрагменты от 1×1 см до 2×2 см, заливают 10 л водно-солевого раствора состава (г/л): NH₄NO₃ - 0,4-4, KNO₃ - 0,51-4,04, CaCl₂ × 2H₂O - 0,07-7, MgSO₄ × 7H₂O - 0,123-1,23, KH₂PO₄ - 0,068-0,68 и выдерживают в холодильнике при 0-15°С в течение 1-5 ч. Далее экстракт центрифугируют, удаляя остатки тканей, осаждают белки 50-100% сульфатом аммония, используют фракции супернатанта для последующего очищения композиции пептидов и белков с использованием электрофореза и диализа. Электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААГ, собирают фракции белков в диапазоне 15-94 кДа, и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа, идущих с фронтом ионов Rf=0,9-1,0 (см. фиг. 1). На фиг. 1 показана электрофореграмма разделения белков и пептидов 2 - подорожника большого, которые затем илюируют и собирают для объединения в белково-пептидный комплекс, 1 - разделение маркеров молекулярной массы.

Пример 1. Получение средства белково-пептидной природы из листьев подорожника большого.

Листья подорожника большого (Plantago major) 3 кг нарезают на маленькие фрагменты 1×1 см, заливают 5 л водно-солевого раствора состава(г/л): NH₄NO₃ - 0,4, KNO₃ - 0,51, СаСl₂×2H₂O - 0,07, MgSO₄×7H₂O - 0,123, KН₂РО₄ - 0,068 и выдерживают в холодильнике при температуре 5°С в течение 5 часов. Далее экстракт, центрифугируют, удаляя остатки тканей, осаждают белки сульфатом аммония 100%. В дальнейшем для работы используют фракции супернатанта, которые очищают от ионов сульфата аммония с использованием электрофореза и диализа. Электрофорез проводят в неденатурирующих условиях, в 15% ПААТ. Собирают фракции белков в диапазоне 15-94 кДа, и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа, идущих с фронтом ионов R_f=1,9-1,0. Далее фракции элюируют с помощью физиологического раствора в течение 1 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды также в течение 1 суток при +4°С. Далее полученные фракции объединяют в соотношении белки:пептиды 10:1 и используют в качестве биологически активной субстанции.

Биологически активные очищенные субстанции разводят до концентраций 10'' мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции.

Пример 2. Получение средства белково-пептидной природы из листьев алоэ вера.

Листья алоэ вера (Aloe vera) 1 кг нарезают на маленькие фрагменты 2×2 см, заливают 3 л водно-солевого раствора состава (г/л): NH₄NO₃ - 1,648, KNO₃ - 2,022, СаСl₂ × 2Н₂О - 0,294, MgSO₄ × 7H₂O - 0,738, KН₂РО₄ - 0,408 и выдерживают в холодильнике при 0°С в течение 4 часов. Далее экстракт центрифугируют, удаляя остатки тканей, осаждают белки 50% сульфатом аммония. В дальнейшем для работы используют фракции супернатанта, которые путем диализа очищают от ионов сульфата аммонния. Для последующего очищения композиции пептидов и белков из фракции супернатанта используют методы электрофореза, диализа. Электрофорез проводят в неденатурирующих условиях, в 12,5% ПААТ. Собирают фракции белков в диапазоне 15-94 кДа, и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа, идущих с фронтом ионов R_f=0,9-1,0. Далее фракции элюируют с помощью физиологического раствора в течение 3 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды также 3 суток при +4°С. Далее полученные фракции объединяют в соотношении белки:пептиды 1:1 и используют в качестве биологически активной субстанции.

Биологически активные очищенные фракции разводят до концентраций 10 мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции.

Пример 3. Получение средства белково-пептидной природы из листьев лещины.

Листья лещины 10 кг нарезают на маленькие фрагменты 2×1 см, заливают 10 л водно-солевого раствора состава(г/л): NH4NO3 - 4, KNO₃ - 4,04, CaCl₂ × 2H₂O - 7, MgSO₄ × 7H₂O - 1,23, KH₂PO₄ - 0,68 и выдерживают в холодильнике при 15°С в течение 1 часа. Далее экстракт центрифугируют, удаляя остатки тканей, осаждают белки сульфатом аммония 80%. В дальнейшем для работы используют фракции супернатанта, которые путем диализа очищают от ионов сульфата аммонния. Для последующего очищения композиции пептидов и белков из фракции супернатанта можно использовать методы электрофореза, диализа. Электрофорез проводят в неденатурирующих условиях, в 13,5% ПААГ. Собирают фракции белков в диапазоне 15-94 кДа, и фракции пептидов, идущих с фронтом ионов Rf=0,9-1,0. Далее фракции элюируют с помощью физиологического раствора в течение 4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды также 4 суток при +4°С. Далее полученные фракции объединяют в соотношении белки:пептиды 1:10 и используют в качестве биологически активной субстанции.

Биологически активные очищенные фракции разводят до концентраций 10^-15 мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции.

Пример 4. Получение средства белково-пептидной природы из ягод черники обыкновенной.

Ягоды черники обыкновенной (Vaccinum myrtillus L.). 1 кг разрезают пополам (1×1 см), заливают 2 л водно-солевого раствора состава (г/л): NH₄NO₃ - 0,4, KNO₃ - 4,04, CaCl₂ × 2H₂O - 0,07, MgSO₄ × 7H₂O - 1,23, KH₂PO₄ - 0,068 и выдерживают в холодильнике при 10°С в течение 2 часов. Далее экстракт центрифугируют, удаляя остатки тканей, осаждают белки 90% сульфатом аммония. Затем фракции супернатанта очищают от ионов сульфата аммония. Для очищения композиции пептидов и белков из фракции супернатанта используют методы электрофореза, диализа. Электрофорез проводят в неденатурирующих условиях, в 14% ПААГ. Собирают фракции белков в диапазоне 15-94 кДа, и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа, идущих с фронтом ионов Rf=0,9-1,0.

Далее фракции элюируют с помощью физиологического раствора в течение 4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды также 4 суток при +4°С. Далее полученные фракции объединяют в соотношении белки:пептиды 5:1 соответственно и используют в качестве биологически активной субстанции.

Биологически активные очищенные фракции разводят до концентраций 10^-7 мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции.

Средство белково-пептидной природы в виде смеси фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки:пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно, которые затем объединяют и разводят до концентрации 10^-7-10^-19 мг/мл, полученное экспериментально, обеспечивает широкое варьирование состава в зависимости от решаемой лечебной задачи при сохранении требуемой биологической активности средства.

Получение средства белково-пептидной природы в указанных режимах путем экстракции измельченных частей растений водно-солевым раствором, выдерживания в холодильнике при температуре 0-15°С в течение 1-5 часов, осаждения белково-пептидной фракции 50-100% сульфатом аммония, очищения фракции супернатанта с использованием электрофореза и диализа, при этом электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААГ, а элюирование фракции белков и пептидов с помощью физиологического раствора в течение 1-4 суток при +4°С, отдиализовывания против дистиллированной воды в течение 1-4 суток при +4°С определены опытным путем и позволяют наиболее полно экстрагировать комплекс биологически активных веществ.

Кроме того наилучшая экстракция средства белково-пептидной природы достигается при использовании измельченных частей растений до размера частиц от 1×1 см до 2×2 см и экстракция водно-солевым раствором в количественном составе (г/л): NH4NO3 - 0,4-4, KNO3 - 0,51-4,04, CaCl2 × 2H2O - 0,07-7, MgSO4 × 7H2O - 0,123-1,23, KH2PO4 - 0,068-0,68, которые также получены экспериментально.

Наиболее выраженное ранозаживляющее и восстанавливающее структуру ткани действие средства белково-пептидной природы, полученного по примеру 1 продемонстрировано на модели экспериментальной травмы кожи мыши in vivo.

Ранозаживляющие и восстанавливающие структуру ткани действия подтверждены на мышах-гибридах F1 линии C57BL/СВА (самцы весом 18-20 г). У каждого экспериментального животного под эфирным наркозом, на спине вырезали лоскут кожи, диаметром около 1 см.

Животных разделили на три группы по 5 особей в каждой. Первая группа -контрольная группа мышей, которым наносили травму и не подвергали далее никакому воздействию. Вторая группа - контрольная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл физиологического раствора. Третья группа - опытная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл средства белково-пептидной природы, в виде смеси фракций белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки:пептиды от 10:1 до 1:10. На восьмые сутки после нанесения экспериментальной раны всех животных выводили из эксперимента в атмосфере эфира, аккуратно вырезали ткань в области травмы и приготавливали поперечные парафиновые гистологические срезы толщиной 7 мкм. Фиксацию тканей проводили в растворе Буэна, срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике. Просмотр гистологических препаратов производили с помощью световой микроскопии на микроскопе фирмы Olympus (Япония).

Пример 5.

Ранозаживление и восстановление структуры ткани смотрели на модели раны кожи у мышей трех групп. Результаты ранозаживления и восстановления структуры ткани показаны на фиг. 2 а, б, в, г, где а - нативная кожа, б - в контроле при заживлении раны первичным натяжением, в - при добавлении физиологического раствора в рану (контроль), г - при добавлении в рану средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 1.

1. Контрольная группа мышей, которым наносили травму и не подвергали далее никакому воздействию.

2. Контрольная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл физиологического раствора.

3. Опытная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 1.

Через 8 суток после операции у всех экспериментальных животных наблюдали практически полную реэпителизацию раневой поверхности, незначительное воспаление в субэпидермальной зоне. У мышей первой контрольной группы (необработанная рана) происходило образование фиброзного рубца - отмечено параллельное эпидермису расположение коллагеновых волокон (см. фиг. 2б). При обработке раны физиологическим раствором во второй группе также наблюдали образование соединительно-тканного рубца, однако в центральной части раны отсутствовало полное заживление и реэпитализация, поскольку образовался очаг хронического воспаления. В подкожной жировой ткани практически не наблюдали жировых клеток; волокна коллагена были более рыхлые, чем в дерме (см. фиг. 2в). У мышей опытной группы, рану которой ежедневно обрабатывали, раствором средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 1, наблюдали восстановление субэпидермальных слоев (см. фиг. 2г). Следует отметить комплексный характер репаративных процессов, протекающий при воздействии заявленного средства, по сравнению с контролем: наблюдали практически полное восстановление эпителия и дермы, в которой были отмечены кровеносные сосуды, а расположение волокон в дерме было более рыхлым, чем в контроле. Помимо этого, при воздействии заявленного средства в подкожной жировой ткани отмечали интенсивное разрастание жировой ткани и восстановление протоков желез; в контроле на месте повреждения не происходило восстановления жировой ткани, а также не было восстановления протоков желез. Восстановление протоков потовых желез говорит о возобновлении их активности в данном участке кожи, а восстановление рыхлой структуры коллагеновых волокон в дерме свидетельствует о появлении эластичности кожи.

Полученные данные показывают, что заявленное средство белково-пептидной природы, выделенные по примеру 1, стимулирует ранозаживление у мышей in vivo, способствуя восстановлению нормальной морфологии кожи, без образования рубцовой ткани.

Пример 6.

Ранозаживление и восстановление структуры ткани смотрели на модели раны кожи также у мышей трех групп при этом в группе 1 - контрольная группа мышей, которым наносили травму и не подвергали далее никакому воздействию, группа 2 - контрольная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл физиологического раствора и группа 3 - опытная группа мышей, которым после нанесения травмы ежедневно наносили в область раны 100 мкл средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 2.

На 8 сутки после нанесения экспериментальной раны всех животных умерщвляли в атмосфере эфира, аккуратно вырезали ткань в области травмы и приготавливали поперечные парафиновые гистологические срезы толщиной 7 мкм. Фиксацию тканей проводили в растворе Буэна, срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике. Просмотр гистологических препаратов производили с помощью световой микроскопии на микроскопе фирмы Olympus (Япония).

Результаты ранозаживления и восстановления структуры ткани показаны на фиг. 3а, б, в, г. На фиг. 3б показано образование фиброзного рубца - отмечено плотное параллельное эпидермису расположение коллагеновых волокон в виде плотных тяжей у мышей контрольной группы (необработанная рана). На фиг. 3в показано образование соединительно-тканного рубца, при этом в центральной части раны полное заживление и реэпитализация отсутствовали, поскольку образовался очаг хронического воспаления из-за влажной раны. В подкожной ткани практически не наблюдали жировых клеток; волокна коллагена были более рыхлые, чем в дерме у мышей при обработке раны физиологическим раствором. На фиг. 3г показано у мышей опытной группы (рану ежедневно обрабатывали средством белково-пептидной природы, полученное по примеру 2) восстановление всех субэпидермальных слоев. В этом исследовании также имелся комплексный характер репаративных процессов, протекающий при воздействии заявленного средства белково-пептидной природы, по сравнению с контролями, а именно наблюдали практически полное восстановление эпителия и дермы, в которой были отмечены кровеносные сосуды, а расположение волокон в дерме было более рыхлым, чем в контролях. Помимо этого, при воздействии заявленного средства, полученного по примеру 2, в подкожной жировой ткани отмечали интенсивное разрастание жировой ткани и восстановление протоков желез; в контрольных группах на месте повреждения не происходило восстановления жировой ткани, а также не было восстановления протоков желез. Восстановление протоков потовых желез говорит о возобновлении их активности в данном участке кожи, а восстановление рыхлой структуры коллагеновых волокон в дерме свидетельствует о появлении эластичности кожи.

Полученные данные показывают, что средство, выделенные по примеру 2 стимулирует ранозаживление у мышей in vivo, способствуя восстановлению нормальной морфологии кожи, без образования рубцовой ткани.

Пример 7.

Восстановление структуры ткани также исследовали на модели органо-типического культивирования, отражающего собой дегенеративные процессы и изменения в определенных слоях сосуда (артерии), которые могут соответствовать состоянию сосудов при патологиях кровеносной системы, например, в результате ишемии или атеросклероза. Для этого опыт был проведен на экспериментальной модели роллерного органо-типического культивирования фрагментов сосудов крысы in vitro. Были взяты фрагменты артерии размером около 5 мм длиной. Фрагменты сосудов промывали изнутри физиологическим раствором от остатков крови, далее помещали во флаконы с питательной средой 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также антибиотик/антимикотик (Sigma) 1% и культивировали на роллере RM5 (Германия) в течение 7 суток при 37°С. Далее фрагменты сосудов фиксировали в фиксаторе Буэна и приготавливали стандартные парафиновые срезы толщиной 7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, и по Ван-Гизону. Для сравнения аналогично были приготовлены гистологические срезы фрагментов нативной артерии, взятые у крысы.

Описание гистологических препаратов и результаты восстановления структуры ткани на модели органо-типического культивирования представлены на фиг 4а, б, в, г, д, е.

Гистологическая структура состояния нативной артерии (см. фиг. 4а, б). Внутренняя оболочка представлена хорошо выраженным слоем эндотелиальных клеток, лежащих на эластической мембране, далее представлена средняя оболочка, в которой наблюдается гадкая мускулатура, эластические мембраны, между которыми находятся сокращенные гладкомышечные клетки и фибробласты, а также эластин, коллаген и аморфное межклеточное вещество. Наружная соединительнотканная оболочка представлена в основном коллагеновыми и частично эластическими волокнами, а также фибробластами и жировыми клетками.

Культивирование в контроле (см. фиг. 4в, г). Гистологическая структура состояния роллерной органо-типической культуры артерии. При данном типе культивирования на 7 день наблюдается деградация внутренней оболочки артерий. Во внутренней оболочке артерии слой эндотелиальных клеток деградировал практически полностью, наблюдалось гибель клеток. Деградация внутренней оболочки артерий, может быть аналогом атеросклеротического повреждения сосудов in vivo. Идет также накопление во внутренней оболочке недифференцированных гладкомышечных клеток, пролиферация которых в условиях in vivo также может приводить к атеросклеротическим повреждениям. Наблюдалось повышение содержания коллагена во внутренней и средней оболочке, что также может свидетельствовать об изменениях, аналогичных атеросклеротическим. Средняя оболочка представлена фибробластами и гладкомышечными клетками, среди которых отмечается значительное количество погибших клеток. Эластические волокна стали рыхлыми, утратили свою конфигурацию в виде тяжей. Наружная оболочка также претерпела изменения, заключающиеся в нарушении организации коллагеновых и эластических волокон, а также в гибели части клеток.

Культивирование с добавлением средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 3 (Фиг. 4д, е). Гистологическая структура состояния артерии культивированной с добавлением средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 3. Во внутренней оболочке видны отдельные эндотелиальные клетки, хорошо выражена внутренняя эластическая мембрана. В средней оболочке наблюдается хорошо представленная гладкая мускулатура, эластические мембраны, между которыми находятся гладкомышечные клетки и фибробласты, а также коллагеновые волокна. В наружной оболочке хорошо выражены коллагеновые и эластические волокна, а также фибробласты.

Таким образом, заявленное средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 3 стимулирует восстановление структуры ткани наружной и внутренней оболочки артерий.

Пример 8.

Восстановление структуры ткани исследовали и на культуре заднего отдела глаза взрослых половозрелых иглистых тритонов (Pleurodeles waltl) обоего пола. Для эксперимента тритоны были наркотизированы в 2% растворе этилуретана на физиологическом растворе для амфибий (0,65% NaCl) или 0,1% растворе MS-222.

Результаты восстановления структуры ткани на культуре заднего отдела глаза взрослых половозрелых иглистых тритонов представлены на фиг. 5а, б.

После наркотизации головы животных ополаскивали 70-градусным этиловым спиртом и проводили энуклеацию глаз при стандартном лабораторном освещении. Изолированные глаза помещали в стерильные чашки Петри (3,5 см) в питательную среду для амфибий (среда 199 - 70%, вода дистиллированная - 30%).

С помощью бинокуляра, оснащенного источником холодного света, изолировали ткани глаз в следующей последовательности. Сначала освобождали глаз от кожных покровов, затем разрезали по окружности, проксимальнее лимба. Ростовую область сетчатки вместе с радужкой, роговицей и хрусталиком отбрасывали. Задние секторы глаз, в состав каждого из которых входили сетчатка, пигментный эпителий, сосудистая оболочка и склера, использовали для последующего культивирования. В некоторых опытах сетчатку тоже удаляли и использовали для культивирования только пигментный эпителий с окружающими его оболочками.

Среда для выделения и культивирования тканей глаза содержала: 350 мл среды L-15 (в некоторых случаях заменяемой средой 199), 150 мл бидистиллированной дважды профильтрованной воды, 0,15 мл 1М буфера Hepes и 1 мл 4% сульфата гентамицина. При роллерном культивировании в среду добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Среда культивирования перед внесением в пузырьки проходила холодную стерилизацию через мембранные фильтры типа "СА" фирмы Nalgene, (США) с размером пор 0,22 мкм. Полученные задние отделы глаз помещали на целлюлозные фильтры типа "А/Е" фирмы Gelman, США, отмытые в 70-градусном этаноле, и ополоснутые в культуральной среде. Во флаконы опытных серий добавляли заявленное средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 4, объемом 0,1 мл. Во флаконы контрольных серий добавляли только 0,1 мл дистиллированной воды. Все флаконы закрывали стерильными крышками, затем пленкой Parafilm М, накрывали алюминиевой фольгой и ставили в термостат. Культивирование проводили в темноте при температуре 22°С в течение двух суток. Культуральную среду в течение этого времени не меняли.

На фиг. 5а показано культивирование в контроле. При культивировании заднего отдела глаза морфология тканей (нейральная сетчатка, ПЭС, сосудистая и склеральная оболочки) сохранилась сходной с интактной. Склеральная оболочка имела хорошо выраженную волокнистую структуру - трехмерную сеть волокон с рассеянными фибробластами. Сосудистая оболочка имела сопоставимые с нормой толщину и уровень пигментации. В сетчатке наблюдали много апоптирующих клеток, происходило нарушение адгезии между пигментным эпителием (ПЭ), нейрональной сетчаткой и сосудистой оболочкой. Наблюдали изменение статуса дифференцировки клеток ПЭ, которое выражалось в смещении пигмента на апикальную сторону клеток монослоя, нарушению адгезии между ними и гибелью самих клеток. В склере деградировали коллагеновые волокна и образовывались пустоты и разрывы.

На фиг. 5б показано влияние белково-пептидного средства, полученного по примеру 4 на жизнеспособность биполяров при культивировании эксплантатов сетчатки в составе заднего сектора глаза тритона. При этом увеличилась концентрация пигментных гранул и их распределение в более базальной области клеток пигментного эпителия сетчатки. При культивировании не было отмечено выхода клеток пигментного эпителия из слоя или их миграции вглубь, во внутренние слои сетчатки, как это происходит в случае нарушения статуса клеточной дифференцировки данных клеток и их нестабильности. Гибель клеток сетчатки, выявляемая морфологически на полутонких срезах, была при этом значительной. Тела биполярных клеток были светло окрашены, имели хорошо различимые ядрышки; форма ядер сохранялась округлой. Погибающие или погибшие биполяры имели ясные отличия от жизнеспособных биполяров. Клетки, входящие в апоптоз, содержали диспергированный плотно окрашенный хроматин на фоне светлых пространств ядер, а погибшие клетки - ядра меньших размеров с наиболее плотной окраской толуидиновым синим. При действии заявленного средства, полученного по примеру 4 в сетчатке и пигментном эпителии наблюдали поддержание жизнеспособности биполярных клеток примерно на 12% выше, чем в контроле (см. фиг. 6). На фиг. 6 представлено по оси абсцисс по вертикали процент жизнеспособных биполярных клеток на единицу площади в сетчатке при культивировании ее в составе заднего сектора глаза; по горизонтали 1 - при культивировании с белково-пептидным средством, полученным по примеру 4; 2 - при культивировании в контроле, без добавления каких-либо факторов в культуральную среду. Гибель нейронов была выше в центральных областях сетчатки, чем на периферии. Также гибель нейронов была выше в контрольной группе, по сравнению с опытной группой с добавлением в среду культивирования заявленного средства, полученного по примеру 4.

Исходя из полученных результатов исследования заявленное средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 4 стимулирует восстановление структуры тканей заднего отдела глаза, поддерживает статус дифференцировки клеток пигментного эпителия, поддерживает жизнеспособность биполярных клеток и нейронов сетчатки, а также состояние адгезии тканей глаза между собой.

Пример 9.

Также было выявлено профилактическое иммуномодулирующее действие средства белково-пептидной природы, полученное по примерам 1 и 2 на модели реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей.

Цель эксперимента: выявить профилактическое действие средства белково-пептидной природы, полученное по примерам 1 и 2 на реакцию ГЗТ. Для этого сформированы группы мышей BALB/c по 8 шт в каждой: Группа 1 (контроль), Группа 2 (контроль ГЗТ), Группа 3 - средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 2 и Группа 4 - средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 1.

1 день - иммунизация препаратом. Введение препаратов внутри/брюшинно в объеме 200 мкл на PBS 0,1М (группы 2, 3, 4). в/брюшинно введение PBS 0,1М 200 мкл группа 1.

2 день - сенсибилизация KLH (гемоцианин из лимфы улитки, Sigma, Hemocyanin from Megathura crenulata).

Группы 1, 2, 3, 4. Каждая группа была сенсибилизирована подкожной инъекцией между лопаток 100 мкг KLH (в 0,1 М PBS рН 7,4), растворенном в ПАФ в соотношении 1:1, в объеме 200 мкл/мышь.

Разрешающая инъекция KLH. На 14-й день после сенсибилизации.

Группа 1 получила внутрикожную инъекцию 50 мкл 0,1 М PBS рН 7,4 в правую заднюю лапу. В левую лапу вводят внутрикожно 50 мкл PBS.

Группы 2, 3, 4. Каждая группа получила внутрикожную инъекцию 20 мкг/мышь KLH в 0,1 М PBS рН 7,4 в правую заднюю лапу, в объеме 50 мкл. В левую лапу вводят внутрикожно 50 мкл PBS. Через 24 ч после разрешающей инъекции KLH, ГЗТ ответ проявлялся увеличением правой лапы, был измерен параметр, отражающий разницу в сумме толщины и ширины правой и левой лап (М), в различные временные точки после разрешающей инъекции (24, 48 ч), с помощью шкалы микрометра МК-25.

Увеличение реакции ГЗТ свидетельствует о стимуляции клеточного иммунитета, при этом происходит активация ТЫ клеток и макрофагов, которые продуцируют цитокины, направленные на изоляцию патогена или другого антигена. В результате образуется очаг временного воспаления, который завершается за 24-48 часов. Воспаление подключается к иммунному ответу в качестве дополнительной защитной реакции, способствующей фиксации, разрушению и элиминации патогена. В очаге воспаления в основном присутствуют макрофаги и лимфоциты, нейтрофилов практически нет. Полученные данные свидетельствуют о том, что средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 1 в данных условиях эксперимента усиливает реакцию ГЗТ примерно в 2 раза через 24 часа. Результаты отражены в таблице 1, а также на фиг. 7.

Через 48 часов, после разрешающей инъекции эффект сохранялся, а к 72 часам спадал. Результаты отражены в таблице 2, а также на фиг. 8.

Таким образом, на фоне введения средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 1 усиливается реакция ГЗТ, которая обладает пролонгированным действием в течение 48 часов, т.е. средство белково-пептидной природы, полученное по примеру 1 может способствовать активации клеточного иммунитета - стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов, выделению ими различных медиаторов, в итоге приводящих к воспалению, хемотаксису и удержанию в области повреждения макрофагов, фагоцитарная активность которых активируется. Все это выражается в воспалительной реакции продуктивного типа, максимум которой приходится на первые 48 часов, к третьим суткам воспаление проходит после элиминации антигена.

Полученные данные в условиях эксперимента через 24 часа относительно средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 2 указывают на снижение реакцию ГЗТ в 1,4 раза. Результаты отражены в таблице 1, а также на фиг. 7. Данный результат может говорить о тенденции влияния данного средства на снижение аллергенных свойств.

Через 48 часов, после разрешающей инъекции эффект сохранялся, а к 72 часам спадал. Результаты отражены в таблице 2, а также на фиг. 8.

Исходя из полученных данных по влиянию средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 1 на реакцию ГЗТ (усиление реакции ГЗТ, при условии его введения до сенсибилизации модельным антигеном) и данных по влиянию средства белково-пептидной природы, полученное по примеру 2 на реакцию ГЗТ (уменьшение реакции ГЗТ, при условии его введения до сенсибилизации модельным антигеном) можно сказать, что данные средства играют роль в процессах подготовки иммунной системы к ответу, а не участвуют уже на стадии развивающейся иммунной реакции (когда происходит активация и продукция лимфоцитов и выброс ими цитокинов). Результаты исследования показывают, что исследуемое средство обладает иммуномодулирующим действием.

Таким образом, заявленное средство белково-пептидной природы, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки:пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно, полученное путем экстракции измельченных частей растений до размера частиц от 1×1 см до 2×2 см водно-солевым раствором состава(г/л): NH4NO3 - 0,4-4, KNO3 - 0,51-4,04, СаСl2 × 2Н2O - 0,07-7, MgSO4 × 7Н2O - 0,123-1,23, KН2РO4 - 0,068-0,68, выдерживания в холодильнике при температуре 0-15°С в течение 1-5 часов, центрифугирования экстракта для удаления остатков тканей, осаждения белково-пептидной фракции 50-160% сульфатом аммония, очищением фракции супернатанта с использованием электрофореза и диализа, при этом электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААТ, далее фракции белков и пептидов элюируют с помощью физиологического раствора в течение 1-4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды в течение 1-4 суток при +4°С и затем полученные очищенные биологически активные фракции объединяют, разводят до концентраций 10^-7-10^-19 мг/мл обладает эффективным восстанавливающим структуру ткани действием.

Изобретение относится к пищевой, биотехнологической и медицинской промышленности, а именно к области получения из растений биологически активных веществ, в частности получения средства белково-пептидной природы, обладающего восстанавливающим структуру ткани действием, используемого в дальнейшем в качестве субстанции для фармацевтических и пищевых продуктов. Создано средство белково-пептидной природы, обладающее восстанавливающим структуру ткани действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки : пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно, полученную путем экстракции измельченных частей растений, где растения выбраны из листьев подорожника большого, алоэ вера, листьев лещины и ягод черники обыкновенной, до размера частиц от 1×1 см до 2×2 см водно-солевым раствором состава (г/л): NH₄NO₃ - 0,4-4, KNO₃ - 0,51-4,04, CaCl₂×2H₂O - 0,07-7, MgSO₄×7H₂O - 0,123-1,23, KH₂PO₄ - 0,068-0,68, выдерживания в холодильнике при температуре 0-15°С в течение 1-5 часов, центрифугирования экстракта для удаления остатков тканей, осаждения белково-пептидной фракции 50-100% сульфатом аммония, очищения фракции супернатанта с использованием электрофореза и диализа. При этом электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААГ, далее фракции белков и пептидов элюируют с помощью физиологического раствора в течение 1-4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды в течение 1-4 суток при +4°С и затем полученные очищенные биологически активные фракции объединяют, разводят до концентраций 10^-7-10^-19 мг/мл и используют в пищевой или фармацевтической продукции. Технический результат заключается в расширении арсенала средств белково-пептидной природы, обладающих эффективным восстанавливающим структуру ткани действием. 8 ил., 2 табл., 8 пр.

Средство белково-пептидной природы, обладающее восстанавливающим структуру ткани действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой смесь фракции белков с молекулярной массой в диапазоне 15-94 кДа и фракции пептидов с молекулярной массой в диапазоне 1-10 кДа с электрофоретической подвижностью Rf 0,9-1, в соотношении белки : пептиды от 10:1 до 1:10 соответственно, полученную путем экстракции измельченных частей растений, где растения выбраны из листьев подорожника большого, алоэ вера, листьев лещины и ягод черники обыкновенной, до размера частиц от 1×1 см до 2×2 см водно-солевым раствором состава (г/л): NH₄NO₃ - 0,4-4, KNO₃ - 0,51-4,04, CaCl₂ × 2H₂O - 0,07-7, MgSO₄ × 7H₂O - 0,123-1,23, KH₂PO₄ - 0,068-0,68, выдерживания в холодильнике при температуре 0-15°С в течение 1-5 часов, центрифугирования экстракта для удаления остатков тканей, осаждения белково-пептидной фракции 50-100% сульфатом аммония, очищения фракции супернатанта с использованием электрофореза и диализа, при этом электрофорез проводят в неденатурирующих условиях в 12,5-15% ПААГ, далее фракции белков и пептидов элюируют с помощью физиологического раствора в течение 1-4 суток при +4°С, отдиализовывают против дистиллированной воды в течение 1-4 суток при +4°С и затем полученные очищенные биологически активные фракции объединяют, разводят до концентрации 10^-7-10^-19 мг/мл.