СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАТАРАКТЫ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/44 A61K38/17 A61P27/02 

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии. Известно изобретение по патенту РФ №2071316 глазные капли для лечения катаракты МКИ 7 А61К 38/05, 9/08, А61Р 27/12, приоритет от 05.08.93 г.

Изобретение заключается в следующем: глазные капли для лечения катаракты, включающие лекарственное средство на основе пептида и воду, отличающееся тем, что в качестве пептида используют карнозин - (дипептид-бета-аланил-L-гистидин) при следующем соотношении ингредиентов, г: карнозин 1-5, вода до 100, при этом рН среды составляет 6,5-7,2.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой в качестве исходного сырья, высокая концентрация дипептида в лекарственном средстве, использование дипептида ограничивает антикатарактальные возможности препарата.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения катаракты из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют неповрежденные хрусталики, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают хрусталики в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония, фильтруют раствор, диализуют его в диализных мешках при 4-7°С до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют его методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после чего собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля при 4-7°С в течение 2-5 дней, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизованной водой, отдиализованный раствор регуляторного пептида повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Оптимальная концентрация пептида в растворе составляет 10^-10-10^-12 мг/мл. Способ характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой при температуре 25°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г на 1 л дистиллированной воды), выдерживают в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 730 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 2000 g 15 мин при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 7 дней при Т=6°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 7 дней, при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (рН 1,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при T=+7°C, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,95), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 7 дней при Т=+7°С, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-11 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+25°С и давлении 730 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-11 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+25°С и давлении 730 мм рт.ст., полученный раствор разливали во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.

Пример 2.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой при температуре 20°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г на 1 л дистиллированной воды), выдерживают в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 3000 g 10 мин при Т=20°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 5 дней при Т=+4°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 7 дней, при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции кислых белков (рН 3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+20°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 5 кДа в течение 10 дней при Т=+4°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-11 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+20°С и давлении 760 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-10 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+20°С и давлении 760 мм рт.ст., полученный раствор разливали во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 3.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой при температуре 23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г на 1 л дистиллированной воды), выдерживают в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 2500 g 15 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 6 дней при Т=+5°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 6 дней, при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +5°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (рН 2,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 10 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа в течение 10 дней при Т=+5°С, давлении 745 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-11 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+23°С и давлении 745 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-10 мг/мл и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+23°С и давлении 745 мм рт.ст., полученный раствор разливали во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1,5 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 4.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis неповрежденные хрусталики с сохраненной капсулой при температуре +20°С и давлении 740 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г на 1 л дистиллированной воды), выдерживают в водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl, 0,238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 740 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют полученный раствор тканевого экстракта при 3000 g 15 мин при Т=20°С и давлении 740 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата аммония в течение 7 дней при Т=+6°С, полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу и диализуют в диализных мешках до полного удаления ионов сульфата аммония в течение 10 дней, при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученный отдиализованный раствор далее высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое затем растворяют в деионизованной воде и разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3,5-10,0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН 1,0-3,0), объединяют их, диализуют в диализных мешках до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+7°С, давлении 740 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле при Т=20°С и давлении 740 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0,95), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 3 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 10 дней при Т=+4°С, давлении 740 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-11 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., далее в 100-мл мерную колбу вносят 10 мл раствора регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-11 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0,15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl - 8,75 г NaCl, 0,111 г CaCl₂, 0,4 г KCl на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при Т=+20°С и давлении 740 мм рт.ст., полученный раствор разливали во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0,22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 5.

Исследование влияния регуляторного пептида, который был выделен из хрусталика глаза быков, на катарактогенез проводят на крысиных хрусталиках. Хрусталики целыми культивируют в течение 8 суток in vitro. Регуляторный пептид добавляют в среду культивирования в конечной концентрации 10^-12 мг/мл. Помутнение хрусталиков in vitro вызывают с помощью изменения концентрации ионов кальция в среде культивирования или добавления в нее пероксида водорода. Проводят следующие серии опытов:

№1 - питательная среда 199;

№2 - питательная среда 199, содержащая Н₂О₂;

№3 - питательная среда 199, содержащая Н₂О₂ + регуляторный пептид;

№4 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂;

№5 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂ + регуляторный пептид.

За этот период времени в хрусталиках, культивируемых в бессывороточной питательной среде без добавления повреждающих агентов, полностью сохраняются их прозрачность и морфология.

В серии №1 помутнения хрусталиков не наблюдают в течение всего периода культивирования. В сериях №2 и 4 (действие повреждающих агентов) на 3-4 сутки культивирования наблюдают образование тотального помутнения хрусталиков.

В сериях №3 и 5 (совместное действие повреждающего агента и исследуемого регуляторного пептида) наблюдают незначительное помутнение хрусталиков в виде легкого флера.

Данные оценки степени помутнения хрусталиков в различных сериях, полученные с помощью визуального наблюдения, полностью совпадают с результатами спектрофотометрического исследования хрусталиков после их культивирования in vitro. Результаты свидетельствуют о том, что добавление в среду культивирования регуляторного пептида хрусталика способствует увеличению прозрачности хрусталиков приблизительно в два раза, по сравнению с хрусталиками, которые культивируют в среде, содержащей только катарактогенные агенты.

Пример 6.

Целые хрусталики, выделенные из свежеэнуклеированных глаз быка, культивируют в течение 8 суток in vitro. Регуляторный пептид, выделенный из хрусталиков быка, добавляют в среду культивирования в конечной концентрации 10^-12 мг/мл. Помутнение хрусталиков in vitro вызывают с помощью изменения концентрации ионов кальция в среде культивирования или добавления в нее пероксида водорода. Проводят следующие серии опытов:

№1 - питательная среда 199;

№2 - питательная среда 199, содержащая Н₂О₂;

№3 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂ + регуляторный пептид;

№4 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂;

№5 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂ + регуляторный пептид.

За время культивирования в хрусталиках, помещенных в бессывороточную питательную среду, которая не содержит повреждающих агентов, полностью сохраняются их прозрачность и морфология.

В серии №1 помутнения хрусталиков не наблюдают в течение всего периода культивирования. В сериях №2 и 4 (действие повреждающих агентов) на 3-4 сутки культивирования наблюдают образование тотального помутнения хрусталиков.

В сериях №3 и 5 (совместное действие повреждающего агента и исследуемого регуляторного пептида) наблюдают незначительное помутнение хрусталиков в виде легкого флера.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление в среду культивирования регуляторного пептида, выделенного из хрусталиков крупного рогатого скота, способствует увеличению прозрачности хрусталиков быка, по сравнению с хрусталиками, которые культивируют в среде, содержащей только катарактогенные агенты.

Пример 7.

Неповрежденные хрусталики, выделенные под контролем микроскопа из свежеэнуклеированных глаз лягушек Rana temporaria, культивируют в течение 8 суток in vitro. Регуляторный пептид добавляют в среду культивирования в конечной концентрации 10^-12 мг/мл. Помутнение хрусталиков in vitro вызывают с помощью изменения концентрации ионов кальция в среде культивирования или добавления в нее пероксида водорода.

Проводят следующие серии опытов:

№1 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ);

№2 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая Н₂O₂;

№3 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая Н₂O₂ + регуляторный пептид;

№4 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая CaCl₂;

№5 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая CaCl₂ + регуляторный пептид.

За время культивирования в хрусталиках, помещенных в бессывороточную питательную среду, которая не содержит повреждающих агентов, полностью сохраняются их прозрачность и морфология.

В серии №1 помутнения хрусталиков не наблюдают в течение всего периода культивирования. В сериях №2 и 4 (действие повреждающих агентов) на 3-4 сутки культивирования наблюдают образование тотального помутнения хрусталиков.

В сериях №3 и 5 (совместное действие повреждающего агента и исследуемого регуляторного пептида) наблюдают незначительное помутнение хрусталиков в виде легкого флера.

Полученные данные показывают, что добавление в среду культивирования регуляторного пептида, выделенного из хрусталиков быка, способствует увеличению прозрачности хрусталиков лягушек Rana temporaria, по сравнению с хрусталиками, которые культивировали в среде, содержащей только катарактогенные агенты.

Пример 8.

Выделенные под микроскопическим контролем из свежеэнуклеированных глаз лягушек Xenopus laevis хрусталики культивируют в течение 8 суток in vitro. Регуляторный пептид добавляют в среду культивирования в конечной концентрации 10^-12 мг/мл. Помутнение хрусталиков in vitro вызывают с помощью изменения концентрации ионов кальция в среде культивирования или добавления в нее пероксида водорода.

Проводят следующие серии опытов:

№1 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ);

№2 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая Н₂O₂;

№3 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая Н₂О₂ + регуляторный пептид;

№4 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая CaCl₂;

№5 - питательная среда 199 (70%) + кипяченая дистиллированная вода (30%) + Hepes buffer (1 мМ), содержащая CaCl₂ + регуляторный пептид.

За время культивирования в хрусталиках, помещенных в бессывороточную питательную среду, которая не содержит повреждающих агентов, полностью сохраняются их прозрачность и морфология.

В серии №1 помутнения хрусталиков не наблюдают в течение всего периода культивирования. В сериях №2 и 4 (действие повреждающих агентов) на 3-4 сутки культивирования наблюдают образование тотального помутнения хрусталиков.

В сериях №3 и 5 (совместное действие повреждающего агента и исследуемого регуляторного пептида) наблюдают незначительное помутнение хрусталиков в виде легкого флера.

Данные этого исследования показывают, что добавление в среду культивирования регуляторного пептида, выделенного из хрусталиков быка, способствует увеличению прозрачности хрусталиков лягушек Xenopus laevis, по сравнению с хрусталиками, которые культивируют в среде, содержащей только катарактогенные агенты.

Пример 9.

Больная А., 53 года. Диагноз: Начальная переднекортикальная катаракта с помутнением по швам коры. Показатели до лечения: OD vis=0,5 c+1,25=0,6.

Проходила курс лечения лекарственным средством, приготовленным, как описано в примере 1, инсциллировала в течение 2 недель по 1-2 капли 3 раза в день лекарственное средство для лечения катаракты.

Показатели после лечения: OD vis=0,5 c+1,25=0,8. Отмечено просветление кортикальных слоев с уменьшением помутнения по швам коры.

Пример 10.

Больная К., 64 года. Диагноз: Осложненная почти зрелая заднекапсулярная чашеобразная катаракта. Показатели до лечения: OD vis=0,4 c-1,75, диафрагма 3 мм=0,5.

Проходила курс лечения лекарственным средством, приготовленным, как описано в примере 1, инсциллировала в течение 2 недель по 1-2 капли 3 раза в день лекарственное средство для лечения катаракты.

Показатели после лечения: OD vis=0,5 c-0,75=0,6. После лечения отмечены устранение хрусталикового астигматизма и уменьшение миопизации.

Пример 11.

Больной Ш., 45 лет. Диагноз: Начальная кортикальная катаракта.

Показатели до лечения: OD vis 0,6 с+1,0=0,8.

Проходил курс лечения лекарственным средством, приготовленным, как описано в примере 1, инсциллировал в течение 2 недель по 1-2 капли 3 раза в день лекарственное средство для лечения катаракты.

Показатели после лечения: OD vis 0,8c+1,0=1,0. После лечения отмечено просветление кортикальных слоев хрусталика.

Предложенный способ позволяет использовать области хрусталика, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, повышать процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой. Полученное таким образом лекарственное средство обладает ярко-выраженным антикатарактальным действием, выражающимся в просветлении кортикальных слоев и уменьшении помутнения по швам коры хрусталика, а также позволяет уменьшить хрусталиковый астигматизм.

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии. Способ заключается в том, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных неповрежденные хрусталики, выдерживают их в водно-солевом растворе, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее путем растворения в 100% растворе сульфата, фильтруют, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, собирают фракции кислых белков, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов, полученный при этом водный раствор белка высушивают и очищают электрофорезом в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, элюируют низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95 деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, затем диализуют полученную фракцию в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизованной водой, сушат полученный регуляторный пептид и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Изобретение обеспечивает повышение процента выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделение высокоочищенных полипептидов с низкой молекулярной массой.

Способ получения лекарственного средства для лечения катаракты, характеризующийся тем, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных неповрежденные хрусталики, выдерживают их в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 ч, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее путем растворения в 100%-ном растворе сульфата аммония при 4-6°С в течение 5-7 дней, фильтруют раствор, диализуют его в диализных мешках при 4-7°С до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют его методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 ч, собирают фракции кислых белков, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках при 4-7°С в течение 10-14 дней, полученный при этом водный раствор белка высушивают и очищают электрофорезом в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, элюируют низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95 деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, затем диализуют полученную фракцию в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней деионизованной водой, сушат полученный регуляторный пептид и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе.