ШТАММ PAENIBACILLUS POLYMYXA ET3, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Группа изобретений относится к области агробиотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, экологии и касается получения нового штамма бактерий Paenibacillus polymyxa ET3, эффективного для улучшения роста и увеличения прироста массы растений, в особенности на начальных этапах развития, за счет способности штамма к фиксации атмосферного азота и образованию ауксинов (ключевое соединение - индолил-3-уксусная кислота) и стимуляции ризогенеза (формирование и рост корней). Предложен штамм и способ его культивирования с добавлением экзогенного триптофана для увеличения биосинтеза ауксинов (ключевое соединение - индолил-3-уксусная кислота) и высушивания полученной культуры с использованием носителя на основе аморфного диоксида кремния. Штамм, проявляющий высокую устойчивость к обработке протравителями (инсектициды, фунгициды, пестициды), может быть использован для получения биопрепарата и фитостимулятора злаковых культур.

Уровень техники

Многие бактерии, заселяющие ризосферу растений, зачастую относятся к группе PGPB (сокращение от plant growth-promoting bacteria - бактерии, стимулирующие рост растений). Они предоставляют растению перекрестную защиту от различных стресс-факторов, повышают резистентность к фитопатогенам и увеличивают продуктивность, улучшая минеральное питание или воздействуя на гормональный фон растения, например, образуя ауксины. Опосредованное влияние PGPB связывают с биологическим контролем и образованием внеклеточных ферментов и соединений, токсичных или сдерживающих рост болезнетворных организмов. PGPB представляют собой альтернативу химическим препаратам в сельском хозяйстве и вызывают особый интерес как фитостимуляторы и биоудобрения для повышения урожайности и адаптационной устойчивости растений, а также для нормализации общего микробиома почвы.

Выбор эффективного штамма PGPB, помимо собственно активных ростстимулирующих характеристик, определяется его конкурентоспособностью, устойчивостью к используемым в сельском хозяйстве химикатам, а также сохранению свойств при хранении и транспортировке.

Известны бактериальные штаммы и биопрепараты, которые могут проявлять различные положительные свойства для ускорения роста, улучшения развития и повышения продуктивности растений: так, Bacillus subtilis 8А (RU 2495119 C1, опубл. 10.10.2013) проявляет фунгицидную активность; Bacillus cereus 875 TS (RU 2624032 C1, опубл. 30.06.2017) - повышает энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы; штаммы Pseudomonas species ГКПМ-Оболенск В-6646 (RU 2451069 C1, опубл. 20.05.2012) и Acinetobacter species ГКПМ-Оболенск В-6645 (RU 2451068 C1, опубл. 20.05.2012) солюбилизируют фосфаты и обладают фунгицидной активностью, а биопрепарат на основе штамма Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 (RU 2390518 C1, опубл. 27.05.2010) позволяет повысить урожайность ячменя и пшеницы за счет накопления фиксированного азота и проявления свойств, усиливающих сопротивляемость растений к различным заболеваниям. Однако недостатком вышеуказанных штаммов является отсутствие данных о биосинтезе фитогормонов - стимуляторов роста растений, прежде всего, ауксина (индолил-3-уксусной кислота).

Известны штаммы бактерий Pseudomonas oryzihabitans (RCAM 04752) (RU 2735432 C1, опубл. 02.11.2020) и Variovorax paradoxus AV10 (RCAM 04753) (RU 2735430 C1, опубл. 02.11.2020), которые образуют ауксины и АЦК-дезаминазу и используются для стимуляции роста и урожайности растений в неблагоприятных агроэкологических условиях. Известен штамм Pseudomonas chlororaphis (RU 2588473 С1, опубл. 27.06.2016) для защиты растений от фитопатогенных грибов и бактерий, и стимуляции роста растений, образующий гетероциклический антибиотик феназин-1-карбоксамид и ауксины (11 мкг/мл). Недостатком вышеуказанных штаммов является то, что у данных штаммов не изучена их способность к азотфиксации, а также их потенциальная выживаемость при использовании протравителей зерна.

Известен штамм Achromobacter album ВНИИСХМ В-322Д для получения биопрепарата, повышающего сахаристость на 0,5-1,0% и урожай сахарной свеклы на 8-24% (RU 2035442 C1, опубл. 20.05.1995). Показана устойчивость этого штамма к инсектициду адифуру и контактному фунгициду ТМТД. Биосинтез β-индолилуксусной кислоты был изучен при использовании глюкозоаспарагиновой среды Муромцева с индукцией триптофаном, который добавляли из расчета 0,05 мас. Максимальные значения содержания ИУК составили 68,3 мкг/мл на 10-е сутки культивирования. Недостатком известного штамма можно считать то, что он усваивает только органические формы азота, поэтому эффективность его использования в обедненных азотом условиях трудно предсказать. Не указана стимулирующая активность штамма в отношении зерновых культур растений, что также ограничивает его применение для злаковых культур.

Известны разнообразные положительные свойства штамма Paenibacillus polymyxa E681, такие как несимбиотическая азотфиксация, биосинтез микробных фитогормонов, образование летучих компонентов, усиление иммунной системы растений и подавление широкого спектра фитопатогенов, что позволяет рассматривать этот штамм как высокоэффективное биоудобрение и фитостимулятор (Jeong H., Choi S-K., Ryu Ch-M., Park S-H. Chronicle of a soil bacterium: Paenibacillus polymyxa E681 as a tiny guardian of plant and human health // Frontiers in Microbiology, 2019, 10, 467). В отечественных научных изданиях также указывается на перспективность использования бактерий рода Paenibacillus для стимуляции роста растений и их защиты от фитопатогенов (Зунг Х.Т., Канарский А.В., Канарская З.А., Щербаков, А.В., Щербакова Е.Н. Перспектива применения бактерий рода Paenibacillus в промышленной биотехнологии для получения биопрепаратов сельскохозяйственного назначения // Вестник Поволжского ГТУ: Лес. Экология. Природопользование, 2020. 3, 47, 74-84).

В прикладном аспекте, однако, крайне мало информации доступно об использовании штаммов Paenibacillus polymyxa для фитостимуляции, причем основным свойством выбирается биосинтез антимикробных соединений. Также известны штамм Paeniacillus polymyxa ВКМ В-3504Д, образующий экзополисахарид леван (RU 2740710 С1, опубл. 20.01.2021).

Известны штаммы Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Bacillus mojavensis ВКПМ В-13580 и Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, которые в составе смеси (1:1:1) используют для разложения пожнивных остатков и защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур (RU 2035442 С1, опубл. 11.08.2021). Указано, что штамм Paenibacillus polymyxa способен к азотфиксации и образованию ауксиноподобных соединений, а также в составе смеси с другими бациллами стимулирует корнеобразование кресс-салата. Однако предлагаемая смесь не предназначена для стимуляции роста растений, а для разложения пожнивных остатков и борьбы с болезнями сельскохозяйственных растений.

Известны штаммы, принадлежащие к роду Paenibacillus и отличающиеся противогрибковыми свойствами, используемыми для биоконтроля и профилактики фитопатогенных инфекций растений, путем применения композиции с по меньшей мере одним выделенным бактериальным штаммом Paenibacillus (DSM 26969, DSM 26970, DSM 26971) или их бесклеточным экстрактом и по меньшей мере одним химическим пестицидом (WO2017/137351, 17.08.2017). Недостатком данной разработки является отсутствие видовой идентификации штаммов. Кроме антимикробной активности в работе не изучены другие свойства бактерий, направленные на стимуляцию роста растений.

Известен штамм бактерий Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-12259, стимулирующий рост вегетативной массы и корневой системы растений и повышающий урожайность сельскохозяйственных и декоративных культур, обладающий повышенной способностью к синтезу антимикробных соединений с широким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры (RU 2626543 C2, опубл. 28.07.2017). Штамм способен солюбилизировать в почве соединения фосфора и калия, а также активно участвует в процессе нитрификации, а также синтезирует бактериоцины, что позволяет использовать этот штамм в качестве удобрения для зерновых культур (пшеница, ячмень, овес, рожь, рис), картофеля, овощных, ягодных, цветочно-декоративных, зернобобовых и бобовых культур; хвойных, лиственных, декоративных пород деревьев и кустарников. Недостатком штамма является отсутствие данных по его способности к биосинтезу фитогормонов, азотфиксации или же устойчивости к протравителям.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм бактерии Azospirillum zeae OPN-14 (ВКПМ В-12542) в качестве биологического агента с ростстимулирующей и повышающей продуктивность растений активностями (RU 2678755 C1, опубл. 31.01.2019). Штамм синтезирует ауксин (ИУК) в концентрации 32-46 мкг/мл и проявляет цитокинин-подобную активность, фиксирует атмосферный азот (1269 нМ С₂Н₄/ч × мг сухой клеточной биомассы), устойчив к ряду гербицидов ("Ларен Про", "Кортес СП", "Аминка"), а также к фунгицидам, содержащим карбендазим. Ростстимулирующее воздействие A. zeae OPN-14 показано на примере стимуляции роста растений гороха, а также на оценке повышения урожайности подсолнечника и яровой пшеницы. Основным недостатком штамма является то, что он не устойчив к фунгицидам, имеющим в своем составе тебуконазол и пропиконазол, которые входят во многие наиболее эффективные фунгициды, используемые в сельском хозяйстве в настоящее время.

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет получения нового штамма бактерий, обладающего ростстимулирующими в отношении злаковых растений свойствами, включающими биосинтез ауксинов и способность к азотфиксации, а также устойчивость к современным фунгицидным и инсектицидным протравителям.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом является получение нового устойчивого к высушиванию в интервале 20-55°C природного штамма спорообразующих бактерий, устойчивого к протравителям зерна, для стимуляции прорастания и роста, увеличения фитомассы и улучшения ризогенеза злаковых культур (не менее чем на 10-20% от контроля на примере пшеницы), за счет фиксации атмосферного азота (не менее 4.0 мкг С₂Н₄/ мл ч) и микробного триптофан-зависимого биосинтеза фитогормона ауксина (не менее 15 мкг индолил-3-уксусной кислоты /мл), а также получение препарата выделенного штамма на основе аморфного диоксида кремния.

Технический результат достигается штаммом бактерии Paenibacillus polymyxa ET3, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-14461, используемый для стимуляции прорастания, роста и развития растений.

Также технический результат достигается препаратом, включающий штамм Paenibacillus polymyxa ET3 и аморфный диоксид кремния. Препарат получают смешение штамма Paenibacillus polymyxa ET3, выращенного на безазотной среде с добавлением L-триптофана, с аморфным диоксидом кремния и высушивание при температуре, не превышающей 55±2°C.

Технический результат также достигается применением штамма Paenibacillus polymyxa ET3 для стимуляции прорастания, роста и развития злаковых растений.

В качестве злаковых культур могут быть использованы пшеница, рожь, овес, рис, кукуруза, ячмень, просо.

Заявляемый бактериальный штамм Paenibacillus polymyxa ET3, выделен из ризопланы оранжерейной орхидеи Dendrobium moschatum (Buch.-Hum.) Sw., культивируемой в Фондовой оранжерее Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (ГБС РАН, г. Москва).

Штамм Paenibacillus polymyxa ET3 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером В-14461. Идентификацию проводили с использованием секвенирования по фрагменту 16S рРНК во ФГУП ГосНИИГенетика.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками:

Штамм Paenibacillus polymyxa ET3 хорошо растет на следующих средах (г/л): ТСА - триптозо-соевый агар (триптозо-соевый экстракт - 30.0, агар - 15.0); среда R2A (дрожжевой экстракт - 0.5; пептон - 0.5; казаминовые кислоты - 0.5; декстроза - 0.5; растворимый крахмал - 0.5; пируват натрия - 0.3; К₂НРО₄ - 0.3; MgSO₄ - 0,05; агар - 15,0); модифицированная среда Чапека (глюкоза - 20.0; K₂HPO₄ - 1.0; NaNO₃ - 2.0; MgSO₄ × 7H₂O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO₄ × 7H₂O - 0.01; дрожжевой экстракт - 0.5 г/л; pH 7.0-7.2).

Морфологокультуральные признаки

Клетки представлены грамположительными спорообразующими палочками; в фиксированных и окрашенных фуксином препаратах клетки расположены преимущественно одиночно. Эндоспоры термостабильны.

Морфологию колоний на плотных (агаризованных) питательных средах определяли после 3-5 суток роста при 30°C. Колонии на среде R2A округлые, гладкие, выпуклые, слизистой консистенции, имеющие диаметр 3-6 мм, мучнисто-белого цвета. Колонии на среде ТСА округлые или с неровным фестончатым краем, плоские, мучнисто-серого цвета; слизистая консистенция ярко не выражена, диаметр 3-4 мм. Субстрат не пигментируют. Для культуры характерна диссоциация (S, M диссоцианты).

При росте на синтетических и полусинтетических средах с высоким содержанием (20 г/л) углеводов: глюкозы, D-маннозы, сахарозы, а также органических спиртов: глицерина и маннита, штамм образует значительное количество внеклеточного матрикса, формирующего желеобразную консистенцию культуры.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб, микроаэрофил, мезофил с температурным оптимумом роста 26-30°C, хорошо растет от +15 до 37°C, отсутствует рост при температуре, превышающей 55±2°C.

Образует каталазу.

На солевом бульоне растет при 2%, некоторый рост отмечен при 5% NaCl, рост отсутствует при 10% NaCl. Оптимальное для роста значение pH 6.8-7.4.

В качестве единственного источника углерода использует глюкозу, сахарозу, декстрозу, галактозу, D-маннозу, D-мальтозу, глицерин, маннит, но не органические кислоты цитрат и пируват. Гидролизует казеин молока и крахмал, но не разжижает желатин. Ферментирует углеводы (глюкоза, сахароза, галактоза, манноза) с образованием кислот. Восстанавливает нитрат до нитрита.

Устойчивость к антибиотикам

Штамм проявляет устойчивость к цефалексину (30 мкг/мл) и ампициллину (10 мкг/мл). Чувствителен к тетрациклину (50 мкг/мл).

Принципиальные физиологические свойства

Штамм проявляет азотфиксирующую активность на агаризованных и жидких средах. Растет диазотрофно на среде Эшби с сахарозой в качестве углевода и микроэлементами по Федорову. Нитрогеназная активность подтверждена ацетиленовым методом Активность этого фермента составляет 4.3 :с 0.16 мкг С₂Н₄/ мл ч.

Штамм синтезирует индолиил-3-уксусную кислоту (ИУК, ауксин), синтез триптофан-зависимый.

Сведения по биологической безопасности

Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека. Не обладает фитопатогенной активностью, что подтверждено отсутствием мацерации на срезах клубней картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Условия хранения

Штамм поддерживают пересевами на свежие агаризованные питательные среды (например, R2A). Штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах при +4°C или в пробирках с короткоскошенной средой под слоем стерильного вазелинового масла. Штамм также хранится при 4°С в пробирках под ватно-марлевыми пробками.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 показан пример культурально-морфологических характеристик штамма Paenibacillus polymyxa ET3 при росте на различных средах, где (а) - колонии Paenibacillus polymyxa ET3 на агаризованной среде R2A; (б) - колонии Paenibacillus polymyxa ET3 на агаризованной среде TSA; (в) - казеинолитическая активность и зона гидролиза при росте по штриху на молочном агаре; (г) - споры штамма Paenibacillus polymyxa ET3 (шкала 1 мкм) при росте на среде R2A; (д) - рост культуры Paenibacillus polymyxa ET3 после обработки в течение 2 ч протравителем зерна и последующей инкубацией при 28°C.

На фиг. 2 показан пример колонизации корней штаммом Paenibacillus polymyxa ET3, способствующим лучшей адгезии и прикреплению частиц субстрата на корнях, где (а) - проросшие семена пшеницы; контроль - вода; (б) - проросшие семена пшеницы, инокулированные предлагаемым штаммом Paenibacillus polymyxa ET3, выращенным на безазотистой среде с добавлением L-триптофана.

На фиг. 3 приведен пример стимуляции роста по параметру высоты всходов семян пшеницы в вермикулите после предпосевной обработки предлагаемым штаммом бактерии Paenibacillus polymyxa ET3 по сравнению с контролем (замачивание в воде). Слева - семена пшеницы были бактеризованы в течение 1 часа культурой штамма Paenibacillus polymyxa ET3, выращенной на безазотистой среде с добавлением L-триптофана и высушенной при 55°C. Справа - семена пшеницы были замочены в течение 1 часа в водопроводной воде (контроль). Растения представлены на 8-е сутки после посева.

Осуществление изобретения

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Изучение азотфиксирующей активности штамма Paenibacillus polymyxa

Штамм сначала выращивали на агаризованной среде Эшби, не содержащей связанных форм азота (г/л): сахароза - 20.0; K₂HPO₄ - 0.2; MgSO₄ × 7H₂O - 0.2; NaCl - 0.2; K₂SO₄ - 0.1; CaCO₃ - 5.0; FeСl₃ - 0.1; раствор микроэлементов по Федорову - 1 мл/л; агар-агар (Oxoid) -15.0 г/л, вода - дистиллированная. Состав микроэлементов по Федорову, г/л: H₃BO₃ - 5.0; (NH₄)₂MoO₄ × 2H₂O - 5.0; ZnSO₄ × 7H₂O - 0.2; KI - 0.5; NaBr - 0.5; Al₂(SO₄)₃ × 18H₂O - 0.3; вода дистиллированная. Отдельные колонии засевали в жидкую среду того же состава и культивировали при 28°C в течение 4 суток в пенициллиновых флаконах объемом 15 мл с 5 мл среды.

Для определения активности нитрогеназы - ключевого фермента азотфиксации, использовали аналитический метод газовой хроматографии ацетиленовой редукции. Оценку проводили согласно ранее описанному методу (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Ватные пробки заменяли на герметичные резиновые, закатывали алюминиевым колпачками, вводили 1 мл ацетилена и инкубировали 3 часа при 28°C. Затем из флаконов отбирали 1мл пробы и измеряли содержание образовавшегося этилена на газовом хроматографе Кристалл 2000М (“Хроматэк”, Россия) с плазменно-ионизационным детектором (длина колонки - 1 м, диаметр - 3 мм, наполнитель - Porapak N (“Agilent Technologies”, США) 80/100, t° колонки - 60°С, t° детектора - 160°С, t° испарителя - 100°С, расход газа носителя (N₂) - 50 мл/мин, воздуха - 280 мл/мин, водорода - 28 мл/мин). В качестве отрицательных контрольных проб служила дистиллированная вода и среда без инокулята. Определение проводили в 3-кратной повторности и рассчитывали среднее арифметическое.

Для определения жизнеспособных клеток, образующих колонии (колониеобразующие единицы, КОЕ), из исходных опытных флаконов отбирали по 0,1 мл для получения десятичных разведений в стерильной водопроводной воде. Затем из каждого разведения высевали аликвоту посевного материала (50 мкл) на поверхность агаризованной среды, растирая шпателем. Чашки инкубировали при 28°C до появления колоний, проводят их количественный учет.

Штамм Paenibacillus polymyxa ET3 обладает высокой нитрогеназной активностью, которая составляет 4.3 :с 0.16 мкг С₂Н₄/ мл ч × 10⁷ КОЕ/мл.

Пример 2. Культивирование штамма Paenibacillus polymyxa ET3 и определение содержания ауксина - индолил-3-уксусной кислоты в среде культивирования

Штамм культивировали на плотной (агаризованной) среде R2A в течение 3-4 суток, затем биомассу снимали бактериологической петлей и вносили в колбы с 50 мл жидкой среды следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 0.5; KH₂PO₄ - 0.3; MgSO₄ · 7H₂O - 0.1; NaCl - 0.5; CaCl₂ ⋅ 6H₂O - 0.03; дрожжевой экстракт - 0.5; глюкоза - 5.0; вода - водопроводная. В качестве индуктора биосинтеза ИУК в среду вносили L-триптофан в количестве 200-400 мкг/мл. Культивировали при 28°С на качалке (100 об/мин) 5 суток.

Количественный анализ ауксина проводили колориметрически (Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indole-acetic acid // Plant Physiol. - 1951. - V. 26. - P. 192-195) на спектрофотометре (КФК-3-01-«ЗОМЗ») после 5 сут культивирования с использованием реактива Сальковского (0,05М FeCl₃ в 35% HClO₄), который добавляли из расчета 1:1 (по объему) к супернатанту, полученному после центрифугирования культуры (10 мин при 10 000g). Пробы инкубировали в темноте при 30°С в течение 15 мин. Контролем служила неинокулированная среда с добавлением реактива. Наличие ИУК проявлялось в розовом (малиновом) окрашивании. Оптическую плотность окрашенных проб измеряли при 530 нм, в кювете с длиной оптического пути 0.5 см. Концентрацию ИУК определяли по калибровочному графику, построенному в диапазоне концентраций ИУК от 1 до 50 мкг/мл.

Таблица 1. Продукция ауксинов предлагаемым штаммом бактерии Paenibacillus polymyxa ET3 в условиях индукции биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты триптофаном Содержание L-триптофана в среде, мкг/мл Ауксины, мкг/мл 200 16.6 :с 2.6 400 31.8 :с 4.2

Из таблицы 1 видно, что биосинтез ауксина культурой Paenibacillus polymyxa ET3 составлял 16.6 мкг/мл при использовании 200 мкг/мл экзогенного триптофана и 31.8 мкг/мл при добавлении 400 мкг/мл L-триптофана. Известно, что штаммы псевдомонад, например, Pseudomonas chlororaphis BKM B-2956D и Pseudomonas aureofaciens BS1393, которая используется в коммерческом препарате "Псевдобактерин-2", образовывали 11.2 и 16.4 мкг/мл ауксина (gатент RU 2588473, опубл. 27.06.2016). Таким образом, использование экзогенного триптофана в количестве 200 мкг/мл достаточно для биосинтеза необходимых ростстимулирующих количеств ауксина предлагаемым штаммом Paenibacillus polymyxa ET3.

Пример 3. Оценка выживаемости штамма Paenibacillus polymyxa ET3 при воздействии протравителей зерна

Для эффективной колонизации бактериями зерен злаков, засеваемых в почву и обязательно проходящих предпосевную обработку протравителями, необходимо определить устойчивость предлагаемого штамма к воздействию токсикантов (гербицидов, фунгицидов). Для этого были приготовлены и объединены рабочие растворы протравителей в соответствии с инструкцией производителя. Действующие вещества в используемых протравителях - это дифеноконазол (67 г/л), имидаклоприд (333 г/л), тебуконазол (17 г/л) и флудиоксонил (75 г/л). Культуру штамма, выращенную на среде R2A, вносили в пробирки с рабочим раствором протравителей, перемешивали на вортексе и оставляли на 2 часа, после чего высевали аликвоту (50 мкл) на поверхность агаризованной среды, растирая шпателем, непосредственно из исходных растворов, а также из их десятичных разведений, полученных с помощью разведения в стерильной водопроводной воде (1:9 по объему). В качестве контроля использовали стерильную водопроводную воду. Подсчет колониеобразующих единиц проводили через 24-48 ч после инкубирования засеянных чашек при 28°С. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Оценка жизнеспособности клеток штамма Paenibacillus polymyxa ET3 в растворах протравителей Рабочий раствор Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) после обработки / мл рабочего раствора Протравитель
(пестицид, фунгицид, инсектицид) 5.8 × 10⁶ Контроль (вода) 1.9 × 10⁷

Согласно полученным результатам, использованные протравители не оказывали какого-либо видимого ингибирования на рост штамма Paenibacillus polymyxa ET3 и не оказывали токсичного эффекта на этот микроорганизм. Культура сохранила жизнеспособность, лишь незначительно сократив общую численность жизнеспособных бактерий. Устойчивость Paenibacillus polymyxa ET3 к неоникотиноидам (имидаклоприд) и триазолам (тебуконазол и дифеноконазол) дает преимущество и обеспечивает эффективность использования этой культуры за счет конкурентного преимущества в отношении других бактерий, угнетаемых действием этих пестицидов. Так, ранее описанный штамм Azospirillum zeae OPN-14, стимулирующий рост растений, оказался неустойчивым к тебуконазолу (Патент РФ RU 2678755 C1, опубл. 31.01.2019, Бюл. № 4). Учитывая, что исследованные вещества входят в основные используемые в сельском хозяйстве препараты протравителей, устойчивость к ним штамма Paenibacillus polymyxa ET3 делает его приоритетным для широкого и масштабного применения.

Пример 4. Оценка выживаемости штамма Paenibacillus polymyxa ET3 после высушивания культуры в жидкой среде

Для применения штамма не менее важным является аспект сохранения жизнеспособности организма при высыхании. Этот фактор определяет сохранность самого препарата, а также устойчивость микроорганизма к высыханию, находясь в почве. Для этих целей жидкая культура штамма Paenibacillus polymyxa ET3 была подвергнута высушиванию при различных температурах (комнатная, 30°С и 55°С). Для этого культуру выращивали в жидкой среде (состав указан в примере 2) в течение 48 ч, аликвоту (4 мл) наливали в открытые чашки Петри (диаметр 40 мм) и оставляли открытыми на сутки. Для применения готовили рабочий раствор, добавляли стерильную водопроводную воду (4 мл), получая исходную суспензию, из которой готовили последовательные десятичные разведения для высева на поверхность питательной среды и подсчета КОЕ. Чашки инкубировали до появления отдельно различимых колоний, которые подсчитывали. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Выживаемость штамма Paenibacillus polymyxa ET3 при высушивании жидкой культуры на воздухе при различных температурах Температура воздуха, °С Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) после высушивания / мл посевного материала 20 :с 2 1.5 × 10⁵ 30 :с 2 1.2 × 10⁶ 55 :с 2 2.3 × 10⁶

Согласно приведенным данным, культура Paenibacillus polymyxa ET3 засухоустойчива и сохраняет жизнеспособность при высушивании на воздухе в ходе естественного испарения жидкости. При этом более быстрый процесс высыхания при температуре 55 ± 2°С способствует большей выживаемости микроорганизмов. Таким образом, предлагаемый штамм устойчив к высушиванию в жидкой культуре, что облегчает его транспортировку и последующее применение на месте бактеризации семян, а также способствует выживанию при недостатке влаги и пересыханию субстрата (почва).

Пример 5. Бактеризация семян пшеницы для стимуляции прорастания

Семена мягких сортов пшеницы замачивали на 1 час в различных вариантах культуры, выращенной в жидкой среде (состав указан в примере 2). Для этого использовали культуры, выращенные на питательной среде с добавлением L-триптофана. Также использовали варианты культуры, смешанной с носителем (аморфный диоксид кремния), для чего в чашки (диаметр 40 мм) вносили 4 мл культуры, к которой прибавляли 1,4 г порошкового носителя - аморфный диоксид кремния и равномерно перемешивали до получения консистенции густой сметаны. Аморфный диоксид кремния добавляют из расчета, что на 1 мл культуральной жидкости используют 0,2 - 0,5 г аморфного диоксида кремния. Семена замачивали в жидкой культуре или раскладывали в культуру с носителем, оставляя на 1 час. Ограниченное до 1 часа время инкубации выбрано с целью не увеличивать дополнительное время предпосевной обработки семян зерновых, которое обычно затрачивается при агротехнике.

После обработки культурой семена засевали в горшки с вермикулитом с целью избежать любого дополнительного влияния на рост семян за счет биоты и питательных соединений, содержащихся в почвенном субстрате. Семена в количестве 9 штук засевали в один горшок, опыт ставили в трех повторностях. Контролем служили семена, замоченные в водопроводной воде, а также семена, помещенные в носитель (аморфный диоксид кремния в воде). Растения выращивали при температуре 20-22°С и продолжительности освещения 14 часов в течение двух недель. Полив осуществляли водопроводной отстоянной водой по мере необходимости. Анализ роста семян и действия штамма по стимуляции прорастания и развития семян проводили, измеряя длину побега, а также определяя массу корней и побегов.

Корни растения освобождали от частиц вермикулита, сначала споласкивая растения в воде, и оставляя прикрепившиеся к корням частицы за счет колонизационной активности штамма Paenibacillus polymyxa ET3 (Фиг. 2). Затем корни полностью освобождали от любых частиц, отмывали в воде и просушивали между слоями фильтровальной бумаги, после чего взвешивали. Результаты представлены в таблицах 4 и 5, а также на фиг. 2 и 3.

Штамм показал свою эффективность по стимуляции ризогенеза и развития пшеницы на ранних этапах роста в течение первых двух недель. Было использовано несколько схем опыта:

1. Использовали штамм Paenibacillus polymyxa ET3, выращенный на среде без азота с добавлением триптофана. Культуру смешивали с носителем (аморфный диоксид кремния) и высушивали при 55°С в течение суток, после чего добавляли водопроводную воду (методика описана в примере 3) до исходного объема, в который затем помещали семена на 1 час. В качестве контроля семена замачивали в водопроводной воде, а также помещали на то же время в суспензию аморфного диоксида кремния в водопроводной воде. Результаты представлены в таблице 4 и на фиг. 3.

Дополнительное исследование выживаемости штамма при его высушивании при 55±2°С на носителе показало, что численность популяции бактерий не уменьшилась ни на порядок и составила без высушивания и нанесения на носитель 1,9 × 10⁷ КОЕ/мл, а после высушивания на аморфном диоксиде кремния - 1.2 × 10⁷ КОЕ/мл. Таким образом, использование носителя при высушивании культуры позволяет сохранить жизнеспособность бактерий и их функциональную активность. В результате наблюдали стимуляцию развития растений, выражающуюся в увеличении их высоты на 16.2%, а массы надземной части и корней - на 20%. При этом использование культуры Paenibacillus polymyxa ET3 позволяет преодолеть некоторый ингибирующий эффект самого носителя (аморфный диоксид кремния).

2. Использовали штамм Paenibacillus polymyxa ET3, выращенный на среде без азота без и с добавлением триптофана в качестве индуктора биосинтеза ИУК. Культуру смешивали с носителем (аморфный диоксид кремния) без дополнительного высушивания. Семена обрабатывали в течение 1 часа. В качестве контроля семена замачивали в водопроводной воде, а также помещали на то же время в суспензию аморфного диоксида кремния в водопроводной воде. Результаты представлены в таблице 5.

Согласно полученным результатам, даже без высушивания, носитель сохраняет ингибирующий эффект на всхожесть семян, который нивелируется при бактеризации семян штаммом Paenibacillus polymyxa ЕТ3. По сравнению с контролем (вода) предпосевная инокуляция семян культурой Paenibacillus polymyxa ЕТ3 оказывала некоторое положительное влияние на рост растений без индукции триптофаном, что может быть связано с азотфиксирующей активностью штамма. Однако наилучшие результаты бактеризацией штаммом Paenibacillus polymyxa ЕТ3 получены именно при внесении в среду L-триптофана. Высота обработанных растений на 8.5%, а масса надземной части - на 7% больше, чем в водном контроле. Наибольшее влияние отмечено на симуляцию ризогенеза растений и увеличение биомассы их корней, которая составила 36.8%, подтверждая эффективность и биологическую активность микробного ауксина.

На фиг. 3 показан пример колонизации корней пшеницы штаммом Paenibacillus polymyxa ЕТ3, выращенном на среде с внесенным триптофаном. В отличие от контроля, бактеризация растений культурой, образующей внеклеточный матрикс, способствует не только более успешной колонизации корней, но и повышению адгезии частиц почвы (на примере вермикулита) вокруг корней, что создает локальную микросреду для лучшей адаптации микробно-растительного консорциума к внешним факторам окружающей среды, в том числе при воздействии стресс-факторов (например, недостаток влаги).

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста и развития сельскохозяйственных растений на примере зерновых культур (пшеница). Он достигается тем, что для обработки растений используется штамм бактерии Paenibacillus polymyxa ET3, обладающий ярко выраженной биологической активностью за счет биосинтеза фитогормона ауксина, стимулирующего образование и рост корней, за счет улучшения минерального питания благодаря свойству диазотрофии - фиксации молекулярного азота воздуха, штамм обладает устойчивостью к химическим протравителям (пестицидам), применяемым в сельском хозяйстве, а также устойчивостью и сохранением жизнеспособности и ростстимулирующей активности при высушивании на воздухе, в том числе при температуре 55±2°С.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Paenibacillus polymyxa, имеющий способность стимулировать рост семян зерновых растений, устойчивый к действию протравителей, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером В-14461. Штамм Paenibacillus polymyxa ET3 за счёт своей способности к азотфиксации и образованию ауксинов может быть использован в качестве бактериального препарата и фитостимулятора. Способ его использования предполагает выращивание в среде с добавлением L-триптофана, а также последующее высушивание с использованием неорганических сорбентов (носитель) на основе аморфного диоксида кремния. Изобретение позволяет улучшить рост растений и увеличить прирост массы растений. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Штамм бактерий Paenibacillus polymyxa ET3, депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ B-14461, обладающий свойством стимуляции прорастания и роста растений пшеницы.

2. Препарат, обладающий стимулирующим рост растений пшеницы свойством, включающий штамм по п. 1, выращенный на безазотной среде с добавлением L-триптофана и полиморфного диоксида кремния.

3. Применение штамма по п. 1 для стимуляции прорастания, роста и развития растений пшеницы.