Смесь бактериальных штаммов, обладающая азотфиксирующей, фосфор- и калиймобилизующей активностью Российский патент 2022 года по МПК C05F11/08 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Касается новой композиции бактериальных штаммов, обладающих азотфиксирующей, фосфор- и калиймобилизующей активностью, а также фитопротекторными и ростостимулирующими свойствами.

Постоянно растущая потребность в высококачественных продуктах питания и сырье для промышленности вызывает острую необходимость разработки и внедрения научно обоснованных и устойчивых приемов, обеспечивающих повышение плодородия почв, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции. В связи с этим являются актуальными работы, направленные на разработку приемов биологизации земледелия, широкого использования микробиологических препаратов на основе N-, P-, K-мобилизаторов, что позволит существенно уменьшить экологическую нагрузку на агроландшафты, рационально использовать плодородие почв, регулировать почвенные микробиологические процессы, повысить роль биологического азота и фосфора в питании растений, мобилизовать запасы калия и получать экологически чистую продукцию.

Известен штамм Paenibacillus mucilaginosus (RU2626543), депонированный в ВКПМ под номером В-12259, используемый в качестве удобрения и агента биологического контроля в профилактике или лечении грибкового заболевания растений.

Также известен препарат для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, обладающий фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в составе он содержит культуральные жидкости штаммов бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicacearum ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008 в соотношении 1:1:1:1:1 с титром бактерий не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл (RU2595405).

Общим недостатком известных биодобавок, используемых в качестве удобрений и/или для защиты растений от фитопатогенов, является отсутствие комплексного действия в обеспечении азотного, фосфорного и калиевого питания растений, а также существует ряд других недостатков, связанных с недостаточно высокой эффективностью, трудоемкостью получения удобрений и узким спектром подавления фитопатогенной микрофлоры.

Технической задачей изобретения является разработка нового микробиологического удобрения для сельского хозяйства, предназначенного для внесения в почву, предпосевной (предпосадочной) обработки семян (посадочного материала), некорневых подкормок сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте для обогащения азотом, фосфором и калием.

Поставленная задача достигается за счет использования смеси бактериальных штаммов для улучшения азотно-фосфорно-калиевого питания, защиты от фитопатогенов и стимулирования роста и развития сельскохозяйственных растений, которая состоит из культур Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр жизнеспособных клеток не менее 1⋅10⁹ КОЕ/мл.

Штамм Bacillus aryabhattai депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика с регистрационным номером ВКПМ В-13579; штамм Paenibacillus polymyxa депонирован в Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-747; штамм Paenibacillus mucilaginosus депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика с регистрационным номером ВКПМ В-13582.

Препарат получают путем смешивания жидких суспензий раздельно выращенных бактерий Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582 в соотношении 1:1:1.

Свойства штаммов-продуцентов:

Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: крупные палочки бациллярной формы с округлыми концами; споры эллипсовидные; окраска по Граму - положительная; при культивировании на ГМФ образует бежевые блестящие колонии с ровным краем, 4-6 мм в диаметре; растворяет неорганические фосфаты (тест на среде Пиковской).

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на ГМФ-агаре или среде R2A (pH 7,0-7,2).

3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду ГМФ или R2A.

4. Продукт, синтезируемый штаммом: фосфатмобилизатор, продуцент ауксин подобных веществ.

Paenibacillus polymyxa ВКМ-747

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: палочки бациллярной формы с округлыми концами; споры овальные, раздувающие спорангий; окраска по Граму - положительная; при культивировании на ГМФ образует кремовые полупрозрачные блестящие колонии, 3-5 мм в диаметре; на R2A - белые блестящие слизистые колонии, с ровным краем, выпуклые; фиксирует атмосферный азот (рост на безазотистой среде Эшби).

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на среде R2A или ГМФ агаре (pH 7,0-7,2).

3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду R2A.

4. Продукт, синтезируемый штаммом: Азотфиксатор, продуцент антимикробных метаболитов (полимиксин), ауксин подобных веществ, эндо-1,4-β-глюканазы, протеаз, амилаз, целлюлаз.

Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582

1. Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма: палочки бациллярной формы с округлыми концами, образует капсулу; споры эллипсовидные. Окраска по Граму - положительная; при культивировании на R2A образует прозрачные слизистые блестящие выпуклые колонии с ровным краем, 4-6 мм в диаметре; растворяет силикаты (тест на среде Александрова).

2. Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма: хранится в холодильнике при температуре 3±2°С в пробирках на среде R2A (pH 7,0-7,2).

3. Способ обнаружения микроорганизма в микробных ассоциациях окружающей среды и биоматериале: Метод предельных разведений с последующим высевом на агаризованную среду R2A.

4. Продукт, синтезируемый штаммом: Калиймобилизатор, продуцент антимикробных метаболитов, ауксин подобных веществ.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для лабораторных и полевых экспериментов, отраженных в примерах 1-7, предлагаемые бактериальные штаммы выращивали раздельно на жидких питательных средах в лабораторных ферментерах Biostat A (Sartorius, Германия) до достижения максимального выхода спор, после чего смешивали в соотношении 1:1:1, при этом титр бактериальной смеси составлял не менее 1,0⋅10⁹ КОЕ/мл.

Пример 1: Ростостимулирующая активность заявляемой смеси штаммов (см. табл. 1)

Ростостимулирующую активность смеси штаммов анализировали в вегетационных опытах на семенах пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Дарья, ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Таловский и овса (Avena sativa L.) сорта Яков. Семена обрабатывали рабочим раствором смеси штаммов (расход - 1 л/т, расход рабочей жидкости - 10 л/т) и высевали в горшки, заполненные торфяным грунтом. Повторность 4-кратная. В контрольном варианте семена обрабатывали дистиллированной водой. Семена выращивали при температуре 24°C и 16/8-часовом периоде освещения в течение 36-68 суток, в течение которых фиксировали всхожесть и высоту растений, а по окончании опыта длину корневой системы, сухую и сырую биомассу и сравнивали с контрольными значениями.

Таблица 1 - Результаты анализа ростостимулирующей активности смеси штаммов Вариант Всхожесть, % Средняя длина побегов, см Средняя длина корней, см Средняя биомасса, г/раст Сырая Сухая Пшеница «Дарья» (36 суток выращивания) Контроль 93 39,4±1,1 17,2±0,5 0,943 0,217 Смесь штаммов 93 41,3±0,8 18,8±0,8 1,018 0,234 Ячмень «Таловский» (36 суток выращивания) Контроль 75 31,6±1,3 18,6±0,9 1,313 0,167 Смесь штаммов 88 38,6±1,4 19,8±1,4 1,432 0,219 Овес «Яков» (68 суток выращивания) Контроль 80 71,2±1,9 19,7±1,1 6,46 1,42 Смесь штаммов 80 72,9±1,1 29,6±2,8 8,16 1,65

Было показано, что анализируемая смесь бактериальных штаммов обладает рострегуляторным действием, выражающемся в стимулировании роста побегов и корневой системы растений, а также увеличении их биомассы.

Пример 2: Фунгицидная активность смеси штаммов (см. табл. 2)

Фунгицидную активность смеси штаммов оценивали методом двухслойного агара с использованием 5 фитопатогенных грибов. Для опыта предварительно разливали по чашкам Петри стерильный 1,5%-ый по агару картофельно-сахарозный агар (КСА). Для анализа готовили суспензию спор и мицелия грибов. Для этого 1/8 часть агара, засеянного грибом, переносили в стерильную чашку Петри, добавляли 10 мл стерильной воды и смывали конидии и мицелии стерильным шпателем. После чего добавляли 20 мкл полученной суспензии в 4,98 мл остуженной до 45°С среды 1,0% КСА, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. После застывания в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл смеси культуральных жидкостей штаммов. Посевы культивировали 4-7 суток (в зависимости от скорости роста грибов) при температуре 20°C, после чего фиксировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогенов.

Обнаружено, что заявляемая бактериальная смесь обладает антагонистической активностью и способна ингибировать рост фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания сельскохозяйственных растений.

Таблица 2 - Результаты анализа фунгицидной активности Фитопатоген Средний диаметр зоны подавления роста фитопатогена, мм Смесь штаммов Контроль Alternaria tenuis 34,4 0 Fusarium graminearum 58918 25,2 0 Fusarium sporotrichioides 58871 31,5 0 Fusarium oxysporum F-55071 27,8 0 Microdochium nivale 31,1 0

Пример 3: Бактерицидная активность смеси штаммов (см. табл. 3)

Бактерицидную активность смеси штаммов проверяли методом диффузии в двухслойный агар. Предварительно разливали по чашкам Петри по 20 мл стерильной среды КСА с 1,5% агара. Для анализа готовили суспензию бактериальных фитопатогенов (культивирование на жидком бульоне ГМФ в шейкере-инкубаторе при постоянном перемешивании 220 об/мин и температуре 30°C в течение 24 ч). После чего добавляли 1 мл полученной суспензии в 4 мл остуженной до 45°С среды КСА с 1% агара, тщательно перемешивали и разливали вторым слоем. После застывания в агаре стерильным пробойником делали «лунки», в которые вносили по 100 мкл смеси культуральных жидкостей штаммов. Посевы культивировали 24 ч при температуре 30°C, после чего фиксировали наличие или отсутствие зон угнетения роста фитопатогена.

Было выявлено, что анализируемая бактериальная смесь обладает также и бактерицидной активностью и способна защищать сельскохозяйственные культуры от развития бактериозов.

Таблица 3 - Результаты анализа бактерицидной активности Фитопатоген Средний диаметр зоны подавления роста фитопатогена, мм Смесь штаммов Контроль Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 101 14,5 0 Pectobacterium carotovorum 480 13,8 0 Pseudomonas syringae БИМ B-280 21,0 0 Pseudomonas syringae 14,3 0 Pseudomonas syringae pv. tomato 15,5 0 Xanthomonas arboricola B-614 19,0 0 Xanthomonas arboricola B-620 14,5 0 Xanthomonas arboricola B-624 12,8 0 Xanthomonas arboricola B-628 45,0 0 Xanthomonas campestris B-610 13,0 0 Xanthomonas pisi B-633 15,0 0 Xanthomonas vasicola B-618 24,5 0

Пример 4: Изучение совместимости бактериальной смеси штаммов с химическими протравителями (см. табл. 4 и 5)

Для изучения возможности совместного применения заявляемой смеси штаммов с химическими протравителями проводили настоящий опыт. В работе использовали протравитель на основе прохлораза, имазалила и тебуконазола (100 + 25 + 15 г/л) в форме микроэмульсии и анализируемую смесь штаммов с общим титром 2,9⋅10⁹ КОЕ/мл. Из указанных препаратов готовили баковые растворы, выдерживали в течение фиксированного времени и анализировали изменение титра жизнеспособных бактериальных клеток методом последовательного разведения бакового раствора с последующим поверхностным посевом на среду R2A.

Показано, что химический протравитель не оказывает негативного влияния на бактериальные штаммы B. aryabhattai ВКПМ В-13579, P. polymyxa ВКМ В-747, P. mucilaginosus ВКПМ В-13582, и их титр в баковой смеси с пестицидом сохраняется на уровне контроля в течение всего периода наблюдения.

Таблица 4 - Результаты анализа совместимости смеси штаммов с химическим протравителем Вариант Расход препарата и рабочего раствора Средний титр жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в рабочем растворе после экспозиции 0 ч 2 ч 4 ч 6 ч Смесь штаммов
(без протравителя) 1,0 л/т - 10 л/т 1,0⋅10⁸ 1,2⋅10⁸ 1,0⋅10⁸ 1,1⋅10⁸ Смесь штаммов + протравитель, МЭ 1,0 + 1,5 л/т - 10 л/т 1,9⋅10⁸ 2,1⋅10⁸ 1,8⋅10⁸ 2,7⋅10⁸

Дополнительно анализировали рострегуляторное влияние бакового раствора смеси штаммов с химическим протравителем в условиях вегетационного опыта на овсе (Avena sativa L.) сорта Яков. Условия проведения эксперимента - см. пример 1.

Выявлено, что совместное применение бактериальной смеси с протравителем положительно влияет на рост и развитие растений. Так, отмечалось увеличение всхожести, значительная прибавка роста растений, а также увеличение сухой и сырой биомассы.

Таблица 5 - Результаты анализа совместимости смеси штаммов с химическим протравителем в вегетационном опыте на овсе сорта Яков Вариант Всхожесть, % Средняя длина побегов, см Средняя длина корней, см Средняя биомасса, г/раст 14 сутки 64 сутки 64 сутки сырая сухая Контроль 96,3 29,2±0,9 55,1±2,4 17,7±0,8 2,55 0,282 Смесь штаммов + протравитель, МЭ (1,0 + 1,5 л/т) 100 29,7±0,6 63,4±1,3 17,7±0,6 2,78 0,312

Таким образом, было доказано возможное применение заявляемой смеси штаммов совместно с химическими протравителями в баковых растворах, характеризующееся отсутствием негативного влияния на титр жизнеспособных клеток штаммов, входящих в состав анализируемого консорциума, а также способствующее улучшению роста и развития сельскохозяйственных растений.

Пример 5: Изучение накопления свободных аминокислот и амидов в тканях растений под влиянием смеси штаммов (см. табл. 6)

Была проведена оценка количественных изменений в составе свободных аминокислот в листьях яровой пшеницы сорта Икар под влиянием обработки семян заявляемой смесью штаммов в условиях полевого опыта (по методике В.В. Церлинг). Для этого на сегменты обеззоленных фильтров наносили пробу сока 5 молодых листьев пшеницы из разных вариантов, а также образцовые растворы аминокислот, используемые в качестве метчиков. Связь интенсивности окраски и размера пятна с количеством аминокислот и амидов оценивали с помощью шкалы образцовых растворов метчиков. Дополнительно на хроматограммах листового сока оценивали площадь, форму и интенсивность окраски хлорофилловой «дуги», образовавшейся при разгонке хлорофиллового пятна в системе растворителей (н-бутанол + уксусная кислота).

Результаты хроматографического анализа степени накопления в листовом соке всходов пшеницы аминокислот и амидов, а также активности синтеза хлорофилла представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Результаты хроматографического анализа степени накопления аминокислот, амидов и хлорофилла в листьях всходов яровой пшеницы Вариант S_{пятен общая}, мм² R_f, мм S_{пятна пролина}, мм² S _{пятна хлорофилла}, мм² Контроль 363,5 26,8 47,4 68,2 Смесь штаммов
(1,0 л/т) 1538,0 55,2 189,0 153,6

Наиболее высокий уровень накопления аминокислот и амидов в тканях листьев всходов пшеницы обеспечила анализируемая смесь штаммов. Помимо этого увеличивалась подвижность аминокислотных пятен на хроматограммах (величина Rf). Также обработка семян пшеницы смесью штаммов способствовала резкому повышению концентрации пролина в листьях растений. В условиях острой засухи это чрезвычайно важно, так как пролин является протекторной аминокислотой, защищающей в высоких концентрациях растения от теплового шока. Также было выявлено значительное увеличение размеров пятен хлорофилла в варианте обработки семян смесью штаммов (153,6 мм²), при этом в контроле средний размер хлорофиллового пятна составил всего 68,2 мм².

Таким образом, было доказано положительное действие предлагаемой смеси штаммов на накопление аминокислот, амидов и хлорофилла, непосредственной влияющих на физиологию растений и их продуктивность.

Пример 6: Диагностика азотно-фосфорно-калиевого питания растений после обработки семян смесью штаммов (см. табл. 7-9)

В анализе использовали индикаторные органы (листья) яровой пшеницы сорта Икар для определения обеспеченности растений биогенными элементами (N, P, K) в разные фазы вегетации. Из каждого варианта отбирали свежие пробы листьев пшеницы, из которых выжимали сок с помощью ручного пресса Магницкого, который наносили на фрагменты фильтровальной бумаги, высушивали и подвергали химическому анализу.

Отмечается, что в фазу всходов обработка семян предлагаемой смесью штаммов формировала оптимальную обеспеченность растений в условиях стартового роста азотом, фосфором и калием, что является гарантией не только качества и величины урожая, но и повышенной стрессоустойчивости растений как к засухе, так и к болезням.

Таблица 7 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (всходы) Вариант Азот нитратный
(N - NO₃) Фосфор неорганич.
(P - PO₄) Калий свободный
(K) Контроль 260 300 4205 Смесь штаммов (1,0 л/т) 500 500 5105

К моменту закладки узла кущения и вторичной корневой системы растений также значительно улучшалась обеспеченность надземной биомассы нитратным азотом, ортофосфатами и калием.

Таблица 8 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (фаза кущения) Вариант Азот нитратный
(N - NO₃) Фосфор неорганич.
(P - PO₄) Калий свободный
(K) Контроль 300 250 3500 Смесь штаммов (1,0 л/т) 600 350 5000

В период выхода в трубку и начала формирования колоска тканевая диагностика обеспеченности биогенными элементами показала закономерное снижение уровня NPK в надземной части растений. В контроле в этот период наблюдалось слабое поступление биогенных элементов в надземную часть растений на уровне NPK-голодания, тогда как обработка семян смесью штаммов сформировала высокую обеспеченность растений нитратным азотом, ортофосфатами и калием.

Таблица 9 - Средние показатели содержания NPK (мг/кг сырого вещества) в листьях яровой пшеницы (фаза выхода в трубку) Вариант Азот нитратный
(N - NO₃) Фосфор неорганич.
(P - PO₄) Калий свободный
(K) Контроль 200 90 3000 Смесь штаммов (1,0 л/т) 400 200 4500

Таким образом, доказано, что предлагаемая смесь штаммов улучшает минеральное питание растений и формирует высокую обеспеченность растений основными биогенными элементами.

Пример 7: Влияние предпосевной обработки семян смесью штаммов на урожайность яровой пшеницы (см. табл. 10 и 11)

Культура: яровая пшеница Дарья;

Место проведения опыта: Орловская область, Малоархангельский район;

Схема опыта:

1. Контроль - без обработки микробиологическим препаратом;

2. Смесь штаммов (1:1:1) - обработка семян с нормой расхода 1,0 л/т, расход рабочей жидкости 10 л/т.

Была изучена роль консорциума микроорганизмов азот-, калий- и фосформобилизаторов в оптимизации минерального питания яровой пшеницы при интродукции на семена в условиях полевого эксперимента. Показано, что предпосевное применение смеси штаммов положительно влияет на морфологические показатели пшеницы и увеличивает ее урожайность. Прибавка при этом составила 11,87 ц/га.

Таблица 10 - Всхожесть пшеницы Вариант Норма высева, млн. шт /га Количество растений, шт/м² Количество стеблей, шт/м² Коэффициент общей кустистости Полевая всхожесть, % Контроль 6,0 584 1932 3,3 96,7 Смесь штаммов 6,0 580 2012 3,5 97,3

Таблица 11 - Структура урожая и урожайность пшеницы Вариант Намолочено, кг Бункерная урожайность, ц/га Урожайность очищенного зерна, ц/га Зачетная урожайность, ц/га Натура, г/л Масса 1000 зерен, г Контроль 1420 32,86 32,60 33,70 728,0 27,6 Смесь штаммов 1960 44,44 44,08 45,57 743,0 34,6

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактериальная композиция представлена смесью трех высокоэффективных штаммов, в состав которой входят культуры с фосфатмобилизующей активностью (Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579), с азотфиксирующей активностью (Paenibacillus polymyxa ВКМ-747) и калиймобилизующей активностью (Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582). Все 3 штамма также обладают ростостимулирующим действием и выраженной антагонистической активностью против фитопатогенных грибов и бактерий, способствующей оздоровлению сельскохозяйственных почв и защите растений.

Высокая активность заявленной смеси штаммов подтверждается результатами лабораторных экспериментов, а также полевых опытов, где было отмечено улучшение минерального питания, роста и развития сельскохозяйственных культур и увеличение их урожайности.

Предлагаемая бактериальная смесь позволит повысить продуктивность зерновых агроценозов, получать в хозяйствах высокие урожаи за счет мобилизации азотно-фосфорно-калийного фонда почв, существенного расширения доли биологически фиксированного азота, подвижного фосфора и калия без затрат на минеральные удобрения и при минимальном расходе средств на создание благоприятного пищевого режима в корневой зоне растений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой смесь бактериальных штаммов для улучшения азотно-фосфорно-калиевого питания, защиты от фитопатогенов и стимулирования роста и развития сельскохозяйственных растений, которая состоит из культур Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр жизнеспособных клеток не менее 1·10⁹ КОЕ/мл. Изобретение позволяет улучшить азотно-фосфорно-калиевое питание, защитить от фитопатогенов и стимулировать рост и развитие сельскохозяйственных растений. 11 табл.

Смесь бактериальных штаммов для улучшения азотно-фосфорно-калиевого питания, защиты от фитопатогенов и стимулирования роста и развития сельскохозяйственных растений, включающая культуры Bacillus aryabhattai ВКПМ В-13579, Paenibacillus polymyxa ВКМ В-747, Paenibacillus mucilaginosus ВКПМ В-13582, смешанных в соотношении 1:1:1 и имеющих общий титр жизнеспособных клеток не менее 1·10⁹ КОЕ/мл.