Способ периодического глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/14 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ глубинного культивирования мицелия базидиомицетов для получения жизнеспособной биомассы с целью микробной трансформации древесных опилок, а также микоризации почвы при производстве сеянцев хвойных растений с закрытой корневой системой.

Уровень техники

Известен способ подготовки мицелия базидиомицетов для микоризации почвы при искусственном выращивании хвойных растений [RU 2751481, A01H 1/00, опубл. 14.07.2021], основанный на использовании мицелиальных культур базидиомицетов трех видов: Tricholoma equestre, Lactarius rufus, Suillus bovinus. Мицелиальные культуры получены при выращивании на чашках Петри с сусло-агаром, содержащим пивное сусло в концентрации 8° по Баллингу, в термостате («Термостат ТС-200 СПУ», Россия) при температуре 25±1°С в течение 5 суток.

Недостатком данного способа является выращивание мицелия грибов на твердом субстрате, что не позволяет получать биомассу в большом количестве.

Известен штамм базидиомицета Laetiporus sulphureus ВКПМ F-1286, [RU 2656143, C12N 1/14, C12R 1/645, опубл. 31.05.2018] обладающий способностью продуцировать липиды в условиях погруженного культивирования. Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальной качалке при температуре 28°С. Среда для погруженного культивирования содержит: глюкозу - 10-30 г/л, соевую муку - 5-15 г/л, дигидрофосфат калия - 2-3 г/л, сульфат магния - 0,2-0,3 г/л и водопроводную воду. Значение рН среды 5,5-6,2. Длительность процесса получения жидкого посевного мицелия составляет 10 суток, ферментации - 6 суток.

Недостатком данного способа является то, что после выделения липидов биомасса мицелия гриба остается нежизнеспособной.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения грибной белковой биомассы [RU 2511041, C12P 21/00, C12N 1/14, C12R 1/77, опубл. 10.04.2014] штамма Fusarium sambucinum ВКПМ F-1161 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей. Осуществляют многоцикличное глубинное культивирование при избыточном давлении 0,4 атм, рН от 3,5 до 7,0, в условиях аэрации воздухом от 0,5 до 2,0 л/л/мин с линейной скоростью перемешивающего устройства от 1 до 4,9 м/с. На каждом цикле ферментации поддерживают температурный режим процесса от начала цикла до точки переключения на уровне от 26 до 30°С, далее до конца цикла - на уровне от 22 до 25°С. Точку переключения определяют по накоплению биомассы до концентрации от 45 до 60% от максимально достижимой в ферментационном аппарате или точку переключения определяют по концентрации растворенного кислорода после её снижения до величины от 20 до 40% от насыщения.

Недостатком данного способа является получение нежизнеспособного мицелия.

Наличие в предлагаемом решении признаков, отличительных от признаков, характеризующих решение, принятое в качестве прототипа, позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «новизна».

Сравнение предлагаемого технического решения с другими известными решениями в данной области, показывает следующее.

Не выявлено в результате поиска и сравнительного анализа технических решений, характеризующихся аналогичной с предлагаемым решением совокупностью признаков, обеспечивающих при использовании достижение аналогичных результатов, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения биомассы базидиомицетов методом периодического глубинного культивирования.

Способ глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов характеризуется тем, что в качестве штамма-продуцента используются штаммы дереворазрушающих грибов: Phanerochaete chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum, Trametes versicolor, а также штаммы микоризных грибов: Suilus luteus, Laccaria bicolor, Lactarius helvus, Tricholoma portentosum, Cortinarius caperatus.

Процесс получения мицелия базидиомицетов осуществляется методом периодического глубинного культивирования в ферментационном аппарате 100 л с рабочим объемом 70 л на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей. Питательную среду готовят непосредственно в аппарате, стерилизуют острым паром при 120±1°C и давлении 0,11-0,12 МПа в течение 40 минут. После охлаждения до температуры 26-37°C питательную среду в асептических условиях инокулируют маточной культурой в количестве 10% по объему. Наработку маточной культуры проводят стационарно в колбах на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей, при рН 4,8-6,2, температуре 26-37°C в течение 6-16 суток, путем пересева культуры базидиомицета с твердой питательной среды. Глубинное культивирование осуществляют при рН 4,2-6,0 температуре 26-37°C с линейной скоростью перемешивающего устройства от 0,3 до 0,5 м/с в течение 6-16 суток. В процессе ферментации поддерживают ступенчатую аэрацию питательной среды стерильным воздухом, в период лаг-фазы расход воздуха составляет 0,3 л/л/мин, в фазе экспоненциального роста - 0,5-1,0 л/л/мин, в стационарной фазе роста - 1,0-1,5 л/л/мин.

После культивирования биомассу мицелия отделяют от культуральной жидкости фильтрованием на нутч-фильтре и высушивают на воздухе при температуре 30-40°C до остаточного содержания влаги 6-8%.

В качестве источника углерода используют глюкозу, свекловичную мелассу, в качестве источника азота - дрожжевой автолизат, нитрат аммония.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение жизнеспособной биомассы базидиомицетов путем глубинного периодического культивирования.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Способ глубинного культивирования мицелия дереворазрушающих грибов.

Для культивирования использовали базидиомицет, выбранный из группы Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum (конидиальная стадия P. chrysosporium).

Наработку маточной культуры мицелия дереворазрушающего гриба проводили стационарно в асептических условиях при температуре 26-37°C в колбах Эрленмейера объемом 2000 мл, содержащих 1000 мл питательной среды следующего состава: глюкоза (декстроза) - 16-18 г/л, дрожжевой автолизат - 9,5-10,5 г/л, вода водопроводная - остальное, рН - 4,8-5,7; путем пересева мицелия базидиомицета, выращенного на агаровой питательной среде. Продолжительность культивирования маточной культуры 6-7 суток.

Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 100 л с рабочим объемом 70 л на питательной среде следующего состава: глюкоза (декстроза) - 16-18 г/л, дрожжевой автолизат - 9,5-10,5 г/л, вода водопроводная - остальное. Проводили термическую стерилизацию при температуре 120±1°C в течение 40 минут, после охлаждали до температуры 26-37°C и инокулировали среду маточной культурой в количестве 10% по объему. Культивирование осуществляли при рН 4,2-5,8 в условиях аэрации воздухом от 0,3 до 1,5 л/л/мин с перемешиванием со скоростью 20-30 об/мин (линейной скоростью 0,3-0,5 м/с) в течение 6-7 суток. В процессе ферментации поддерживали ступенчатую аэрацию питательной среды стерильным воздухом, в период лаг-фазы расход воздуха составлял 0,3 л/л/мин, в фазе экспоненциального роста - 0,5-1,0 л/л/мин и в стационарной фазе роста - 1,0-1,5 л/л/мин.

По окончании культивирования осуществляли фильтрацию биомассы мицелия от культуральной жидкости на нутч-фильтре, переносили мицелий грибов на пористый минеральный носитель и сушили при температуре 30-40°C. Жизнеспособность мицелия подтверждали с помощью микробиологического контроля.

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 6,6-9,5 г/л.

Пример 2. Наработку маточной культуры и глубинное культивирование мицелия базидиомицета проводили по примеру 1, но содержание в питательной среде глюкозы (декстрозы) составляло 19-21 г/л, дрожжевого автолизата 11-12 г/л.

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 7,5-9,8 г/л.

Пример 3. Наработку маточной культуры и глубинное культивирование мицелия базидиомицета проводили по примеру 1, но содержание в питательной среде глюкозы (декстрозы) составляло 22-25 г/л, дрожжевого автолизата 13-14 г/л.

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 6,0-9,7 г/л.

Пример 4. Способ глубинного культивирования мицелия микоризообразующих грибов.

Для культивирования использовали базидиомицет, выбранный из группы Suilus luteus, Laccaria bicolor, Lactarius helvus, Tricholoma portentosum, Cortinarius caperatus.

Наработку маточной культуры мицелия микоризного гриба проводили стационарно в асептических условиях при температуре 25-28°C в колбах Эрленмейера объемом 2000 мл, содержащих 1000 мл питательной среды следующего состава: свекловичная меласса - 35-36 г/л, нитрат аммония - 2,7-2,8 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,9-1,0 г/л, вода водопроводная - остальное, рН - 5,1-6,2; путем пересева мицелия базидиомицета, выращенного на агаровой питательной среде. Продолжительность культивирования маточной культуры 14-16 суток.

Глубинное культивирование осуществляли в периодическом режиме в ферментационном аппарате 100 л с рабочим объемом 70 л на питательной среде следующего состава: свекловичная меласса - 35-36 г/л, нитрат аммония - 2,7-2,8 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,9-1,0 г/л, вода водопроводная - остальное. Проводили термическую стерилизацию при температуре 120±1°C в течение 40 минут, после охлаждали до температуры 25-28°C и инокулировали среду маточной культурой в количестве 10% по объему. Культивирование осуществляли при рН 4,8-5,9 в условиях аэрации воздухом от 0,3 до 1,5 л/л/мин с перемешиванием со скоростью 20-30 об/мин (линейной скоростью 0,3-0,5 м/с) в течение 14-16 суток. В процессе ферментации поддерживали ступенчатую аэрацию питательной среды стерильным воздухом, в период лаг-фазы расход воздуха составлял 0,3 л/л/мин, в фазе экспоненциального роста - 0,5-1,0 л/л/мин, в стационарной фазе роста - 1,0-1,5 л/л/мин.

По окончании культивирования осуществляли фильтрацию биомассы мицелия от культуральной жидкости на нутч-фильтре и высушили при температуре 30-40°C. Жизнеспособность мицелия подтверждали с помощью микробиологического контроля.

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 8,0-9,1 г/л.

Пример 5. Наработку маточной культуры и глубинное культивирование мицелия базидиомицета проводили по примеру 4, но содержание в питательной среде свекловичной мелассы составляло 40-41 г/л, нитрата аммония 3,0-3,1 г/л, калия фосфорнокислого однозамещенного 1,1-1,2 г/л

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 9,6-10,0 г/л.

Пример 6. Наработку маточной культуры и глубинное культивирование мицелия базидиомицета проводили по примеру 4, но содержание в питательной среде свекловичной мелассы составляло 43-45 г/л, нитрата аммония 3,3-3,5 г/л, калия фосфорнокислого однозамещенного 1,3-1,4 г/л

Выход воздушно-сухой биомассы мицелия (влажность 6-8%) составил 8,3-10,2 г/л.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает наработку маточной культуры, приготовление жидкой питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей и воду, инокуляцию питательной среды маточной культурой, глубинное культивирование с последующим отделением и сушкой биомассы мицелия. Процесс культивирования осуществляют при рН 4,2-6,2, температуре 26-37°C с линейной скоростью перемешивающего устройства от 0,3 до 0,5 м/с в течение 6-16 суток. В процессе ферментации поддерживают ступенчатую аэрацию питательной среды стерильным воздухом на уровне 0,3 л/л/мин в период лаг-фазы, 0,5-1,0 л/л/мин в фазе экспоненциального роста, 1,0-1,5 л/л/мин в стационарной фазе роста, с выходом биомассы 6,0-10,2 г/л за один цикл. Изобретение обеспечивает получение жизнеспособной биомассы базидиомицетов. 6 пр.

Способ периодического глубинного культивирования мицелия базидиальных грибов с получением жизнеспособной биомассы, предусматривающий наработку маточной культуры, приготовление жидкой питательной среды, содержащей источники углерода, азота, минеральных солей и воду, инокуляцию питательной среды маточной культурой, глубинное культивирование с последующим отделением и сушкой биомассы мицелия, отличающийся тем, что процесс культивирования осуществляют при рН 4,2-6,2, температуре 26-37°C с линейной скоростью перемешивающего устройства от 0,3 до 0,5 м/с в течение 6-16 суток, в процессе ферментации поддерживают ступенчатую аэрацию питательной среды стерильным воздухом на уровне 0,3 л/л/мин в период лаг-фазы, 0,5-1,0 л/л/мин в фазе экспоненциального роста, 1,0-1,5 л/л/мин в стационарной фазе роста, с выходом биомассы 6,0-10,2 г/л за один цикл.