Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 для растениеводства в качестве средства для улучшения фосфорного питания и увеличения продуктивности зерновых и овощных культур.
Известен биопрепарат Фосфоробактерин для повышения плодородия почвы на основе штамма бактерий Bacillus megaterium subsp. phosphaticum 49, описанный в Авт. св. СССР № 97943 на изобретение «Способ получения фосфоробактерина» (з. 447504, пр. 26.01.1952), МКИ4 кл.16,14.
В указанном способе бактерии выращивают на картофельной среде, высушивают и смешивают с порошкообразным каолином, служащим субстратом для сохранения спор высушенных бактерий. При использовании Фосфоробактерина происходит минерализация сложных фосфороорганических соединений, что приводит к повышению плодородия почвы.
Известны также зарубежные публикации, в которых описано использование бактерий вида Bacillus megaterium в качестве средства стимуляции роста растений и/или их корней (например, в патенте KR 20100963774 В1 от 14.06.2010г. на штамм Bacillus megaterium KNUC 251 или в заявке США 20130014434, опубликованной 17.01.2013г., в которой питательная композиция для корней пересаживаемого растения содержит в числе других микроорганизмов бактерии Bacillus megaterium или в качестве средства для борьбы с болезнями растений (например, в патенте US 054035830, опубликованном 04.04.1995г. на штамм Bacillus megaterium АТСС 55000 в качестве средства биологической борьбы с заболеваниями сои, вызванных грибом Rhizoctonia solani).
Известен также Патент РФ №2327737 с пр. 01.08.2006г. на изобретение «Штамм бактерий Вacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину», МПК C12N 1/20, C05F 11/08, C12R 1/11, опубликовано 27.06.2008г.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм может быть использован для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.
Известен также штамм ризосферных бактерий Bacillus subtilis Ч-13, используемый в качестве средства для улучшения питания, ускорения роста и увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур (патент РФ № 2259397 с пр. 02.04.2003г.). Штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 используют для производства микробиологического удобрения в торфяной форме «Бисолби», сухой форме «БисолбиФит» и жидкой форме «Экстрасол» (Свидетельство о гос. регистрации № 0680-07-2018-216-0-0-0-1 от 29.03.2007).
Известен патент РФ №2649359 на изобретение «Штамм бактерий Bacillus megaterium V3 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности винограда, зерновых, овощных и древесных культур» по заявке № 2016148893, приоритетом 13.12.2016г., МПК C12N 1/00, A01N 63/00, опубликовано 02.04.2018г. (прототип).
Описанный штамм споровых бактерий Bacillus megaterium V3 обладает ростостимулирующим эффектом, улучшает фосфорное питание растений.
Задачей изобретения является выявление нового штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве в качестве средства для улучшения фосфорного питания и увеличения продуктивности зерновых и овощных культур, а также позволяющего расширить арсенал подобных средств.
Указанная задача решается за счет того, что в качестве средства для улучшения фосфорного питания, увеличения продуктивности зерновых и овощных культур в сельском хозяйстве, а также расширения арсенала подобных средств, используется штамм эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018.
Штамм эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 был выделен из семян озимой пшеницы, выращиваемой на черноземных почвах Веденского района Чеченской Республики и депонирован 07.12.2022г. в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (RCAM) в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 06230. Справка о депонировании штамма прилагается.
Среда культивирования: агар Луриа-Бертани, LB (г/литр: триптон -10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl- 10,0, агар - 15,0); рН - 7,2). Оптимальная температура для роста - 30°С. Культивирование в течение 72 часов.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и фи-зиолого-биохимическими признаками. Грамположительные спорообразующие бактерии. Споры овальные, продолговатые. Поверхность колонии блестящая, цвет бежевый. Размер колоний 2-3 мм. Оптимальная температура роста 28-30°С; при температуре более 37°С и менее 15°С рост замедленный. Не растет при +10°С и при 5% NaCl. Оптимальное значение рН среды 7,1; рост происходит также при рН от 5,7 до 8,8.
В качестве единственного источника углерода штамм использует декстрин, фруктозу, галактозу, глюкозу, мальтозу, маннозу, манитол. Использует минеральные формы азота: соли аммония и нитраты. Каталазоположительный. Проявляет целлюлозолитическую, амилолитическую, протеолитическую активность. Не обладает липолитической активностью. Обладает способностью к азотфиксации и деградации труднорастворимых форм фосфора.
Экспериментально установлено, что штамм Paenibacillus xylanexedens W018 обладает способностью растворять ортофосфаты кальция.
Для определения свойств бактерий, способных растворять ортофосфаты кальция использовали глюкозоаспарагиновую среду Муромцева состава (г/л): глюкоза-10; аспарагин-1; K2SO4- 0,2; MgSO4х7Н20 - 0,2; агар - 20; дрожжевой экстракт- 0,02; вода водопроводная, pH-6,8. Фосфаты кальция Ca3(PO4)2 вносили в питательную среду методом осаждения. Для этого в стерильную расплавленную агаризованную среду вносили (из расчета на 1 литр) 3,4г CaCl2 и Na3PO4 по мере их растворения. На 1 л среды образуется 1,5г свежеосажденного Ca3(PO4)2. Приготовленную таким образом питательную среду разливали по чашкам Петри и после застывания засевали поверхностно 0,04 мл бактериальной суспензии из приготовленных разведений - 0,1%, 1% и 10%. Чашки культивировали при температуре 28°С в течение 5-9 суток. По образованию зон просветления вокруг колоний активных микроорганизмов судили о растворении ортофосфата кальция.
Результаты опыта представлены в Таблице 1.
и Bacillus megaterium V3 на зону растворения ортофосфатов кальция
ортофосфатов, мм
Из данных, представленных в Таблице 1, видно, что 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Paenibacillus xylanexedens W018 оказывали эффективное влияние на зону растворении ортофосфата кальция - на 6,2-10,9 мм или на 63-72,9 % по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus megaterium V3.
Экспериментально установлено, что штамм Paenibacillus xylanexedens W018 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в частности, к кресс-салату, яровой пшенице, ячменю и овсу.
Так, в лабораторном опыте определяли ростостимулирующую активность штаммов Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium V3 на растениях кресс-салата (Lepidium sativum) сорта «Дукат». Тестируемые штаммы были выращены на среде Луриа-Бертани. Из полученных образцов суспензии были приготовлены 0,1%, 1% и 10% растворы бактериальных суспензий исследуемых штаммов с изначальным титром бацилл 1,2-1,3х107 КОЕ/мл. Семена кресс-салата помещали в стерильные пробирки, заливали приготовленными растворами исследуемых штаммов и замачивали на 30 мин. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Подготавливали «влажные камеры»: в стерильные чашки Петри раскладывали фильтровальную бумагу и увлажняли стерильной водопроводной водой объёмом 6 мл на камеру. Семена кресс-салата стерильным пинцетом помещали на поверхность влажных камер по 20 шт. на чашку. На каждый вариант делалось минимум 3 повторности. Влажные камеры помещали в фитотрон и инкубировали 5 суток при температуре 28°C. После инкубации измеряли длину побега и длину корня проростков. Полученные данные обрабатывали с помощью программы Excel. Результаты опыта представлены в Таблице 2.
Bacillus megaterium V3 на рост побегов и корней кресс-салата с.Дукат
контролю
контролю
(новый)
(новый)
(новый)
Из данных, представленных в Таблице 2, видно, что 0,1-10% растворы бактериальной суспензии Paenibacillus xylanexedens W018 оказывали эффективное влияние на длину побегов и корней кресс-салата, увеличивая их на 38,1-53,0% и 20,7-26,8% по сравнению с контролем соответственно, что было существенно выше: на 4-14,9 % по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus megaterium V3.
Были проведены микровегетационные опыты, в которых определяли влияние бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium V3 на вес зеленой массы растений ячменя сорта «Ленинградский» (Hordeum vulgare) и овса сорта «Боррус» (Avena sativa L.).
Опыты по влиянию бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium V3 на продуктивность зеленой массы растений ячменя и овса в зависимости от концентрации этих штаммов проводили в вегетационном боксе с 16 часовым световым днем, температурой 23°C и интенсивностью света 5000-6000 лк. Пластиковые стаканчики объемом 0,5 л набивали стерильным кварцевым песком по 470 г, и проливали 72 мл раствора PNS (Ca(NO3)2x4H2O - 972; MgSO4x7H2O - 616; NaNO3 - 140; KH2PO4 - 170; NH4NO3 - 55; Fe-EDTA - 20; ZnSO4x7H2O - 1,7; B4Na2O7x7H2O - 3,35; CuSO4x5H2O - 0,25 и Na2MoO4x2H2O - 0,12 мг/л). На сосуд высаживали по 12 семян ячменя и овса, предварительно замоченных в суспензии изучаемых штаммов (106 и 107 КОЕ/мл) в течение 30 мин, без проращивания. Контрольные семена замачивали на 30 мин в водопроводной воде. Растения выращивали в течение 28 дней, после чего их взвешивали на весах «СартоГосм» НПВ 510г (точность измерения 0,01г). Результаты опытов представлены в Таблице 3.
megaterium V3 на биометрические показатели растений ячменя с. «Ленинградский» и овса с. «Боррус»
растений, г
контролю
корней, см
Из данных Таблицы 3 видно, что растворы бактериальной суспензии Paenibacillus xylanexedens W018, с титром 106-107 КОЕ/мл оказывают существенное влияние на биомассу растений ячменя с. «Ленинградский» и овса с. «Боррус», увеличивая ее соответственно на 19-36,6% и 27,2-46,8% по сравнению с контролем. При этом штамм Paenibacillus xylanexedens W018 оказал большее стимулирующее влияние на биомассу растений ячменя и овса по сравнению со штаммом-аналогом Bacillus megaterium V3.
Данные таблицы 3 демонстрируют, что штамм Paenibacillus xylanexedens W018 с титром 106-107 КОЕ/мл оказывал существенное влияние также на длину корней ячменя и овса: длина корней растений ячменя увеличилась на 14,9-26,6% по сравнению с контролем, а длина растений овса увеличилась на 10,7-19,2% по сравнению с контролем. При этом штамм Paenibacillus xylanexedens W018 оказал большее стимулирующее влияние на длину корней ячменя и овса по сравнению со штаммом-аналогом Bacillus megaterium V3.
При использовании заявляемого штамма бактерии Paenibacillus xylanexedens W018 в составе различных микробных препаратов важным является также то, что бактерии образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев после их получения.
Результаты исследований позволяют сделать вывод, что титр (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 для его эффективного использования в составе различных микробных препаратов должен составлять 105-107 кл. в 1 мл культуральной жидкости. Так как экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 105 кл/мл ведет к снижению ростостимулирующего действия, а увеличение концентрации свыше 107 кл/мл приводит к ингибированию роста растений.
Ниже приведен пример получения жидкой формы микробиологического препарата на основе заявляемого штамма эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018.
Маточная культура
Для получения маточной культуры штамма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 использовали жидкую питательную среду Луриа Бертани, следующего состава: (г/литр) триптон -10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl- 10,0; дистиллированная вода -1000 мл. Значение рН среды довели до 7,2.
Полученную жидкую питательную среду разлили в 750 мл - качалочные колбы по 100 мл и стерилизовали 30 минут при 1 атм. Затем стерильно провели инокуляцию питательной среды в колбах микробиологической петлей из пробирки со скошенным агаром Луриа Бертани, содержащим чистую культуру Paenibacillus xylanexedens W018. После этого колбы поместили на качалку (220 об/мин) и культивировали в течение 48 часов при температуре 30°С. Таким образом в колбах была получена маточная культура Paenibacillus xylanexedens W018 с титром бактерий около 6⋅107 КОЕ/мл, которую хранили в холодильнике до 1 месяца при температуре +4°С для последующего засева бутылей или ферментеров.
Рабочая культура
Для промышленного культивирования штамма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 рабочую культуру получали в бутылях или ферментерах на аналогичной указанной выше среде (допускается ее разбавление в 2 раза). Норма инокуляции маточной культурой 2-5%, продолжительность культивирования - 72 часа при температуре 30°С. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 32°С. Так получали концентрат бактериальной суспензии с титром бактерий не менее 107 КОЕ/мл.
Жидкая форма микробиологического препарата на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018
Полученный концентрат бактериальной суспензии на основе штамма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 разводили стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20. Полученную жидкую форму выдерживали в течение 3-5 дней при температуре 20-25°С до получения титра бактерий не менее 5⋅107 КОЕ в 1 мл, после чего препарат готов для обработки сельскохозяйственных культур.
Жидкий препарат стерильно разливали в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров, которые предварительно ополаскивали спиртом.
Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости его роста, жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее, необходим постоянный контроль всех этапов получения микробного препарата на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018.
Эффективность микробиологического препарата, полученного на основе штамма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 указанным выше способом, была проверена в двухлетних вегетационных опытах в теплицах ФГБНУ ВНИИСХМ в отношении продуктивности салата сорта «Грейт Лайкс 659» и яровой пшеницы сорта «Ленинградская 6».
Для постановки вегетационных опытов использован дерново-подзолистую почву с опытного поля ФГБНУ ВНИИСХМ. Повторность опыта на салате четырехкратная, на пшенице пятикратная. Для исследований использовались бактериальные суспензии штаммов эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium V3 с титром 107 КОЕ/мл.
Семена пшеницы и салата замачивали в бактериальной суспензии на 30 минут. В сосудах делали лунки: для салата по 6 лунок на сосуд (после всходов оставляли 3 растения), для пшеницы - по 12 лунок на сосуд (после всходов оставляли 9 растений). Полив почвы в сосудах проводился по мере необходимости одинаковым объемом воды. Растения салата и яровой пшеницы выращивали до полного созревания растений, после чего их взвешивали на весах «СартоГосм» НПВ 510г (точность измерения 0,01г).
Результаты опыта представлены в Таблицах 4, 5.
megaterium V3 на продуктивность яровой пшеницы с. «Ленинградская 6»
Из данных, приведенных в Таблицах 4 и 5 видно, что применение полученного указанным выше способом микробиологического препарата на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018 для обработки семян салата и яровой пшеницы способствовало увеличению урожая салата на 21,6% и урожая зерна яровой пшеницы на 65,3% по сравнению с контролем. При этом по всем биометрическим показателям, приведенным в Таблице 5, применение полученного указанным выше способом препарата на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018 было эффективнее, чем при использовании микробиологического препарата на основе штамма-аналога Bacillus megaterium V3.
Эффективность микробиологического препарата, полученного на основе штам-ма бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 была проверена также на редисе сорта Дуся в вегетационных опытах в теплицах ФГБНУ ВНИИСХМ. Вегетационный опыт проводили на дерново-подзолистой окультуренной почве. Для исследований использовались бактериальные суспензии штаммов Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium V3 с титром 107 КОЕ/мл. Семена редиса перед посадкой замачивали в 1% бактериальной суспензии 30 минут. Через 7 и 14 дней после посадки проводили обработку 1% бактериальной суспензией штаммов Paenibacillus xylanexedens W018 и Bacillus megaterium из расчета 3 л/га.
Для опытов использовали пластиковые сосуды с 5 кг почвы. Норма внесения минеральных удобрений азофоска (NPK-16:16:16) у всех вариантов составляла - 30г/м2 (0,72 г/1 сосуд объемом 5 л). В сосудах делали лунки по 6 лунок на сосуд, после всходов оставляли 4 растения. Повторность опытов 4-х кратная. Через 25 дней проводили учет урожая корнеплодов редиса. Корнеплоды взвешивали на весах «СартоГосм» НПВ 510г (точность измерения 0,01г).
Результаты опыта представлены в Таблице 6.
megaterium V3 на урожай корнеплодов редиса с. «Дуся»
+ - обработка семян
+++ - обработка семян и две обработки по вегетации через 7и 15 дней после всходов
Из данных, приведенных в Таблице 6 видно, что применение микробиологического препарата на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018 для обработки семян растений редиса способствовало увеличению урожая корнеплодов на 52,6%, а при обработке семян и вегетирующих растений редиса - на 75,6% по сравнению с контролем. При этом по показателям урожая корнеплодов редиса, приведенным в Таблице 6, препарат на основе штамма Paenibacillus xylanexedens W018, полученный указанным выше способом, для обработки семян и вегетирующих растений редиса было эффективнее, чем при использовании препарата на основе штамма - аналога Bacillus megaterium V3.
Таким образом, опытным путем было установлено, что штамм эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 пригоден и перспективен для использования в сельском хозяйстве в качестве средства для улучшения фосфорного питания, ускорения роста и увеличения продуктивности зерновых и овощных культур, позволяющего расширить арсенал подобных средств.
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018, депонированный 07.12.2022 г. в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ под рег. номером RCAM 06230. Опытным путем было установлено, что штамм Paenibacillus xylanexedens W018 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным с/х культурам. Опытным путем было установлено, что штамм эндофитных бактерий Paenibacillus xylanexedens W018 пригоден и перспективен для использования в сельском хозяйстве в качестве средства для улучшения фосфорного питания и увеличения продуктивности зерновых и овощных культур, а также позволяет расширить арсенал подобных средств. 6 табл.
Штамм бактерий Paenibacillus xylanexedens W018, депонированный в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 06230, в качестве средства для улучшения фосфорного питания, увеличения продуктивности зерновых и овощных культур в сельском хозяйстве.
Штамм бактерий Bacillus megaterium V3 в качестве средства для ускорения роста и увеличения продуктивности винограда, зерновых, овощных и древесных культур | 2016 |
|
RU2649359C1 |
СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЗЕРНОВЫХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР, ПОДСОЛНЕЧНИКА, ВИНОГРАДА ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, А ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ | 2003 |
|
RU2259397C2 |
NELSON D.V., et al., Paenibacillus tundrae sp | |||
nov | |||
and Paenibacillus xylanexedens sp | |||
nov., psychrotolerant, xylan-degrading bacteria from Alaskan tundra, nternational Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2009), 59, 1708-1714 DOI 10.1099/ijs.0.004572-0. |
Авторы
Даты
2023-07-21—Публикация
2022-12-14—Подача