ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS VELEZENSIS W017 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2025 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017 в качестве средства для повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.

Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без применения минеральных удобрений и средств защиты растений. Так, широкое использование минеральных удобрений, в первую очередь азотных, позволило за последние 50 лет более чем в 5 раз поднять урожайность основных сельскохозяйственных культур в развитых странах. Однако процесс получения и применения минеральных азотных удобрений является наиболее энергоемким - на него расходуется до от 30 до 50% всей энергии, потребляемой в сельскохозяйственном производстве. В связи с этим, разработка микробиологических препаратов, позволяющих сократить дозу применяемых минеральных удобрений и фунгицидов на 20-30% без сокращения урожайности сельскохозяйственных культур.

В настоящее время известно большое число микробиологических препаратов для сельского хозяйства различного назначения: ростостимулирующих, а также подавляющих развитие фитопатогенных бактерий и грибов.

Специалистам в области сельскохозяйственной микробиологии известно, что микроорганизмы могут стимулировать их рост (Azospirillum и Azotobacter), связывать азот (Rhizobium или Azotobacter), предотвращать заболевания растений (Pseudomonas или Bacillus), или же уничтожать насекомых (Streptomyces или Bacillus).

Известно изобретение «Способ предпосевной обработки семян овощных культур и способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур» по патенту РФ № 2140138 с приоритетом от 13.11.98г., авторов Чеботаря В.К., Быковой Н.В., Темновой О.В., Орловой Н.А. и Хотяновича А.В.; МПК A01C 1/06, опубл. 27.10.1999 г.

Этот способ осуществляют с помощью биопрепарата, содержащего штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13. Изобретение позволяет повысить эффективность защиты овощных культур от фитопатогенных грибов при предпосевной обработке семян.

Известно изобретение «Средство для защиты зерновых сельскохозяйственных культур, подсолнечника, винограда от фитопатогенных микроорганизмов, а овощных культур от фитопатогенных бактерий» по патенту РФ № 2259397 с пр. от 02.04.2003г., авторы Чеботарь В.К., Быкова Н.В., Темнова О.В., Орлова Н.А., Хотянович А.В., МПК C12N 1/20, C12R 1:125, А01С 1/06, опубл. 27.08.2005 г.

Штамм бактерий Bacillus subtilis Ч-13 используют при производстве микробиологического удобрения для увеличения продуктивности овощных, зерновых и технических культур в торфяной форме «Бисолби», в сухой форме «БисолбиФит» и в жидкой форме «Экстрасол».

Известно изобретение «Штамм бактерий Bacillus pumilus A1.5 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней» по патенту РФ № 2551968 с пр. от 01.08.2013, авторов Чеботаря В.К, Ерофеева С.В., Щербакова А.В., Чижевской Е.П.; МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/07, опубл. 10.02.2015 г.

Для этого используют биопрепарат, содержащий штамм эндофитных бактерий Bacillus pumilus A1.5, выделенный из зерна озимой пшеницы, депонированный 29.05.2013г. в коллекции ГНУ ВНИСХМ Россельхозакадемии под номером RCAM02057. Изобретение позволяет повысить продуктивность растений и обеспечить их защиту от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Известно изобретение «Штамм эндофитной бактерии Bacillus velezensis MGMM30 для стимуляции роста, снижения развития болезней и повышения урожайности сельскохозяйственных культур» по патенту РФ № 2823280 с пр. от 25.12.2023, авторов Афордоаньи Д.М., Валидова Ш.З., Шульги Е.Ю., Исламова Б.Р. Штамм оказывает положительное влияние на ростовые процессы растений, обладает антагонистической активностью против фитопатогенных бактерий и грибов, повышает урожайность сельскохозяйственных культур и может быть использован для создания на его основе биопрепаратов для использования в растениеводстве.

Известно изобретение «Штамм Bacillus velezensis BS89 в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от болезней» по патенту № 2599416, с пр. от 02.09.2015г., авторов Чеботаря В.К., Ерофеева С.В., МПК C12N 1/20, A01N 63/02, C12R 1/07, опубл. 10.10.2016 г.

Штамм депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства 09.07.2015 г. под регистрационным номером RCAM 03458. Полные последовательности генома штамма депонированы в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под регистрационным номером MPHE00000000 (Chebotar VK, Voshol GP, Malfanova NV, Chizhevskaya EP, Zaplatkin AN, Komarova OV, Baganova ME, Lazarev AM, Balakina SV. Draft genome sequence of plant growth promoting Bacillus velezensis BS89// Microbiol Resour Announc 10:e01294-20. 2021. https://doi.org/ 10.1128/MRA.01294-20). Данный штамм Bacillus velezensis BS89 наиболее близок по свойствам и источнику происхождения к заявляемому штамму Bacillus velezensis W017 и выбран в качестве прототипа.

Задачей настоящего изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве не только с целью стимуляции роста растений, но и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений.

Указанная задача решается за счет того, что в качестве штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве с целью стимуляции роста растений и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов используется штамм эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017, у которого выявлена и экспериментально подтверждена способность стимуляции роста растений за счет продуцирования фитогормонов ауксинов и защиты растений за счет продуцирования фунгицидных веществ бациллибактина, бацилизина, сурфактина, плантазолицина, бутирозиа, макролактина Н, бациллаена, фенгицина и диффицидина.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017 был выделен из зерна озимой пшеницы с. Безостая 100, произрастающей на черноземе, Веденский район, Чеченская Республика РФ и депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства (ФБГНУ ВНИИСХМ) 22.10.2024 года под номером RCAM 06997. Справка о депонировании прилагается.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками. Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток: 0,9-1,0 х 1,8-2,0 мкм. Штамм образует споры в центре клетки, положительно окрашивается по Граму. На мясо-пептонном агаре образует сухие колонии кремового цвета, пастообразной консистенции с неровными изрезанными краями. Диаметр колоний 5-12 мм. Оптимальная температура для роста 30°С. При температуре более 45°С и менее 15°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 7,0, рост происходит также при рН от 4,5 до 9,0. Штамм гидролизует казеин, желатину, крахмал и лакмусовое молоко. Лакмус при этом обесцвечивается. Штамм обладает амилазной, протеазной, липазной активностью. Штамм растет при 50°С, 10% NaCl и 0,001% лизоцима. В качестве единственного источника углерода штамм использует с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, маннит, глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, сорбит, глицерин, декстрин. Использует преимущественно минеральные формы азота - соли аммония и нитраты, а также аминокислоты и белки.

Штамм Bacillus velezensis W017 был проверен на способность подавлять развитие фитопатогенных грибов, наиболее опасных возбудителей корневых гнилей пшеницы Fusarium solani 60519, Fusarium culmorum 58800, Fusarium oxysporum 60521, Bipolaris sorokiniana 60018. Определение фунгицидной активности проводилось методом «колодцев» на картофельно-декстрозном агаре (PDA, Sigma). Суспензии конидий (5 мл концентрацией 1х10⁵ конидий/мл) штаммов фитопатогенных грибов были добавлены к 250 мл теплого картофельно-декстрозного агара. После перемешивания среда была разлита в чашки Петри. После застывания, в каждой чашке стерильным пробочным сверлом были проделаны 6 мм колодцы (по 2 на одну чашку). Тестируемые бактериальные штаммы (Bacillus velezensis W017 и штамм-прототип Bacillus velezensis BS89) выращивали стационарно на мясо-пептонном бульоне в течение 5 суток при 28°С. Затем по 100 мкл бактериальной суспензии были инокулированы в приготовленные колодцы в трехкратной повторности. После этого через 3-5 дней определяли антифунгальную активность штаммов как зону ингибирования роста фитопатогенных грибов вокруг колодцев в чашках при 28°С. В таблице 1 представлены результаты опыта по определению антагонистической активности штамма-прототипа - Bacillus velezensis BS89 и нового штамма Bacillus velezensis W017, по отношению к фитопатогенным грибам.

Таблица 1. Антагонистическая активность штаммов бактерий

Bacillus velezensi по отношению к фитопатогенным грибам

Штамм
бактерий Зона ингибирования фитопатогенных грибов, мм Fusarium culmorum 58800 Fusarium solani
60519 Fusarium oxysporum 60521 Bipolaris
sorokiniana 60018 Bacillus velezensis BS89 (прототип) 19,7±1,5 17,5±1,5 18,5±1,3 32,5±2,7 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 27,5±1,9 25,9±2,1 27,7±2,0 43,0±3,1

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявляемый штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus velezensis BS89.

Также была проанализирована бактерицидная активность штамма Bacillus velezensis W017 по отношению к различным штаммам фитопатогенных бактерий: Pectobacterium atrosepticum 5128, Clavibacter michiganensis 5351, Xanthomonas campestris 23, Pseudomonas syringae 8949.

Антагонистическую активность эндофитных бактерий анализировали с помощью метода «агаровых блочков». Для чего тестируемые штаммы (Bacillus velezensis W017 и штамм-прототип Bacillus velezensis BS89) сначала выращивали в течение 4-х суток при 28°С на твердом питательном агаре. После инкубации стерильным пробочным сверлом в агаре вырезали блочки диаметром 8 мм. Тест-культуры фитопатогенных бактерий высевали сплошным газоном на агаризованый 2% картофельный агар, после чего на картофельный агар сразу выкладывали блочки с тестируемыми штаммами. После этого чашки Петри выдерживали 24 ч при 28°С и судили о степени бактерицидной активности штаммов исследуемых бактерий по диаметру зон ингибирования роста фитопатогенных бактерий вокруг агаровых блочков. В таблице 2 представлены результаты опыта.

Таблица 2. Антагонистическая активность штаммов бактерий -

Bacillus velezensis по отношению к фитопатогенным бактериям

Штамм
бактерий Зона ингибирования фитопатогенных бактерий, мм Pectobacterium atrosepticum
5128 Clavibacter
michiganensis 5351 Xanthomonas campestris 23 Pseudomonas syringae 8949 Bacillus velezensis BS89 (прототип) 8,3+0,7 13,7+1,3 11,0+1,0 15,5+1,3 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 11,3+0,9 19,1+1,7 15,1+1,3 23,1+1,9

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что заявляемый штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus velezensis BS89.

Проведенное полногеномное секвенирование штамма бактерий Bacillus velezensis W017 показало, что фунгицидная и бактерицидная активность этого штамма может быть обусловлена продуцированием антибиотиков бациллибактина, бацилизина, сурфактина, плантазолицина, бутирозиа, макролактина Н, бациллаена, фенгицина и диффицидина.

Экспериментально установлено, что штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает ростостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам.

Анализ ростостимулирующей активности бактерий: штамма Bacillus velezensis W017 и штамма - прототипа Bacillus velezensis BS89 проводили в лабораторном опыте по оригинальной методике с использованием растений салата сорта «Дукат» и яровой пшеницы сорта «Ленинградская 6». Для этого семена растений сначала стерилизовали в течение 2-х мин в 70% этаноле и отмывали в стерильной водопроводной воде. Затем семена замачивали на 20 мин в суспензии бактерий с титром клеток 10⁷ КОЕ/мл и раскладывали в стерильные влажные камеры по 25 шт. в 4-кратной повторности. В контроле семена замачивали в стерильной водопроводной воде. Далее семена выдерживали в фитотроне 96 ч при температуре (25+1)°С, после чего измеряли длину корешков и побегов, а ростостимулирующую активность тестируемых штаммов рассчитывали по отношению к контрольным проросткам. Результаты представлены в таблицах 3, 4.

Таблица 3. Ростостимулирующая активность штаммов бактерий

Bacillus velezensis на проростках салата

Вариант опыта Средняя длина корня, мм Средняя длина
зеленой части ростка, мм Контроль (вода) 17,1±1,3 21,5±1,5 Bacillus velezensis BS89 (прототип) 24,3±2,0 26,3±2,0 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 32,0±2,5 34,5±2,9

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что заявляемый штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает более сильной ростостимулирующей активностью по отношению к проросткам салата по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus velezensis BS89, увеличивая среднюю длину корня в 1,32 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,31 раза.

Таблица 4. Ростостимулирующая активность штаммов бактерий

Bacillus velezensis на проростках яровой пшеницы

Вариант опыта Средняя длина корня, мм Средняя длина
зеленой части ростка,
мм Контроль (вода) 10,3±0,5 13,5±1,0 Bacillus velezensis BS89 (прототип) 14,9±1,0 17,0±1,5 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 18,1±1,5 23,1±1,9

Из данных, приведенных в таблице 4, видно, заявляемый штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает более сильной ростостимулирующей активностью по отношению к проросткам пшеницы по сравнению со штаммом - прототипом Bacillus velezensis BS89, увеличивая среднюю длину корня в 1,21 раза, а среднюю длину зеленой части ростка в 1,36 раза.

Данные полногеномного секвенирования штамма Bacillus velezensis W017 показали, что его геном содержит кластеры генов, ответственных за продукцию ауксинов.

Экспериментально также установлено, что штамм Bacillus velezensis W017 обладает фитостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам. Проведены вегетационные опыты по изучению эффективности заявляемого штамма Bacillus velezensis W017 и штамма-прототипа Bacillus velezensis BS89 на урожайность яровой пшеницы, редиса, гороха и картофеля.

Растения из семян яровой пшеницы, редиса и гороха выращивали в сосудах, содержащих 6 кг, а картофеля 10 кг дерново-подзолистой почвы: гумус - 1,43%; азот общий - 0,25%; подвижный фосфор - 58 мг Р₂О₅/100 г; подвижный калий - 59 мг K₂O/100 г; рН 6,0. Удобрения в почву вносили в количестве (мг/сосуд):

- для яровой пшеницы, редиса и гороха - мочевина - 195; KCl - 143;

- для картофеля мочевина - 389; KCl - 665.

Сосуды набивали почвой по весу: для яровой пшеницы, редиса и гороха-6 кг, для картофеля - 10 кг. Семена яровой пшеницы, редиса и гороха стерилизовали в течение 2-х мин в 70% этаноле и отмывали в стерильной водопроводной воде 3 раза по 2 мин. Раскладывали семена яровой пшеницы сорта «Ленинградская 6» (по 15 шт. на сосуд), редиса сорта «Чемпион» (по 5 шт. на сосуд) и гороха сорта «Усатый кормовой» (по 5 шт. на сосуд) и картофеля сорта «Садон» (1 клубень на сосуд) и одновременно инокулировали водными суспензиями бактерий Bacillus velezensis W017 и Bacillus velezensis BS89 с численностью10⁷ клеток/мл в количестве 1 мл на семя или на клубень, контроль обрабатывали стерильной водой. Навески KCl и мочевины растворяли в 300 мл воды и полученным раствором проливали сосуд. Вегетационные опыты проводили в летний период в поликарбонатной теплице с естественным световым и температурным режимами. Влажность почвы поддерживали на уровне 60% (оптимальное увлажнение почвы) от полной полевой влагоемкости регулярным поливом сосудов по весу. За растениями проводился регулярный уход, включавший в себя: ежедневные наблюдения за состоянием растений, полив по мере необходимости, но не реже 3-х раз в неделю, профилактические опрыскивания против комплекса вредителей и болезней. При определении урожая растений повторность во всех опытах была 5-кратной. Результаты представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5. Влияние штаммов Bacillus velezensis на урожайность

яровой пшеницы и редиса в вегетационных опытах

Вариант опыта Урожай яровой пшеницы,
г/сосуд Процент к
контролю Урожай
редиса,
г/сосуд Процент к
контролю Контроль 6,15 - 13,35 - Bacillus velezensis BS89 (прототип) 7,91* 28,6 17,52* 31,2 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 10,23* 66,3 21,45* 60,7

*- достоверные отличия от контроля

Таблица 6. Влияние штаммов Bacillus velezensis на урожайность

гороха и картофеля в вегетационных опытах

Вариант опыта Биомасса
гороха,
г/сосуд Процент к
контролю Урожай
картофеля,
г/сосуд Процент к
контролю Контроль 8,23 - 91,65 - Bacillus velezensis BS89 (прототип) 11,25* 36,7 121,24* 32,2 Bacillus velezensis W017 (заявленный) 13,79* 67,6 133,40* 45,6

*- достоверные отличия от контроля

Из данных, представленных в таблице 5 видно, что заявляемый штамм Bacillus velezensis W017 достоверно увеличил урожай зерна яровой пшеницы на 66,3%, а урожай корнеплодов редиса на 60,7% по сравнению с контролем. При этом заявляемый штамм Bacillus velezensis W017 оказал большее влияние на повышение урожайности яровой пшеницы по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus velezensis BS89.

Из данных, представленных в таблице 6 также видно, что заявляемый штамм Bacillus velezensis W017 достоверно увеличил биомассу гороха на 67,6%, а урожай клубней картофеля на 45,6% по сравнению с контролем. При этом заявляемый штамм Bacillus velezensis W017 оказал большее влияние на повышение урожайности биомассы гороха и клубней картофеля по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus velezensis BS89.

Важным является также и то, что при использовании указанного штамма в составе микробиологических препаратов бактерии штамма Bacillus velezensis W017 образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев.

Экспериментально установлено, что для эффективного использования штамма бактерии Bacillus velezensis W017 в составе различных микробиологических препаратов количество жизнеспособных клеток и спор должно составлять 10⁴-10⁹ клеток на 1 мл культуральной жидкости. Так как использование штамма в концентрации менее 10⁴ кл/мл ведет к снижению эффективности стимуляции роста сельскохозяйственных культур, а увеличение концентрации свыше 10¹⁰ кл/мл не приводит к увеличению эффективности стимуляции их роста.

Ниже приведен пример изготовления микробиологического препарата на основе штамма Bacillus velezensis W017.

Пример

Сначала выращивают культуру бактерий Bacillus velezensis W017 в жидкой стерильной питательной среде следующего состава:

меласса - 25 г/л,

кукурузный экстракт - 12,5 г/л,

дрожжевой автолизат - 1,0 г/л

MgSO₄х7Н₂О - 0,25 г/л,

CaCl₂х2 Н₂О - 1,0 г/л,

рН = 7,2

на качалке или в ферментере при температуре 28°С в течение 36-42 ч до достижения в культуральной жидкости титра не менее 1,2х10⁹ кл/мл и содержания спор не менее 95%.

После этого получают жидкую форму микробиологического препарата на основе штамма бактерий Bacillus velezensis W017, смешивая 20% культуральной жидкости и 80% воды (титр препарата - не менее 1,8х10⁸ кл/мл).

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017 в качестве средства для повышения продуктивности растений и их защиты от болезней. Штамм эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017 был выделен из зерна озимой пшеницы с. Безостая 100, произрастающей на черноземе, Веденский район, Чеченская Республика РФ, и депонирован в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства 22.10.2024 года под номером RCAM 06997. Экспериментально установлено, что штамм Bacillus velezensis W017 способен подавлять развитие фитопатогенных грибов, наиболее опасных возбудителей корневых гнилей пшеницы Fusarium solani 60519, Fusarium culmorum 58800, Fusarium oxysporum 60521, Bipolaris sorokiniana 60018, а также развитие различных штаммов фитопатогенных бактерий: Pectobacterium atrosepticum 5128, Clavibacter michiganensis 5351, Xanthomonas campestris 23, Pseudomonas syringae 8949. Опытным путем было подтверждено, что штамм бактерий Bacillus velezensis W017 обладает ростостимулирующим эффектом по отношению к различным сельскохозяйственным культурам, в т.ч. к салату, яровой пшенице, гороху, редису, картофелю. Заявленный штамм способствует повышению продуктивности сельскохозяйственных растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов. 4 табл.

Штамм эндофитных бактерий Bacillus velezensis W017, депонированный в Сетевой биоресурсной коллекции в области генетических технологий для сельского хозяйства 22.10.2024 года под номером RCAM 06997, в качестве средства для повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов.