СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРОБЛАСТОВ И Г-КСФ-ПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ ФИБРОБЛАСТНАЯ МАССА Российский патент 2023 года по МПК C12N5/77 A61K35/33 A61P9/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001]

Настоящее изобретение в основном относится к способам получения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов. Дополнительно настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний сердца, содержащим фибробласты. Настоящее изобретение также относится к популяциям клеток, содержащим фибробласты, положительные по гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (Г-КСФ).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002]

Фибробласты являются одной из разновидностей интерстициальных клеток, присутствующей в различных живых органах. Фибробласты играют роли в секреции факторов роста и цитокинов, а также в продукции и разрушении элементов внеклеточного матрикса в ответ на воспаление или повреждение в органах либо тканях, а также в контроле функций органов и тканей и в поддержании гомеостаза микроокружения посредством различных межклеточных взаимодействий. С другой стороны, фибробласты также поддерживают патологическое микроокружение при таких заболеваниях, как фиброз и рак, и обеспечивают их прогрессирование. В целом, фибробласты известны как веретенообразные клетки со множеством цитоплазматических отростков, экспрессирующие гены и белки со значительной избирательностью в зависимости от органов, в которых локализованы (см. непатентный документ 1).

[0003]

В отношении фибробластов авторы настоящего изобретения ранее обнаружили, что те фибробласты, в которых присутствует молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа, МАСЭ-1 (VCAM-1, CD106), можно применять для создания функциональных клеточных пластов кардиомиоцитов (см. патентный документ 1).

ДОКУМЕНТ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

[0004]

Патентный документ 1: WO2016/006262

Патентный документ 2: WO2018/155651

НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

[0005]

Непатентный документ 1: Chang, H. Y. и соавт., Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 12877-12882 (2002) («Разнообразие, топографическая дифференцировка и позиционная память фибробластов человека»).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗАДАЧИ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

[0006]

В патентном документе 1, к примеру, для получения в достаточном количестве CD106-положительных фибробластов применяют методы сортировки клеток с использованием CD106 в качестве маркера. Однако некоторые фибробласты могут давать очень небольшие количества (значения числа клеток) CD106-положительных фибробластов.

[0007]

С другой стороны, авторы настоящего изобретения разработали инъекционные средства для лечения заболеваний сердца и подали патентную заявку на них (см. патентный документ 2). Согласно патентному документу 2, авторы настоящего изобретения обнаружили, что предпочтительные фибробласты, которые эффективны в качестве инъекционных средств и CD106-положительны, являются также CD90-положительными.

Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении нового способа получения фибробластов, являющихся CD106-положительными и/или CD90-положительными.

СРЕДСТВО ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ

[0008]

Для того чтобы достичь изложенной выше цели, авторы настоящего изобретения провели исследование, в результате которого обнаружили, что культивирование фибробластов в присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α), который известен как фактор, индуцирующий геморрагический некроз опухоли, и интерлейкина-4 (ИЛ-4), который известен своей ролью в возникновении аллергических реакций, приводит к увеличению числа CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов, что позволило реализовать настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает следующий первый аспект (изобретение А):

[0009]

(A1) Способ получения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов, включающий этап:

культивирования фибробластов в присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4, с увеличением числа CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов;

(A2) Способ по (A1), в котором фибробласты для культивирования, получают от взрослого;

(A3) Способ по (A1) или (A2), в котором CD106-положительные и/или CD90-положительные фибробласты положительны по CD106 и CD90;

(A4) Способ по любому из (A1) - (A3), дополнительно включающий этап обогащения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов; и

(A5) Способ по любому из (A4), в котором обогащение выполняют с применением антитела к CD106 и/или антитела к CD90.

[0010]

Настоящее изобретение также включает следующий второй аспект (изобретение B):

(B1) Популяция клеток, содержащая фибробласты, включающие CD106-положительные фибробласты взрослого;

(B2) Популяция клеток по (B1), в которой процентная доля (число клеток) CD106-положительных фибробластов взрослого среди фибробластов составляет 3,36% или более, предпочтительно 5% или более; при этом в более предпочтительном варианте 7% или более фибробластов положительны по CD90, CD106, и Г-КСФ;

(B3) Популяция клеток по (B1) или (B2), в которой фибробласты взрослого положительны по CD106 и CD90;

(B4) Популяция клеток по любому из (B1) - (B3), в которой фибробласты взрослого стимулированы ФНО-α и/или ИЛ-4;

(B5) Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию клеток по любому из (B1) - (B3) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество;

(B6) Фармацевтическая композиция по (B5), причем данная композиция является терапевтическим средством для лечения ишемической болезни сердца; и

(B7) Фармацевтическая композиция по (B5) или (B6), причем указанную композицию вводят в орган, из которого были получены фибробласты взрослого.

[0011]

Настоящее изобретение включает следующий третий аспект (изобретение C):

(C1) Способ получения Г-КСФ-положительных фибробластов, включающий этап:

культивирования фибробластов в присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4, с повышением уровня экспрессии Г-КСФ и, таким образом, увеличением числа Г-КСФ-положительных фибробластов;

(C2) Способ по (C1), в котором фибробласты для культивирования получают от взрослого;

(C3) Способ по (C1) или (C2), дополнительно включающий, после культивирования, этап обогащения Г-КСФ фибробластов;

(C4) Способ по любому из (C1) - (C3), в котором обогащение включает этап сортировки с применением антитела к CD106 и/или антитела к CD90;

(C5) Популяция клеток, содержащая изолированные CD106-положительные и Г-КСФ-положительные фибробласты; и

(C6) Популяция клеток по (C5), в которой процентная доля (число клеток) Г-КСФ-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 6,75% или более.

[0012]

Настоящее изобретение дополнительно включает следующий аспект (изобретение D):

(D1) Инъекционная композиция для лечения заболеваний сердца, содержащая Г-КСФ-положительные фибробласты;

(D2) Инъекционная композиция по (D1), в которой процентная доля (число клеток) Г-КСФ-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 6,75% или более;

(D3) Способ лечения заболеваний сердца, включающий этапы:

получения популяции фибробластов, содержащей Г-КСФ-положительные фибробласты; и

введение путем инъекции указанной популяции фибробластов в некротизированную область ткани сердца либо его периферическую область и/или в коронарную артерию; и

(D4) Способ по (D3), в котором процентная доля (число клеток) Г-КСФ-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 6,75% или более.

РЕЗУЛЬТАТЫ, ОБЕСПЕЧИВАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

[0013]

Согласно настоящему изобретению предложен новый способ получения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена популяция клеток, содержащая Г-КСФ-положительные фибробласты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0014]

На ФИГ. 1 показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов сердца взрослого с добавлением ФНО-α.

На ФИГ. 2 показано: на (A) показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов сердца взрослого при добавлении ИЛ-4. На (B) показан график, отображающий процентную долю (%) CD106-положительных клеток среди фибробластов сердца взрослого в присутствии ИЛ-4 в различных концентрациях (N = 3). На (C) показан график, отображающий процентную долю (%) CD90-положительных клеток среди фибробластов сердца взрослого в присутствии ИЛ-4 в различных концентрациях (N = 3). На (D) показан график, отображающий процентную долю (%) CD106-положительных и CD90-положительных клеток среди фибробластов сердца взрослого в присутствии ИЛ-4 в различных концентрациях (N = 3).

На ФИГ. 3-1 показано: на (B) показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов сердца взрослого с добавлением двух факторов, ФНО-α и ИЛ-4. На (A) показан контрольный вариант без добавления какого-либо из них.

На ФИГ. 3-2 показан график, отображающий (A) процентную долю CD106-положительных клеток, (B) процентную долю CD90-положительных клеток и (C) процентную долю двойных положительных, ДП (DP) клеток в присутствии добавленных ФНО-α и ИЛ-4 в различных концентрациях (N = 3).

На ФИГ. 4-1 показано: на (A) показан анализ методом проточной цитометрии фетальных фибробластов сердца (F-HCF) и фибробластов, полученных из фракции индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) кардиомиоцитов, (i-HCF) с добавлением ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл). В качестве контрольного варианта показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов F-HCF и i-HCF без добавления ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл).

На ФИГ. 4-2 показано: (B) процентная доля (%) CD106- и CD90-положительных клеток среди фибробластов F-HCF при добавлении ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл) (N = 1). В качестве контрольного варианта показана процентная доля (%) CD106- и CD90-положительных клеток среди фибробластов F-HCF без добавления ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл) (N=1). На (C) показана процентная доля (%) CD106- и CD90-положительных клеток среди фибробластов i-HCF с добавлением ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл) (N = 1). В качестве контрольного варианта показана процентная доля (%) CD106- и CD90-положительных клеток среди фибробластов i-HCF без добавления ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл) (N=1).

На ФИГ. 5 показано: на (A) показан анализ методом проточной цитометрии фетальных CD106-отрицательных фибробластов сердца (F-VNCF). На (B) показан анализ методом проточной цитометрии фетальных CD106-положительных фибробластов сердца (F-VCF). На (C) показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов сердца взрослого (A-HCF). На (D) показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов A-HCF, культивируемых с добавлением ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл) (uA-HCF). На (E) показан анализ методом проточной цитометрии клеточной популяции фибробластов uA-HCF, которая положительна как по CD106, так и по CD90 (uA90⋅106-HCF) и собрана методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Только те клетки, которые находятся в пределах ограниченного гейта (P4) на фигуре, собраны методом FACS. На (F) находится график, на котором показан уровень экспрессии гена Г-КСФ в различных фибробластах (FPKM Г-КСФ нормировано по FPKM β-актина) (N = 3 для фибробластов F-VCF и F-VNCF; N = 2 для остальных). На (G) представлен график, на котором показан уровень экспрессии гена Г-КСФ в различных фибробластах (кратное увеличение FPKM Г-КСФ нормировано по FPKM β-актина; значение для фибробластов F-VCF установлено на уровне 1) (N = 3 для фибробластов F-VCF и F-VNCF; N = 2 для остальных).

ФИГ. 6 представляет собой график, на котором показано число положительных по Ki67 и по сердечному тропонину T (cTnT) двойных положительных клеток среди кардиомиоцитов, полученных из клеток иПС, иПС-КМ (iPS-CM), культивируемых совместно с различными фибробластами сердца (день 10, ***P < 0,01). Фибробласты uA90-HCF относятся к клеточной популяции CD90-положительных фибробластов uA-HCF после клеточной сортировки с использованием CD90 в качестве маркера. Фибробласты uA106-HCF относятся к клеточной популяции CD106-положительных фибробластов uA-HCF после клеточной сортировки с использованием CD106 в качестве маркера. Число Ki67- и cTnT-двойных положительных клеток среди кардиомиоцитов иПС-КМ, культивируемых совместно с фибробластами A-HCF, принято за 1 (N = 3).

На ФИГ. 7-1 показано: на (A) показан анализ методом проточной цитометрии фибробластов, введенных крысе с моделью хронической сердечной недостаточности. На (B) показан график, отображающий процентную долю CD106-положительных клеток, процентную долю CD90-положительных клеток и процентную долю двойных положительных (ДП) клеток среди фибробластов, введенных крысе с моделью хронической сердечной недостаточности.

На ФИГ. 7-2 показаны эхокардиографические изображения (M-режим) сердца крысы (фотография заменяет фигуру).

На ФИГ. 7-3 показано: на (A) представляет собой график, на котором показано изменение фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) (%) сердца крысы в присутствии различных фибробластов сердца. (B) представляет собой график, на котором показан % изменения ФВ ЛЖ через 4 недели после инъекционного введения различных фибробластов сердца (ФВ ЛЖ (неделя 4) - ФВ ЛЖ (неделя 0), **P < 0,05, N = 4 для групп, получивших фибробласты A-HCF и uA-HC; N = 3 для группы, получившей фибробласты uA90-HCF). (C) представляет собой график, на котором показано изменение фракции укорочения левого желудочка (ФУ ЛЖ) (%) сердца крысы в присутствии различных фибробластов сердца. (D) находится график, на котором показан % изменения ФУ ЛЖ через 4 недели после инъекционного введения различных фибробластов сердца (ФУ ЛЖ (4 недели) - ФУ ЛЖ (0 недель), **P < 0,05, N = 4 для групп, получивших фибробласты A-HCF и uA-HC; N = 3 для группы, получившей фибробласты uA90-HCF).

На ФИГ. 8 показано: на (A) показан анализ методом проточной цитометрии различных фибробластов. (В) представляет собой график, отображающий процентную долю (%) Г-КСФ-положительных клеток среди различных фибробластов (***P < 0,01, N = 4). Фибробласты uA90⋅106-HCF являются клеточной популяцией фибробластов uA-HCF, положительных как по CD106, так и по CD90 и собранных методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Только те клетки, которые находятся в пределах ограниченного гейта (P3) на фигуре, собраны методом FACS.

На ФИГ. 9-1 показаны эхокардиографические изображения (M-режим) сердец крыс с моделью хронической сердечной недостаточности, которым вводили различные фибробласты сердца (фотография заменяет фигуру).

На ФИГ. 9-2 показано: (А) представляет собой график, на котором показано изменение ФВ ЛЖ (%) у крыс с моделью хронической сердечной недостаточности, которым вводили различные фибробласты сердца (****P < 0,01 в сравнении с A-HCF, ***P < 0,05 в сравнении с uA-HCF, **P < 0,01 в сравнении с контрольной группой (группой, которой вводили только среду (среда Игла, модифицированная по методу Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы + 10% сыворотка новорожденных телят (NBCS))), N = 6 для группы с имитацией вмешательства (группа, которая подверглась такой же торакотомии, как контрольная группа и группа, получившая клеточную терапию, но не подверглась ишемии-реперфузии), N = 4 для контрольной группы, N = 7 для группы, получившей фибробласты A-HCF, N = 8 для группы, получившей фибробласты uA-HCF, N = 9 для группы, получившей фибробласты uA90-HCF. (В) представляет собой график, на котором показан % ФВ ЛЖ через 18 недель после инъекционного введения различных фибробластов сердца (ФВ ЛЖ (18 недель) - ФВ ЛЖ (0 недель), ****P < 0,01 в сравнении с A-HCF, ***P < 0,01 в сравнении с uA-HCF, **P < 0,01 в сравнении с контрольной группой, *P < 0,05 в сравнении с контрольной группой). (C) представляет собой график, на котором показано изменение ФУ ЛЖ (%) у крыс с моделью хронической сердечной недостаточности в присутствии различных фибробластов сердца (****P < 0,01 в сравнении с A-HCF, ***P < 0,05 в сравнении с uA-HCF, **P < 0,01 в сравнении с контрольной группой). На (D) находится график, на котором показан % изменения ФУ ЛЖ через 18 недель после инъекционного введения различных фибробластов сердца (ФУ ЛЖ (неделя 18) - ФУ ЛЖ (неделя 0), ****P < 0,01 в сравнении с A-HCF, ***P < 0,05 в сравнении с uA-HCF, **P < 0,01 в сравнении с контрольной группой).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015]

Настоящее изобретение далее будет описано более подробно ниже с использованием конкретных вариантов осуществления. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается приведенными с иллюстративной целью конкретными вариантами осуществления.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, способ получения CD106-положительных (также называемых CD106⁺) и/или CD90-положительных (также называемых CD90⁺) фибробластов включает этап культивирования фибробластов в присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4, с увеличением числа CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов. Культивирование присутствии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4, приводит к получению популяции фибробластов, содержащей увеличенное число CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов.

[0016]

В настоящем описании термин “обогащение” означает процесс сортировки клеток, посредством которого увеличивается соотношение между числом конкретных клеток и общим числом клеток. Следует отметить, что в настоящем описании термин “культивирование” не входит в состав термина “обогащение”. В настоящем описании термин “изоляция” (выделение) означает отделение определенного компонента от ткани, в то время как термин “очистка” означает отделение определенного компонента от по меньшей мере одного или нескольких прочих компонентов.

[0017]

В настоящем описании термин “положительный” означает, что клетки экспрессируют поддающийся обнаружению уровень маркера.

[0018]

В настоящем описании термин “содержать” означает, что он может опционально включать в себя неуточненный третий компонент. Термин “состоять из” в настоящем описании означает, что он по существу не включает в себя никакого третьего неуточненного компоненту. Предполагается, что термин “по существу не включающий” не исключает возможность включения третьего компонента в результате загрязнения в процессе производства в количестве, которое делает невозможным его удаление с технической точки зрения.

[0019]

Фибробласты являются разновидностью интерстициальных клеток, вырабатывающих элементы внеклеточного матрикса, такие как коллаген. Фибробласты являются разновидностью клеток, которая располагается в соединительных тканях живого организма и преимущественно их формирует. Фибробласты могут быть положительными по как минимум одному, выбранному из группы, состоящей из виментина и рецептора дискоидинового домена 2 (DDR2), которые являются маркерами соединительнотканных клеток. Согласно некоторым аспектам, фибробласты не положительны по сердечному тропонину и альфа-актину, которые являются маркерами, специфичными для кардиомиоцитов. Согласно некоторым аспектам, фибробласты не положительны по VE-кадгерину (кадгерину эндотелия сосудов). К примеру, фибробласты не являются клетками сосудистого эндотелия. К примеру, фибробласты не являются сосудистыми гладкомышечными клетками. Фибробласты могут являться либо не являться миофибробластами.

Фибробласты могут быть получены из ткани сердца, в том числе фибробласты, изолированные из ткани сердца. Фибробласты могут быть изолированы из эпикарда или эндокарда. Фибробласты могут быть изолированы из фетального эпикарда или эндокарда. Фибробласты могут быть изолированы из эпикарда или эндокарда взрослого. Фибробласты могут быть положительными по как минимум одному, выбранному из группы, состоящей из виментина и DDR2, и иметь потенциал вырабатывать коллаген. Согласно всем аспектам настоящего изобретения, фибробласты могут быть предпочтительно получены из ткани сердца (далее в настоящем документе они могут называться также фибробластами сердца), включая фибробласты, изолированные из эпикарда или эндокарда.

Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, любые клетки, которые дифференцируются в фибробласты в живом организме, можно использовать в качестве источника фибробластов.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, фибробласты, используемые для трансплантации в сердце, можно получить из ткани сердца, эпикарда или эндокарда.

Согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, фибробласты могут быть обогащены, изолированы или очищены.

[0020]

Фибробласты могут быть получены из любого источника и можно использовать после дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки (ЭС клетки), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПС клетки), или мультилинейно-дифференцирующиеся устойчивые к стрессу клетки (клетки Muse), или стволовые клетки взрослых (соматические), такие как мезенхимальные стволовые клетки. Как альтернативный вариант, можно использовать первичные клетки, собранные у животного (включая человека), или стабилизированные клетки. Предпочтительно фибробласты можно выделить из эпикарда или эндокарда либо получить из сердца взрослого человека, однако настоящее изобретение этим не ограничивается.

[0021]

Помимо фибробластов, о которых говорилось выше, то же можно сказать в отношении всех аспектов, в которых фибробласты выделены из ткани сердца либо изолированы из эпикарда или эндокарда. Настоящее изобретение будет описано в приведенных ниже примерах со ссылкой на эксперименты, в которых в качестве фибробластов используются иллюстративные фибробласты сердца.

[0022]

CD106, который также называется МАСЭ-1 (МАСЭ1), является белком, известным как молекула клеточной адгезии, которая экспрессируется, к примеру, в клетках сосудистого эндотелия. CD90, который также называется Thy-1, является высокогликозилированной молекулой, связанной с гликозилфосфатидилинозитолом, ГФИ (GPI), и экспрессируется в различных стромальных клетках, таких как нервные ткани и соединительные ткани, но не в кардиомиоцитах. Таким образом, принадлежность фибробластов к CD90⁺ указывает на то, что они не включают кардиомиоциты. Указание на то, что термин “CD90⁺ фибробласты” в настоящем документе не включает кардиомиоциты, подразумевает, что допустимо включение некоторого количества кардиомиоцитов, и кардиомиоциты могут составлять 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее, 0,5% или менее, 0,1% или менее, либо 0,01% или от общего количества клеток.

[0023]

Процентная доля CD90⁺ фибробластов в CD106⁺ фибробластах (по числу клеток) может составлять 1% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, либо 100%.

[0024]

Фибробласты могут быть коннексин 43-положительными (коннексин 43⁺ фибробластами).

Коннексин 43 является трансмембранным белком, о котором известно, что он экспрессируется на поверхности кровеносных сосудов в ассоциации с атеросклеротической бляшкой и соединяет соседние клетки в качестве белка межклеточных щелевых контактов кардиомиоцитов, способствуя распространению электрического возбуждения сердца. Авторы настоящего изобретения полагают, что, когда фибробласты положительны по коннексину 43, это обеспечивает возможность передачи электрических импульсов в тканях сердца и дает улучшенный терапевтический эффект в применении к заболеваниям сердца.

Процентная доля коннексин 43⁺ фибробластов среди CD106⁺ фиброблстов (по числу клеток) может составлять 1% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, либо 100%.

[0025]

Способ приведения фибробластов в контакт с по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4 (далее в настоящем документе они также называются просто “фактор”), не имеет особых ограничений. Обычно, но без ограничения этим, фактор добавляют в среду, содержащую фибробласты. В процессе контакта со множеством факторов фибробласты могут приводить в контакт с каждым из них по отдельности или одновременно. С целью одновременного контакта фибробластов с факторами можно первоначально смешать множество факторов, а затем добавить их к фибробластам.

[0026]

В этом варианте осуществления, поскольку фибробласты можно культивировать в среде, дополненной фактором, уровень(ни) экспрессии CD106 и/или CD90 в фибробластах можно поддерживать на протяжении культивирования. Это позволяет получать фибробласты с высоким(и) уровнем(ями) CD106 и/или CD90.

[0027]

При добавлении этих факторов к среде (мл), количество ФНО-α не ограничивается специально и обычно составляет 0,1 нг/мл или более, либо может составлять 0,5 нг/мл или более, 1 нг/мл или более, либо 10 нг/мл или более. Верхний предел не ограничивается специально и обычно составляет 500 нг/мл или менее, либо может составлять 100 нг/мл или менее.

Количество добавляемого ИЛ-4 не ограничивается специально и обычно составляет 0,1 нг/мл или более, либо может составлять 0,5 нг/мл или более, либо 1 нг/мл или более. Верхний предел не ограничивается специально и обычно составляет 10 нг/мл или менее, либо может составлять 5 нг/мл или менее, либо 1 нг/мл или менее.

При добавлении обоих факторов соотношение (по массе) добавляемых ФНО-α и ИЛ-4 (ФНО-α: ИЛ-4) обычно составляет от 10000:1 до 1:1, либо может составлять от 50000:1 до 10:1. В альтернативном варианте соотношение может составлять от 1:1 до 1:10000, либо может составлять от 1:10 до 1:50000.

[0028]

После контакта с этими факторами фибробласты можно далее культивировать с получением фибробластов, экспрессирующих CD106⁺ и/или CD90⁺.

Фибробласты можно культивировать любым известным методом получения культур клеток, без конкретного ограничения, в условиях, которые дают возможность для экспрессии CD106⁺ и/или CD90⁺ либо являются подходящими для данной культуры.

Среду для применения в культуре определяют сообразно обстоятельствам, например, в зависимости от типа клеток, которые будут культивировать. Примеры культуральных сред, которые можно применять, включают следующие: DMEM, α-MEM, RPMI-1640 и HFDM-1(+). Культуральную среду можно дополнить питательными веществами, такими как фетальная телячья сыворотка (FCS, ФТС) и фетальная бычья сыворотка (FBS, ФЮС), а также факторами роста, цитокинами и антибиотиками. В дальнейшем клетки можно культивировать в культуральной среде, содержащей ФНО-α и/или ИЛ-4.

[0029]

Период культивирования (число дней) определяют сообразно обстоятельствам, например, в соответствии с целью достичь требуемого числа клеток и/или придать им требуемую функцию. Примеры периодов культивирования включают один день, два дня, три дня, четыре дня, пять дней, шесть дней, семь дней, восемь дней, девять дней, десять дней, две недели, один месяц, два месяца, три месяца и шесть месяцев.

Температуру при культивировании определяют сообразно обстоятельствам в соответствии с типом клеток, которые будут культивировать, и она может составлять, например, 10°C или выше, 15°C или выше, 20°C или выше, 25°C или выше, or 30°C или выше, and may be, for example, 60°C или ниже, 55°C или ниже, 50°C или ниже, 45°C или ниже или 40°C или ниже.

[0030]

После культивирования фибробласты можно собрать на этапе сбора. На этапе сбора клетки можно собирать путем отсоединения клеток при помощи протеаз, таких как трипсин, либо при помощи изменений температуры с применением термочувствительной чашки для культивирования. В альтернативном варианте клетки можно собрать либо обогатить с применением антитела к CD90 или антитела к CD106 в автоматизированной системе магнитной клеточной сортировки (напр., autoMACS), в системе магнитной клеточной сортировки (напр., MACS), в замкнутой системе магнитной клеточной сортировки (напр., Prodigy), или в клеточном сортере (напр., FACS). Ниже основного потока промотора(ов) гена(ов), кодирующего(их) белок(ки) CD90 и/или CD106, можно ввести ген лекарственной устойчивости, и тогда клетки можно отбирать при помощи лекарственного препарата.

[0031]

Способ получения согласно настоящему варианту осуществления, может включать этап отсортировки CD90⁺ фибробластов с применением антитела к CD90, этап отсортировки CD106⁺ фибробластов с применением антитела к CD106 или оба указанных этапа. Этап сортировки можно осуществить в любой момент времени. Соответствующий момент времени может иметь место перед контактом с факторами, описанным выше; после контакта с факторами и перед культивированием; или после культивирования.

Можно использовать любые известные антитела к CD90 и к CD106, включая имеющиеся в продаже продукты. Сортировка с применением антитела к CD90 и/или антитела к CD106 может привести к увеличению процентной доли CD106⁺ фибробластов и/или CD90⁺ фибробластов среди фибробластов и обеспечить получение CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов, обладающих высокой эффективностью в лечении заболеваний сердца.

[0032]

Способ получения CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов согласно настоящему варианту осуществления обеспечивает получение фибробластов с повышенной экспрессией CD106 и/или CD90, которые представляют собой популяцию фибробластов для другого варианта осуществления настоящего изобретения. В частности, в популяции клеток фибробластов, содержащей CD106⁺ и/или CD90⁺ CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробласты взрослого, показана повышенная экспрессия CD106 и/или CD90, возникшая в результате стимуляции с применением ФНО-α и/или ИЛ-4, и данную популяцию клеток можно должным образом применять в качестве фармацевтической композиции.

[0033]

Процентная доля CD106⁺ фибробластов среди общего количества фибробластов в популяции клеток может составлять, но без конкретного ограничения, 3,36% или более, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, либо 95% или более, по числу клеток.

[0034]

Процентная доля CD90⁺ фибробластов среди общего количества фибробластов в популяции клеток может составлять, но без конкретного ограничения, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, либо 95% или более, по числу клеток.

[0035]

Процентная доля CD106⁺ и CD90⁺ фибробластов среди общего количества фибробластов в популяции клеток может составлять, но без конкретного ограничения, 5% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, либо 95% или более, по числу клеток.

[0036]

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что Г-КСФ-положительные фибробласты можно получать путем приведения фибробластов в контакт с по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4.

Согласно имеющейся информации, Г-КСФ уменьшает гибель кардиомиоцитов, ассоциированную с сердечной недостаточностью, и предотвращает прогрессирование ремоделирования миокарда (Harada, M. и соавт, Г-КСФ предотвращает ремоделирование сердца после инфаркта миокарда путем активации сигнального пути Jak-Stat-киназ у кардиомиоцитов. Nat.Med.11, 305-311 (2005)). Также было установлено, что Г-КСФ способствует клеточному росту кардиомиоцитов (Shimoji, K. и соавт., Г-КСФ стимулирует пролиферацию развивающихся кардиомиоцитов как в живом организме, так и при получении их из ЭСК и иПСК. Cell Stem Cell 6, 227-237 (2010)).

[0037]

Таким образом, согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения, способ получения Г-КСФ-положительных фибробластов включает этапы приведения фибробластов в контакт с по меньшей мере одним фактором, выбранным из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4; и культивирование фибробластов после указанного контакта в условиях, способствующих увеличению экспрессии Г-КСФ.

Описание способа получения CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов может относиться к этапу контакта, этапу культивирования и т.д., согласно настоящему варианту осуществления. Созданные Г-КСФ-положительные фибробласты можно обогатить с применением антитела к CD90 и/или антитела к CD106 в автоматизированной системе магнитной клеточной сортировки (напр., autoMACS), в системе магнитной клеточной сортировки (напр., MACS), в замкнутой системе магнитной клеточной сортировки (напр., Prodigy), или в клеточном сортере (напр., FACS). Ниже основного потока промотора гена, кодирующего белок Г-КСФ, можно ввести ген лекарственной устойчивости, и тогда клетки можно отобрать при помощи лекарственного препарата.

[0038]

Способ получения Г-КСФ-положительных фибробластов, согласно настоящему варианту осуществления, обеспечивает получение Г-КСФ-положительных фибробластов. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения, также можно получить популяцию фибробластов, содержащую Г-КСФ-положительные фибробласты. Вышеуказанную популяцию фибробластов можно должным образом применять в качестве фармацевтической композиции. Кроме того, популяция клеток, содержащая Г-КСФ-положительные фибробласты, может применяться в способе лечения заболеваний сердца, который включает этап инъекционного введения в некротизированную область ткани сердца либо его периферическую область и/или в коронарную артерию.

[0039]

Процентная доля Г-КСФ-положительных фибробластов в общей популяции клеток, содержащей фибробласты, может составлять, но без конкретного ограничения, 1% или более, 5% или более, 6,75% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, по числу клеток.

[0040]

Для уровня экспрессии гена, кодирующего белок Г-КСФ у фибробластов, FPKM (количество фрагментов на миллион килобаз) с нормировкой по бета-актину может составлять 0,01 или более, 0,02 или более, 0,03 или более, 0,04 или более, 0,05 или более, либо 0,1 или более.

Кроме того, уровень экспрессии гена, кодирующего белок Г-КСФ у фибробластов, может превышать уровень его экспрессии в природе (в живом организме) в 1,1 раз или более, в 2 раза или более, в 5 раз или более, в 10 раз или более, в 20 раз или более, в 50 раз или более, в 100 раз или более, в 200 раз или более, либо в 500 раз или более.

[0041]

Кроме того, Г-КСФ-положительные фибробласты могут являться положительными по CD106 и/или CD90, и Процентная доля таких фибробластов (по числу клеток) может составлять 1% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, либо 100%.

Процентная доля Г-КСФ-положительных фибробластов (по числу клеток) среди фибробластов, положительных по CD106 и/или CD90, в популяции клеток, содержащей фибробласты, может составлять 1% или более, 3% или более, 5% или более, 10% или более, 25% или более, либо 50% или более.

[0042]

В частности, Г-КСФ-положительные, CD106-положительные и CD90-положительные фибробласты в популяции клеток, содержащей фибробласты, могут составлять 1% или более, 5% или более, 7% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, либо 100%, по числу клеток.

[0043]

Популяция клеток фибробластов в качестве фармацевтической композиции может содержать прочие компоненты, которые являются физиологически приемлемыми в составе фармацевтической композиции, в дополнение к клеточной популяции фибробластов.

[0044]

Фармацевтическая композиция согласно настоящему варианту осуществления может применяться у пациентов с заболеваниями сердца с целью улучшения функции сердца. Заболевания сердца, согласно настоящему варианту осуществления, включают заболевания, вызываемые, например, повреждениями, дефектами и функциональным нарушениями в тканях сердца, включая, среди прочего, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, инфаркт миокарда, кардиомиопатию, миокардит, гипертрофическую кардиомиопатию и дилатационную кардиомиопатию. Таким образом, согласно настоящему изобретению, предложена фармацевтическая композиция, содержащая CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробласты либо Г-КСФ⁺ фибробласты для применения с целью улучшения функций сердца, например, для роста миокарда в живом организме и/или для повышения фракции выброса сердца. Согласно настоящему изобретению, предложена также фармацевтическая композиция, содержащая CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробласты либо Г-КСФ⁺ фибробласты для применения с целью предотвращения прогрессирования фиброза в тканях сердца.

[0045]

CD106⁺ и/или CD90⁺ Фибробласты либо Г-КСФ⁺ фибробласты секретируют цитокины и им подобные вещества, контролирующие воспалительный процесс, с целью поддержания гомеостаза органа. Выделенные цитокины, хемокины и им подобные вещества могут приводить к формированию подходящего микроокружения для регенерации мышечных тканей сердца, обеспечивая возможность роста кардиомиоцитов и регулирование их сокращений. Кроме того, CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробласты либо Г-КСФ⁺ фибробласты могут предотвращать прогрессирование фиброза.

[0046]

Иллюстративным способом введения фармацевтической композиции пациенту с заболеванием сердца является инъекция.

При применении фармацевтической композиции в качестве инъекционного средства (инъекционной композиции) данное инъекционное средство может содержать прочие клетки и прочие компоненты наряду с CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластами либо Г-КСФ⁺ фибробластами. При наличии в составе прочих клеток Процентная доля CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов либо Г-КСФ⁺ фибробластов среди всех фибробластов, содержащихся в составе инъекционного средства, может составлять 0,03% или более, 0,1% или более, 1% или более, 2% или более, 4% или более, 5% или более, 6.75% или более, 10% или более, 20% или более, 30% или более, 40% или более, 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более, либо 99% или более, по числу клеток.

Что касается инъекционного средства, число CD106⁺ и/или CD90⁺ фибробластов и Г-КСФ⁺ фибробластов, содержащихся в составе инъекционного средства, может составлять 1 × 10⁶ клеток или более, 5 × 10⁶ клеток или более, or 1 × 10⁷ клеток или более.

CD106⁺ и/или CD90⁺ Фибробласты либо Г-КСФ⁺ фибробласты, содержащиеся в составе инъекционной композиции, можно культивировать совместно с прочими клеткам, например, кардиомиоцитами.

[0047]

Инъекционное средство может содержать прочие компоненты, являющиеся физиологически приемлемыми в составе инъекционного средства. Примеры вышеуказанных прочих компонентов включают физиологический раствор, фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), раствор для консервации клеток, среду для культивирования клеток, гидрогель, внеклеточный матрикс и раствор для криоконсервации.

Инъекционное средство обеспечивает возможность инъецировать фибробласты взрослого в ткань сердца, например, в некротизированную область ткани сердца либо его периферическую область и/или в коронарную артерию, либо в вену, артерию, лимфатический узел или лимфатический сосуд для лечения заболеваний сердца. В качестве источника фибробластов взрослого взрослого можно использовать собственные ткани пациента с заболеванием сердца для выполнения аутотрансплантации.

[0048]

Популяцию фибробластов можно применять в качестве подложки для культуры других клеток либо для формирования органа или ткани, например, для организации планарной или трехмерной рыхлой соединительной ткани. Популяцию фибробластов можно культивировать совместно с другими клетками, такими как кардиомиоциты, чтобы получить планарную или трехмерную ткань, но популяция фибробластов эффективно функционирует в качестве планарной иыли трехмерной ткани без совместного культивирования. Примеры планарной или трехмерной ткани включают, среди прочего, клеточный пласт, клеточное волокно и ткань, сформированную при помощи 3D-принтера.

Вышеуказанную планарную или трехмерную ткань можно наносить на область некротизированной ткани сердца либо заменить некротизированной тканью сердца в качестве искусственного органа для лечения заболеваний сердца.

ПРИМЕРЫ

[0049]

Настоящее изобретение будет описано более подробно ниже со ссылкой на примеры, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.

<Животные, клетки и реагенты>

Все протоколы проведения экспериментов на животных, осуществляемых в рамках настоящего исследования, были одобрены этическим комитетом компании LSI Medience Corporation (Токио, Япония). Все животные использовались исключительно по необходимости и гуманно.

Поставщиками клеток являлись следующие производители: фибробласты сердца взрослого человека - компания Lonza, Базель, Швейцария; фетальные фибробласты сердца человека - компания Cell Applications, Сан-Диего, штат Калифорния; и кардиомиоциты человека, полученные из клеток иПС - иПС-КМ, компания Myoridge, Киото, Япония. Фибробласты сердца человека, полученные из клеток иПС, изолировали от кардиомиоцитов иПС-КМ на основании различной способности к адгезии к поверхности субстрата.

[0050]

Для иммунофлюоресцентного окрашивания и анализа методом проточной цитометрии использовали следующие антитела: BV421, антитело мыши к CD106 человека (компания BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния); BV421, иммуноглобулин G1 мыши; изотипический контроль каппа (компания BD Biosciences); антитело человека CD90-PE (компания Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия); рекомбинантный изотипический (REA) контроль (S)-PE (компания Miltenyi Biotec); моноклональное антитело к сердечному тропонину T (cTnT) мыши (компания аThermo Scientific, Уолтем, штат Массачусетс); поликлональное антитело к Ki67 кролика (компания Abcam, Кембридж, Великобритания); раствор Хехст 33258 (компания Dojindo Laboratories, Кумамото, Япония); моноклональные антитела Ms к Г-КСФ (компания Abcam); и антитело APC козы к иммуноглобулину G мыши (компания BioLegend, Сан-Диего, штат Калифорния). С целью проведения анализа белков, находящихся в цитоплазме, клетки подвергли пермеабилизации клеточных мембран с применением 0,1% раствора Тритон-X (компания Sigma Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури) в течение 30 минут (при комнатной температуре), после чего выполнили иммунофлюоресцентное окрашивание для проведения флуоресцентной микроскопии. С целью проведения анализа методом проточной цитометрии каждый тип фибробластов подвергли пермеабилизации клеточных мембран с применением 0,1% раствора сапонина (компания Nacalai Tesque, Киото, Япония) в течение 15 минут (при комнатной температуре), после чего выполнили иммунофлюоресцентное окрашивание.

[0051]

<Сортировка клеток >

F-VNCF (CD106-отрицательные фетальные фибробласты сердца), F-VCF (CD106-положительные фетальные фибробласты сердца) и uA106-HCF (CD106-положительные фибробласты сердца взрослого, полученные посредством добавления ФНО-α и ИЛ-4 к фибробластам сердца взрослого с целью увеличить процентную долю клеток, положительных по CD90 и CD106, а затем подвергнутые клеточной сортировке с применением CD106 в качестве маркера) подвергли первичному иммунному окрашиванию с применением комплекса “CD106 (МАСЭ-1) человека - биотин” (компания Miltenyi Biotec), после чего выполнили вторичное иммунное окрашивание с применением антибиотиновых микросфер (компания Miltenyi Biotec). uA90-HCF (CD90-положительные фибробласты сердца взрослого, полученные посредством добавления ФНО-α и ИЛ-4 к фибробластам сердца взрослого с целью увеличить процентную долю клеток, положительных по CD90 и CD106, а затем подвергнутые клеточной сортировке с применением CD90 в качестве маркера) подвергли первичному иммунному окрашиванию с применением комплекса “CD90 человека - биотин” (компания Miltenyi Biotec), после чего выполнили вторичное иммунное окрашивание с применением антибиотиновых микросфер (компания Miltenyi Biotec). Окрашенные клетки подвергли сортировке с использованием autoMACS (компания Miltenyi Biotec) с целью собрать CD106- and CD90-положительные клетки.

Фибробласты сердца взрослого (uA90⋅106-HCF) с высокой процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток собрали следующим образом: обработали фибробласты сердца взрослого факторами ФНО-α и ИЛ-4 с целью увеличить процентную долю CD90- и CD106-положительных клеток; произвели иммунное окрашивание клеток при помощи BV421, антитела мыши к CD106 человека (компания BD Biosciences, Сан-Хосе, штат Калифорния), BV421, иммуноглобулина G1 мыши; изотипического контроля каппа (компания BD Biosciences); антитела человека CD90-PE (компания Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия); REA контроля (S)-PE (компания Miltenyi Biotec) и подвергли вышеуказанные клетки клеточной сортировке с применением BD FACS ARIAIII (компания BD Biosciences).

[0052]

<Проточная цитометрия>

После иммунофлюоресцентного окрашивания клетки заготовили в концентрации 1,0 × 10⁶ клеток в пробе и произвели анализ при помощи проточного цитометра (MACSQuant Analyzer 10, компания Miltenyi Biotec). После распознавания типов клеток при помощи прямого светорассеяния (FSC-A) и бокового светорассеяния (SSC-A) вычислили процентную долю клеток, положительных по различным маркерным белкам (%, по числу клеток).

[0053]

<Экстракция РНК и секвенирование мРНК>

Из каждого типа фибробластов собрали рибонуклеиновую кислоту (РНК) с применением мини-набора Qiagen RNeasy (компания QIAGEN, Валенсия, штат Калифорния). Фибробласты сердца взрослого (uA90⋅106-HCF) с высокой процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток собрали следующим образом: обработали фибробласты сердца взрослого факторами ФНО-α и ИЛ-4 с целью увеличить процентную долю CD90- и CD106-положительных клеток; затем подвергли вышеуказанные клетки клеточной сортировке с применением BD FACS ARIAIII (компания BD Biosciences). Собранную РНК проанализировали для определения концентрации и беспримесности с применением биоанализатора Agilent 2100 (компания Agilent Technologies, Пало-Альто, штат Калифорния) и NanoDrop One (компания Thermo Fisher Scientific). Для приготовления библиотеки использовали один микрограмм РНК со значением числа целостности РНК (RIN) 7 или более. Приготовление библиотеки для секвенатора следующего поколения проводили согласно протоколу от производителя набора для приготовления библиотеки РНК NEBNext Ultra для компании Illumina.

[0054]

Полиаденилированную матричную РНК (поли(A) мРНК) изолировали при помощи магнитного изоляционного модуля для поли(A) мРНК NEBNext (компания NEB) и набора для удаления рибосомной РНК (рРНК) Ribo-Zer (компания Illumina). мРНК подвергли фрагментированию и праймированию с применением рабочего буферного раствора для синтеза первой цепи NEBNext и случайных праймеров NEBNext.

Первую цепь комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) синтезировали с применением обратной транскриптазы ProtoScript II. Вторую цепь кДНК синтезировали с применением смеси ферментов для синтеза второй цепи. После очистки при помощи набора для очистки после полимеразной цепной реакции (ПЦР) AxyPrep Mag (компания Axygen, Юнион-Сити, штат Калифорния) двухцепочечную кДНК подвергли восстановлению концевых фрагментов, достроили dA-хвост к концевым фрагментам продукта амплификации, а затем обработали смесью ферментов для обработки концевых фрагментов с целью ТА-клонирования. Что касается размера ДНК, соединенной с адаптером, фрагменты длиной до 360 пар нуклеотидных оснований (bp) отобрали с применением набора для очистки после ПЦР AxyPrep Mag (компания Axygen). Полученные образцы амплифицировали на протяжении 11 циклов ПЦР с применением праймеров P5 и P7. Продукты ПЦР очистили с применением набора для очистки после ПЦР AxyPrep Mag (компания Axygen) и провели контроль их качества с применением биоанализатора Agilent 2100 (компания Agilent Technologies). Количественное определение продуктов ПЦР осуществляли с применением флуориметра Qubit 2.0 (компания Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния).

[0055]

Секвенирование осуществляли на секвенаторе Illumina HiSeq (компания Illumina) с применением парно-концевой (PE) конфигурации 2 × 150bp. Анализ изображений и распознавание азотистых оснований осуществляли с применением программного обеспечения системы управления HiSeq (HCS) + OLB + GAPipeline-1.6 (компания Illumina). Секвенирование произвели в компании GENEWIZ (Саут-Плейнфилд, штат Нью-Джерси).

[0056]

<Анализ дифференциальной экспрессии>

Анализ дифференциальной экспрессии осуществляли с применением программного пакета DESeq Bioconductor. Уровень ложноположительных результатов (FDR) корректировали с применением метода Бенджамини и Хохберга. Значение вероятности (p-значение) < 0,05 признали статистически значимым.

[0057]

<Совместное культивирование кардиомиоцитов и фибробластов>

На 384-луночный планшет (компания Thermo Fisher Scientific) нанесли матрикс из базальной мембраны Матригель (компания Corning, Корнинг, штат Нью-Йорк), разведенный в соотношении 1:30 со средой DMEM с высоким содержанием глюкозы, в количестве 100 мкл на лунку при температуре 37°C за 1 час до заселения клеток. Кардиомиоциты иПС-КМ и фибробласты культивировали совместно в среде DMEM + 10% сыворотка новорожденных телят (NBCS) в соотношении 8:2 (кардиомиоциты: фибробласты = 16000:4000 (клеток на лунку)).

На 10 день после начала совместного культивирования клетки закрепили 4% раствором формальдегида и произвели их иммунофлюоресцентное окрашивание. Анализ окрашенных образцов осуществляли с применением анализатора клеток IN 2200 (компания GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) и программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.92 (компания GE Healthcare).

[0058]

<Подготовка и эхокардиография у крысы с моделью хронической сердечной недостаточности>

Бестимусных крыс (F344/NJcl-rnu/rnu, 8 недель, самцы) приобрели у компании CLEA Japan (Токио, Япония). После акклиматизации продолжительностью в 1 неделю каждому животному выполнили ингаляционную анестезию 2% изофлюраном (вспомогательный анестетик; веселящий газ: кислород=7:3) с применением аппарата для ингаляционной анестезии у подопытных животных (Soft Lander (корпорация Shin-ei Industries, Сайтама, Япония)), а затем состригли шерсть. Сразу же после этого произвели интубацию трахеи, и в аппарат для искусственной вентиляции легких напрямую подали газовую смесь для ингаляционной анестезии, содержащую от 0,5 до 2% изофлюрана (вспомогательный анестетик; веселящий газ: кислород=7:3), с целью поддержания анестезии. В условиях искусственного управления дыханием животное зафиксировали в положении лежа на спине и произвели торакотомию продольным разрезом, через хрящевую часть ребер, на два или три ребра между третьим и пятым ребрами слева. Операционное поле расширили при помощи ранорасширителя и отделили перикард, чтобы обнажить сердце. Левый желудочек приподняли, ввели в него лигатуру на глубину около 2 мм и вывели на расстоянии от 4 до 5 мм с применением атравматичной слабо изогнутой иглы круглого сечения, предназначенной для кровеносных сосудов (6-0: Nescosuture). Оба конца лигатуры сложили вместе и провели их сквозь петлю, изготовленную из полиэтиленовой трубки. Лигатуру натянули при помощи артериального зажима (петлевой метод), чтобы вызвать локальную ишемию путем пережатия коронарной артерии на 30 минут. После этого произвели реперфузию. После стабилизации состояния животного убедились в отсутствии кровотечения, произвели дренирование грудной клетки, а затем наложили швы на мышечный слой и кожу. На кожу наложили внутрикожный шов. После заживления швы удалили в зависимости от отслеживаемого послеоперационного состояния. Через неделю после препарирования модельного животного, а иначе говоря, за один день до введения ему клеток, произвели эхокардиографическое измерение с применением диагностического аппарата для визуализации ультразвуковых изображений (Xario SSA-660A, компания Toshiba Medical Systems, Тотиги, Япония). Особей, у которых фракция выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ = (внутренний диаметр левого желудочка в диастолу в 3 степени (LVIDd3) - внутренний диаметр левого желудочка в систолу в 3 степени (LVIDs3)) / LVIDd3) составила не более 55%, стали рассматривать как модель хронической сердечной недостаточности и подвергли эксперименту по введению фибробластов.

[0059]

<Введение фибробластов крысе с моделью хронической сердечной недостаточности>

В день введения исследуемого препарата криоконсервированные фибробласты разморозили, развели со средой DMEM с высоким содержанием глюкозы + 10% NBCS и ввели каждой особи по 2,0 × 10⁶ клеток в 50 мкл клеточной суспензии из расчета по числу живых клеток. Испытания проводились с N = 4 для групп, получивших фибробласты A-HCF и uA-HCF, и с N = 3 для группы, получившей фибробласты uA90-HCF. Во время поддержания анестезии тем же способом, что и при препарировании модельного животного, в условиях искусственного управления дыханием животным при помощи катетера с иглой размера 30-G ввели клеточную суспензию общим объемом 50 мкл в область инфаркта миокарда раздельно в двух местах. После стабилизации состояния животного убедились в отсутствии кровотечения и утечки введенной жидкости, произвели дренирование грудной клетки, а затем наложили швы на мышечный слой и кожу. На кожу наложили внутрикожный шов. После заживления швы удалили в зависимости от отслеживаемого послеоперационного состояния.

[0060]

<Определение функций сердца у крысы с моделью хронической сердечной недостаточности с применением эхокардиографии>

За крысой с моделью хронической сердечной недостаточности, которой ввели фибробласты, проводили динамическое наблюдение с выполнением эхокардиографических измерений при помощи диагностического аппарата для визуализации ультразвуковых изображений (Xario SSA-660A) каждые две недели. В частности, шерсть на груди животного состригли машинкой для стрижки волос и поместили на грудь датчик, чтобы измерить фракцию выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ = (LVIDd3 - LVIDs3) / LVIDd3) и фракцию укорочения левого желудочка (ФУ ЛЖ = (внутренний диаметр левого желудочка в диастолу (LVIDd) - внутренний диаметр левого желудочка в систолу (LVIDs)) × 100/ LVIDd) в M-режиме. Показатели функций сердца предоставили с точностью до одной десятой (с округлением до первого десятичного знака).

[0061]

<Статистический анализ>

Показатели функций сердца представлены как среднее значение ± SE (стандартная ошибка). Прочие данные представлены как среднее значение ± SD (стандартное отклонение). Значимое различие между двумя группами вычислили с применением критерия Стьюдента. Различие вариаций между тремя или большим количеством групп вычислили с применением однофакторного дисперсионного анализа. В дальнейшем значимое различие между тремя группами вычислили с применением критерия множественных сравнений Тьюки-Крамера. Значимость различия считалась доказанной, когда p-значение было менее, чем 0,05. Все статистические показатели вычисляли с применением программной среды R.

[0062]

Результаты проведенных экспериментов будут представлены ниже.

<Увеличение уровня экспрессии CD106 и CD90 в фибробластах сердца под влиянием ФНО-α и ИЛ-4>

Фибробласты сердца взрослого (A-HCF) обработали ФНО-α в различных концентрациях, культивировали в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней, а затем определили процентную долю CD106-положительных клеток (%) и процентную долю CD90-положительных клеток (%) с применением проточного цитометра. Результаты показаны на ФИГ. 1.

Кроме того, фибробласты сердца взрослого (A-HCF) обработали ИЛ-4 в различных концентрациях, культивировали в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней, а затем определили процентную долю CD106-положительных клеток (%) и процентную долю CD90-положительных клеток (%) с применением проточного цитометра. Результаты показаны на ФИГ. 2.

Как явствует из результатов, добавление ФНО-α или ИЛ-4 увеличило процентную долю (%) CD106-положительных клеток и процентную долю (%) CD90-положительных клеток.

[0063]

На следующем этапе фибробласты сердца взрослого (A-HCF) обработали комбинацией двух факторов, ФНО-α и ИЛ-4, культивировали в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней, а затем определили процентную долю CD106-положительных клеток (%) и процентную долю CD90-положительных клеток (%) с применением проточного цитометра. Результаты показаны на ФИГГ. 3-1 и 3-2. Как явствует из ФИГ. 3-1, добавление комбинации двух факторов, ФНО-α и ИЛ-4, показанное на B, значительно увеличило процентную долю (%) CD106-положительных клеток и процентную долю (%) CD90-положительных клеток по сравнению с контрольным образцом (необработанным), показанным на A.

[0064]

Кроме того, фетальные фибробласты сердца (F-HCF) и полученные из клеток иПС фибробласты сердца (i-HCF) обработали комбинацией двух факторов, ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл), культивировали в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней, а затем определили процентную долю CD106-положительных клеток (%) и процентную долю CD90-положительных клеток (%) с применением проточного цитометра. Результаты показаны на ФИГГ. 4-1 и 4-2.

Как видно из ФИГГ. 4-1 и 4-2, даже если фибробласты сердца получены из различных источников, добавление комбинации двух факторов, ФНО-α и ИЛ-4, значительно увеличило процентную долю (%) CD106-положительных клеток и процентную долю (%) CD90-положительных клеток.

[0065]

На следующем этапе выполнили дифференциальный анализ экспрессии генов для следующих клеток: фибробласты A-HCF; фибробласты uA-HCF, у которых процентная доля CD106- и CD90-положительных клеток увеличили путем культивирования фибробластов A-HCF на протяжении 3 дней в среде HFDM-1 (+), дополненной комбинацией двух факторов, ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл); и фибробласты uA90⋅106-HCF, полученные при помощи клеточной сортировки для отбора только CD106- и CD90-двойных положительных клеток из фибробластов uA-HCF, с применением в качестве контрольного образца фибробластов F-VCF со значительно увеличенной процентной долей CD106- и CD90-положительных клеток, а также фибробластов F-VNCF, процентная доля CD106-положительных клеток в которых была значительно уменьшена при помощи клеточной сортировки фибробластов F-HCF с антителом к CD106. Результаты показаны на ФИГ. 5. На ФИГ. 5 показано, что у различных типов фибробластов сердца наблюдается значительное различие уровней экспрессии гена, кодирующего белок гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Было показано, что уровни экспрессии гена Г-КСФ в фибробластах F-VNCF, F-VCF и A-HCF (FPKM Г-КСФ нормировано по FPKM β-актина) составили 0,000178, 0,000125 и 0,000553, соответственно, в то время как уровень экспрессии у фибробластов uA-HCF составил 0,101496, а у фибробластов - uA90⋅106-HCF 0,229072. Было показано, что если значение показателя для фибробластов F-VCF принято за 1, то уровни экспрессии гена Г-КСФ в фибробластах F-VNCF и A-HCF (кратное увеличение FPKM Г-КСФ нормировано по FPKM β-актина) составили 1,42 and 4,41, соответственно, в то время как уровень экспрессии составил 810,21 в фибробластах uA-HCF и 1828,61 в фибробластах uA90⋅106-HCF.

[0066]

Таким образом, было показано, что добавление комбинации двух факторов, ФНО-α и ИЛ-4, к фибробластам A-HCF успешно увеличило процентную долю CD106- и CD90-положительных клеток, таким образом значительно увеличивая уровень экспрессии Г-КСФ. Также было показано, что клеточная сортировка фибробластов uA-HCF успешно увеличила процентную долю CD106- и CD90-положительных клеток, таким образом дополнительно увеличивая уровень экспрессии Г-КСФ. Согласно информации, полученной в ходе предшествующих исследований, Г-КСФ уменьшает гибель кардиомиоцитов, ассоциированную с сердечной недостаточностью, и предотвращает прогрессирование ремоделирования миокарда, а также было установлено, что Г-КСФ способствует клеточному росту кардиомиоцитов. Данные результаты свидетельствуют о том, что фибробласты uA-HCF, uA90-HCF, uA106-HCF и uA90⋅106-HCF, уровень экспрессии Г-КСФ в которых искусственно увеличили с применением ФНО-α и ИЛ-4, демонстрируют высокие показатели клеточного роста кардиомиоцитов и выраженный терапевтический эффект в отношении сердечной недостаточности.

[0067]

<Влияние фибробластов сердца с увеличенными уровнями экспрессии CD106 и CD90 на рост кардиомиоцитов человека, полученных из клеток иПС>

Фибробласты сердца с увеличенной процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток приготовили согласно описанию в таблице 1, посредством добавления комбинации двух факторов, ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл), культивирования в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней. Кроме того, в качестве контрольного образца приготовили фибробласты сердца, культивированные без добавления ФНО-α и ИЛ-4.

Приготовленные фибробласты сердца с увеличенной процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток подвергли клеточной сортировке с применением антитела к CD90 или антитела к CD106, успешно и эффективно собрав таким образом CD106- и CD90-двойные положительные (ДП) фибробласты.

[0068]

[0069]

На следующем этапе каждый тип фибробластов сердца, показанный в таблице 1, культивировали совместно с кардиомиоцитами, полученными из клеток иПС (иПС-КМ), с целью определить влияние фибробластов сердца на рост миокарда. В качестве кардиомиоцитов иПС-КМ применяли клетки, 92,22% которых были положительными по сердечному тропонину T (cTnT), маркеру, специфичному для кардиомиоцитов. Фибробласты и кардиомиоциты иПС-КМ совместно культивировали на протяжении 10 дней, после чего определили численность кардиомиоцитов с двойной положительностью по Ki67 и по сердечному тропонину T (cTnT), находящихся в состоянии пролиферации. Результаты показаны на ФИГ. 6.

На ФИГ. 6 показано, что совместное культивирование с фибробластами uA90-HCF при добавлении ФНО-α и ИЛ-4 привело к увеличению количества кардиомиоцитов в состоянии пролиферации по сравнению с аналогичным показателем для фибробластов A-HCF, в то время как совместное культивирование с фибробластами uA90-HCFs и uA106-HCFs привело к значительному увеличению количества кардиомиоцитов в состоянии пролиферации.

[0070]

<Долгосрочный терапевтический эффект фибробластов сердца с увеличенной процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток в отношении хронической сердечной недостаточности у крысы>

Крысам с моделью хронической сердечной недостаточности, которых подготовили описанным выше методом ишемии-реперфузии, ввели интрамиокардиально при помощи шприца фибробласты A-HCF, uA-HCF, и uA90-HCF, показанные в таблице 1, а затем определили терапевтические эффекты различных фибробластов в отношении сердечной недостаточности у крыс с применением эхокардиографии. Диагностические процедуры выполнили с N = 6 для группы с имитацией вмешательства, N = 4 для контрольной группы, N = 7 для группы, получившей фибробласты A-HCF, N = 8 для группы, получившей фибробласты uA-HCF и N = 9 для группы, получившей фибробласты uA90-HCF. Определив процентную долю CD106- и CD90-положительных клеток в каждом типе подготовленных популяций фибробластов с применением проточного цитометра, обнаружили, что среди фибробластов A-HCF было 1,77% CD90- и CD106-двойных положительных клеток (ДП), среди фибробластов uA-HCF было 21,36% ДП и среди фибробластов uA90-HCF было 61,25% ДП. Результаты показаны на ФИГГ. 7-1, 7-2 и 7-3.

Как явствует из ФИГГ. 7-1, 7-2 и 7-3, введение фибробластов A-HCF не показало терапевтического эффекта в отношении сердечной недостаточности, однако фибробласты uA-HCF и uA90-HCF успешно показали значительное увеличение ФВ ЛЖ и ФУ ЛЖ через 4 недели после трансплантации.

Кроме того, сравнительный анализ процентного изменения ФВ ЛЖ и ФУ ЛЖ (дельта-ФВ ЛЖ, дельта-ФУ ЛЖ) под влиянием различных фибробластов показал, что фибробласты uA-HCF и uA90-HCF способствовали увеличению дельта-ФВ ЛЖ и дельта-ФУ ЛЖ по сравнению с таковыми до трансплантации клеток, а фибробласты uA90-HCF способствовали значительному увеличению дельта-ФВ ЛЖ и дельта-ФУ ЛЖ по сравнению с таковыми для фибробластов A-HCF.

[0071]

<Процентная доля Г-КСФ-положительных клеток среди фибробластов человека и увеличение процентной доли Г-КСФ-положительных клеток при добавлении ФНО-α и ИЛ-4>

Фибробласты сердца (uA-HCF) с увеличенной процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток подготовили согласно описанию в таблице 2, путем комбинации двух факторов, ФНО-α (50 нг/мл) и ИЛ-4 (2 нг/мл), и культивировали в среде HFDM-1 (+) на протяжении 3 дней. Затем приготовили фибробласты сердца (uA90⋅106-HCF) путем клеточной сортировки с применением антитела к CD90 и антитела к CD106. Кроме того, в качестве контрольных образцов подготовили фибробласты сердца (A-HCF), фетальные CD106-отрицательные фибробласты сердца (F-VNCF), и фетальные CD106-положительные фибробласты сердца (F-VCF), которые культивировали без добавления ФНО-α и ИЛ-4.

[0072]

[0073]

Определив процентную долю Г-КСФ-положительных клеток среди каждого типа фибробластов методом проточной цитометрии, обнаружили, что среди фибробластов F-VNCF было 9,04% Г-КСФ-положительных клеток, среди фибробластов F-VCF - 4,35%, среди фибробластов A-HCF - 6,75%, среди фибробластов uA-HCF - 24,70%, а среди фибробластов uA90⋅106-HCF - 92,50% (ФИГ. 8). Полученные результаты свидетельствуют о том, что естественно присутствующие CD106-положительные клетки (F-VCF) характеризуются низкой процентной долей Г-КСФ-положительных клеток, а CD106-положительные и/или CD90-положительные фибробласты сердца, произведенные искусственно путем контакта с ФНО-α и ИЛ-4, показали увеличенную процентную долю Г-КСФ-положительных клеток, поскольку процентная доля CD106- и/или CD90-положительных клеток также была увеличена.

[0074]

<Долгосрочный терапевтический эффект фибробластов сердца с увеличенной процентной долей CD90- и CD106-положительных клеток в отношении хронической сердечной недостаточности у крысы>

Крысам с моделью хронической сердечной недостаточности, которых подготовили описанным выше методом ишемии-реперфузии, ввели интрамиокардиально при помощи шприца фибробласты A-HCF, uA-HCF, и uA90-HCF, а затем определили долгосрочные терапевтические эффекты различных фибробластов в отношении сердечной недостаточности у крыс с применением эхокардиографии. Результаты исследования не показали терапевтического эффекта от введения фибробластов A-HCF в отношении сердечной недостаточности, а через 18 недель после трансплантации результаты показали, что ФВ ЛЖ составила 44,1 ± 2,8%, а ФУ ЛЖ составила 17,8 ± 1,4% (ФИГГ. 9-1 и 9-2 A и C). Фибробласты uA90-HCF после клеточной сортировки с применением антигена CD90 в качестве маркера способствовали увеличению ФВ ЛЖ и ФУ ЛЖ в долгосрочном периоде (через 12 недель после трансплантации), а через 18 недель после трансплантации ФВ ЛЖ составила 61,0 ± 2,2% и ФУ ЛЖ составила 27,2 ± 1,4%.

[0075]

Кроме того, сравнительный анализ процентного изменения ФВ ЛЖ и ФУ ЛЖ (дельта-ФВ ЛЖ, дельта-ФУ ЛЖ) под влиянием различных фибробластов показал, что у группы, получившей фибробласты A-HCF, значение дельта-ФВ ЛЖ составило -6,9 ± 2,6%, а значение дельта-ФУ ЛЖ составило -3,5 ± 1,3% через 18 недель после трансплантации (ФИГГ. 9-2 B и 9-2 D). С другой стороны, у группы, получившей фибробласты uA-HCF, значение дельта-ФВ ЛЖ составило -1,8 ± 3,4%, а значение дельта-ФУ ЛЖ составило -0,6 ± 1,8% через 18 недель после трансплантации. У группы, получившей фибробласты uA90-HCF, значение дельта-ФВ ЛЖ составило 9,2 ± 2,6%, а значение дельта-ФУ ЛЖ составило 5,6 ± 1,6% через 18 недель после трансплантации. Таким образом, выяснилось, что фибробласты uA90-HCF обеспечили возможность для значительного улучшения функций повреждённых тканей миокарда в долгосрочном временном периоде. Подробные сведения о первичных конечных точках исследования (ФВ ЛЖ и ФУ ЛЖ) вторичных конечных точках (конечный диастолический объем левого желудочка (КДО ЛЖ), конечный систолический объем левого желудочка (КСО ЛЖ), внутренний диаметр левого желудочка в диастолу (LVIDd), внутренний диаметр левого желудочка в систолу (LVIDs), толщина передней стенки левого желудочка в конце диастолы (LVAWd), толщина задней стенки левого желудочка в конце диастолы (LVPWTd) и частота сердечных сокращений (ЧСС)) показаны в таблицах 3-11.

[0076]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[0082]

[0083]

[0084]

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов. Также настоящее изобретение обеспечивает популяцию клеток Г-КСФ-положительных фибробластов и фармацевтические композиции для лечения заболеваний сердца, содержащие фибробласты. Способ получения CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов включает этап культивирования фибробластов в присутствии по меньшей мере одного фактора, выбранного из группы, состоящей из ФНО-α и ИЛ-4, с увеличением числа CD106-положительных и/или CD90-положительных фибробластов. 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 11 табл., 1 пр.

1. Фармацевтическая композиция для улучшения функций сердца, содержащая популяцию клеток, содержащую выделенные CD106-положительные и Г-КСФ-положительные фибробласты сердца и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, причем

процентная доля по числу клеток CD106-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 10% или более и

процентная доля по числу клеток Г-КСФ-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 10% или более.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где процентная доля по числу клеток CD90-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 40% или более.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где процентная доля по числу клеток CD106-положительных и CD90-положительных фибробластов среди фибробластов составляет 1,77% или более.