СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИАГРЕГАНТНОГО ПРЕПАРАТА В ОБРАЗЦАХ ЦЕЛЬНОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N33/96 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки эффективности антиагрегантного препарата в образцах цельной периферической крови.

Процесс свертывания крови представляет собой каскад последовательных реакций, запускающийся при повреждении сосудистой стенки, конечной целью которого является образование гемостатической пробки в месте повреждения сосуда. Центральную роль в этом процессе играют тромбоциты, так как при повреждении кровеносного сосуда именно они первыми оказываются в зоне поражения, что приводит к их активации, агрегации и привлечению новых тромбоцитов и других форменных элементов крови (лейкоциты, эритроциты), принимающих непосредственное участие в гемостатических реакциях. Возникающие при этом межклеточные взаимодействия являются неотъемлемой частью процесса свертывания крови и характеризуются не только образованием связей между клетками, но и их взаимной активацией для реализации согласованного ответа на воздействия повреждающих и патологических факторов [Шитикова А.С. Тромбоцитопатии, врожденные и приобретенные. Под ред. Л.Н. Папаян, О.Г. Головиной. СПб.: ООО «Бастион», 2008. 320 с.]. Активированные тромбоциты, вступая в непосредственный контакт с иммунокомпетентными клетками, формируют тромбоцитарно-лейкоцитарные комплексы и могут модулировать фенотипические и функциональные свойства лейкоцитов, входящих в состав этих комплексов. Особое внимание привлекают комплексы тромбоцитов с моноцитами, так как именно моноциты обладают уникальными свойствами: это единственные клетки, на поверхности которых имеется возможность для сборки и функционирования всех ферментативных компонентов системы свертывания крови [Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М. - Тверь: ООО «Триада», 2005. 227 с.].

Применение антиагрегантных препаратов, направленных на подавление реакций активации тромбоцитов и используемых в терапии и профилактике тромбоэмболических осложнений, значительно снизило риск их развития. Однако, при этом сохраняется высокий риск осложнений и побочных эффектов в силу того, что при ингибировании одной группы реакций системы гемостаза сохраняются альтернативные пути ее активации.

Для оценки эффективности антиагрегантных препаратов применяются различные подходы, связанные с искусственной предварительной активацией тромбоцитов in vitro [Sharma P., Sachdeva M.S., Kumar N. et al. A comparative study between light transmission aggregometry and flow cytometric platelet aggregation test for the identification of platelet function defects in patients with bleeding. Blood Res. 2021;56(2):109-18. DOI: 10.5045/br.2021.2020232]. Одним из основных методов исследования функциональной активности тромбоцитов является метод оптической АДФ-индуцированной агрегатометрии, позволяющий интегрально оценить функциональную активность тромбоцитов. - Этот метод позволяет оценить агрегацию тромбоцитов между собой (гомотипическая агрегация), но не дает возможности оценивать взаимодействие с другими типами клеток, вовлеченных в процесс свертывания крови (гетеротипическая агрегация).

Метод проточной цитофлуориметрии позволяет не только определить экспрессию поверхностных рецепторов, которые непосредственно связаны с гиперагрегацией тромбоцитов, но и охарактеризовать межклеточные взаимодействия тромбоцитов, приводящие к формированию тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов, что может иметь значение как для оценки тромбообразования, так и для характеристики повреждения клеток и тканей в процессе развития каскада гемостазиологических реакций.

Кроме того, существующие методы оценки действия антиагрегантов не позволяют охарактеризовать возможные долговременные эффекты, обусловленные их воздействием на другие клетки.

На сегодняшний день не существует стандартизованного интегрального способа определения гемостатической функции крови. Объективная оценка данного процесса in vitro чрезвычайно затруднена, так как уже при взятии образца для анализа (венепункции) запускаются механизмы свертывания крови. В этой связи представляется актуальным поиск адекватных способов оценки агрегационного потенциала крови и антиагрегантных свойств фармакологических препаратов с целью выработки эффективного способа лечения различных тромбофилических состояний.

Известен способ исследования антиагрегационного действия препаратов (патент RU 2 188 419 С2 от 2002 года), согласно которому эффективность действия препарата оценивается по АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов с помощью оптического агрегометра. При этой методике кровь подвергается центрифугированию, что необходимо для отделения тромбоцитов от форменных элементов крови (эритроциты, лейкоциты). Однако, такая манипуляция вызывает активацию клеток и, следовательно, приводит к искажению получаемых данных. Кроме того, при таком подходе не учитывается тот факт, что роль тромбоцитов в гемостазе не ограничивается формированием только гомотипических тромбоцитарных агрегатов. Активированные тромбоциты способны взаимодействовать с лейкоцитами, при этом активирующие сигналы, возникающие при связывании тромбоцитов с лейкоцитами, вызывают секрецию провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли, моноцитарный хемотаксический протеин и пр.), повышают активность лейкоцитарных интегринов, индуцируют дифференцировку моноцитов в макрофаги, стимулируют экспрессию тканевого фактора, являющегося наиболее сильным активатором свертывания крови. Все это ведет к усилению активации системы гемостаза и, в конечном итоге, к тромбозу.

Наиболее близким к предлагаемому нами подходу является способ оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов (RU 2 442 167 С1 от 10.02.2012 года), при котором исследуют тромбоциты в цельной крови, не подвергая ее центрифугированию. Он заключается в количественном определении экспрессии рецепторов GP IIb-IIIa и Р-селектина до и после добавления индуктора активации тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. Однако, данная методика также не учитывает взаимодействие тромбоцитов с другими типами клеток.

Техническим результатом изобретения является повышение объективности оценки, возможность интегральной оценки влияния антиагрегантных препаратов на систему гемостаза с учетом различного механизма их действия, возможность оценить не только влияние тестируемого препарата на тромбоциты, но и его возможные эффекты в отношении межклеточных взаимодействий, характеризующих непосредственное участие клеток в гемостатических реакциях, в результате чего появляется возможность осуществлять индивидуальный подбор препаратов для антиагрегантной терапии.

Указанный технический результат достигается в способе оценки эффективности антиагрегантного препарата в образцах цельной периферической крови путем определения тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК), в котором в образце крови определяют уровень АДФ-индуцированных ТМК без и в присутствии тестируемого антиагрегантного препарата и если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата выше, чем без него, то антиагрегантный препарат считают неэффективным, если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата ниже, чем без него или сохраняется на исходном уровне, то антиагрегантный препарат считают эффективным.

Способ иллюстрируется фиг. 1-8, где:

На фиг. 1 - Репрезентативная гистограмма, иллюстрирующая стратегию гейтирования при определении тромбоцитарно-моноцитарных комплексов;

На Фиг. 2 - Скорость и степень АДФ-индуцированного образования тромбоцитов при действии ацетилсалициловой кислоты (АСК) и эптифибатида, определенные методом оптической агрегатометрии;

На Фиг. 3 - Уровни экспрессии CD62P и CD41a на АДФ-индуцированных тромбоцитах, при действии АСК и эптифибатида, определенные методом проточной цитофлуориметрии;

На Фиг. 4 - Влияние препаратов АСК и эптифибатида на образование АДФ-стимулированных тромбоцитарно-моноцитарных комплексов;

На Фиг. 5 - АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов без добавления антиагрегантного препарата;

На фиг. 6 - АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов под влиянием антиагрегантного препарата Эптифибатид;

На фиг. 7 - АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов без добавления антиагрегантного препарата;

На Фиг. 8 - АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов под влиянием антиагрегантного препарата Эптифибатид

Заявляемый способ основан на обследовании 22 относительно здоровых женщин репродуктивного возраста (26,0±4,7 лет). Критериями исключения были наличие заболеваний, связанных с нарушением свертываемости крови; беременность; прием лекарственных препаратов, влияющих на свертывание крови (антиагреганты, антикоагулянты); гормональных контрацептивов; противовоспалительных и антибактериальных препаратов. Кровь забиралась во вторую фазу менструального цикла.

В качестве испытуемых антиагрегантных препаратов были выбраны ацетилсалициловая кислота (АСК) и эптифибатид, обладающие различными механизмами действия.

Механизм действия АСК основан на блокировании циклооксигеназы, что приводит к подавлению синтеза тромбоксана А2, являющегося самым сильным агонистом агрегации тромбоцитов.

Эптифибатид блокирует конечную и общую для всех индукторов стадию агрегации тромбоцитов - связывание фибриногена с рецептором GPIIb/IIIa на тромбоцитах, препятствуя образованию связей между активированными тромбоцитами и таким образом полностью блокируя агрегацию тромбоцитов между собой.

Было установлено, что АСК подавляет скорость и степень агрегации тромбоцитов, измеренную методом стандартной агрегатометрии (Фиг 2). Также под влиянием АСК происходило снижение экспрессии CD62P и CD41a на свободных тромбоцитах (Фиг 3). Уровень ТМК под действием АСК уменьшался либо не изменялся (Фиг 4). Данные эффекты согласуются с механизмом действия препарата: ингибирование циклооксигеназы ведет к подавлению синтеза тромбоксана А2, стимулирующего секрецию активных факторов из альфа-гранул тромбоцитов, в том числе и Р-селектина. В результате наблюдается снижение функциональной активности тромбоцитов.

Эптифибатид также подавлял скорость и степень агрегации тромбоцитов, измеренную методом стандартной агрегатометрии (Фиг 2), при этом происходило увеличение экспрессии CD62P и CD41a на свободных тромбоцитах (Фиг 3). При этом установлено, что у части пациентов эптифибатид оказывал протромбогенный эффект, характеризующийся повышением уровня ТМК (фиг 4).

Увеличение экспрессии CD62P и CD41a на тромбоцитах и выраженное подавление скорости и степени агрегации тромбоцитов при обработке эптифибатидом объясняется механизмом действия этого препарата, а именно, блокированием финальной стадии агрегации - связывания фибриногена с рецептором GPIIb/IIIa. Таким образом, эптифибатид препятствует агрегации активированных тромбоцитов между собой. При этом активированные тромбоциты могут взаимодействовать с моноцитами, образуя ТМК. Повышенный уровень образования комплексов является показателем недостаточной антитромботической активности препарата.

Таким образом, если уровень ТМК под воздействием антиагрегантного препарата не снижается, а, наоборот, повышается, то антиагрегантная способность данного препарата не может считаться вполне эффективной. Если под воздействием препарата происходит снижение или сохранение исходного уровня ТМК, то его антиагрегантную способность можно считать эффективной.

Способ осуществляют, например, следующим образом:

I. Порядок исследования.

1. Подготовка рабочих растворов и реагентов:

1.2. Моноклональные антитела для идентификации тромбоцитарно-лейкоцитарных комплексов, меченные флуорохромами CD41a-APC, CD45-FITC, CD14-PE.

1.4. АДФ лиофильно высушенный с концентрацией 1 мМ/фл

1.5. лизирующий раствор (BD FACS Lysing Solution)

2. Подготовка необходимых материалов:

2.1 Пробирки для проточной цитометрии

2.2 Наконечники для дозаторов переменного объема до 1000 мкл.

2.3. Наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл.

2.4. наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл.

3. Подготовка необходимого оборудования:

3.1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.

3.2. Набор механических дозаторов переменного объема.

3.3. Холодильник 6+2°С.

3.4. Проточный цитофлюориметр оборудованный 488 нм и 633 нм лазером.

3.5 Термостат с поддержанием температуры 37°С

II. Порядок работы.

1. Подготовить пробирки для проточной цитометрии, подписать, пронумеровать из расчета на одного пациента: одна контрольная пробирка и две опытные.

3. Провести взятие крови из локтевой вены в вакутейнер с антикоагулянтом (3,8% цитрат натрия)

4. Перемешать, плавно покачивая пробирку с кровью, для смешивания крови с антикоагулянтом.

6. В подготовленные пробирки для проточной цитометрии внести по 50 мкл цельной крови.

7. В контрольную пробирку добавить 5 мкл физиологического раствора (0,9% NaCl), в опытные раствор АСК в конечной концентрации 0,25 мг/мл и раствора эптифибатида в конечной концентрации 0,2 мг/мл.

8. Инкубировать 5 минут при 37°С

9. Добавить АДФ в конечной концентрации 2 мкмоль/л

10. Инкубировать 5 минут при 37°С

11. Добавить моноклональные антитела для идентификации тромбоцитарно-моноцитарных комплексов CD41a-APC, CD45-FITC, CD41-PE в количестве, соответствующему рекомендациям производителя антител.

12. Инкубировать в темноте при комнатной температуре, в течение 15 минут

13. Добавить 450 мкл лизирующего раствора

14. Инкубировать в темноте 15 минут

III. Алгоритм обсчета результатов исследования:

Анализ тромбоцитарно-моноцитарных комплексов проводят на проточном цитофлуориметре. Анализируется 50000 событий. На гистограмме CD45-FITC/CD14-PE выделяют регион, соответствующий популяции моноцитов. Для анализа комплексов тромбоцитов с моноцитами события из соответствующего региона «проецируют» на двумерную гистограмму CD41a-APC/CD14-PE и подсчитывают количество событий в соответствующем квадранте CD14+CD41+(Фиг. 1).

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациентка А. АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов без добавления антиагрегантного препарата составило 74%, с добавлением антиагрегантного препарата Эптифибатид - 92%. Наблюдается повышение образования ТМК с антиагрегантным препаратом, следовательно, антиагрегантная способность данного препарата считается неэффектив ной (Фиг. 5, 6).

Пример 2. Пациентка Б. АДФ-индуцированное образование тромбоцитарно-моноцитарных комплексов без добавления антиагрегантного препарата составило 72%, с добавлением антиагрегантного препарата Эптифибатид - 61%. Наблюдается снижение образования ТМК с антиагрегантным препаратом, следовательно, антиагрегантная способность данного препарата считается эффективной (Фиг. 7, 8).

Заявляемый способ повышает объективность оценки эффективности тестируемых антиагрегантных препаратов, позволяет провести интегральную оценку влияния антиагрегантных препаратов на систему гемостаза с учетом различного механизма их действия. Такой подход позволяет оценить не только влияние тестируемого препарата на тромбоциты, но и его возможные эффекты в отношении межклеточных взаимодействий, характеризующих непосредственное участие клеток в гемостатических реакциях. В результате такого тестирования появляется возможность осуществлять индивидуальный подбор препаратов для антиагрегантной терапии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки эффективности антиагрегантного препарата в образцах цельной периферической крови. Предлагается способ оценки эффективности антиагрегантного препарата в образцах цельной периферической крови путем определения тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК), согласно изобретению в образце крови определяют уровень АДФ-индуцированных ТМК без и в присутствии тестируемого антиагрегантного препарата и если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата выше, чем без него, то антиагрегантный препарат считают неэффективным, если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата ниже, чем без него, или сохраняется на исходном уровне, то антиагрегантный препарат считают эффективным. Вышеуказанное изобретение позволяет повысить объективность оценки, дает возможность интегральной оценки их влияния на систему гемостаза с учетом различного механизма их действия, возможность оценить не только влияние тестируемого препарата на тромбоциты, но и его возможные эффекты в отношении межклеточных взаимодействий, характеризующих непосредственное участие клеток в гемостатических реакциях. 8 ил., 2 пр.

Способ оценки эффективности антиагрегантного препарата в образцах цельной периферической крови путем определения тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК), отличающийся тем, что в образце крови определяют уровень АДФ-индуцированных ТМК без и в присутствии тестируемого антиагрегантного препарата и если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата выше, чем без него, то антиагрегантный препарат считают неэффективным, если уровень АДФ-индуцированных ТМК в присутствии препарата ниже, чем без него, или сохраняется на исходном уровне, то антиагрегантный препарат считают эффективным.