Пептидное лекарственное средство Российский патент 2024 года по МПК A61K38/10 C07K7/08 A61P29/00 

Заявляемое изобретение относится к биологически активным пептидам, обладающим противовоспалительными свойствами за счет способности ингибировать миграцию моноцитарных клеток крови, стимулированную белком МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1). Указанные соединения могут найти применение при лечении болезней, связанных с миграцией моноцитов и требующих длительной терапии, таких как атеросклероз, псориаз, ревматоидный артрит, дерматит и др.

Ингибирующая активность в отношении миграции моноцитарных клеток крови впервые была обнаружена у укороченных пептидных аналогов МСР-1 человека, а именно, соответствующих остаткам 8-76, 9-76, 10-76 и 11-76 материнского белка [J.-H. Gong, I. Clark-Lewis. J. Exp.Med., 1995, 18: 631-640]. Это открытие послужило началом для разработок по созданию антагонистов МСР-1 с более короткими аминокислотными последовательностями. Были получены пептиды, состоящие из 12 L-аминокислотных остатков с последовательностями EICADPKQKWVQ (линейный пептид peptide 3) и EICLDPKQKWIQ (линейный пептид [Leu⁴;Ile¹¹]-peptide 3), а также из 11 D-аминокислотных остатков с последовательностью CLDPKQKWIQC (циклический пептид NR58-3.14.3) [Reckless J., Grainger D.L. Biochem J., 1999, 340(3):803-811; Reckless J., Tatalick L.M., Grainger D.L. Immunology, 2001, 103(2): 24454]. При этом эффективность пептидов [Leu⁴;Ile¹¹]-peptide 3 и NR58-3.14.3 в качестве ингибиторов миграции моноцитов крови в экспериментах in vitro выше эффективности пептида peptide 3 в 20 и 1000 раз, соответственно.

Однако указанные пептиды либо синтезированы из D-аминокислот, что значительно усложняет их синтез и увеличивает стоимость продукта, либо обладают недостаточной эффективностью и селективностью. Кроме того, при использовании D-аминокислот всегда существует риск проявления токсичности, так как пептид уже не является частью эндогенной молекулы МСР-1, состоящей из L-аминокислот.

Наиболее близким по составу и проявляемым свойствам к заявляемому пептиду является 12-тичленный пептид DHLDKQTQTPKT [RU 2260598, кл. МПК C07K 7/08, A61K 38/10, 2005, бюлл. №26]. Указанный пептид состоит из L- аминокислот и способен ингибировать подвижность клеток, стимулированную хемокином МСР-1; он предназначен для использования в кардиологии для покрытия стентов при ангиопластике с целью предупреждения рестенозов.

Впоследствии выяснилось, что олигопептид DHLDKQTQTPKT был выбран авторами патента RU 2260598 из более чем десятка потенциально активных пептидных фрагментов, так как только он проявил ингибирующую активность в экспериментах по миграции моноцитарных клеток крови [Кухтина Н.Б. Моноцитарный хемотоксический белок МСР-1 как фактор воспаления при атерогенезе. Разработка пептидного ингибитора МСР-1. Автореф. дисс. на получение степени канд. медицин. наук, Москва, 2009]. Таким образом, способность к ингибированию подвижности клеток, стимулированной хемокином МСР-1, не является очевидным свойством 10-12-тичленных олигопептидов.

В RU 2260598 не приведены свойства полученных пептидов, такие как наличие или отсутствие токсичности, а также растворимость в воде, физиологическом растворе, буферном растворе и плазме крови, необходимые для решения вопросов медицинского применения; указывается лишь, что кроме покрытия стентов, эти пептиды могут быть использованы как лекарственные средства. Однако, поскольку свойства пептидов не указаны, трудно судить, в качестве каких лекарств они могут применяться.

Задачей, поставленной в заявляемом изобретении, является синтез нового 13-членного олигопептида, способного ингибировать миграцию моноцитарных клеток, стимулированную белком МСР-1.

Указанная задача решается синтезом олигопептида формулы:

Лизил-триптофанил-валил-глутаминил-аспартил-серил-изолейцил-аспарагинил-тирозил-лейцил-аспарагинил-лизил-лизин-Y (KWVQDSINYLNKK-Y), где Y=NH₂, или его фармацевтически приемлемые соли.

Заявляемый олигопептид получен по стандартной технологии твердофазного пептидного синтеза с использованием Fmoc/Bu^t стратегии [Behrendt R., White P., Offer J. Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis. J. Pept. Sci. 2016; 22: 4-27].

Синтез проводили на полимере Rink Amide (сополимер стирола и дивинилбензола с 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)фенокси-якорной группой) с емкостью 0,67 ммоль/г. В процессе образования пептидной связи к деблокированному полимеру при перемешивании добавляли охлажденную смесь 3 экв. Fmoc-защищенной аминокислоты, 3 экв. этил-2-циано-2-(гидроксиимино)ацетата и 3 экв. диизопропилкарбодиимида в диметилформамиде и оставляли на ночь.

Для удаления Fmoc защиты пептидил-полимер обрабатывали 20% раствором пиперидина в диметилформамиде (1×2 мин; 1×8 мин); промывали диметилформамидом (2×1 мин), изопропиловым спиртом (2×1 мин) и диметилформамидом (3×1 мин). После присоединения Fmoc-Asp(OBut)-OH к раствору пиперидина добавляли 1 М раствор 1-гидроксибензотриазола в диметилформамиде в соотношении 10:1 для предотвращения побочной реакции образования аминосукцинильных производных.

Для отщепления пептида от полимера с одновременным деблокированием к сухому полимеру добавляли смесь трифторуксусной кислоты с 3,6-диоксо-1,8-октандитиолом и триизопропилсиланом в соотношении (95:2.5:2.5) и оставляли на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывали трифторуксусной кислотой (2×1 мин), растворитель упаривали и остаток заливали метил-трет-бутиловым эфиром. Полученный осадок растворяли в воде, промывали н-бутиловым спиртом и очищали с помощью препаративной обращенно-фазовой хроматографии. Раствор очищенного пептида упаривали до небольшого объема и лиофилизовали.

Полученный олигопептид исследовался на предмет биологической активности в следующих тестах:

- противовоспалительные свойства олигопептида определяли по анализу клеточной миграции в камере Бойдена по методике [W. Falk, R.H. Jr. Goodwin, E.J. Leonard. J. Immunol Methods, 1980, 33, 239-247];

- антиокислительную активность синтезированного олигопептида определяли в реакции DPPH по методике [RU 2680604, 2019];

- антиагрегационные свойства олигопептида определяли по АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов крови по методике [Е.А. Пономаренко, А.А. Игнатова, Д.В. Федорова и др., Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2019, 18(3), 112-119].

Пример 1.

Изучение противовоспалительных свойств пептида Противовоспалительные свойства пептида изучались в эксперименте in vitro на модели ингибирования миграции моноцитарных клеток крови, стимулированной белком МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1).

Промоноцитарная клеточная линия ТНР-1 была получена из Американской коллекции клеточных культур (АТСС). Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и 20 мкл меркаптоэтанола.

Анализ клеточной миграции осуществляли в модифицированной камере Бойдена. В нижние ячейки камеры помещали раствор хемоаттрактанта МСР-1 в концентрации 12,5 нМ (100 нг/мл), в верхние - суспензию мононуклеарных клеток (1 млн/мл), все в среде для миграции, состоящей из раствора Хэнкса с добавлением 20 мМ HEPES и 1% бычьего сывороточного альбумина. Исследуемый пептид и смесь аминокислот, из которых состоит пептид, вносили в верхние и нижние ячейки камеры в количестве 1-100 мкг/мл. Верхние и нижние ячейки разделяли пористой мембраной с размером пор 8 мкм, предварительно покрытой фибронектином человека (по 1 мкг белка на 1 см² поверхности мембраны). Камеру Бойдена помещали в СО₂-инкубатор на 1,5 часа. Непромигрировавшие клетки счищали с верхней части мембраны, а клетки, оставшиеся на фильтре, фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Гимза. Мембрану с прокрашенными клетками фотографировали, изображение анализировали с использованием программного обеспечения Scion-Image для Windows Alpha 4.0.3.2 (Scion Corp.). Данные выражали в процентах, принимая за 100% значение, соответствующее количеству промигрировавших клеток в градиенте МСР-1 (положительный контроль). Отрицательным контролем выступали значения, соответствующие количеству промигрировавших клеток в отсутствие градиента МСР-1. Индуцированной МСР-1 миграцией клеток выступала миграция в градиенте МСР-1, спонтанная миграция - в отсутствии градиента МСР-1. Эксперименты проводили в трех повторах.

Результаты проведенного эксперимента показали, что исследуемый пептид дозозависимо подавлял способность ТНР-1 клеток к миграции в присутствии МСР-1. Достоверное ингибирование наблюдалось при внесении препарата в концентрации 10 мкг/мл и выше (табл. 1). Смесь аминокислот при этом при максимальной концентрации 100 мкг/мл не оказывала влияния на МСР-1-зависимую миграцию клеток.

Пример 2.

Изучение антиокислительных (антиоксидантных) свойств пептида Исследование антиоксидантных свойств пептида были проведены при помощи оценки антиокислительной активности (АОА), основанной на колориметрии свободных радикалов в реакции DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), растворенного в метаноле с образцом антиоксиданта по схеме:

DPPH.+АН → DPPH-H+А.

В результате восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в метаноле, а реакция контролируется по изменению оптической плотности при 515 нм методом спектрофотометрии через определенный период времени.

Для проведения анализа готовили реактив: 20 мг 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила помещали в колбу вместимостью 50 мл, доводили до метки метанолом и растворяли при помощи ультразвука в течение 10 мин. Отбирали 5,5 мл данного раствора, помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки метанолом.

Для приготовления испытуемого раствора навеску пептида 5,36 мг растворяли в 1 мл воды.

Для проведения испытания использовали кварцевые кюветы с толщиной слоя 10 мм. В кювету помещали 1 мл реактива и 1 мл испытуемого раствора. Через 15 мин измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 515 нм.

АОА в процентах рассчитывают по формуле:

где:

D₀ - оптическая плотность реактива;

D₁ - оптическая плотность испытуемого раствора.

В результате проведенного исследования была рассчитана антиоксидантная активность пептида, которая составила 29,5% (при концентрации пептида 4,40 мг/мл).

Пример 3.

Изучение антиагрегационных свойств пептида Антиагрегационные свойства пептида изучались в in vitro модели АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов периферической крови добровольцев-женщин фертильного возраста 18-35 лет методами оптической агрегометрии и проточной цитофлюорометрии. Исследуемый пептид использовали в концентрации 0,3 мг/мл. Положительным контролем выступал аспирин (0,25 мг/мл); отрицательным - стерильный раствор 0,9% хлорида натрия.

Содержание активированных тромбоцитов определялось по экспрессии Р-селектина на проточном цитофлуориметре с использованием коммерческих наборов, содержащих моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромами CD62P FITC и CD41a АРС. В полистироловые пробирки для проточной цитометрии добавляли по 50 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы. Пробирки с исследуемыми образцами, с положительным и отрицательным контролями инкубировали 5 мин при 37°С с последующим добавлением АДФ (2 мкМ) и повторной инкубацией при тех же условиях.

После инкубации в каждую пробирку добавляли смесь моноклональных антител CD41a АРС и CD62P FITC, инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре, затем к образцам добавляли 300 мкл изотонического раствора и проводили анализ экспрессии дифференцировочных и активационных маркеров на проточном цитофлуориметре. Анализировали 1000 событий. На двумерной гистограмме с координатами SSC-CD41a АРС выделяли регион, соответствующий тромбоцитам, в котором определяли количество событий (соответствующее экспрессии активационного маркера CD62P) без стимуляции АДФ, после стимуляции АДФ и после стимуляции АДФ с испытуемыми образцами. Экспрессию CD62P и CD41a определяли, как среднюю интенсивность флуоресценции.

В другом эксперименте в контрольную отрицательную, контрольную положительную и опытные кюветы вносили по 400 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы. В опытные кюветы вносили по 50 мкл исследуемых образцов. В контрольную отрицательную кювету вносили 50 мкл физиологического раствора, в контрольную положительную - 50 мкл раствора аспирина. Кюветы инкубировали при температуре 37°С в течение 3 мин. Во все кюветы вносили раствор АДФ (2 мкМ) и измеряли степень и скорость агрегации тромбоцитов с использованием оптического агрегометра «ChronoLog 590» в течение 6 мин. Степень оценивали через максимальное значение амплитуды агрегации в течение времени измерения. Скорость оценивали по наклону кривой агрегации на линейном участке в течение первых 30 сек измерения.

В результате проведенного эксперимента установлено, что аспирин достоверно снижал как количество тромбоцитов, экспрессирующих CD62P (р<0,0001; n=22), так и уровень экспрессии CD62P на тромбоцитах (р=0,0004; n=22), что согласуется с механизмом его действия, основанного на ингибировании циклооксигеназы, что ведет к подавлению синтеза тромбоксана А2 (одного из сильнейших активаторов тромбоцитов), стимулирующих секрецию активных факторов из альфа-гранул тромбоцитов, в том числе Р-селектина. Исследуемый пептид не приводит к увеличению экспрессирующих CD62P тромбоцитов (р=0,43; n=20) или уровня экспрессии CD62P на тромбоцитах (р=0,19; n=20), а, значит, не оказывает стимулирующего эффекта на тромбоциты, что может говорить об отсутствии у пептида тромбогенного потенциала, способствующего нарушениям микроциркуляции.

По результатам оптической агрегометрии установлено, что пептид подавляет агрегационную активность (р=0,0004; n=20) и скорость агрегации (р=0,0002; n=20) тромбоцитов в тесте АДФ-индуцированной агрегации.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии антиагрегационных свойств исследуемого пептида, а также его безопасности в плане возможной активации тромбоцитов, приводящей к гемостазиологическим нарушениям.

Как видно из приведенных примеров, заявляемый новый олигопептид при хорошей растворимости в воде, физиологическом растворе, плазме и буферном растворе (>10 мг/мл) обладает выраженными противовоспалительными свойствами, а также дополнительно обладает потенциально полезными для медицинского применения антиоксидантными и особенно антиагрегационными свойствами.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биологически активным пептидам, обладающим противовоспалительными свойствами за счет способности ингибировать миграцию моноцитарных клеток крови, стимулированную белком МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1). Заявлен 13-членный пептид формулы KWVQDSINYLNKK-Y, где Y=NH₂, обладающий наравне с противовоспалительными дополнительно антиоксидантными и антиагрегационными свойствами, или его фармацевтически приемлемые соли. Указанные соединения могут найти применение при лечении болезней, связанных с миграцией моноцитов и требующих длительной терапии, таких как атеросклероз, псориаз, ревматоидный артрит, дерматит и др. 1 табл., 3 пр.

Обладающий противовоспалительной активностью олигопептид формулы Лизил-триптофанил-валил-глутаминил-аспартил-серил-изолейцил-аспарагинил-тирозил-лейцил-аспарагинил-лизил-лизин-Y (KWVQDSINYLNKK-Y), где Y=NH₂, или его фармацевтически приемлемые соли.