СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ТРОМБОЦИТОВ СПОСОБОМ РОТАЦИОННОГО ПЕРЕМЕШИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ Российский патент 2021 года по МПК C12N5/78 A61K35/19 

Техническая область

[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения тромбоцитов способом ротационного перемешивания.

Уровень техники

[0002] Препараты тромбоцитов вводят с целью лечения и профилактики симптомов у пациентов, испытывающих сильное кровотечение во время операции или травмы, или пациентов, проявляющих тенденцию к кровотечению, связанную с уменьшением тромбоцитов после лечения противоопухолевыми препаратами. В настоящее время получение препаратов тромбоцитов зависит от донорства крови здоровыми добровольцами. Однако число доноров крови в Японии сокращается по демографическим причинам, и, по оценкам, к 2027 году будет ощущаться нехватка примерно миллиона доноров. Поэтому обеспечение стабильных поставок тромбоцитов является задачей в технической области настоящего изобретения.

[0003] Кроме того, поскольку обычные тромбоцитарные препараты подвержены высокому риску бактериального заражения, существует опасность серьезных инфекций, возникающих после трансплантации препаратов тромбоцитов. Поэтому, постоянно существует клиническая потребность в безопасных препаратах тромбоцитов. Для удовлетворения этой потребности в настоящее время разрабатываются способы получения тромбоцитов из мегакариоцитов, культивируемых in vitro.

[0004] Традиционно получение тромбоцитов из культивированных клеток осуществлялось в стационарной системе культивирования с использованием чашки (WO 2014/ 100779A1, Qiang Feng et al., Stem Cell Reports). Однако стационарные системы культивирования чрезвычайно трудоемки и не подходят для крупномасштабного культивирования.

Список литературы

Патентный документ

[0005] Патентный документ 1: WO 2014/100791

Непатентный Документ

[0006] Непатентный документ 1: Qiang Feng et al., Stem Cell Reports 3, 1-15 (2014)

Краткое описание изобретения

Техническая проблема

[0007] Авторам настоящего изобретения удалось продуцировать тромбоциты с высокой биоактивностью в системе культивирования с взбалтыванием с использованием смесительной колбы, т. е. способом культивирования, при котором встряхивается сама емкость для культивирования. При этом было обнаружено, что в системе культивирования в колбах с взбалтыванием количество тромбоцитов (CD41a+CD42b+) и активность тромбоцитов (связывание PAC1, положительный показатель Р-селектина) уменьшается с увеличением количества среды.

[0008] Деградация тромбоцитов (снижения положительный показатель CD42b), которую можно объяснить шеддингом и тому подобным, также была обнаружена в системе культивирования в колбах с взбалтыванием. Более того, было установлено, что такая система содержит более необычные тромбоциты (аннексин V-положительные тромбоциты), которые не подходят для трансплантации in vivo.

[0009] Поэтому целью настоящего изобретения является предоставление способа крупномасштабного производства высококачественных тромбоцитов, которые могут быть трансплантированы in vivo.

Решение проблемы

[0010] В результате обширных исследований, направленных на решение вышеупомянутых проблем, авторы изобретения обнаружили, что культивирование мегакариоцитов при перемешивании культурального раствора во направлении вращения с помощью мешалки, расположенной в сосуде для культивирования, а не путем взбалтывания сосуда для культивирования, может повысить эффективность производства и биоактивность тромбоцитов, контролировать деградацию тромбоцитов на низком уровне и уменьшать необычные тромбоциты. Настоящее изобретение было завершено после дополнительных исследований условий культивирования, включая плотность клеток во время культивирования путем перемешивания культуры, скорость вращения при перемешивании и тому подобное.

[0011] То есть настоящее изобретение представляет собой способ получения тромбоцитов, включающий стадию культивирования мегакариоцитов в культуральном растворе в сосуде для культивирования, причем культуральный раствор перемешивается мешалкой на стадии культивирования.

[0012] В способе получения тромбоцитов по настоящему изобретению мешалка предпочтительно имеет форму лопасти.

[0013] В способе получения тромбоцитов по настоящему изобретению сосуд для культивирования предпочтительно является герметичным биореактором.

[0014] В способе получения тромбоцитов по настоящему изобретению мешалку предпочтительно вращают со скоростью вращения не менее 50 об/ мин.

[0015] Кроме того, в способе получения тромбоцитов по настоящему изобретению мегакариоцитами предпочтительно являются клетки, полученные путем экспрессии, по меньшей мере, одного гена, выбранного из группы, состоящей из онкогена, гена белка поликомба и гена подавления апоптоза в недифференцированных клетках мегакариоцитов, а затем прекращения сверхэкспрессии.

[0016] Настоящее изобретение представляет собой также способ получения препарата тромбоцитов, включающий: стадию получения тромбоцитов в мегакариоцитах описанными выше способами и сбор тромбоцитов из культуры; и стадию удаления из тромбоцитов компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов.

[0017] Настоящее изобретение также представляет способ получения препарата крови, включающий: стадию получения препарата тромбоцитов описанными выше способами; и стадию смешивания этого препарата тромбоцитов с другими компонентами для получения препарата крови.

[0018] Настоящее изобретение также предоставляет тромбоциты, изготовленные любым из вышеперечисленных способов.

[0019] Настоящее изобретение также предоставляет получение тромбоцитов, изготовленных любым из вышеперечисленных способов, или препарата тромбоцитов, содержащего вышеописанные тромбоциты.

[0020] Настоящее изобретение также предоставляет препарат крови, произведенный вышеуказанными способами, или препарат крови, содержащий вышеописанные тромбоциты.

Преимущества изобретения

[0021] С помощью способа по настоящему изобретению можно повысить эффективность продуцирования тромбоцитов по сравнению с традиционным культивированием с взбалтыванием. Кроме того, полученные тромбоциты обладают биоактивностью, превышающей биоактивность тромбоцитов, полученных с помощью традиционного культивирования с взбалтыванием.

[0022] Кроме того, с помощью способа по настоящему изобретению возможно подавление реакции деградации тромбоцитов (снижение положительного показателя CD42b), а также подавление образования необычных тромбоцитов (аннексин V-положительные тромбоциты).

Краткое описание чертежей

[0023] На Фиг. 1 приведены результаты проточной цитометрии, выполненной на тромбоцитах, полученных путем культивирования мегакариоцитов с перемешиванием или культивирования с взбалтыванием, с использованием антител анти-CD42b и антител анти-PAC-1 до и после стимулирования PMA или АДФ.

На Фиг. 2 приведены результаты проточной цитометрии, выполненной на тромбоцитах, полученных путем культивирования мегакариоцитов с перемешиванием или культивирования с взбалтыванием, с использованием антител анти-CD42b и антител анти-CD62p до и после стимулирования PMA или АДФ.

На Фиг. 3 приведены результаты проточной цитометрии, выполненной на тромбоцитах, полученных путем культивирования мегакариоцитов с перемешиванием или культивирования с взбалтыванием, с использованием антител анти-CD41a и антител анти-CD42b.

На Фиг. 4 показана скорость связывания аннексина V в тромбоцитах, полученных путем культивирования мегакариоцитов с перемешиванием или культивирования с взбалтыванием, определенная способом проточной цитометрии.

На Фиг. 5 приведены результаты проточной цитометрии, выполненной с использованием антител анти-CD41a и антител анти-CD42b на тромбоцитах, полученных при культивировании с перемешиванием при различных скоростях вращения.

Описание вариантов осуществления изобретения

[0024] Способ получения тромбоцитов по настоящему изобретению включает этап культивирования мегакариоцитов в культуральном растворе в сосуде для культивирования, причем культуральный раствор перемешивают мешалкой в направлении вращения на стадии культивирования.

[0025] В этом описании, "сосуд для культивирования" особенно не ограничен при условии, что он представляет собой сосуд, в котором мегакариоциты можно культивировать как культуральный раствор, перемешиваемый при помощи мешалки, и примеры включают закрытой системы сосуды с завинчивающейся крышкой, биореакторы и подобное.

[0026] В этом описании "мешалка" может быть любой, способной непосредственно перемешивать культуральный раствор при размещении в культуральном растворе, и примеры включают различные виды мешалок, используемых в магнитных мешалках, и перемешивающие лопасти, прикрепленные к биореакторам. При использовании магнитного мешальника магнитной мешалки, магнитный мешальник помещают в культуральный раствор, и культуральный раствор можно затем перемешивать, вращая магнитный мешальник при помощи моторчика, распоженного за пределами культурального сосуда. В случае биореактора с перемешивающей лопастью, лопасть внутри биореактора располагается под поверхностью жидкости культурального раствора, и перемешивающую лопасть можно затем вращать при помощи моторчика, прикрепленного в биореактору, чтобы таким образом перемешивать культуральный раствор.

[0027] Пример использования биореактора с перемешивающей лопастью поясняется ниже как один из вариантов осуществления изобретения.

[0028] В этом описании "биореактором" может быть любой, имеющий резервуар для культивирования, в котором можно культивировать мегакариоциты, и механизм перемешивания, способный перемешивать культуральный раствор внутри резервуара для культивирования, и можно использовать коммерческий биореактор.

[0029] Биореактор обеспечивает физико-химическую среду, подходящую для оптимальной пролиферации клеток, клеточного метаболизма, дифференцировки и созревания мегакариоцитов, мультинуклеацию мегакариоцитов, образование протромбоцитов, продуцирование тромбоцитов, поддержание биоактивности тромбоцитов и тому подобное. Следовательно, он может быть оборудован механизмом аэрации, механизмом выпуска, механизмом контроля температуры, механизмом контроля рН, механизмом регулирования парциального давления растворенного кислорода (DOT), дефлектором, рассекателем, портом и т.п.

[0030] Механизм перемешивания биореактора может быть настроен любым способом, который позволяет перемешивать культуральный раствор, и, например, он может быть оборудован крыльчаткой, закрепленной внутри резервуара для культивирования и с приводом от моторчика, вместе с лопастью мешалки, прикрепленной к крыльчатке.

[0031] При перемешивании биореактора по настоящему изобретению, скорость вращения при перемешивании не особенно ограничена, но может составлять от 10 об/ мин до 300 об/ мин или, предпочтительно, по меньшей мере, 50 об/ мин. Более предпочтительно составляет, по меньшей мере, 100 об/ мин, или еще более предпочтительно, по меньшей мере, 140 об/ мин.

[0032] Форма резервуара для культивирования биореактора также не особенно ограничена и может иметь, например, форму вертикальной трубы или форму с плоскими поверхностями в верхней и нижней части резервуара.

[0033] Резервуара для культивирования имеет объем, по меньшей мере, 0,3 литра, или предпочтительно, по меньшей мере, 1 литр, или 50 литров, или более предпочтительно, по меньшей мере 200 литров, или еще более предпочтительно, по меньшей мере 500 литров, или еще более предпочтительно, по меньшей мере 1000 литров, или наиболее предпочтительно, по меньшей мере 2000 литров.

[0034] Форма лопасти биореактора по настоящему изобретению не ограничена. Например, может применяться тип плоско-лопастной турбины, тип пропеллера, тип лопасти в виде наконечника стрелы, тип лопасти с криволинейным профилем или тип турбины с одной плоской лопастью в виде диска.

[0035] В настоящем описании "мегакариоциты" представляют собой самые крупные клетки, присутствующие в костном мозге in vivo и обладающие свойством высвобождения тромбоцитов. Они также имеют свойство быть положительными для маркеров клеточной поверхности CD41a, CD42a и CD42b, а также могут экспрессировать маркеры, выбранные из группы, состоящей из CD9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 и CD203c. В случае, когда "мегакариоциты" являются многоядерными (полиплоидизированными), они имеют в 16-32 раза больше геномной ДНК, чем нормальные клетки, но в этом описании термин "мегакариоцит" сам по себе охватывает как многоядерные мегакариоциты, так и мегакариоциты до многоядерности, при условии, что присутствуют вышеупомянутые свойства. "Мегакариоциты до многоядерности" также можно назвать "незрелыми мегакариоцитами" или "мегакариоцитами стадии роста".

[0036] Мегакариоциты могут быть получены различными известными способами. Неограничивающие примеры способов получения мегакариоцитов включают способ, описанный в WO 2011/034073. В этом способе бессмертная мегакариоцитарная линия клеток-предшественников, которая пролиферирует бесконечно, может быть получена путем сверхэкспрессии онкогена и гена белка поликомба в "недифференцированных клетках мегакариоцитов". Кроме того, следуя способам, описанным в WO 2012/157586, бессмертные мегакариоциты также могут быть получены путем экспрессии гена подавления апоптоза в "недифференцированных клетках мегакариоцитов". Когда эти бессмертные мегакариоциты освобождаются от принудительной экспрессии генов, развивается многоядерность и высвобождаются тромбоциты.

[0037] Способы, описанные в вышеупомянутой литературе, также могут быть объединены для получения мегакариоцитов. В этом случае сверхэкспрессию онкогена, гена белка поликомба и гена подавления апоптоза можно проводить либо одновременно, либо последовательно. Например, онкоген и ген белка поликомба можно сверхэкспрессировать, и эта сверхэкспрессия может быть подавлена, после чего сверхэкспрессируют ген подавления апоптоза, и эта сверхэкспрессия подавляется для получения многоядерных мегакариоцитов. Альтернативно, онкоген, ген белка поликомба и ген подавления апоптоза можно сверхэкспрессировать одновременно, после чего эта сверхэкспрессия одновременно подавляется для того, чтобы получить многоядерные мегакариоциты. Онкоген и ген белка поликомба можно также сверхэкспрессировать первыми, после чего сверхэкспрессировать гена подавления апоптоза, и каждая из сверхэкспрессий затем одновременно подавляется для получения многоядерных мегакариоцитов.

[0038] В этом описании "недифференцированные клетки мегакариоцитов" являются клетками, обладающими способностью дифференцироваться в мегакариоциты, и могут представлять собой клетки на различных стадиях дифференцировки, начиная от линий гемопоэтических стволовых клеток до мегакариоцитам. Неограничивающие примеры недифференцированных клеток мегакариоцитов включают гемопоэтические стволовые клетки, гемопоэтические клетки-предшественники, CD34-положительные клетки и мегакариоцит-эритроидные клетки-предшественники (MEP). Эти клетки могут быть получены путем выделения клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферийной крови, или путем индукции дифференцировки от плюрипотентных стволовых клеток, таких как клетки ES или клетки iPS, которые представляют собой более недифференцированные клетки.

[0039] В данном описании "онкоген" представляет собой ген, который вызывает канцеризацию клеток в живом организме, и примеры включают семейство MYC-генов (таких как c-MYC, N-MYC и L-MYC), семейство SRC-генов, семейство RAS-генов, семейство RAF-генов и с-Kit, PDGFR, Abl и другие гены семейства протеинкиназ.

[0040] В данном описании, "гены белков поликомба" представляют собой гены, которые негативно контролируют гены CDKN2a (INK4a/ARF), и они известны как гены, которые функционируют, чтобы предотвратить старение клеток (Ogura et al, Saisei Iryo (Regenerative Medicine) Vol. 6, No. 4, pp. 26-32; Jseus et al, Natural Reviews Molecular Cell Biology Vol. 7, pp. 667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 100, pp. 211-216, 2003). Неограничивающие примеры генов белков поликомба включают BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC and Dnmt1/3a/3b.

[0041] В данном описании "ген, подавляющий апоптоз" представляет собой ген, имеющий функцию подавления клеточного апоптоза, и примеры включают ген BCL2, и гена BCL-xL, ген сурвивина, ген MCL1 и тому подобное.

[0042] Принудительная экспрессия генов и прекращение сверхэкспрессии могут быть выполнены способами, описанными в WO 2011/034073, WO 2012/157586, WO 2014/123242 или в Nakamura S. et al., Cell Stem Cell 14, 535-548, 2014, или другими известными способами.

[0043] В этом описании, "тромбоциты" представляют собой клеточный компонент крови и имеют свойства быть CD41a-позитивными и CD42b-позитивными. Тромбоциты играют жизненно важную роль в формировании тромбов и гемостазе, а также участвуют в регенерации тканей после травмы и в патофизиологии воспаления. Когда тромбоциты активируются кровотечением или им подобным, на их клеточных мембранах экспрессируются рецепторы факторов адгезии клеток, таких как интегрин αIIBβ3 (гликопротеин IIb/IIIa; комплекс CD41a и CD61). В результате тромбоциты агрегируют вместе, и фибрин свертывается различными факторами свертывания крови, высвобождаемыми тромбоцитами, что приводит к образованию тромбов и гемостазу.

[0044] Функции тромбоцитов можно определить и оценить известными способами. Например, количество активированных тромбоцитов можно определить с помощью антител к PAC-1, который специфически связывается с интегрином αIIBβ3 на клеточных мембранах активированных тромбоцитов. Количество активированных тромбоцитов также можно определить с помощью антител для детектирования маркера активации тромбоцитов CD62P (Р-селектина). Например, гейтирование сначала может быть выполнено способом проточной цитометрии с использованием антител к независимому от активации маркеру тромбоцитов CD41 или CD61, и связывание можно затем детектировать антителами анти-ПАК-1 или антителами анти-CD62P. Эти стадии можно проводить в присутствии аденозиндифосфата (АДФ).

[0045] Функцию тромбоцитов также можно оценить, посмотрев, происходит ли связывание с фибриногеном в присутствии АДФ. Связывание тромбоцитов с фибриногеном приводит к активации интегринов, необходимых на ранних стадиях тромбообразования.

[0046] Функцию тромбоцитов также можно оценить способом визуализации и наблюдения способности тромбообразования in vivo, как показано на фиг. 6 в WO 2011/034073.

[0047] С другой стороны, когда тромбоциты имеют низкую скорость экспрессии CD42b или низкий положительный показатель аннексина V, тромбоциты считаются деградировавшими или необычными. Эти тромбоциты не являются клинически полезными, поскольку они не обладают достаточным тромбообразованием или гемостатической функцией.

[0048] В этом описании, "деградация тромбоцитов" означает, что CD42b (GPIbα) уменьшается на поверхности тромбоцитов. Следовательно, деградированные тромбоциты включают тромбоциты со сниженной экспрессией CD42b и тромбоциты, из которых внеклеточные области CD42b были удалены путем шеддинга. С удалением CD42b с поверхности тромбоцитов функция свертывания крови тромбоцитов теряется, поскольку они больше не способны соединяться с фактором фон Виллебранда (VWF). Деградацию тромбоцитов можно оценить по показателю CD42b отрицательных (или числу CD42b-отрицательных частиц) относительно показателя CD42b положительных (или числа CD42b-положительных частиц). Чем выше показателю CD42b отрицательных по отношению к показателю CD42b положительных или большее количество CD42b отрицательных частиц по отношению к количеству CD42b положительных частиц, тем выше деградация тромбоцитов. Показатель CD42b положительных представляет собой процент тромбоцитов, способных связываться с антителами анти-CD42b из тромбоцитов, содержащихся в тромбоцитарной фракции, и показатель CD42b отрицательных представляет собой соотношение тромбоцитов, которые не связываются с антителами анти-CD42b, из тромбоцитов, содержащиеся в тромбоцитарной фракции.

[0049] В этом описании "необычные тромбоциты" представляют собой тромбоциты, в которых отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин экспонирован изнутри наружу липидного бислоя. In vivo, фосфатидилсерин экспонируется на поверхности клетки, когда тромбоциты активированы, и связывается там с многочисленными факторами свертываемости крови для того, чтобы усилить реакции каскада свертывания крови. С другой стороны, в необыкновенных тромбоцитах большое количество фосфатидилсерина всегда экспонировано на поверхности клетки, и когда такие тромбоциты вводят пациентам, они могут вызвать чрезмерные реакции свертывания крови и привести к тяжелым состояниям, таким как синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Поскольку аннексин V связывается с фосфатидилсерином, фосфатидилсерин на поверхности тромбоцитов может детектироваться способом проточной цитометрии на основе количества связывания флуоресцентно-меченого аннексина V. Следовательно, количество необычных тромбоцитов может быть оценено на основе положительной скорости Аннексина V фракции тромбоцитов или, другими словами, на основе соотношения или количества тромбоцитов, демонстрирующих связывание аннексина. Чем выше положительная скорость аннексина V или чем больше число частиц аннексина V, тем больше число необычных тромбоцитов.

[0050] Условиями культивирования мегакариоцитов в настоящем изобретении могут быть обычные условия. Например, температура может составлять примерно от 35°C до 42°C или от 36°C до 40°C или от 37°C до 39°C, и можно использовать от 5% до 15% СО₂ и/или примерно 20% О₂.

[0051] Среда для культивирования мегакариоцитов не особенно ограничена, и известную среду, подходящую для получения тромбоцитов из мегакариоцитов или эквивалентную среду можно использовать соответствующим образом. Например, среду можно подготовить, используя среду, применяемую для культивирования клеток животных в качестве основной среды. Примеры основной среды включают среду IMDM, среду 199, минимально необходимую среду Игла (EMEM), среду αMEM, минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM), среда Хэма F12, среда RPMI 1640, среда Фишера, среда Neurobasal (корпорация Лайф текнолоджис) и их смеси.

[0052] Среда может содержать сыворотку или плазму, или может не содержать сыворотку. Среда может также содержать одно или более веществ, таких как альбумин, инсулин, трансферрин, серин, жирные кислоты, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, тиолглицерин, монотиолглицерин (MTG), липиды, аминокислоты (такие как L-глутамин), аскорбиновая кислота, гепарин, незаменимые аминокислоты, витамины, факторы роста, низкомолекулярные соединения, антибиотики, антиоксиданты, пировиноградная кислота, буферы, соли неорганических кислот, цитокины и тому подобное, при необходимости. Цитокины представляют собой белки, которые стимулируют дифференцировку клеток крови, и примеры включают васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), тромбопоэтин (TPO), различные TPO-подобные активные вещества, фактор стволовых клеток (SCF), ITS (инсулин-трансферрин-селенит), ингибиторы ADAM и подобное. В настоящем изобретении предпочтительной средой является среда IMDM, содержащая сыворотку крови, инсулин, трансферрин, серин, тиолглицерин, аскорбиновую кислоту и TPO. Она может также содержать SCF, и может также содержать гепарин. Различные концентрации этого не особо ограничены, но, например, концентрация TPO может составлять от примерно 10 нг/мл до 200 нг/мл, или от примерно 50 нг/мл до примерно 100 нг/мл, в то время как таковая для SCF может составлять от примерно 10 нг/мл до 200 нг/мл, или примерно 50 нг/мл и таковая гепарина может составлять от примерно 10 ед/мл до 100 ед/мл, или около 25 ед/мл. Также может быть добавлен форболовый эфир (такой как форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA)).

[0053] При использовании сыворотки предпочтительной является сыворотка человека. Человеческая плазма или подобное могут также быть использованы вместо сыворотки. В способе по настоящему изобретению тромбоциты, эквивалентные полученным с помощью сыворотки, также могут быть получены с использованием этих компонентов.

[0054] В случае, когда реагирующая на лекарственное средство система индукции экспрессии генов, такая как Tet-on или Tet-off, используется для индуцирования и прекращения сверхэкспрессии гена, соответствующий препарат, такой как тетрациклин или доксициклин, может присутствовать в среде на стадии сверхэкспрессии, и сверхэкспрессия может быть подавлена исключением его из среды.

[0055] Стадия культивирования мегакариоцитов по настоящему изобретению может проводиться без питающих клеток, если оно выполняется как плавающая культура.

[0056] Настоящее изобретение охватывает тромбоциты, изготовленные способом по настоящему изобретению.

[0057] Способ получения препарата тромбоцитов по настоящему изобретению включает стадию культивирования мегакариоцитов способом по изобретению для получения тромбоцитов и сбора из культуры фракции, обогащенной тромбоцитами, и стадию удаления из полученной тромбоцитарной фракции компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов. Стадия удаления компонентов клеток крови может быть выполнена путем использования фильтра для удаления лейкоцитов (например, изготовленного корпорацией Терумо или Асахи Касеи медикал ко., лимитед) или подобного для удаления компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов, включая мегакариоциты. Более конкретные способы изготовления препаратов тромбоцитов описаны, например, в WO 2011/034073.

[0058] способ получения препарата крови настоящего изобретения включает этап получения препарата тромбоцитов способами настоящего изобретения и этап смешивания этого препарата тромбоцитов с другими компонентами. Примеры других компонентов включают, например, клетки крови.

[0059] Другие компоненты, способствующие стабилизации клеток, также могут быть добавлены к препарату тромбоцитов и препарату крови.

[0060] Полное раскрытие всех патентных документов и непатентных документов, указанных в настоящем описании, включено путем ссылки в настоящее описание.

Пример 1

[0061] Настоящее изобретение подробно описывается ниже на основе примеров, но настоящее изобретение никоим образом не ограничивается ими. Специалист в данной области может изменять настоящее изобретение различными способами, не отклоняясь от значения настоящего изобретения, и такие изменения также входят в сферу применения настоящего изобретения.

[0062] 1. Подготовка бессмертных мегакариоцитов

1-1. Получение гемопоэтических клеток-предшественников из клеток iPS

Дифференцировочное культивирование проводили, чтобы дифференцировать клетки iPS человека (клетки Tkdn SeV2:iPS из фибробластов кожи плода человека, образованные с помощью вируса Сендай) в клетки крови способами, описанными в Takayama N. et al., J. Exp. Med. 2817-2830 (2010). То есть, колонию клеток ES/iPS человека совместно культивировали в течение 14 дней с питающими клетками C3H10T1/2 в присутствии 20 нг/мл VEGF (R&D Systems, Inc.), чтобы подготовить гемопоэтические прогениторные клетки (HPC). Условия культивирования составляли 20% O₂, 5% CO₂ (здесь и ниже, если не указано иное).

[0063] 1-2. Система введения генов

В качестве системы введения генов использовалась лентивирусная векторная система. Лентивирусный вектор представляет собой вектор тетрациклин-контролируемой Tet-on™ системы индукции генной экспрессии. c-MYC, BMI1 и BCL-xL заменили кассету mOKS в LV-TRE-mOKS-Ubc-tTa-I2G (Kobayashi, T. et al., Cell 142, 787-799 (2010)) mOKS, чтобы подготовить LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G и LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G, соответственно.

[0064] Вирусные частицы были получены путем генетического введения вышеупомянутых лентивирусных векторов в клетки 293T.

[0065] Инфицированные этими вирусными векторами клетки-мишени служат для введения генов BMI1, MYC и BCL-xL в последовательности генома клеток-мишеней. После того, как эти гены были стабильно введены в последовательность генома, они могут быть сверхэкспрессированы путем добавления доксициклина (#631311 (Clontech Laboratories, Inc.)) в среду.

[0066] 1-3. c-MYC и BMI1 вирусное инфецирование гемопоэтических клеток-предшественников

Клетки HPC, полученные способами, описанными выше, засевали в 5 × 10⁴ клеток/лунку в 6-луночные планшеты, в которые ранее были засеяны питающие клетки C3H10T1/2, и C-myc и BMI1 экспрессировали лентивирусным способом. Для каждой клеточной линии было использовано 6 лунок. То есть, вирусные частицы добавляли в среду в соотношении MOI 20 для каждого и инфицировали при помощи спиновой инфекции (32°С, 900 об/ мин, центрифугирование 60 минут). Эту операцию проводили дважды с интервалом в 12 часов.

[0067] Использованная среда представляла собой основную среду (IMDM (среда Дульбекко в модификации Искова) (Sigma-Aldrich Company Ltd.), содержащую 15% фетальной бычьей сыворотки (Gibco), 1% пенициллин-стрептомицин-глютамин (Gibco), 1% раствор инсулина-трансферрина-селена (ITS-G, Gibco), 0,45 мМ 1-тиоглицерола (Sigma-Aldrich Company Ltd.) и 50 г/ мл L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich Company Ltd.)) с 50 нг/ мл тромбопоэтина человека (TPO, R&D Systems, Inc.), 50 нг/ мл фактора стволовых клеток человека (SCF, R&D Systems, Inc.) и 2 г/мл доксициклина (Dox), добавленного к этому (далее называемая средой дифференцировки), к которой был дополнительно добавлен протамин в конечной концентрации 10 г/ мл.

[0068] 1-4. Подготовка и поддержание культуры саморепродуцирующихся мегакариоцитарных клеточных линий

При инфекции в день 0 как день, когда была проведена вирусная инфекция cMYC и BMI1 описанными выше способами, мегакариоциты с введенными генами cMYC и BMI1 культивировали для подготовки саморепродуцирующихся мегакариоцитарных клеточных линий, для каждой. Сверхэкспрессия гена BMI1 и гена с-MYC была достигнута добавлением в среду 1 мкг/мл доксициклина (#631311 (компания Clontech Laboratories, Inc.)).

[0069] День инфекции 2 по день инфекции 11

Вирус-инфицированные клетки крови, полученные описанными выше способами, собирали пипеткой и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об/мин, супернатант удаляли, а клетки суспендировали в новой среде дифференцировки и высевали на питающие клетки C3H10T1/2 (6-луночный планшет). На 9-й день инфицирования клетки пассировали при помощи тех же операций. Клетки подсчитывали и высевали на питающие клетки C3H10T1/2 (6-луночный планшет) при 1×10⁵ клеток/2 мл/лунку.

[0070] С дня инфицирования 12 по день 13

Были проведены такие же операции, что и во 2-й день инфицирования. Клетки подсчитывали, а затем засевали на питающие клетки C3H10T1/2 (100 мм чашка) при 3×10⁵ клеток/10 мл/ 100 мм чашку.

[0071] День инфецирования 14

Вирусно зараженные клетки крови собирали и подвергали реакциям антител с использованием 2 мкл антител анти-CD41a-APC человека (BioLegend, Inc.), 1 мкл антител анти-CD42b-PE человека (eBioscience) и 1 мкл антител против человеческого CD235ab-Pacific Blue (BioLegend, Inc.) на 1,0×10⁵ клеток. После реакции они были проанализированы с помощью FACSVerse (Бектон, Дикинсон и компания). На 14-й день инфицирования в качестве саморепродуцирующейся мегакариоцитарной клеточной линии брали клетки с показателем CD41a-положительных не менее 50%.

[0072] 1-4. Вирусная инфекция BCL-xL самораспространяющихся мегакариоцитарных клеточных линий

BCL-xL был генетически введен лентивирусным способом в предшествующую саморепродуцирующуюся мегакариоцитарную клеточную линию с 14-го дня инфицирования. Вирусные частицы добавляли в среду с коэффициентом MOI 10, и инфецировали при помощи спиновой инфекции (32°С, 900 об/мин, центрифугирование 60 минут). Сверхэкспрессия гена BCL-xL была достигнута путем добавления в среду 1 мкг/мл доксициклина (#631311 (Клонтек лабораторис, Инк.)).

[0073] 1-5. Подготовка и поддержание культуры бессмертной линии мегакариоцитов

С 14-го дня инфецирования по 18-й день инфецирования

Саморепродуцирующуюся мегакариоцитарную клеточную линию с введенным геном BCL-xL, полученную описанными выше способами, собирали и центрифугировали в течение 5 минут при 1200 об/ мин. После центрифугирования, осажденные клетки ресуспендировали в новой среде дифференцировки и высевали при 2×10⁵ клеток/2 мл/лунку на новые питающие клетки C3H10T1/2 (6-луночный планшет).

[0074] 18-й инфецирования: пассаж

Клетки подсчитывали и высевали при в 3×10⁵ /10 мл/100 мм чашку.

[0075] 24-й день инфецирования: пассаж

Клетки подсчитывали и высевали при 1×10⁵/10 мл/100 мм чашку. Их впоследствии пересевали каждые 4-7 дней для проведения поддержания культуры.

[0076] В день инфецирования 24, саморепродуцирующуюся мегакариоцитарную линию клеток с интродуцированным геном BCL-xL собирали, иммунно окрашивали с использованием 2 мкл антител против человеческого CD41a-APC (BioLegend, Inc.), 1 мкл антител против человеческого CD42b-PE (eBioscience) и 1 мкл антител против человеческого CD235ab-Pacific Blue (Anti-CD235ab-PB, BioLegend, Inc.) на 1,0×10⁵ клеток и анализировали с FACSVerse (Becton, Dickinson and Company), а также в 24-й день инфецирования линию, имеющую показатель CD41a-положительных не менее 50%, взяли в качестве бессмертной мегакариоцитной линии. Эти клетки, которые успешно размножались в течение, по меньшей мере 24 дней после инфецирования, были обозначены как бессмертная мегакариоцитная линия SeV2-MKCL.

[0077] Полученную SeV2-MKCL стационарно культивировали на 10 см чашке (10 мл/чашку). Среда представляла собой основную среду IMDM, к которой были добавлены следующие компоненты (приведены конечные концентрации).

FBS (#172012 лот. 12E261 (Sigma)) 15% L-глутамин (#25030-081 (Gibco)) ITS (#41400-045 (Gibco)) разбавление 100x MTG (монотиоглицерол, #M6145-25МЛ (Sigma)) 450 мкМ Аскорбиновая кислота (#A4544 (Sigma)) 50 г/мл Пуромицин (#P8833-100мг (Sigma)) 2 мкг/мл SCF (#193-15513 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)) 50 нг/мл TPO-подобное активное вещество 200 нг/мл

Условия культивирования представляли собой 37°C, 5% CO₂.

[0078] 2. Продуцирование тромбоцитов

[0079] Сверхэкспрессию затем устраняли путем культивирования клеток в среде, не содержащей доксициклина. В частности, бессмертные мегакариоциты (SeV2-MKCL), полученные способами по 1., дважды промывали PBS(-) и суспендировали в следующей среде при плотности посева 1,0×105 кл/мл.

[0080] Cреда представляла собой основную среду IMDM, к которой были добавлены следующие компоненты (приведены окончательные концентрации).

FBS 15% L-глутамин (#25030-081 (Gibco)) ITS (#41400-045 (Gibco)) 100× разбавление

[0081]

MTG (монотиоглицерол, #M6145-25МЛ (Sigma)) 450 мкМ Аскорбиновая кислота (#A4544 (Sigma)) 50 мкг/мл SCF (#193-15513 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd)) TPO-подобное активное вещество 200 нг/мл Ингибитор ADAM 15 мкМ SR1 750 нМ Ингибитор ROCK 5 мкМ

[0082] Полученную суспензию бессмертной линии мегакариоцитов добавляли в смесительную колбу объемом 125 мл (25 мл среды) и емкость для культивирования с перемешиванием биореактора (700 мл среды). Тромбоциты продуцировали от 3 до 9 дней культивирования в этих условиях. В качестве биореактора использовали резервуар для перемешивания культуры BCP от Biott Corporation (далее именуемый BCP).

[0083] В BCP 0,7 литра суспензии бессмертной линии мегакариоцитов культивировали в 2-литровом резервуаре для культивирования или 0,5 литра культивировали в 1-литровом резервуаре для культивирования. Скорость перемешивания составляла 75 об/ мин. Перемешивание проводили с помощью вращающейся лопасти. Спецификации BCP представляли собой следующее: Внешние размеры 300 (ш) × 905 (в) × 500 (д) мм; объем жидкости резервуара для культивирования от 0,5 до 10 л; колба или сосуд с перемешиванием; нижняя магнитная система перемешивания; скорость вращения от 10 до 140 об/ мин; с регулировкой температуры до комнатной температуры +10°C до 45°C; измерительный контроль перемешивания, температуры, pH, DO, уровня и подпитки.

[0084] 125 мл смесительную колбу культивировали с помешиванием при 100 об/ мин в инкубаторе для культивирования с взбалтыванием (AniCell, Н-БИОТЕК) при 37°С, 5% CO₂.

[0085] 3. Определение тромбоцитов

[0086] Для измерения тромбоцитов, полученных способом 2., образец супернатанта культуры собирали через 6 дней культивирования после прекращения сверхэкспрессии, окрашивали различными антителами и анализировали при помощи проточной цитометрией. Количество CD41a-положительных CD42b-положительных частиц принимали за количество нормальных тромбоцитов, а количество CD41a-положительных CD42b-отрицательных частиц за количество деградированных тромбоцитов. Количество V-положительных частиц аннексина принимали за количество необычных тромбоцитов. Образцы стимулировали PMA или АДФ/тромбином, и положительные показатели для PAC-1 и CD62p до и после стимулирования рассчитывали в качестве меры биоактивности.

[0087] Подробные способы определения и результаты представляли собой следующее.

3-1. Определение тромбоцитов

Для определения нормальных тромбоцитов, деградированных тромбоцитов и биоактивности тромбоцитов 900 мкл раствора для разведения добавляли в 1,5 мл микропробирки, и к нему добавляли 100 мкл культурального супернатанта и смешивали. 200 мкл разведенного смешанного культурального супернатанта помещали в пробирку FACS и окрашивали добавлением следующих меченых антител или белка. Для определения необычных тромбоцитов 100 мкл культурального супернатанта помещали в пробирку FACS, окрашивали добавлением следующих меченых антител или белка, разбавляли в 5 раз буфером для связывания аннексина V (Бектон, Дикинсон и Кампани) непосредственно перед анализом проточной цитометрией и анализировали.

[0088] Антитела использовали следующим образом.

Для определения нормальных тромбоцитов и деградировавших тромбоцитов

0,5 мкл антитела анти-CD41, меченого APC (303710 (BioLegend, Inc.))

0,5 мкл антитела анти-CD42a, меченого РВ (48-0428-42 (eBioscience))

0,5 мкл антитела анти-CD42b, меченого PE (12-0428-42 (eBioscience))

Для определения биологической активности тромбоцитов

0,5 мкл антитела анти-CD42a, меченого РВ (48-0428-42 (eBioscience))

0,5 мкл антитела анти-CD42b, меченого PE (12-0428-42 (eBioscience))

0,5 мкл антитела анти-CD62p, меченого APC (304910 (BioLegend, Inc.))

10 мкл антитела анти-PAC-1, меченого FITC (303704 (Becton, Dickinson and Company))

Для определения количеств необычных тромбоцитов

0,5 мкл антитела анти-CD41, меченого APC (303710 (BioLegend, Inc.))

0,5 мкл анти-CD42a антитела, меченого РВ (48-0428-42 (eBioscience))

5 мкл аннексина V, меченого FITC (556419 (Becton, Dickinson and Company))

[0089] 3-2. Определение биологической активности тромбоцитов

Тромбоциты стимулировали при комнатной температуре 0,2 мкМ PMA (форбол 12-миристат 13-ацетат, #P1585-1МG (Sigma)) или 100 мкМ АДФ (#A2754 (Sigma)) и 0,5 ед/мл тромбина (Sigma). Через 30 минут после стимуляции их определяли с помощью проточного цитометра ACSVerse Becton, Dickinson and Company.

Показатель PAC-1-положительных и показатель CD62p-положительных определяли до и после стимуляции в CD42a-положительной фракции тромбоцитов и подвергали сравнительной оценке.

Результаты приведены на Фиг. 1. В случае культивирования с перемешиванием в BCP, MFI показателя PAC-1-положительных при стимулировании PMA или АДФ/тромбином составляло примерно от 2 до 3 раз от такового, полученного при условиях культивирования с взбалтыванием в 125 мл смесительной колбе.

Более того, как показано на Фиг. 2, в случае культивирования с перемешиванием в BCP показатель CD62p положительных составлял, по меньшей мере, 2 раза от такового, полученного при культивировании с взбалтыванием в смесительной колбе, что показывает, что были получены тромбоциты с высокой биоактивностью.

[0090] 3-3. Определение деградации тромбоцитов

Каждый обработанный образец анализировали проточной цитометрией способом 3-1., описанным выше, и количество CD41a-положительных CD42b-положительных частиц считали как количество нормальных тромбоцитов и количество CD41a-положительных, CD42b-отрицательных частицы как количество деградированных тромбоцитов.

Результаты приведены на Фиг. 3. Эффективность продуцирования нормальных тромбоцитов при культивировании с перемешиванием в BCP была примерно в 1,7 раза выше, чем таковая при культивировании с взбалтыванием. Кроме того, количество деградированных тромбоцитов при культивировании с перемешиванием в BCP уменьшилось примерно в 0,75 раза по сравнению с культивированием с взбалтыванием.

[0091] 3-4. Определение необычных тромбоцитов

Каждый обработанный образец анализировали проточной цитометрией указанными выше способами 3-1., и количество аннексин V-положительных частиц принимали за количество необычных тромбоцитов. Результаты приведены на Фиг. 4. Количество необычных тромбоцитов при культивировании с перемешиванием в BCP сократилось примерно в 0,7 раза по сравнению с культивированием с взбалтыванием.

[0092] 4. Оптимизация условий культивирования

Скорость ротационного перемешивания инкубатора BCP для культивирования с перемешиванием меняли и определяли различия в эффективности продуцирования тромбоцитов. Скорость вращения при перемешивании устанавливали на 100 об/ мин, 120 об/ мин или 140 об/ мин, а CD41a-положительные CD42b-положительные частицы определяли с результатами, показанными на фиг. 5.

Продуцирование тромбоцитов (CD41a-положительные CD42b-положительные) было наибольшим при максимальной скорости вращения 140 об/ мин.

Промышленная применимость

[0093] Очевидно, что высококачественные тромбоциты, которые не могут быть получены с помощью культивирования с взбалтыванием в смесительной колбе, могут быть получены при помощи настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение может способствовать осуществлению крупномасштабного производства тромбоцитов на промышленном уровне.

Группа изобретений относится к биомедицине и клеточной технологии. Предложены способ получения тромбоцитов, включающий культивирование мегакариоцитов в культуральном растворе в сосуде для культивирования, в котором культуральный раствор перемешивается перемешивающей лопастью, и стадию сбора получаемых тромбоцитов из культурального раствора; способ получения препарата тромбоцитов и способ получения препарата крови с использованием тромбоцитов, полученных заявленным способом. Изобретения обеспечивают повышение эффективности продуцирования тромбоцитов с повышенной биоактивностью, пригодных для трансплантации in vivo. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 пр.

1. Способ получения тромбоцитов, включающий стадию культивирования мегакариоцитов в культуральном растворе в сосуде для культивирования, в котором культуральный раствор перемешивается перемешивающей лопастью на стадии культивирования; и

стадию сбора получаемых тромбоцитов из культурального раствора.

2. Способ по п. 1, в котором перемешивающая лопасть представляет собой лопасть плоско-лопастной турбины, лопасть пропеллера, лопасть наконечника стрелы, лопасть с криволинейным профилем или лопасть турбины с одной плоской лопастью в виде диска.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором сосуд для культивирования является герметичным биореактором.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором мешалка вращается со скоростью вращения по меньшей мере 50 об/мин.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором мегакариоциты представляют собой клетки, полученные путем сверхэкспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из онкогена, гена белка поликомба и гена, подавляющего апоптоз в недифференцированных клетках мегакариоцитов, а затем прекращения сверхэкспрессии.

6. Способ получения препарата тромбоцитов, включающий:

стадию получения тромбоцитов в мегакариоцитах способами по любому из пп. 1-5 и сбора тромбоцитов из культуры и

стадию удаления компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов, от тромбоцитов.

7. Способ получения препарата крови, включающий:

стадию изготовления препарата тромбоцитов способом по п. 6 и

стадию смешивания этого препарата тромбоцитов с другими компонентами для получения препарата крови.