Способ получения низкомолекулярного коллагена из шкур рыб Российский патент 2023 года по МПК A23J1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения гидролизата морского коллагена, который может быть использован в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности для получения медицинских и косметических препаратов, а также некоторых продуктов питания.

Коллаген - самый распространенный белок в животном мире. В настоящий момент идентифицировано около 30 типов коллагена и это еще не предел его разнообразия. На долю коллагена приходится около 30% общего количества органической материи и 60% белковых веществ, содержащихся в тканях млекопитающих. Получают коллаген из многочисленных сырьевых источников, но, главным образом, из сельскохозяйственных животных и птиц. В последние десятилетия для получения коллагена широко используют соединительные ткани и кожу рыб и беспозвоночных, так называемый «морской коллаген». Это объясняется такими положительными характеристиками этой субстанции, как низкая температура денатурации, меньшая молекулярная масса, повышенная способность к адгезии, слабая иммуногенность, метаболическая совместимость. И, в первую очередь, структурное сходство с коллагеном человека, обеспечивающее биосовместимость.

Значительные преимущества низкомолекулярного коллагена перед высокомолекулярным коллагеном определяются его способностью более эффективно поглощаться как в пищеварительном тракте, так и органами покровной системы человека: кожей, волосами, ногтями.

В настоящее время существует ряд способов выделения коллагена с различной молекулярной массой (ММ).

Наиболее применимыми для выделения низкомолекулярного коллагена в настоящее время являются методы химического (щелочного, щелочно-солевого, кислотного) и ферментативного гидролиза. В последнем случае используют протеолитические ферментные препараты, а также комплексные добавки, содержащие несколько ферментов.

В то же время качество сырья также во многом определяет параметры выделения коллагена.

Несмотря на разнообразие способов выделения коллагена из различных источников, вопрос подбора и подготовки сырья не остается без внимания производителей.

Исходя из анализа патентной и научной литературы, можно предположить, что получение коллагена из рыбного сырья является актуальной проблемой.

Известен способ получения коллагеновой дисперсии, который включает последовательную обработку кожи рыб раствором поваренной соли, водой, раствором ферментного препарата с последующим растворением в органической кислоте. После обработки ферментным препаратом осуществляют дополнительную промывку водой и отделение балластных веществ и фермента механическим путем. В качестве ферментного препарата используют липоризин Г3х из культуры Rhizopus oryzae в количестве 0,8-1,0% к массе сырья. Обработку осуществляют при температуре 37-40°С в течение 2,0-2,5 ч. (Патент РФ №2259779, A23J 1/04, A23J 1/10, A23L 1/327, опубл. 10.09.2005).

Недостатком способа является ограниченные условия и сроки хранения полученного препарата.

Известен способ получения сухого гидролизата из кожи рыб, который выделяют следующим образом. Снятую со свежей рыбы кожу промывают в проточной водопроводной воде 20 мин для удаления слизи и загрязнений, зачищая от прирезей мышечной ткани, дают стечь воде в течение 15-20 мин. Затем кожу измельчают на волчке с диаметром отверстий решетки 2-5 мм. Измельченную кожу обрабатывают раствором ферментного препарата Протепсин 150, который заливают в емкость с сырьем, при соотношении кожа:раствор 1:2, и выдерживают в течение 1,5-4,5 ч при периодическом перемешивании при температуре 20-25°С. Фильтрат от продукта отделяют на сите. К гидролизату добавляют раствор лимонной кислоты концентрацией 0,3% от массы гидролизата, настаивают в течение 45 мин при температуре 20°С, соотношения гидролизат:раствор 1:3. Затем раствор сливают и промывают полученный коллоидный коллагеновый гидролизат водой. Далее его высушивают в сублимационной сушилке. Высушенный гидролизат имеет пористую структуру с молекулярной массой коллагеновых волокон 200-300 кДа. Далее полученный коллаген используют для получения коллагено-растительной композиции путем механического смешения компонентов. (Патент РФ 2583660 A23J 1/10, A23J 1/14, A23J 3/04, A23J 3/14 опубл. 10.05.2016).

Недостатком способа является то, что конечный продукт имеет высокую молекулярную массу коллагеновых белков, что снижает усвояемость его организмом, а также плохая растворимость и низкая степень очистки от сопутствующих белков.

Известен способ получения белкового гидролизата из вторичного сырья. Вторичные продукты разделки рыб промывают проточной водой с температурой 12°С в течение 2-6 ч. Далее замачивают сырье в воде на 24 ч и снова промывают 3-4 раза проточной водой. Обезжиривают сырье спирто-эфирной смесью в соотношении 1:1 в течение 2-4 ч. Затем проводят деминерализацию сырья 3% раствором уксусной кислоты в течение 12-24 ч при температуре 18-25°С с последующей нейтрализацией 2,5% раствором гидроксида натрия до рН 5,8-6,2. Полученную смесь снова промывают проточной водой в течение 1 ч и измельчают на волчке с диаметром решетки 9-12 мм. Полученную массу подвергают гидролизу раствором коллагеназы активностью 60 ед/г в количестве 0,3% к массе сырья в течение 12-24 ч при 37°С. Затем проводят инактивацию фермента нагреванием гидролизата при температуре 80°С в течение 10 мин с последующим центрифугированием гидролизата. Полученный гидролизат подвергают сублимационной сушке в течение 30 часов при температуре входа -50°С и температуре выхода 25°С. Сухую массу измельчают на мельнице до однородного порошка и герметично упаковывают в полиэтиленовые пакеты. (Патент РФ 2711915 A23J 1/04, A23J 3/04, опубл. 23.01.2020).

Недостатком способа является низкая степень очистки конечного продукта, что снижает качество готового продукта, а также низкий выход сухого белкового гидролизата 28-30%.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ получения гидролизата рыбного коллагена, который включает подготовку и анализ сырья, в качестве которого используют шкуры промысловых рыб, ферментативное выделение гидролизата коллагена, получение кислой дисперсии гидролизата коллагена, формирование сухой формы гидролизата коллагена. Подготовку сырья осуществляют путем очистки рыбьих шкур, промывки их водой, последующего замораживания, измельчения и перемешивания. Анализ сырья проводят путем контроля содержания в сырье влаги, золы и жира. При реализации способа используют гомогенизированный продукт, содержащий не более 55% воды, не более 3% золы и менее 1% жира. Ферментативное выделение гидролизата коллагена осуществляют путем промывки подготовленного гомогенизированного продукта водой, заливки 1-3%-ным раствором протеолитического ферментного препарата при гидромодуле 1:2-1:5 и последующего выдерживания в течение 5 часов. После чего отделяют продукт от примесей путем фильтрации. Для получения кислой дисперсии используют раствор уксусной кислоты, доводя фильтрат до рН 5,5-6,5. Формирование сухой формы осуществляют путем испарения воды из фильтрата без нагрева при температуре выше 50°С. (Патент РФ 2665589 A23J 1/04, A23J 3/04, A23J 3/30, опубл. 31.08.2018).

Недостатком способа является низкий выход продукта, а также в результате слабой степени очистки, наличие лишнего балласта, что снижает пищевую ценность, а, следовательно, снижает качество конечного продукта.

Задача изобретения - разработка способа получения рыбного коллагена, характеризующегося максимальным выходом конечного продукта с высокой степенью очистки.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение низкомолекулярного рыбного коллагена из шкур рыб (рыбного сырья) за счет глубокой степени расщепления белка и высоким выходом конечного продукта.

Это достигается тем, что способ получения низкомолекулярного коллагена из кожи рыб включает подготовку рыбного сырья, ферментативное выделение гидролизата, получение кислой дисперсии гидролизата, формирование сухой формы гидролизата коллагена причем при подготовке рыбное сырье дополнительно обрабатывают перекисью водорода и ферментом нейтраза, а ферментативное выделение гидролизата осуществляют раствором протеолитического ферментного препарата протамекс, затем протеолитическим препаратом пепсин с последующей инактивацией ферментов и разделением ферментолизата на фракции.

Сырье (шкура-сырец) до обработки перекисью и нейтразой содержит коллаген от 15,9 до 19,6%. Дополнительная обработка перекисью водорода и ферментом нейтраза позволяет получить коллагена в 2,8-5,0 раз больше, чем в шкуре сырце, что способствует достижению технического результата.

Обоснование применения нейтразы и перекиси водорода для предобработки сырья основано на следующем исследовании.

Для удаления белковых и жировых примесей более рациональным представляется использование ферментов. Известно о применении ферментных препаратов панкреатина, протосубтилина Г3х, протепсина, амилосубтилина Г3х для получения кожевенного полуфабриката из рыбных шкур (рыбное сырье). Основное требование к применению ферментов для обработки шкур рыб - способность гидролизовать глобулярные белки соединительной и мышечной ткани и не оказывать влияние на коллаген. К таким ферментам относится нейтраза.

Нейтраза - нейтральная протеаза, продуцируемая селекционированным штаммом Bacillus amyloliquefaciens и используемая при затирании для увеличения уровня свободного аминного азота в сусле.

Основываясь на данных литературы об использовании ферментных препаратов для обработки шкур, было проведено определение влияния нейтразы на качественные показатели шкур рыб. Предварительные исследования показали, что ферментный препарат нейтраза в течение 60 мин гидролизует прирези мышечной и соединительной ткани с поверхности шкур.

В ходе экспериментов определено, что после обработки нейтразой шкур рыб, резко увеличилось количество коллагена в полуфабрикате по сравнению с содержанием его в необработанной шкуре рыб (сырец).

Также, была проведена серия экспериментов по оценке влияния перекиси водорода на цветовые характеристики рыбного сырья и выход коллагена (таблица 1). В шкуры рыб после предварительной обработки и промывки добавляют 3-5% перекись водорода в соотношении сырье: раствор перекиси: 1:1. Результаты исследования показали, что после обработки перекисью водорода сырье отбелилось, т.е. исчезла пигментация кожи, снизилось количество примесей, что значительно улучшило его качество. А также повысилась концентрация коллагена.

Результаты экспериментов отражены в таблице 1.

На основании данных таблицы 1, выход препарата после обработки ферментом нейтраза шкур рыб составляет 1,7% от массы исходного сырья и содержание коллагена в нем составило 46,1%.

При этом очевидно, что совместное использование перекиси водорода и нейтразы (эксперименты 2, 3, 4) заметно, почти в 2 раза по сравнению применением только нейтразы (эксперимент 1), увеличило выход коллагена из рыбного сырья, что значительно приблизило достижение технического результата.

В таблице 1 показаны данные по предварительной обработке шкур рыб компонентами и оценка их влияния на характеристики продукта.

В дальнейшем, с целью повышения экстрактивности коллагена из шкуры рыб проведена серия экспериментов по влиянию кислоты, например, лимонной, яблочной, молочной, на величину выхода конечного продукта.

Результаты исследований, отраженные в таблице 1 (эксперименты 5, 6), показали, что дополнительное использование кислоты для выделения коллагена из рыбного сырья также повышает количество коллагена в полуфабрикате рыбного сырья, что также способствует достижению технического результата.

При получении гидролизатов коллагенов актуальным является вопрос выбора ферментного препарата и определение его эффективных концентраций. При выборе ферментного препарата основывались на его коллагенолитической и протеазной активности. В качестве ферментных препаратов использовали протамекс, коллагеназу из печени камчатского краба, микробиальную коллагеназу из Clostridium sp., а также экстракт печени камчатского краба в качестве ферментного препарата. Во всех используемых препаратах ферментов была определена общая протеолитическая активность известным способом, по Каверзневой.

Из проведенного определения видно, что наиболее высокая протеолитическая активность характерна для сухого препарата коллагеназы из печени камчатского краба и препарата протамекс.

Далее была проведена оценка влияния различных ферментов на гидролиз коллагена.

Проведенное исследование показало, что все исследованные ферменты катализируют гидролиз концентрата коллагена преимущественно в течение 2,5 часов. В данной серии экспериментов также отмечена более высокая гидролитическая активность препарата протамекс по отношению к концентрату коллагена.

В результате, для первой ступени гидролиза шкур рыб был выбран фермент протамекс. Концентрацию протамекса подбирали опытным путем.

Для повышения выхода коллагена при экстракции из сырья используют пепсин. Были проведены исследования по обоснованию использования пепсина на второй стадии ферментирования шкур рыб. Ферментолиз проводили при разных концентрациях пепсина. В результате определена оптимальная концентрация пепсина и рациональное время ферментолиза. Все это привело к максимальному выходу коллагена из рыбного сырья и позволило решить поставленную техническую проблему.

Именно совокупность всех существенных признаков обеспечила высокий выход коллагена из рыбного сырья, позволила увеличить пищевую ценность конечного продукта за счет глубокого расщепления белка и достичь заявленный технический результат.

Предлагаемый способ позволяет получить коллаген с высоким выходом и высокой степени очистки, что немаловажно, т.к. примеси могут вызывать аллергические реакции при употреблении коллагена.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ позволяет:

- провести глубокое расщепление белков;

- снизить содержание балластных веществ в продукте;

- повысить выход коллагена;

Способ реализуется следующим образом.

После стандартной обработки рыбных шкур проводят обработку перекисью водорода, после отмывают водой и обрабатывают ферментным препаратом нейтраза, повторно отмывают, затем измельчают. Далее сырье подвергают экстракции раствором кислоты, например, лимонной. После формирования осадка его отделяют, а полученный гомогенизированный продукт промывают холодной водой и подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу с применением ферментных препаратов протамекс и пепсин. После каждой ступени гидролиза фермент инактивируют. Полученный ферментолизат разделяют на фракции. При необходимости подвергают сушке.

Ниже приведены примеры, подтверждающие реализацию способа получения низкомолекулярного рыбного коллагена.

Пример 1

Шкуру минтая очищают, взвешивают, промывают холодной проточной водой, обрабатывают 5%-ным раствором перекиси водорода и снова промывают водой. Затем шкуру обрабатывают в течение 1,5 часов при 50°С ферментом нейтраза в соотношении фермент: сырье 1:3, предварительно приготовив ферментный раствор в разведении фермент: вода 1:3. После чего шкуры дважды промывают. Далее шкуры измельчают на коллоидной мельнице и проводят экстракцию в воде при соотношении 1:1 в течение 1,5 часа при 50°С. Раствор фильтруют. В фильтрат вносят лимонную кислоту в расчете 10 г на 1 кг измельченного сырья. После формирования осадка, его отделяют на сепараторе.

Полученный гомогенизированный продукт содержит коллагена 73,5%. Гомогенизированный продукт промывают холодной водой и растворяют в воде в соотношении 1:1. Полученный раствор подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу при температуре 40°С с применением ферментных препаратов протамекс (1,3 ПЕд/г сырья, рН 8,0) в течение 2,5 часов и пепсин (1,2 Ед/г сырья, рН 4,5) в течение 2,5 ч. После каждой ступени гидролиза фермент инактивируют при температуре 80°С в течение 20 мин. Полученный ферментолизат разделяют на фракции на ультрафильтрационной установке с кассетами 300 кДа. Фракцию ниже 300 к Да сушат лиофильно.

Содержание коллагена в конечном продукте составляет 97,7%.

Пример 2.

Шкуру горбуши очищают, взвешивают, промывают холодной проточной водой, обрабатывают 3%-ным раствором перекиси водорода и снова промывают водой. После этого сырье обрабатывают ферментом нейтраза в соотношении сырье: фермент 1:5, предварительно приготовив ферментный раствор из расчета фермент: вода 1:9. После чего шкуры промывают дважды. Затем проводят экстракцию в воде 1:3 в течение 1 часа при температуре 45°С. Раствор фильтруют, в фильтрат вносят яблочную кислоту в расчете 8,0 г на 1 кг измельченного сырья. После формирования осадка, его отделяют на сепараторе. Полученный гомогенизированный продукт содержит коллагена 68,5%. Гомогенизированный продукт промывают холодной водой и растворяют в воде в соотношении 1:1. Полученный раствор подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу при температуре 40°С с применением ферментных препаратов протамекс (1,5 Ед/г сырья, рН 8,0) в течение 2 часов, затем пепсин (1,5 Ед/г сырья, рН 4,5) в течение 3 часов. После каждой ступени гидролиза фермент инактивируют при температуре 80°С в течение 25 мин. Полученный ферментолизат разделяют на фракции на ультрафильтрационной установке с кассетами 300 кДа. Фракцию ниже 300 к Да сушат лиофильно.

Содержание коллагена в конечном продукте составляет 89,5%.

Пример 3.

Шкуру трески очищают, взвешивают, промывают холодной проточной водой, обрабатывают 4%-ным раствором перекиси водорода и снова промывают водой. После этого сырье обрабатывают ферментом нейтраза в соотношении сырье: фермент 1:4, предварительно приготовив ферментный раствор из расчета фермент: вода 1:9. После чего сырье промывают дважды. Затем проводят экстракцию в воде 1:1 в течение 1,5 часов при 40°С. Раствор фильтруют, в фильтрат добавляют молочную кислоту в расчете 9,0 г на 1 кг измельченного сырья. После формирования осадка, его отделяют на сепараторе. Полученный гомогенизированный продукт содержит коллагена 75,5%. Гомогенизированный продукт промывают холодной водой и растворяют в воде в соотношении 1:1. Полученный раствор подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу при температуре 38°С с применением ферментных препаратов протамекс (1,6 Ед/г сырья), рН 8,0) в течение 2,5 ч и пепсин (1,3 Ед/г сырья, рН 4,5, в течение 2,5 часов. После каждой ступени гидролиза фермент инактивируют при температуре 80°С в течение 25 мин. Полученный ферментолизат разделяют на фракции на ультрафильтрационной установке с кассетами 300 кДа. Фракцию ниже 300 кДа сушат лиофильно.

Содержание коллагена в конечном продукте составляет 95,5%.

Изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения гидролизата рыбного коллагена, который может быть использован в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности для получения медицинских и косметических препаратов, а также некоторых продуктов питания. Способ получения низкомолекулярного коллагена из шкур рыб включает подготовку рыбного сырья путем его очистки и промывки холодной проточной водой. После промывки рыбное сырье обрабатывают 3-5% перекисью водорода в соотношении сырье:перекись водорода 1:1 и ферментом нейтраза. Затем шкуры дважды промывают, измельчают на коллоидной мельнице и проводят экстракцию в воде, раствор фильтруют, в фильтрат вносят пищевую кислоту, после формирования осадка его отделяют на сепараторе, гомогенезированный продукт промывают холодной водой и растворяют в воде в соотношении 1:1, полученный раствор подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу при температуре 38-40°С с применением ферментных препаратов: протамекс из расчета 1,3 Ед/г сырья, рН=8 в течение 2,5 часов и пепсин из расчета 1,2 Ед/г сырья, рН=4,5 в течение 2,5 часов, после каждой ступени гидролиза фермент инактивируют, полученный ферментолизат разделяют на фракции на ультрафильтрационной установке с кассетами 300 кДа, фракцию ниже 300 кДа сушат лиофильно. Предлагаемый способ получения гидролизата рыбного коллагена обеспечивает получение гидролизата коллагена с максимальным выходом до 97,7% со значением молекулярной массы от 15 до 300 кДа. 2 табл., 3 пр.

Способ получения низкомолекулярного коллагена из шкур рыб, включающий подготовку рыбного сырья путем его очистки и промывки холодной проточной водой, ферментативное выделение гидролизата, получение кислой дисперсии гидролизата, формирование сухой формы гидролизата коллагена, отличающийся тем, что после промывки рыбное сырье обрабатывают 3-5% перекисью водорода в соотношении сырье:перекись водорода 1:1 и ферментом нейтраза, затем шкуры дважды промывают, измельчают на коллоидной мельнице и проводят экстракцию в воде, раствор фильтруют, в фильтрат вносят пищевую кислоту, после формирования осадка его отделяют на сепараторе, гомогенезированный продукт промывают холодной водой и растворяют в воде в соотношении 1:1, полученный раствор подвергают ступенчатому ферментативному гидролизу при температуре 38-40°С с применением ферментных препаратов: протамекс из расчета 1,3 Ед/г сырья, рН=8 в течение 2,5 часов и пепсин из расчета 1,2 Ед/г сырья, рН=4,5 в течение 2,5 часов, после каждой ступени гидролиза фермент инактивируют, полученный ферментолизат разделяют на фракции на ультрафильтрационной установке с кассетами 300 кДа, фракцию ниже 300 кДа сушат лиофильно.