НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ПОРЧИ МЯСА В ВАКУУМНОЙ УПАКОВКЕ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления генетического материала (ДНК) возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке в биологических образцах - в мясном соке, пробах-смывах с оборудования, образцах окружающей среды, культуральных жидкостях и прочих биопробах и мазках, без необходимости этапа обогащения с целью постановки диагноза о возможной дальнейшей порчи вакуумированного куска мяса, оценки качества химической обработки мясоперерабатывающего оборудования от контаминации спорами возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке, а также для решения научно-исследовательских задач по выделению отечественных штаммов с целью их депонирования, мониторингу качества выпускаемой продукции в вакуумной упаковке, созданию диагностических и противомикробных антиспоровых препаратов и может быть использовано в ветеринарии, биотехнологии и санитарной гигиене. При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда возможно выявление генетического материала (ДНК) возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке [3].

В настоящее время отечественных наборов нет.

Несмотря на то что хорошая санитарная гигиена и достаточно низкие температуры охлаждения (-1,5 °C) могут применяться для контроля порчи первичных продуктов из говядины в вакуумной упаковке [7], это все еще является серьезной проблемой для мясоперерабатывающего сектора говядины [8]. Говяжьи туши легко заражаются спорами C. estertheticum, C. gasigenes и, в меньшей степени, C. ruminantium во время обезвоживания и последующей обработки [6, 8]. Вакуумная упаковка обваленных первичных продуктов часто способствует прорастанию спор [4, 11], и охлажденное (от 0 до 2 °C) хранение создает холодные, анаэробные условия, в которых могут расти эти психрофильные организмы [1, 2, 5, 10]. Вздутие упаковки, которое обычно возникает после 4-6 недель хранения в охлажденном состоянии, характеризуется выделением больших объемов газа (двуокиси углерода), неприятным запахом (сероводород) и металлическим блеском. Мясо, испорченное таким образом, не имеет коммерческой ценности [2].

C.estertheticum вызывает порчу говядины, баранины и оленины и делает мясо неприемлемым, что приводит к финансовым потерям и снижению доверия потребителей. Ряд штаммов, включая Clostridium algidicarnis, Clostridium algidixylanolyticum, Clostridium estertheticum, Clostridium frigidicarnis и Clostridium gasigenes, были вовлечены в порчу красного мяса. В отличие от некоторых других клостридий, С. estertheticum психрофильны и полностью способны к росту в охлажденных, анаэробных условиях, особенно таких, как мясо в вакуумной упаковке в морозильной камере холодного хранения. Бактерии потребляют сахара, такие как глюкоза и лактоза, что приводит к брожению и образованию газов, что приводит к порче “взорванной упаковки”. С. estertheticum (tpi). C.estertheticum может передаваться при капании мясного сока, а также при непосредственном контакте между загрязненными продуктами. Как упоминалось ранее, хранение в холодильнике не делает С. estertheticum инертным, и он может продолжать портить продут.

Для наиболее длительного сохранения полезных пищевых свойств охлажденного мяса различных видов (баранины, говядины и пр.) широко используют вакуумные упаковки. Существует очевидная проблема, связанная со вздутием вакуумных упаковок, которое способствует дальнейшей порче охлажденного мяса, содержащегося в таких упаковках. Вздутие вакуумных упаковок связано, прежде всего, с действием Clostridium estertheticum [8].

Попадание Clostridium estertheticum в вакуумную упаковку, содержащих мясопродукты, связано с заражением убойных туш спорами на бойне. Известно, что основными источниками заражения мяса Clostridium estertheticum являются шкуры скота, навоз, почва, корма и растения [5].

Известны методы определения Clostridium estertheticum, такие как классические методы отбора проб, культивирование, микрокопирование, микробиологические и молекулярно-биологические методы. Диагностика возбудителя порчи - Cl. estertheticum и подобных микроорганизмов в нашей стране не налажена, культуральные методы исследований занимают до 3 месяцев времени, а экспресс-диагностика методом ПЦР в реальном времени отечественными наборами ПЦР полностью отсутствует.

Таким образом, существует явная потребность в разработке способа идентификации возбудителей, вызывающих порчу охлажденного мяса в вакуумных упаковках с помощью ПЦР-анализа с детекцией продуктов амплификации в процессе производства.

Ниже приведены зарубежные аналоги, представляющие собой наборы праймеров и наборы реагентов, обеспечивающие детекцию ДНК возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке.

Известна заявка, которая относится к выделенному штамму клостридий и способам обнаружения присутствия выделенного штамма в мясных продуктах. Способ обнаружения в мясном соке штамма Clostridia, вызывающего порчу упаковки, в мясном продукте, где используют ПЦР (расшифровать), раскрытый в документе WO2010032233 A2 (BOLTON DECLAN et all.) от 25.03.2010.

Существует коммерческий набор Primerdesign Ltd TM Clostridium estertheticum triosephosphate isomerase (tpi) gene 150 tests genesig Advanced Kit ® производства Великобритания.

Существует коммерческий набор Techne qPCR Clostridium estertheticum triosephosphate isomerase (tpi) gene (150 тестов): Quantification of Clostridium estertheticum genomes. 1 Advanced kit handbook HB10.03.07 производства Китай.

Существует коммерческий набор производства NZYTECH, Турция:

Clostridium estertheticum Real-time PCR Kit, RUO; Catalogue number: MD00721, 150 reactions.

Существует коммерческий набор реагентов SureFast ® Clostridium estertheticum PLUS для определения Cl. Estertheticum производства CONGEN, Германия (прототип). Доступен для заказов отечественных потребителей по настоящее время только набор этого производителя, но он обладает очень высокой стоимостью. Существенным недостатком данного набора является отсутствие валидации для отечественных ДНК-амплификаторов (например, амплификатор, детектирующий "ДТпрайм" по ТУ 9443-004-96301278-2010 в модификации 5М1).

Технической задачей является разработка набора для быстрой идентификации ДНК Cl. Estertheticum, вызывающей порчу охлажденного мяса в вакуумных упаковках, с помощью ПЦР-анализа с детекцией продуктов амплификации в процессе производства и обладающий чувствительностью, достигаемое на отечественном оборудовании.

Техническим результатом заявленного технического решения является то, что заявляемое техническое решение позволяет без использования дополнительных методов выявлять ампликоны Cl. Estertheticum в биологических образцах в виде, например, мясного сока. Заявленное техническое решение позволяет сокращать риск контаминации продуктами амплфикации, что приводит к снижению технологических ошибок в процессе производства мясной продукции. Кроме того, заявленное техническое решение позволяет сократить издержки, связанные с проведением анализа.

Указанный технический результат достигается тем, что набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации ДНК Cl. Estertheticum методом гибридизационно-флуоресцентно полимеразной цепной реакции включает олигодезоксирибонуклеотиды, обладающие специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно-меченный зонд, имеющие следующую структуру: Fw primer - GAGTTTGATCCTGGCTCA, Rv primer - TTACCTCACCAACTAGCTAA, зонд 5'→3' FAM- TAACATCAAAGGAATTTTTCGGAATTTC -BHQ1.

Расчет и конструирование набора диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на консервативную область гена

Используемые для расчета праймеров и зонда последовательности геномов клостридий были получены из международной базы данных GenBank. Для построения элайнментов, анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0.0 (Informax, США) и онлайн-интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI).

Праймеры и зонд для детекции ДНК Cl. Estertheticum могут быть представлены в следующем виде:

Fw primer - GAGTTTGATCCTGGCTCA, t = 53,8

Rv primer - TTACCTCACCAACTAGCTAA, t = 53,0

Размер ампликона 258 п.о.

Зонд :FAM- TAACATCAAAGGAATTTTTCGGAATTTC -BHQ1

Набор праймеров и зонд позволяют идентифицировать ДНК возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке методом ПЦР в реальном времени с получением специфического амплифицированного фрагмента гена и характеризуется наличием последовательности-мишени в гене 16S рРНК.

Конструирование положительных контролей и оценка специфичности праймеров и зондов в реакции ПЦР

Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования специфического ампликона в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США). Затем полученными плазмидными конструкциями, несущими специфическую вставку, трансформировали компетентные клетки E. Coli линии TOP 10 (Invitrogen, США). Наличие специфической к гену Cl. Estertheticum ДНК-вставки подтверждали секвенированием. В ходе проделанной работы была получена рекомбинантная плазмида.

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния (Mg²⁺), концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. С использованием полученной плазмидной конструкции были подобраны оптимальные концентрации ионов Mg²⁺(2.5 мМ MgCl₂), прямого и обратного праймеров (300 нМ), флуоресцентного ДНК-зонда (100 нМ). Важно отметить, что все этапы оптимизации проведения ПЦР были осуществлены с использованием коммерческих реагентов и приборов для амплификации, являясь коммерчески доступными, они предназначены для массового применения в диагностических лабораториях России. Это позволяет широко применять данное изобретение в лабораторной практике.

Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК. Концентрацию плазмидной ДНК определяли при помощи коммерческого набора реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США). Аналитическая чувствительность разработанного метода с использованием праймеров составила 10² геномных эквивалентов (ГЭ).

Было проведено сравнение разработанной лабораторной версии набора реагентов ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) с набором реагентов SureFast ® Clostridium estertheticum PLUS для определения Cl. Estertheticum производства CONGEN, Германия (прототип) для детекции Clostridium estertheticum в биологических образцах.

Сравнительные данные показали, что ПЦР-РВ (заявленное решение) по чувствительности превосходит набором реагентов SureFast ® Clostridium estertheticum PLUS для определения Cl. Estertheticum производства CONGEN, Германия (прототип) на 1,5-2%. Эти результаты подтверждали секвенированием биологического материала, применяемого в сравнительных испытаниях.

Заявляемое техническое решение позволяет кроме этого сократить стоимость проведения одного анализа.

Специфичность разработанной лабораторной версии набора реагентов ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) проверяли на большом количестве штаммов клостридий и бактерий других видов.

Таким образом, рассчитанные и представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд обладают минимальной вырожденностью, а созданный на их основе набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью.

Пример расчета и подготовки 10 реакций

Таблица 1. Расчет использования реагентов Компоненты для мастер-микса Объем на 1 реакцию Объем на 10 реакций с 10% избытком Реакционная смесь 19.3 мкл 212.3 мкл Taq Полимераза 0.7 мкл 7.7 мкл Общий объем 20 мкл 220 мкл

Хорошо перемешайте мастер-микс и центрифугируйте до использования.

Таблица 2. Состав набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации ДНК возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке Код реагента Реагент Количество Цвет крышки 1 Реакционная смесь 2 x 1100 мкл Оранжевый 2 Taq Полимераза 1 x 80 мкл Красный 3 Положительный контроль 1 x 200 мкл Синий

Таблица 3. Установочные параметры термоциклера Амплификатор детектирующий "ДТпрайм" по ТУ 9443-004-96301278-2010 в модификации 5М1 Blockcycler &
R-Biopharm RIDA®CYCLER Rotorcycler & LightCycler® 480 II &
LTF MyGo Pro Начальная денатурация 1 мин, 95°C, 1 мин, 95°C, 1 мин, 95°C Циклы 45 45 45 Денатурация 15 с, 95°C 15 с, 95°C 10 с, 95°C Отжиг/Элонгация (CYCLE) 30 с, 60°C 30 с, 60°C 15 с, 60°C Скорость температурного перехода/ Ramp Rate максимум максимум максимум

Таблица 4. Насторойка канала для обнаружения Наименование прибора Детектирующий канал Амплификатор детектирующий "ДТпрайм" по ТУ 9443-004-96301278-
2010 в модификации 5М1 FAM Внутренний положеительный контроль HEX Blockcycler &
R-Biopharm RIDA®CYCLER Clostridium estertheticum Green Внутренний положительный контроль Yellow Rotorcycler & LightCycler® 480 II &
LTF MyGo Pro Clostridium estertheticum Внутренний положительный контроль

Приготовление смеси для ПЦР в реальном времени

• Внесите пипеткой 20 мкл мастер-микса в соответствующие пробирки/лунки.

• Закройте пробирку с отрицательным контролем (отрицательный контроль готов к ПЦР).

• Внесите пипеткой 5 мкл образца в указанные пробирки/лунки или капилляры.

• Внесите пипеткой 5 мкл положительного контроля в указанные пробирки/лунки или капилляры.

• Центрифугируйте все пробирки / лунки или капилляры на низкой скорости.

• Поместите пробирки / лунки или капилляры в прибор для ПЦР в реальном времени и запустите цикл в соответствии с настройками.

Интерпретация результатов

Оценка должна выполняться в соответствии с обычной программой анализа, рекомендованной производителем прибора для ПЦР в реальном времени.

Контрольные реакции должны давать правильные результаты.

ДНК Clostridium estertheticum обнаруживается в FAM-канале. В канале VIC/HEX осуществляется контроль амплификации.

Образец считается положительным, если наблюдается амплификация в соответствующем канале (FAM-канале).

Образец считается отрицательным, если амплификации не наблюдается в соответствующем канале (FAM-канале), и если внутренний контроль (VIC/HEX-канал) образца является положительным со сдвигом значения Cp<2 по сравнению с отрицательным контролем.

Если образец ДНК в VIC/HEX-канале не показывает амплификации или сдвига значения Cp> 2 по сравнению с отрицательным контролем, то он содержит вещества, ингибирующие ПЦР. Значительное снижение сигнала флуоресценции также может указывать на присутствие веществ, ингибирующих ПЦР. В этих условиях необходимо улучшить выделение ДНК и очистку образца. В качестве альтернативы ДНК можно разбавить (рекомендация 1: 2 в воде для ПЦР) и снова проанализировать на ингибирование. Коэффициент разбавления также влияет на предел обнаружения Clostridium estertheticum.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. ADAM, K. H., FLINT, S. H. & BRIGHTWELL, G. (2013). Reduction of spoilage of chilled vacuum-packed lamb by psychrotolerant clostridia. Meat Science, 93, 310-315.

2. BOLTON, D. J., CARROLL, J. & WALSH, D. (2015). A four-year survey of blown pack spoilage Clostridium estertheticum and Clostridium gasigenes on beef primal cuts. Letters in Applied Microbiology, 61, 153-157.

3. BRIGHTWELL, G. & CLEMENS, R. (2012). Development and validation of a real-time PCR assay specific for Clostridium estertheticum and C. estertheticum-like psychrotolerant bacteria. Meat Science, 92, 697-703.

4. BRODA, D. M. (2007). The effect of peroxyacetic acid-based sanitizer, heat and ultrasonic waves on the survival of Clostridium estertheticum spores in vitro. Lett Applied Microbiol, 45, 336-41.

5. BRODA, D. M., BOEREMA, J. A. & BELL, R. G. (2003). PCR detection of psychrophilic Clostridium spp. causing 'blown pack' spoilage of vacuum-packed chilled meats. Journal of Applied Microbiology, 94, 515-522.

6. BRODA, D. M., BOEREMA, J. A. & BRIGHTWELL, G. (2009). Sources of psychrophilic and psychrotolerant clostridia causing spoilage of vacuum-packed chilled meats, as determined by PCR amplification procedure. J Appl Microbiol, 107, 178-86.

7. MILLS. J., A. DONNISON & BRIGHTWELL, G. (2014) factors affecting microbial spoilage and shelf-life of chilled vacuum-packaged lamb transported to distant markets: A review. Meat Science, 98, 71-80.

8. MOSCHONAS, G., BOLTON, D. J., SHERIDAN, J. J. & MCDOWELL, D. A. (2009a). Isolation and sources of 'blown pack' spoilage clostridia in beef abattoirs. Journal of Applied Microbiology, 107, 616-624.

9. MOSCHONAS, G. (2009b). Control of 'blown pack' spoilage of vacuum packed chilled meats. PhD, University of Ulster.

10. MOSCHONAS, G., BOLTON, D. J., SHERIDAN, J. J. & MCDOWELL, D. A. (2010). The effect of storage temperature and inoculum level on the time of onset of 'blown pack'spoilage. Journal of Applied Microbiology, 108, 532-539.

11. MOSCHONAS, G., BOLTON, D. J., SHERIDAN, J. J. & MCDOWELL, D. A. (2011). The effect of heat shrink treatment and storage temperature on the time of onset of “blown pack” spoilage. Meat Science, 87, 115-118

12. MOSCHONAS, G. & BOLTON, D. J. (2013). Characterization of a potentially novel 'blown pack' spoilage bacterium isolated from bovine hide. Journal of Applied Microbiology, 114, 771-777.

13. WO 2010032233 A2 (BOLTON DECLAN et al.) от 25.03.2010.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для идентификации ДНК возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке. Набор содержит пару олигонуклеотидных праймеров, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченный ДНК-зонд. Заявляемое техническое решение позволяет выявлять генетический материал (ДНК) возбудителя порчи мяса в вакуумной упаковке - Clostridium estertheticum. 4 табл.

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно- меченного зонда для детекции ДНК Clostridium estertheticum методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в биологических образцах, которые имеют следующую структуру: прямой (F) и обратный (R) праймеры F: 5'- GAGTTTGATCCTGGCTCA -3' и R: 5'- TTACCTCACCAACTAGCTAA -3'; флуоресцентно-меченный ДНК-зонд FAM- TAACATCAAAGGAATTTTTCGGAATTTC -BHQ1.