НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ДНК ГЕРПЕСВИРУСОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 1 И 5 ТИПОВ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/11 C12Q1/68 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и молекулярной биологии, может быть использовано для выявления участка ДНК и последующей дифференциации герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано специалистами научно-исследовательских учреждений, ветеринарных диагностических лабораторий, занимающихся изучением инфекционных болезней и их возбудителей.

Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ) - остаётся одной из наиболее экономически значимых вирусных болезней крупного рогатого скота для современного промышленного животноводства. Заболевание проявляется различными клиническими признаками в зависимости от способа инфицирования животных. Большую опасность представляет способность возбудителя длительное время персистировать в организме инфицированных восприимчивых животных.

По современной классификации возбудитель болезни - Varicellovirus bovinealpha1 (BoHV-1) является типичным представителем рода Varicellavirus подсемйства Alphaherpesvirinae.

Анализ генетической структуры BoHV-1 позволил разделить его на подтипы 1.1, 1.2а, 1.2b и 1.3. Развитие респираторной или генитальной формы заболевания определяется не столько подтипом вируса, сколько путем инфицирования животных. Подтип 1.3, вызывающий нейропатологию у телят, в настоящее время классифицирован как герпесвирус КРС 5 типа (BoHV-5 - Varicellovirus bovinealpha5), поскольку геном двух вирусов идентичен только на 86%, что достаточно для классификации BoHV-5 как самостоятельного возбудителя. Имеющиеся в настоящее время литературные данные подтверждают циркуляцию этого возбудителя на территории России. При этом все авторы отмечают, что BoHV-5, изолированный на территории России, вызывает респираторную патологию у телят. Все изоляты вирусов BoHV-1 и BoHV-5 иммунологически идентичны, принадлежность полевых, аттенуированных вакцинных и генно-модифицированных штаммов к тому или иному подтипу можно определить только генетическими методами.

Показано, что на территории России циркулируют все указанные подтипы возбудителя. Тем не менее, точные литературные данные относительно географической распространенности разных подтипов вируса на территории страны в настоящее время отсутствуют. Для уточнения эпизоотической ситуации в каждом из субъектов Российской Федерации необходимо проводить активный мониторинг циркуляции BoHV-1 и BoHV-5.

Получение олигонуклеотидных синтетических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации и дифференциации ДНК герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов позволит дополнить и усовершенствовать методы изучения вирусов, вызывающих респираторную патологию у крупного рогатого скота - одну из наиболее широко распространенных и экономически значимых проблем современного промышленного животноводства.

Известен набор синтетических уникальных олигонуклеотидов-праймеров 5’-CGCGCTCTCCGCGTCGTG-3’ (18 н.) и 5’-CCGCGTGCGCTCCCGTG-3’ (17 н.), используемых для выявления ДНК вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита-герпесвируса 1 типа крупного рогатого скота [патент №2241751 C2 Российская Федерация]. Предложенные олигонуклеотиды позволяют проводить идентификацию нуклеиновой кислоты вируса инфекционного ринотрахеита и пустулезного вульвовагинита (ИРТ-ИПВ), - гипервируса 1 типа крупного рогатого скота (BoHV-1). Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК ИРТ-ИПВ (BoHV-1) в пробе.

Известен также набор синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ выявления ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) [патент №2259398 C1 Российская Федерация]. Предложенные праймеры комплементарные высоко консервативной области генома вируса ИРТ КРС района гена тимидинкиназы (tk) и используются для выявления ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции. Также предложен способ выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Предложенный способ предусматривает проведение амплификации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для проведения ПЦР используют синтетические праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса ИРТ КРС района гена тимидинкиназы (tk). Оценку результатов реакции проводят без предварительной рестрикции полученного продукта. Результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 298 пар оснований.

Недостатком описанных выше наборов и способов является их высокая специфичность к соответствующим участкам генома герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа (BoHV-1) и, соответственно, невозможностью детектировать геном герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа (BoHV-5).

Известен способ выявления вируса ИРТ КРС в полимеразной цепной реакции с последующей дифференциацией вакцинного штамма ТК-А от эпизоотических штаммов и изолятов при помощи ПДРФ-анализа [патент № 2265667 C2 Российская Федерация]. Способ предусматривает проведение полимеразной цепной реакции с праймерами 5’-ACGTGCTGCTCAACGTGTAC-3’ и 5’-AGGACGAGCTCGCGGATATA-3’ с последующей дифференциацией выявленной ДНК в случае положительного результата реакции ПЦР. Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 464 пар оснований. Для дифференциации продукт ПЦР обрабатывают эндонуклеазой Sac II. В результате чего наличие одного фрагмента длиной 464 пар оснований соответствует вакцинному штамму ТК-А, а двух фрагментов размером 343 и 121 пар оснований соответствует эпизоотическим штаммам и изолятам. К недостаткам данного способа относится его стадийность, трудоемкость и, как следствие, сложность использования в рутинной лабораторной диагностике.

Кроме того, применяются способы дифференциальной диагностики герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, основанные на амплификации консервативных участков гена гликопротеина В (gB) указанных вирусов по конечной точке, получения продуктов ПЦР определенной длины. Последующая дифференцировка вирусов осуществляется методом секвенирования продуктов ПЦР по Сенгеру и анализу полученных нуклеотидных последовательностей при помощи on-line ресурса BLAST (NCBI) [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] [Юров К.П., Методические рекомендации по молекулярной диагностике альфагерпесвирусных инфекций крупного рогатого скота 1 и 5 типа. К.П. Юров, А.В. Пчельников, С.А. Алексеенкова - Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» - М., - 2017. - 14 c.]. Недостатками данных способов является их трудоемкость и длительность исполнения.

Ближайшим аналогом является способ генотипирования герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов ранее предлагали праймеры к различным участкам гена гликопротеина С указанных вирусов. Claus M.P. et al. [Claus M.P., Alfieri A.F., Folgueras-Flatschart A.V., Wosiacki S.R., Médici K.C., Alfieri A.A. Rapid detection and differentiation of bovine herpesvirus 1 and 5 glycoprotein C gene in clinical specimens by multiplex-PCR. J. Virol. Methods. 2005; 128 (1-2):183-188. doi:10.1016/j.jviromet.2005.05.001] разработали праймеры для амплификации по конечной точке различных участков гена гликопротеина С герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, с последующим анализом продуктов амплификации путем разделения их электрофорезом в 2%-ном агарозном геле. Получение в результате амплификации фрагмента генома длиной 159 н.п. свидетельствует о детекции генетического материала герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа. Получение фрагмента генома длиной 354 н.п. свидетельствует о детекции генетического материала герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа.

Технической проблемой указанного метода является более длительный временной интервал проведения исследования, связанный с необходимостью электрофоретической детекции продуктов амплификации.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность и аналитическая чувствительность олигонуклеотидных праймеров, комплементарных идентичным консервативным областям генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, и флуоресцентно-меченых зондов, а также значительное сокращение времени исследование за счет использования метода ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Флуоресцентно-меченые зонды отжигаются в участках генома соответствующего вируса, делетированных у другого вируса. Это позволяет использовать систему, состоящую из двух праймеров, одинаково комплементарных к участкам генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов и уникальных для каждого вируса флуоресцентно-меченых зондов, детектируемых в разных световых диапазонах, что значительно упрощает процедуру дифференциации двух вирусов.

Сущность изобретения заключается в том, что созданы синтетические олигонуклеотидные праймеры, одинаково комплементарные идентичным консервативным участкам генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов и уникальных для каждого вируса флуоресцентно-меченых зондов.

Предлагаемые синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды имеют следующую нуклеотидную последовательность:

F. primer - 5’-GGCACCTCCATTAAATGGGC-3’;

R. primer - 5’-CGCCACGTCCTCGAACCA-3’;

Probe_BoHV-1 - 5’-GCTACCTCCAAAGCGAAGGCGCC -3’;

Probe_BoHV-5 - 5’-ACACCGACGCCGACGTGGAGAT-3’.

Выявление ДНК герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов проводят методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (РВ-ПЦР).

Для исследования проводят выделение суммарной ДНК из 100 мкл исследуемого материала с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (Амплисенс, Россия). РВ-ПЦР проводят в объеме 25 мкл при помощи набора реагентов для проведения ПЦР с флуоресцентными зондами БиоМастер HS-qPCR (2×) (ООО «Биолабмикс», Россия). Реакционная смесь содержит: 2× смесь БиоМастер HS-qPCR (2×) -12,5 мкл, 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль каждого зонда и 5 мкл выделенной ДНК и деионизованную воду до 25 мкл. Амплификация проводится по по следующему температурному протоколу: 5 мин при 94°C; циклирование: 20 с при 94°C, 20 с при 62°С, 15 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала при 62°С). Детектирование результата амплификации ДНК герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа проводится на канале FAM/Green; результаты амплификации ДНК герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа - на канале ROX/Orange/TxR. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для выбора праймеров проанализировали полные последовательности генома всех штаммов герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, представленных в базе данных GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/]. С помощью программы Primer Premier 5.0 были подобраны праймеры к идентичным консервативным участкам генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов и уникальные для каждого вируса последовательности зондов (таблица 1).

Таблица 1

Название праймеров и зондов Последовательность праймера от 5'-3' Назначение Forward primer ggcacctccattaaatgggc Амплификация участка генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов Reverse primer cgccacgtcctcgaacca Probe_BoHV-1 GCTACCTCCAAAGCGAAGGCGCC Детекция генома герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа Probe_BoHV-5 acaccgacgccgacgtggagat Детекция генома герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа

Высокую специфичность праймеров и флуоресцентно-меченых зондов подтвердили с помощью on-line ресурса BLAST (NCBI) [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. Данные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды предназначены для постановки РВ-ПЦР.

Пример 2. Постановка РВ-ПЦР включала выделение суммарной ДНК из 100 мкл исследуемого материала с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (Амплисенс, Россия). РВ-ПЦР проводили в объеме 25 мкл при помощи набора реагентов для проведения ПЦР с флуоресцентными зондами БиоМастер HS-qPCR (2×) (ООО «Биолабмикс», Россия). Реакционная смесь содержала: 2× смесь БиоМастер HS-qPCR (2×) -12,5 мкл, 10 пмоль каждого праймера, 5 пмоль каждого зонда и 5 мкл выделенной ДНК и деионизованную воду до 25 мкл.

В каждой серии анализов использовали по 2 контрольных образца: отрицательный - деионизированная вода; положительный - ДНК, выделенная из культуры клеток MDBK, зараженной штаммами герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов.

Пример 3. РВ-ПЦР проводили по протоколу, указанному в Таблице 2.

Таблица 2. Этапы и температурный режим ОТ-ПЦР

Этап Температура-Время Количество циклов Денатурация 94°C-5 мин 1 Денатурация 94°C-20 сек 40 Отжиг праймеров 62°C-20 сек Элонгация 72°C-15 сек

Пример 4. Оценка аналитической чувствительности праймеров для детекции и дифференциальной диагностики герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов готовили последовательные десятикратные разбавления вируссодержащей суспензии референтных штаммов с известным уровнем инфекционной активности, переведенной путем применения распределения Пуассона в количество инфекционных вирусных частиц концентрациями от 7,9×10⁵ копий/см³ до 7,9×10² копий/см³ для герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа и от 1,9*10⁹ копий/см³ до 1,9*10² копий/см³ для герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа. Выделение ДНК проводили с использованием преципитационного метода (набор «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию образца, для которой получен положительный результат ПЦР в трех повторах (значения Ct < 40). Аналитическая чувствительность праймеров для детекции и дифференциальной диагностики герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов составляет 7,9×10² копий/см³ для герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа и 1,9×10⁴ копий/см³ для герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа.

Пример 5. Детекцию накопления продуктов амплификации участка генома герпесвируса крупного рогатого скота 1 типа проводится на канале FAM; результаты амплификации участка генома герпесвируса крупного рогатого скота 5 типа - на канале ROX. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивали с помощью программного обеспечения на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="Заявка_Пчельников.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-06-19">

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская

государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА

имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И.

Скрябина)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution

of Higher Education Moscow State Academy of Veterinary Medicine and

Biotechnology - MVA named after K I Skryabin</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Пчельников Александр

Владимирович</InventorName>

<InventorNameLatin>Pchelnikov Aleksandr

Vladimirovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор олигонуклеотидных праймеров

и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации и дифференциации ДНК

герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Varicellovirus bovinealpha1

Varicellovirus bovinealpha5</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcacctccattaaatgggc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Varicellovirus bovinealpha1

Varicellovirus bovinealpha5</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgccacgtcctcgaacca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Varicellovirus

bovinealpha1</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctacctccaaagcgaaggcgcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Varicellovirus

bovinealpha5</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaccgacgccgacgtggagat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации и дифференциации ДНК герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов. Настоящее изобретение обеспечивает высокую специфичность и аналитическую чувствительность олигонуклеотидных праймеров, комплементарных идентичным консервативным областям генома герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, и флуоресцентно-меченых зондов, а также значительное сокращение времени исследования за счет использования метода ПЦР с детекцией в режиме реального времени. 2 табл., 5 пр.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации и дифференциации ДНК герпесвирусов крупного рогатого скота 1 и 5 типов, имеющих следующий нуклеотидный состав:

F. primer - 5’-GGCACCTCCATTAAATGGGC-3’;

R. primer - 5’-CGCCACGTCCTCGAACCA-3’;

Probe_BoHV-1 - 5’-GCTACCTCCAAAGCGAAGGCGCC -3’;

Probe_BoHV-5 - 5’-ACACCGACGCCGACGTGGAGAT-3’.