Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом ПЦР в режиме реального времени Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к набору диагностических праймеров и флуоресцентно меченного зонда для одновременного выявления генетического материала широкого спектра флавивирусов, полученных из различных источников, путем амплификации методом ОТ-ПЦР в реальном времени и последующего секвенирования фрагмента генома вируса и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической инженерии, и в медицине.

В настоящее время на территории России отмечена циркуляция флавивирусов, переносимых как комарами: вирус Западного Нила (ВЗН), вирус японского энцефалита (ВЯЭ); так и клещами: вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), вирус омской геморрагической лихорадки (ВОГЛ), вирус Повассан (ВП), вирус шотландского энцефаломиелита овец (ВШЭО), вирус желтой лихорадки (ВЖЛ), вирус Кьяасанурской лесной болезни (ВКЛБ), вирус Ламми (ВЛ).

Геном флавивирусов представляет собой несегментированную одноцепочечную (+)РНК длиной приблизительно 11000 нуклеотидов. В процессе трансляции образуется один полипротеин, который под действием протеаз разрезается на 10 белков: 3 структурных (C, prM, E) и 7 неструктурных (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5).

В связи с этим возникает вопрос о возможной роли новых вирусных агентов в развитии трансмиссивных инфекций на территории России, что требует дальнейшего изучения, в том числе с использованием методов молекулярной биологии.

Известны методы обнаружения генетического материала флавивирусов, предложенные в работах Kuno G. et al., 1998, Kuno G., 1998, Scaramozzino N. et al., 2001.

Однако описанные в этих работах методы диагностики флавивирусов подразумевают применение гель-электрофоретической детекции продуктов амплификации, что делает метод более трудоемким и повышает риск контаминации продуктами амплификации ДНК. В открытых источниках отсутствует информация об использовании универсальных зондов для рода флавивирусов на ген NS5.

Результаты патентного поиска по выявлению генетического материала флавивирусов позволили определить несколько аналогов, которые все же значительно отличаются от предлагаемого изобретения.

Патент Китая касается способа для определения крайне специфического флавивируса, который поражает пресноводных креветок Macrobrachium rosenbergii (CN110846441, МПК C12Q1/6851, опубл. 28.02.2020 г.). Хотя в патенте и используется метод ПЦР в «реальном времени» с применением праймеров и зондов, специфических для гена полимеразы флавивируса, но данные праймеры и зонды не являются специфичными для остальных вирусов рода Flavivirus.

Известна международная заявка, которая касается использования мультиплексных биочипов для экспресс-диагностики вирусов, переносимых комарами (WO2014067390, МПК C12Q1/68, опубл. 08.05.2014 г.). Данный комплекс предусматривает использование дорогостоящего оборудования и не может быть доступен при выполнении простых диагностических задач. Кроме того, способ не подходит для диагностики флавивирусов, переносимых клещами.

Известен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа (патент RU2715617, МПК C12Q1/68, опубл. 02.03.2020 г.).

Известен способ выявления вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в реальном времени (патент RU2744187, МПК C12Q1/68, опубл. 03.03.2021 г.).

Известен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (патент RU2629604, МПК C12Q1/68, опубл. 30.08.2017 г.). Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами.

Однако предложенные в данных патентах-аналогах олигонуклеотиды не позволяют определять большинство вирусов рода Flavivirus. Необходимо также отметить, что целевые праймеры и зонды в указанных патентах специфичны к различным участкам генома, что не позволяет проводить диагностику всех возможных комариных и клещевых флавивирусов.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является универсальный набор праймеров для обнаружения флавивирусов и способ диагностики флавивирусов типа 1, вируса денге 2 типа, вируса денге 3 типа, вируса денге 4 типа, японского энцефалита, вируса Западного Нила, вируса желтой лихорадки и вируса Зика (патент Южной Кореи KR102181996, МПК C12Q1/70, опубл. 23.11.2020 г.). Набор обеспечивает повышение чувствительности и снижение ложноположительной реакции, которая является хронической проблемой обычного универсального набора праймеров для обнаружения флавивирусов.

Однако такой диагностический набор касается выявления флавивирусов, передаваемых комарами с применением специфических праймеров и зондов, но не позволяет проводить выявление флавивирусов, переносимых клещами.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого набора праймеров и оригинального флуоресцентно меченного зонда, который обеспечивает выявление генетического материала широкого спектра рода флавивирусов, полученного из различных источников.

Указанный технический результат достигается тем, что создан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченого зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом ПЦР в режиме реального времени, включающий панспецифичные праймеры для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и флуоресцентно меченный зонд, специфичный для представителей вирусов рода Flavivirus, имеющие следующие последовательности:

Праймеры:

MAMD: 5'- AACATGATGGGRAARAGRGATAA-3' 23

cFD2: 5'-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3' 26

Зонд:

FLAV-1: FAM-GGAAGCCGAGCCATTTGGTACATGTGG-BHQ1, 27

где: FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм;

BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.

Разработанный флуоресцентно меченый зонд направлен на родоспецифичное выявление фрагмента гена NS5, фланкируемого вышеприведенным набором прямого и обратного праймеров, и обеспечивает гибридизационно-флуоресцентную детекцию в режиме реального времени, что дает возможность в последующем сконструировать мультиплексный набор с использованием других родо- и видоспецифичных зондов для представителей семейства Flaviviridae.

Изобретение иллюстрируется графиками на фиг. 1, представляющими собой кривые флуоресценции на двух оптических каналах амплификатора.

ПЦР в «реальном времени» позволяет не только обнаружить нуклеотидную последовательность в пробе, но и измерить количество ее копий, следовательно, рассчитать количество исходной матрицы. Это возможно благодаря зонду с флуорофором.

Олигонуклеотидный зонд является небольшим олигонуклеотидом, комплементарным амплифицируемой последовательности кДНК. Зонд в формате TaqMan состоит из флуорофора, ковалентно присоединенного к 5’-концу олигонуклеотидного зонда, и гасителя на 3’-конце. При целой структуре зонда гаситель поглощает сигнал от красителя благодаря безызлучательному переносу энергии от молекулы флуорофора и ее рассеиванию. Во время амплификации движущаяся по ДНК полимераза разрушает зонд, и флуоресценция красителя становится заметной из-за ослабевания влияния гасителя вследствие отдаления молекул друг от друга.

Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого зонда для идентификации кДНК флавивирусов генотипа методом ОТ-ПЦР и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

На основе множественного выравнивания in silico полногеномных нуклеотидных последовательностей различных флавивирусов (длина - около 11000 нуклеотидов), депонированных в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) для конструирования флуоресцентно-меченого зонда FLAV-1, предназначенного для идентификации флавивирусов, была выбрана консервативная последовательность гена, кодирующего NS5-белок известных флавивирусов (семейство Flaviviridae). Размеры специфичных праймеров MAMD и cFD2 (Scaramozzino et al., 2001) составили 23 и 26 нуклеотидов, соответственно. Для флуоресцентной детекции продуктов ОТ-ПЦР в режиме реального времени сконструирован родоспецифичный флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд (для рода Flavivirus), обозначенный FLAV-1, размером 27 нуклеотидов, который гибридизуется на участке ампликона между прямым MAMD и обратным cFD2 праймерами. В качестве метки использовали флуорофор FAM на 5'-конце зонда и гаситель флуоресценции BHQ1 - на 3'-конце.

Поскольку праймеры специфичны для всего семейства Flaviviridae, а зонд - родоспецифичен (род Flavivirus), то вместо известных нуклеотидных последовательностей были использованы последовательности генов, полученных путем множественного выравнивания с использованием различных алгоритмов, что требует квалифицированных научных исследований, что подтверждает новизну и изобретательский уровень предлагаемого технического решения.

Пример 2. Амплификация и детекция специфичных фрагментов кДНК флавивирусов с помощью праймеров MAMD / cFD2 и разработанного флуоресцентно-меченого зонда FLAV-1 для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Работу с образцами биологического материала проводили согласно требованиям СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (раздел IX Санитарно - эпидемиологические требования к обеспечению безопасности при работе с ПБА) и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение РНК ВКЭ из биологических образцов осуществляли с помощью наборов реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), в соответствии с инструкциями к наборам.

ПЦР в режиме реального времени проводили в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

1. кДНК - 8 мкл;

2. Реакционная смесь 5X qPCRmix-HS (HS Taq ДНК полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Mg2+ и реакционный буфер; Евроген, Россия) - 5 мкл;

3. Прямой праймер MAMD (концентрация 10 мкмол/л) - 1,8 мкл;

4. Обратный праймер cFD2 (концентрация 10 мкмол/л) - 1,8 мкл;

5. Зонд FLAV-1 (концентрация 10 мкмол/л) - 0,9 мкл;

6. Вода для ПЦР - 7,5 мкл.

Общий объем - 25 мкл

В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили равный объем дистиллированной воды. В качестве положительного контроля использовали РНК вируса клещевого энцефалита дальневосточного субтипа.

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации при 95°С - 15 мин; первое циклирование (5 повторений): денатурация при 95°С - 15 с; отжиг праймеров при 62°С - 20 с; элонгация цепи при 72°С - 20 с; второе циклирование (40 повторений): денатурация при 95°С - 15 с; отжиг праймеров при 54°С - 20 с; элонгация цепи при 72°С - 20 с. Детекцию накопления продуктов реакции осуществляли по каналу Green на этапе второго циклирования при температуре 54°С.

Анализ продуктов ОТ-ПЦР осуществляли в режиме реального времени на амплификаторе «StepOne Plus» («Applied Biosystems», США). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью программного обеспечения к прибору. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой накопления флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct - cycle threshold) в соответствующей графе в таблице результатов. Положительными считали образцы, для которых значение порогового цикла не превышало 35 на этапе второго циклирования.

Пример 3. Определение специфичности реакции амплификации с помощью разработанного флуоресцентно-меченого зонда FLAV-1 и набора олигонуклеотидных праймеров MAMD / cFD2 для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Специфичность ОТ-ПЦР с разработанными праймерами и зондом оценивали при исследовании образцов РНК, выделенных из проб биологического материала, содержащего генетический материал флавивирусов. В качестве биологического материала использовали положительные образцы, содержащие генетический материал вируса клещевого энцефалита (2 пробы) и генетический материал вируса японского энцефалита (3 пробы). Образцами биологического материала, которые содержали генетический материал боррелий, являлись: 2 пробы суспензий клещей Ixodes persulcatus. В качестве образцов биологического материала, которые содержали генетический материал вируса гепатита C использовали 2 пробы клинического материала (сыворотки крови пациентов). Наличие флавивирусов в положительных образцах было подтверждено методом секвенирования.

Пробоподготовку и постановку реакции ОТ-ПЦР осуществляли, как описано в примере 2. При тестировании исследуемых образцов с использованием разработанного зонда FLAV-1 и набора олигонуклеотидных праймеров MAMD / cFD2 положительный результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени был получен для всех проб, содержащих РНК флавивирусов (вирус клещевого энцефалита и вирус японского энцефалита, как представители рода Flavivirus). С образцами биологического материала, содержащего генетический материал боррелий и вируса гепатита C, в реакции ОТ-ПЦР с разработанным зондом FLAV-1 и набором праймеров MAMD / cFD2 получен отрицательный результат в 100% случаев (фиг. 1).

На фиг. 1 представлены результаты определения специфичности реакции амплификации с помощью разработанного флуоресцентно-меченого зонда FLAV-1 и набора олигонуклеотидных праймеров MAMD / cFD2 для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Примечание: кДНК, полученная из образцов биологического материала, содержащего генетический материал вируса клещевого энцефалита (TBEV_01 - шт. Софьин, TBEV_02 - линия Заусаев, полевой материал), вируса японского энцефалита (JEV_01 , JEV_02 - полевой материал, JEV_03 - шт. Пекин-1), образцы биологического материала, содержащего генетический материал Borrelia burgdorferi s.l. (Borrelia_01, Borrelia_02 - полевой материал), вируса гепатита C (HCV_01, HCV_02 - клинический материал).

Таким образом, разработанный флуоресцентно-меченый зонд FLAV-1 и набор олигонуклеотидных праймеров MAMD / cFD2 позволяет в короткий срок с высокой специфичностью выявлять вирусы рода Flavivirus в биологическом материале и может быть использован при проведении эпидемиологического надзора за природно-очаговыми вирусными инфекциями.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N, Cropp CB. Phylogeny of the genus Flavivirus. J Virol. 1998;72(1):73-83.

2. Kuno G. Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses. J Virol Methods. 1998;72(1):27-41.

3. Scaramozzino N, Crance JM, Jouan A, DeBriel DA, Stoll F, Garin D. Com- parison of flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. J Clin Microbiol. 2001; 39(5):1922-7.

4. Патент Китая CN110846441, МПК C12Q1/6851, опубл. 28.02.2020 г.

5. Межд. заявка WO2014067390, МПК C12Q1/68, опубл. 08.05.2014 г.

6. Патент RU2715617, МПК C12Q1/68, опубл. 02.03.2020 г.

7. Патент RU2744187, МПК C12Q1/68, опубл. 03.03.2021 г.

8. Патент RU2629604, МПК C12Q1/68, опубл. 30.08.2017 г.

9. Патент Южной Кореи KR102181996, МПК C12Q1/70, опубл. 23.11.2020 г. (прототип).

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный

научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120> Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченого

зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом

ПЦР в режиме реального времени

<160> SEQ ID NO:3

<210> SEQ ID NO:1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность олигонуклеотидов

видоспецифическая к гену NS5-белка флавивирусов семейства

Flaviviridae (прямой праймер MAMD:).

<400> 1

AACATGATGGGRAARAGRGATAA

<210> SEQ ID NO:2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность олигонуклеотидов

видоспецифическая к гену NS5-белка флавивирусов семейства

Flaviviridae (обратный праймер cFD2).

<400> 2

GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC

<210> SEQ ID NO:3

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность олигонуклеотидов видоспецифическая к гену

NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae (Зонд FLAV-1).

<400> 3

FAM-GGAAGCCGAGCCATTTGGTACATGTGG-BHQ1

2

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом ПЦР в режиме реального времени. Набор включает панспецифичные праймеры для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и флуоресцентно-меченый зонд, специфичный для представителей вирусов рода Flavivirus. Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора праймеров и оригинального флуоресцентно-меченого зонда, который обеспечивает выявление генетического материала широкого спектра рода флавивирусов, полученного из различных источников. 1 ил., 3 пр.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда в формате TaqMan для выявления вирусов рода Flavivirus методом ПЦР в режиме реального времени, включающий панспецифичные праймеры для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и флуоресцентно-меченый зонд, специфичный для представителей вирусов рода Flavivirus, имеющие следующие последовательности:

праймеры, прямой и обратный:

MAMD: 5'- AACATGATGGGRAARAGRGATAA-3' 23;

cFD2: 5'-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3' 26;

зонд:

FLAV-1: FAM-GGAAGCCGAGCCATTTGGTACATGTGG-BHQ1 27,

где: FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм;

BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.