Способ идентификации генетического материала флавивирусов, передаваемых клещами и комарами, методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно-меченых зондов Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии. Предложен способ идентификации генетического материала флавивирусов, передаваемых комарами и клещами, методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно-меченого зондов.

Уровень техники

В настоящее время на территории России отмечена циркуляция следующих вирусов, входящих в род Flavivirus: вирус Повассан, вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), вирус шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), вирус Западного Нила, вирус японского энцефалита, вирус Ламми, вирус клещевого энцефалита (ВКЭ).

Эволюционные изменения арбовирусов вероятнее всего происходят на границах ареала и в зонах совместного обитания клещей и комаров разных родов и видов, что приводит к возникновению новых вариантов вируса и связано со сменой видов-хозяев и основных прокормителей. В связи с глобальными климатическими изменениями смещается ареал переносчиков, что позволяет вирусам распространяться на новые биотопы, где их никогда не детектировали и не регистрировали вызываемую ими заболеваемость.

В связи с этим возникает вопрос о возможной роли новых вирусных агентов в развитии трансмиссивных инфекций на территории России, что требует дальнейшего изучения, в том числе с использованием методов молекулярной биологии.

Известны методы обнаружения генетического материала флавивирусов, предложенные в работах Kuno G. et al., 1998, Kuno G., 1998, Scaramozzino N. et al., 2001.

В статье Daidoji T. et al. была разработана система универсальных праймеров для обнаружения фрагментов последовательности гена NS5-белка флавивирусов в широком диапазоне для рода Flavivirus. Несмотря на интересный дизайн и универсальность панфлавивирусных праймеров в этой работе, в качестве положительных образцов использовались синтетические аналоги последовательностей генома природных изолятов флавивирусов, что не позволяет в полной мере экстраполировать результаты работы для проб из природных популяций. Кроме этого, указанные праймеры фланкируют достаточно большой регион – около 1000 п.н., что может привести к ложноотрицательным результатам для проб с низкой концентрацией вируса.

В перечисленных работах методы диагностики флавивирусов подразумевают применение гель-электрофоретической детекции продуктов амплификации, что делает метод более трудоемким и повышает риск контаминации продуктами амплификации ДНК. В открытых источниках отсутствует информация об использовании универсальных зондов для рода флавивирусов на ген NS5.

Результаты патентного поиска по выявлению генетического материала флавивирусов позволили определить несколько аналогов, которые все же значительно отличаются от предлагаемого изобретения.

Патент Китая CN110846441A касается способа для определения крайне специфического флавивируса, который поражает пресноводных креветок Macrobrachium rosenbergii. Хотя в патенте и используется метод ПЦР в «реальном времени» с применением специфических праймеров и зондов, специфических для гена полимеразы флавивируса, но данные праймеры и зонды не являются специфичными для вирусов рода Flavivirus.

Изобретение по патенту Южной Кореи KR102181996B1 касается выявления флавивирусов, передаваемых комарами, методом ПЦР в «реальном времени» с применением специфических праймеров и зондов, но не позволяет проводить выявление флавивирусов, передаваемых клещами. Похожие результаты получены по патенту Южной Кореи WO2020153673A1, в котором были подобраны панфлавивирусные праймеры для флавивирусов, передаваемых комарами (различные типы вирусов Денге, Зика, Западного Нила, японского энцефалита, желтой лихорадки) и специфический зонд, что позволило проводить индикацию генетического материала «комариных» флавивирусов с помощью ПЦР в «реальном времени». Однако, приведенные в патенте специфичные праймеры и зонд не подходят для выявления в биоматериале флавивирусов, передаваемых клещами.

Известен патент Китая WO2014067390A1, который касается использования мультиплексных биочипов для экспресс-диагностики вирусов, переносимых комарами. Данный комплекс предусматривает использование дорогостоящего оборудования и не может быть доступен при выполнении простых диагностических задач. Кроме того, способ не подходит для диагностики флавивирусов, переносимых клещами.

Существует набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации вируса клещевого энцефалита, вируса лихорадки Западного Нила, боррелий и риккетсий методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (патент RU2629604C1). Изобретение обеспечивает набор праймеров и зондов для мультиплексной идентификации генетического материала четырех инфекционных патогенов, передающихся клещами. Также известен набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса Западного Нила 2 генотипа (патент RU2715617C1) и способ выявления вируса клещевого энцефалита методом ОТ-ПЦР в реальном времени (патент RU2744187C1). Однако предложенные в данных патентах олигонуклеотиды не позволяют определять большинство вирусов рода Flavivirus. Необходимо также отметить, что целевые праймеры и зонды в указанных патентах специфичны к различным участкам генома, что не позволяет проводить диагностику всех возможных комариных и клещевых флавивирусов.

Раскрытие сущности изобретения

Задача изобретения – создание способа, позволяющего идентифицировать флавивирусы, изолированные из различных источников и переносчиков, путем амплификации и последующего секвенирования фрагмента генома вируса.

Технический результат – разработка праймеров и зондов для идентификации генетического материала флавивирусов, ассоциированных с клещами и комарами, методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Указанный технический результат достигается тем, что создан способ для идентификации флавивирусов с помощью ПЦР в «реальном времени» с использованием вновь сконструированных панспецифичных праймеров (модификация на основе праймеров – Scaramozzino et al., 2001) для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и оригинальных флуоресцентно-меченых зондов, специфичных для представителей рода Flavivirus и флавивирусов, переносимых клещами и комарами, соответственно:

Праймеры:

Primer F-FVFL: 5´- ACAACATGATGGGRAARAGRGARAA-3´

Primer R1-FV: 5´- CCARTGGTCYTCATTYAGGAATCC-3´

Зонд, специфичный для классических флавивирусов:

PROBE_gen-FV: FAM- GCCATCTGGTWCATGTGGCTKGG-BHQ1;

Зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых клещами:

PROBE_tick-FV: HEX-TGGGGAGCCGSTTYCTGGAGTTTGA-BHQ1;

Зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых комарами:

PROBE_mosq-FV: FAM-AGTTTGGAAARGCGAARGGAAGCAGWGCC-BHQ1,

где FAM – карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции – 520 нм;

где HEX – гексахлорфлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 533 нм, а длина волны флуоресценции – 549 нм;

BHQ1 – гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480–580 нм.

Разработанные флуоресцентно-меченые зонды направлены на родоспецифичное выявление фрагмента гена NS5, а также специфических фрагментов гена NS5-белка флавивирусов, переносимых комарами и клещами, фланкируемых вышеприведенным набором прямого и обратного праймеров, и обеспечивают гибридизационно-флуоресцентную детекцию в режиме реального времени.

Изобретение поясняется иллюстрациями Фиг. 1–4, представляющими собой кривые флуоресценции на двух оптических каналах амплификатора.

На Фиг.1 представлены результаты определения оптимального температурного режима для разработанных праймеров F-FVFL / R1-FV и флуоресцентно-меченых зондов PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (детекция генетического материала вируса клещевого энцефалита):

красные линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для I ПЦР-смеси, зонд PROBE_gen-FV, канал FAM), синие линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_tick-FV, канал HEX), зеленые линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_mosq-FV, канал FAM); кДНК, получена из образцов биологического материала, содержащего генетический материал вируса клещевого энцефалита (шт. Софьин), цифры на графиках – различные температуры отжига праймеров и зондов.

На Фиг. 2 представлены результаты определения оптимального температурного режима для разработанных праймеров F-FVFL / R1-FV и флуоресцентно-меченых зондов PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (детекция генетического материала вируса японского энцефалита):

красные линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для I ПЦР-смеси, зонд PROBE_gen-FV, канал FAM), синие линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_tick-FV, канал HEX), зеленые линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_mosq-FV, канал FAM); кДНК, получена из образцов биологического материала, содержащего генетический материал вируса японского энцефалита (шт. Пекин-1), цифры на графиках – различные температуры отжига праймеров и зондов.

На Фиг. 3 – Результаты определения специфичности реакции амплификации с помощью разработанного флуоресцентно-меченого зонда PROBE_gen-FV и набора олигонуклеотидных праймеров F-FVFL / R1-FV для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени:

кДНК, полученная из образцов биологического материала, содержащего генетический материал вируса клещевого энцефалита (TBEV_01 – шт. Софьин; TBEV_02, TBEV_03 – линия Заусаев, полевой материал: Свердловская обл., 2023 г; TBEV_04, TBEV_05, TBEV_06 – линия Заусаев, полевой материал: Тюменская обл., 2024 г.), вируса японского энцефалита (JEV_01 – шт. Пекин-1, JEV_02 – полевой материал), образцы биологического материала, содержащего генетический материал Borrelia burgdorferi s.l. (Borrelia_01, Borrelia_02 – клиническаий материал), вируса гепатита C (HCV_01, HCV_02, HCV_03, HCV_04 – клинический материал).

На Фиг.4 представлены результаты определения специфичности реакции амплификации с помощью разработанных флуоресцентно-меченых зондов PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV и набора олигонуклеотидных праймеров F-FVFL / R1-FV для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени:

кДНК, полученная из образцов биологического материала, содержащего генетический материал вируса клещевого энцефалита (TBEV_01 – шт. Софьин; TBEV_02, TBEV_03 – линия Заусаев, полевой материал: Свердловская обл., 2023 г; TBEV_04, TBEV_05, TBEV_06 – линия Заусаев, полевой материал: Тюменская обл., 2024 г.), вируса японского энцефалита (JEV_01 – шт. Пекин-1, JEV_02 – полевой материал), образцы биологического материала, содержащего генетический материал Borrelia burgdorferi s.l. (Borrelia_01, Borrelia_02 – клиническаий материал), вируса гепатита C (HCV_01, HCV_02, HCV_03, HCV_04 – клинический материал); фиолетовые линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_tick-FV, канал HEX), зеленые линии – кривые накопления флуоресцентного сигнала (для II ПЦР-смеси, зонд PROBE_mosq-FV, канал FAM).

Осуществление изобретения

ПЦР в «реальном времени» позволяет не только обнаружить нуклеотидную последовательность в пробе, но и измерить количество ее копий, следовательно, рассчитать количество исходной матрицы. Это возможно благодаря зонду с флуорофором.

Олигонуклеотидный зонд является небольшим олигонуклеотидом, комплементарным амплифицируемой последовательности кДНК. Зонд в формате TaqMan состоит из флуорофора, ковалентно присоединенного к 5’-концу олигонуклеотидного зонда, и гасителя на 3’-конце. При целой структуре зонда гаситель поглощает сигнал от красителя благодаря безызлучательному переносу энергии от молекулы флуорофора и ее рассеиванию. Во время амплификации движущаяся по ДНК полимераза разрушает зонд, и флуоресценция красителя становится заметной из-за ослабевания влияния гасителя вследствие отдаления молекул друг от друга.

Пример 1. Методика конструирования праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации кДНК флавивирусов методом ОТ-ПЦР и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

На основе множественного выравнивания in silico полногеномных нуклеотидных последовательностей различных флавивирусов (длина – около 11000 нуклеотидов), депонированных в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) для конструирования:

– флуоресцентно-меченого зонда PROBE_gen-FV, предназначенного для идентификации флавивирусов;

– флуоресцентно-меченого зонда PROBE_tick-FV, предназначенного для идентификации флавивирусов, переносимых клещами;

– флуоресцентно-меченого зонда PROBE_mosq-FV, предназначенного для идентификации флавивирусов, переносимых комарами;

была выбрана консервативная последовательность гена, кодирующего NS5-белок известных флавивирусов (семейство Flaviviridae). Размеры специфичных праймеров F-FVFL и R1-FV (модификация на основе праймеров – Scaramozzino et al., 2001) составили 25 и 24 нуклеотидов, соответственно. Для флуоресцентной детекции продуктов ОТ-ПЦР в режиме реального времени сконструированы: родоспецифичный флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд (для рода Flavivirus), обозначенный PROBE_gen-FV, размером 23 нуклеотида; флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых клещами, обозначенный PROBE_tick-FV, размером 25 нуклеотидов; флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых комарами, обозначенный PROBE_mosq-FV, размером 29 нуклеотидов, которые гибридизуются на участке ампликона (длина – 137 п.н.) между прямым F-FVFL и обратным R1-FV праймерами. В качестве метки использовали флуорофоры FAM (для зондов PROBE_gen-FV и PROBE_mosq-FV) и HEX (для зонда PROBE_tick-FV) на 5'-конце зонда и гаситель флуоресценции BHQ1 – на 3'-конце.

Поскольку праймеры специфичны для всего семейства Flaviviridae, первый зонд – родоспецифичен (род Flavivirus), а два других – специфичны для флавивирусов, переносимых клещами и комарами, то вместо известных нуклеотидных последовательностей были использованы последовательности генов, полученных путем множественного выравнивания с использованием различных алгоритмов, что требует квалифицированных научных исследований, что подтверждает новизну и изобретательский уровень предлагаемого технического решения.

Пример 2. Выбор оптимального температурного режима (температура отжига) для разработанных праймеров F-FVFL / R1-FV и флуоресцентно-меченых зондов PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV.

Работу с образцами биологического материала проводили согласно требованиям СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (раздел IX Санитарно-эпидемиологические требования к обеспечению безопасности при работе с ПБА) и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». Выделение РНК ВКЭ из биологических образцов осуществляли с помощью наборов реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), в соответствии с инструкциями к наборам.

Полученная ДНК/кДНК каждой пробы исследуется в двух пробирках c реакционными смесями следующего состава (на 1 исследование):

I ПЦР-смесь с зондом PROBE_gen-FV, специфичным для рода Flavivirus:

1. кДНК – 8 мкл;

2. Реакционная смесь БиоМастер HS-qPCR (2×) (высокопроцессивная рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Mg2+ и реакционный буфер; «Биолабмикс», Россия) – 12,5 мкл;

3. Прямой праймер F-FVFL (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

4. Обратный праймер R1-FV (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

5. Зонд PROBE_gen-FV (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

6. Вода для ПЦР – 1,5 мкл.

II ПЦР-смесь с зондами PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV, специфичными для флавивирусов, переносимых клещами и комарами, соответственно:

1. кДНК – 8 мкл;

2. Реакционная смесь БиоМастер HS-qPCR (2×) (высокопроцессивная рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, Mg2+ и реакционный буфер; «Биолабмикс», Россия) – 12,5 мкл;

3. Прямой праймер F-FVFL (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

4. Обратный праймер R1-FV (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

5. Зонд PROBE_tick-FV (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

6. Зонд PROBE_mosq-FV (концентрация 10 мкмоль/л) – 1 мкл;

7. Вода для ПЦР – 0,5 мкл.

____________________________________________

Общий объем для каждой смеси – 25 мкл

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации при 95°С – 5 мин; циклирование (45 повторений): денатурация при 95°С – 15 с; отжиг праймеров с градиентом температур от 54 до 64°С (с шагом в 2°С) – 20 с; элонгация цепи при 72°С – 30 с; режим хранения при 10°С. Детекцию накопления продуктов реакции осуществляли по каналу FAM (PROBE_gen-FV) для I ПЦР-смеси и по каналам FAM (PROBE_mosq-FV) и HEX (PROBE_tick-FV) – для II ПЦР-смеси при указанном выше градиенте температур.

Анализ продуктов ОТ-ПЦР осуществляли в режиме реального времени на амплификаторе «CFX96 Touch» («Bio-Rad», США). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью программного обеспечения к прибору. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой накопления флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла (Ct – cycle threshold) в соответствующей графе в таблице результатов. Положительными считали образцы, для которых значение порогового цикла не превышало 35.

Оптимальный температурный режим для разработанных праймеров и зондов в ОТ-ПЦР определяли при исследовании образцов РНК, выделенных из проб биологического материала, содержащего генетический материал флавивирусов. В качестве биологического материала использовали положительные образцы, содержащие генетический материал вируса клещевого энцефалита (2 пробы) и генетический материал вируса японского энцефалита (2 пробы).

На фиг. 1 и 2 показаны кривые флуоресценции на двух оптических каналах амплификатора (FAM и HEX). Исходя из графиков флуоресценции, показано, что максимально эффективное протекание ОТ-ПЦР было достигнуто при 54°С, как для зонда, специфичного для рода Flavivirus, так и для зондов специфичных для флавивирусов, переносимых клещами и комарами.

Пример 3. Амплификация и детекция специфичных фрагментов кДНК флавивирусов с помощью разработанных праймеров F-FVFL / R1-FV и флуоресцентно-меченых зондов PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Пробоподготовку и постановку реакции ОТ-ПЦР осуществляли, как описано в примере 2. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили равный объем дистиллированной воды. В качестве положительного контроля использовали РНК вируса клещевого энцефалита дальневосточного субтипа.

Условия проведения реакции: этап предварительной денатурации при 95°С – 5 мин; первое циклирование (5 повторений): денатурация при 95°С – 15 с; отжиг праймеров при 56°С – 20 с; элонгация цепи при 72°С – 30 с; второе циклирование (40 повторений): денатурация при 95°С – 15 с; отжиг праймеров при 54°С – 20 с; элонгация цепи при 72°С – 20 с. Детекцию накопления продуктов реакции осуществляли по каналу FAM для I ПЦР-смеси и по каналам FAM (PROBE_mosq-FV) и HEX (PROBE_tick-FV) – для II ПЦР-смеси на этапе второго циклирования при температуре 54°С.

Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой накопления флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct – cycle threshold) в соответствующей графе в таблице результатов. Положительными считали образцы, для которых значение порогового цикла не превышало 35 на этапе второго циклирования.

Пример 4. Определение специфичности реакции амплификации с помощью разработанных праймеров F-FVFL / R1-FV и флуоресцентно-меченых зондов PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV для детекции вирусов рода Flavivirus методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Специфичность ОТ-ПЦР с разработанными праймерами и зондами оценивали при исследовании образцов РНК, выделенных из проб биологического материала, содержащего генетический материал флавивирусов. В качестве биологического материала использовали положительные образцы, содержащие генетический материал вируса клещевого энцефалита (6 проб) и генетический материал вируса японского энцефалита (2 пробы). Образцами биологического материала, которые содержали генетический материал боррелий, являлись: 2 пробы лейкоцитарной фракции крови пациентов. В качестве образцов биологического материала, которые содержали генетический материал вируса гепатита C использовали 4 пробы клинического материала (плазма крови пациентов). Наличие флавивирусов в положительных образцах было подтверждено методом секвенирования.

Пробоподготовку и постановку реакции ОТ-ПЦР осуществляли, как описано в примере 2. При тестировании исследуемых образцов с использованием разработанного специфичного зонда PROBE_gen-FV для рода Flavivirus и набора олигонуклеотидных праймеров F-FVFL / R1-FV положительный результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени был получен для всех проб, содержащих РНК флавивирусов (вирус клещевого энцефалита и вирус японского энцефалита, как представители рода Flavivirus, см. фиг. 3).

При тестировании исследуемых образцов с использованием разработанных зондов PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV, специфичных для флавивирусов, переносимых клещами и комарами и набора олигонуклеотидных праймеров F-FVFL / R1-FV положительный результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени был получен для всех проб, содержащих РНК флавивирусов: вирус клещевого энцефалита детектировался только по каналу HEX (зонд специфичный только для «клещевых» флавивирусов), а вирус японского энцефалита – только по каналу FAM (зонд специфичный только для «комариных» флавивирусов) (см. фиг. 4).

С образцами биологического материала, содержащего генетический материал боррелий и вируса гепатита C, в реакции ОТ-ПЦР с разработанными зондами PROBE_gen-FV, PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV и набором праймеров F-FVFL / R1-FV получен отрицательный результат в 100% случаев (фиг. 3, 4).

Таким образом, разработанные флуоресцентно меченые зонды, направленные на родоспецифичное выявление фрагмента гена NS5-белка (PROBE_gen-FV), а также специфических фрагментов гена NS5-белка флавивирусов, переносимых комарами и клещами (PROBE_tick-FV и PROBE_mosq-FV) и набор олигонуклеотидных праймеров F-FVFL / R1-FV позволяют в короткий срок с высокой специфичностью выявлять вирусы рода Flavivirus в биологическом материале, дифференцировать флавивирусы переносимые комарами и клещами, и могут быть использован при проведении эпидемиологического надзора за природно-очаговыми вирусными инфекциями.

Литература:

1. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N, Cropp CB. Phylogeny of the genus Flavivirus. J Virol. 1998;72(1):73–83.

2. Kuno G. Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses. J Virol Methods. 1998;72(1):27–41.

3. Scaramozzino N, Crance JM, Jouan A, DeBriel DA, Stoll F, Garin D. Com- parison of flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. J Clin Microbiol. 2001; 39(5):1922–7.

4. Daidoji T, Morales Vargas RE, Hagiwara K et al. Development of genus-specific universal primers for the detection of flaviviruses. Virol J 18, 187 (2021). https://doi.org/10.1186/s12985-021-01646-5

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ идентификации

генетического материала флавивирусов, передаваемых клещами и

комарами, методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием

флуоресцентно-меченых зондов.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-03-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024132880 </ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-11-01</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>W24072811</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024132880</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-11-01</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение

науки Федеральный научно-исследовательский институт вирусных инфекций

«Виром» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека (ФБУН ФНИИВИ «Виром»

Роспотребнадзора)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBIS FSRIVI VIROME

ROSPOTREBNADZOR</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Мищенко Владимир

Алексеевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Mishchenko Vladimir

Alekseevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ идентификации генетического

материала флавивирусов, передаваемых клещами и комарами, методом

ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно-меченых

зондов</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaacatgatgggraaragrgaraa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccartggtcytcattyaggaatcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccatctggtwcatgtggctkgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggggagccgsttyctggagtttga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>29</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..29</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtttggaaargcgaarggaagcagwgcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии. Предложен способ идентификации генетического материала флавивирусов, передаваемых комарами и клещами, методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентно-меченого зонда. Используют сконструированные панспецифичные праймеры для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и флуоресцентно-меченые зонды, специфичные для представителей рода Flavivirus и флавивирусов, переносимых клещами и комарами соответственно: праймеры: primer F-FVFL: 5´- ACAACATGATGGGRAARAGRGARAA-3´; primer R1-FV: 5´- CCARTGGTCYTCATTYAGGAATCC-3´; зонд, специфичный для классических флавивирусов: PROBE_gen-FV: FAM- GCCATCTGGTWCATGTGGCTKGG-BHQ1; зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых клещами: PROBE_tick-FV: HEX-TGGGGAGCCGSTTYCTGGAGTTTGA-BHQ1; зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых комарами: PROBE_mosq-FV: FAM-AGTTTGGAAARGCGAARGGAAGCAGWGCC-BHQ1, где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм; где HEX - гексахлорфлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 533 нм, а длина волны флуоресценции - 549 нм; BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм. Технический результат заключается в разработке праймеров и зондов для идентификации генетического материала флавивирусов, ассоциированных с клещами и комарами, методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». 4 ил., 4 пр.

Способ идентификации генетического материала флавивирусов, передаваемых клещами и комарами, методом обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, характеризующийся тем, что используют сконструированные панспецифичные праймеры для гена NS5-белка флавивирусов семейства Flaviviridae и флуоресцентно-меченые зонды, специфичные для представителей рода Flavivirus и флавивирусов, переносимых клещами и комарами соответственно:

праймеры:

primer F-FVFL: 5´- ACAACATGATGGGRAARAGRGARAA-3´;

primer R1-FV: 5´- CCARTGGTCYTCATTYAGGAATCC-3´;

зонд, специфичный для классических флавивирусов:

PROBE_gen-FV: FAM- GCCATCTGGTWCATGTGGCTKGG-BHQ1;

зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых клещами:

PROBE_tick-FV: HEX-TGGGGAGCCGSTTYCTGGAGTTTGA-BHQ1;

зонд, специфичный для флавивирусов, переносимых комарами:

PROBE_mosq-FV: FAM-AGTTTGGAAARGCGAARGGAAGCAGWGCC-BHQ1,

где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 492 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм;

где HEX - гексахлорфлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 533 нм, а длина волны флуоресценции - 549 нм;

BHQ1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 480-580 нм.