Способ формирования модели врожденной диафрагмальной грыжи у плодов крыс с применением нитрофена «ЭКУМ» Российский патент 2023 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 A01N33/18 A61B8/08 

Настоящее изобретение относится к медицине, к области акушерства и гинекологии. Предназначено для изучения патогенеза врожденной диафрагмальной грыжи, формирования изменения легочной ткани, исследования препаратов по коррекции гипоплазии легких.

Врожденная диафрагмальная грыжа (ВДГ) - это порок, который возникает в результате замедления процесса закрытия плевроперитонеального канала или несостоятельности диафрагмы. Последнее приводит к нарушению разделения грудной и брюшной полостей, а также к смещению желудка, селезенки, кишечника и печени в грудную клетку [1- Некрасова Е.С. Пренатальная ультразвуковая диагностика и тактика ведения беременности при диафрагмальной грыже плода // Ультразвуковая и функциональная диагностика. 2011. №2. С. 47-56; 2 - Юдина Е.В. Легкие // Пренатальная эхография / Под ред. Медведева М.В. М.: Реальное Время, 2005, С. 341-371.1, 2]. Частота встречаемости этой патологии 0,28-0,8 случаев на 1000 новорожденных [2]. Около 30% случаев ВДГ сочетаются с хромосомными аномалиями. В группе плодов с изолированной ВДГ выживаемость новорожденных составляет около 60%. Основной причиной смерти в неонатальном периоде является гипоплазия легких или легочная гипертензия [3 - Jani J., Keller R.L., Benachi A. et al. Prenatal prediction of survival in isolated leftsided diaphragmatic hernia // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2006. V.27. №1. P.18-22.].

Животные модели, доступные для изучения ВДГ, включают хирургическую модель на кролике и овце, фармакологическую (нитрофеновую) модель на крысах и мышах, а также генетические (нокаутные) мышиные модели. Хирургические модели ВДГ использовались в основном для тестирования перспективных методов дородовой терапии, но не использовались для изучения раннего происхождения ВДГ и гипоплазии легких, поскольку диафрагмальный дефект возникает на поздних сроках беременности [4 - Van Loenhout R.B. et al. Congenital diaphragmatic hernia: comparison of animal models and relevance to the human situation // Neonatology. - 2009. - Т. 96. - № 3. - С. 137-149.]. Генетические модели невозможно использовать для изучения этиологии и патофизиологии ВДГ, поскольку они являются многофакторными и не связаны с мутацией одного гена [5 - Clugston R. D. et al. Teratogen-induced, dietary and genetic models of congenital diaphragmatic hernia share a common mechanism of pathogenesis // The American journal of pathology. - 2006. - Т. 169. - № 5. - С. 1541-1549.]. Нитрофен-индуцированная животная модель была изучена, модифицирована и используется в изучении фармакологических препаратов из-за раннего развития ВДГ и сходства с состоянием человека. Для ее создания применяли очищенный нитрофен, который в России не производится и запрещен к использованию во многих странах.[6 - Migliazza L. et al. Heart hypoplasia in experimental congenital diaphragmatic hernia // Journal of pediatric surgery. - 1999. - Т. 34. - №.5. - С. 706-711.].

Животная модель ВДГ основана на введении очищенного нитрофена до начала формирования легких и диафрагмы. Эта модель представляется наилучшей из имеющихся, поскольку время наступления «удара» в развитии сходно с таковым у человека, большим недостатком является то, что значимость потенциальных тератогенных эффектов нитрофена у грызунов никогда не была продемонстрирована на людях. Хотя все больше доказательств этиологии ВДГ указывают на нарушение в ретиноидных сигнальных путях. Поэтому модель нитрофена, учитывая очевидные недостатки токсикологической (животной) модели, может служить хорошим инструментом для изучения патогенеза и терапевтических возможностей при ВДГ.

Задачей изобретения является создание схемы введения промышленного нитрофена «ЭКУМ» и возможность формирования модели диафрагмальной грыжи у плодов крыс с применением данного препарата для изучения патогенеза врожденной диафрагмальной грыжи, формирования изменений легочной ткани препарата для создания модели ВДГ.

Технический результат: формирование диафрагмальной грыжи и морфологических изменений легочной ткани уменьшение сосудов микроциркуляторного русла в 1,4 раза, уменьшение количества альвеол в 1,5 раза, уменьшение объема легких в 1,3 раза.

Самки из экспериментальной группы получали промышленный нитрофена «ЭКУМ», на самок контрольной группы воздействие нитрофена было исключено.

Заявляется способ формирования модели вроденной диафрагмальной грыжи у плодов крыс с применением нитрофена «ЭКУМ», заключающийся в том, что введение крысам нитрофена проводилось еженедельно после совмещения самок и самцов крыс до момента подтверждения у них 9-тидневой беременности.

На 9-ый день предполагаемой беременности крысам проводилось ультразвуковое исследование для оценки размера плодов (таблица 1) [Ypsilantis P. et al. Ultrasonographic diagnosis of pregnancy in rats //Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. - 2009. - Т. 48. - №.6. - С. 734-739.]. Исследование проводилось линейным датчиком (частота 3-15 МГц, ультразвуковой аппарат Mindray DC-40). В случае неподтвержденной беременности УЗИ проводилось до того момента, пока размеры плодов не будут соответствовать 9-му дню беременности. После этого срока беременности еженедельное пероральное введение нитрофена самкам крыс основной группе прекращалось.

Таблица 1. Размеры плодов крыс в зависимости от срока беременности (среднее значение ± σ). День беременности Диаметр эмбриона (см) продольный поперечный средний 9 0,37±0,07 0,52±0,08 0,45±0,05 10 0,44±0,07 0,56±0,09 0,51±0,06 11 0,51±0,10 0,71±0,06 0,61±0,06 12 0,55±0,05 0,79±0,04 0,67±0,02 13 0,58±0,08 0,83±0,12 0,71±0,06 14 0,69±0,08 0,95±0,08 0,82±0,06 15 0,78±0,14 1,24±0,12 0,98±0,14 16 0,87±0,06 1,55±0,15 1,21±0,08

На 21-ый день беременности плоды крыс обеих групп были извлечены из матки оперативным путем. Плодам проведена стернотомия и лапаротомия для осмотра целостности диафрагмы и получения аутопсийного материала легких для морфологического исследования.

Изобретение поясняется иллюстрациями.

На Фиг.1 - легкое плода крысы, окраска гематоксилин и эозин, увеличение х400.

На Фиг.2 - легкое плода крысы с диафрагмальной грыжей, окраска гематоксилин и эозин, увеличение ×400. Сосуды микроциркуляторного русла были исследованы методом компьютерной морфометрии, при помощи свободно распространяемого программного пакета «ImageJ».

На Фиг.3 - легкое плода из контрольной группы слева.

На Фиг.4 - легкое у плода с диафрагмальной грыжей с разметками для расчета площади сосудов микроциркуляторного русла.

Эксперимент

Незадолго до начала эксперимента крысы были приручены. Предварительно все животные были промаркированы нанесением ушной метки. Крыс размещали в группах по две-три самки в клетке с самцом, корм и вода были в свободном доступе. Самки содержались в стандартных лабораторных условиях при постоянной температуре 21°C и 12-часовом цикле дня и ночи. Через 8 дней после спаривания самки получили эфирный наркоз в инсикаторе, их шерсть на передней брюшной стенки участка 3×3 см была продепилирована восковыми полосками («Просто шугаринг», пр-во Россия). На 9-ый день крысы снова подвергались седации диэтиловым спиртом, после чего на продепилированную часть брюха наносился гель и проводилось ультразвуковое исследование (ультразвуковой аппарат Mindray DC-40) линейным датчиком (частота 3-15МГц) для определения наличия беременности и его срока.

Крыс помещали в положение лежа на спине, а на датчик наносили гель для ультразвукового сканирования. Во время исследования контролировалось дыхание и ЧСС самок. Сканирование выполнялось справа налево, при этом датчик был ориентирован перпендикулярно брюшной стенке в сагиттальной плоскости, начиная с правой паховой области и при необходимости поворачивался в аксиальной плоскости на уровне каудальной части живота. При обнаружении признаков беременности осмотр продолжали краниально по ходу рога матки. Эмбрионы были дифференцированы от фекального стула, обнаруженного в латеральной области живота. Каловые массы представляли собой округлые или овальные образования, форма которых не менялась при надавливании сканирующим датчиком на брюшную стенку. Напротив, давление датчиков изменило форму эмбрионов. Эхогенность фекального стула варьировала от средней до высокой в отличие от более низкой эхогенности заполненных жидкостью эмбриональных пузырьков. На 9-й день плацента видна в виде гиперэхогенной структуры, прикрепленной к внутренней поверхности плодного яйца. Продольный диаметр эмбриона 0,37±0,07 см, поперечный - 0,52±0,08 см, средний - 0,45±0,05 см. В случае неподтвержденной беременности УЗИ проводилось до того момента, пока размеры плодов не будут соответствовать 9-му дню беременности.

В эксперименте использовался нитрофен (2,4-дихлорфенил-4-нитрофениловый эфир, изготовитель ЭКУМ, концентрация которого равна 41±3% (100 мг нитрофена = 0,25 мл раствора). 0,25 мл раствора вводили экспериментальной группе перорально инсулиновым шприцом без иглы еженедельно после ссаживания самок крыс с самцами. После этой процедуры не было никаких признаков рефлюкса или регургитации, и все животные перенесли ее без осложнений. Контрольная группа не получила нитрофен. Вся работа с химикатами проводилась с соблюдением соответствующих мер предосторожности.

Плоды были извлечены оперативным путем на 21-ый день беременности. После стернотомии и лапаротомии проводили осмотр целостности диафрагмы. Для оценки морфологических изменений ткани легкого можно провести гистологическое исследование.

Для апробации данного способа 10 самок крыс линии Wistar (возраст 4-6 мес., масса 150-200 г) со сроком беременности 9 дней были рандомизированы в одну из двух следующих групп:

1. Контрольная группа, не получавшая нитрофен;

2. Экспериментальная группа, получившая нитрофен еженедельно после ссаживания самок и самцов крыс до 9-го дня беременности.

В результате получили 35 плодов в экспериментальной группе и 40 плодов в контрольной группе. Врожденная диафрагмальная грыжа зарегистрирована у 7 (20 %) плодов, матери которых получили нитрофен. По сравнению с контрольными плодами в морфологических изменениях легочной ткани наблюдали уменьшение количества сосудов микроциркуляторного русла в 1,4 раза, уменьшение количества альвеол в 1,5 раза и уменьшение объема легких в 1,3 раза. Различия обнаружены на высоком уровне статистической значимости (Фиг. 1-4, таблица 2).

Таблица 2. Количество альвеол в одном поле зрения при увеличении х400 в легких плодов крыс Плоды из контрольной группы Плоды с ВДГ Р-критерий Среднее 19,4 12,9 0.000012 Медиана 20 13

Данную схему введения нитрофена и способ формирования модели ВДГ с использованием промышленного нитрофена «ЭКУМ» можно использовать для исследования терапевтических возможностей лечения данного порока развития.

Список литературы

1. Некрасова Е.С. Пренатальная ультразвуковая диагностика и тактика ведения беременности при диафрагмальной грыже плода // Ультразвуковая и функциональная диагностика. 2011. №2. С. 47-56.

2. Юдина Е.В. Легкие // Пренатальная эхография / Под ред. Медведева М.В. М.: Реальное Время, 2005, С.341-371.

3. Jani J., Keller R.L., Benachi A. et al. Prenatal prediction of survival in isolated leftsided diaphragmatic hernia // Ultrasound Obstet. Gynecol. 2006. V. 27. №1. P. 18-22.

4. Van Loenhout R.B. et al. Congenital diaphragmatic hernia: comparison of animal models and relevance to the human situation // Neonatology. - 2009. - Т. 96. - №. 3. - С. 137-149.

5. Clugston R.D. et al. Teratogen-induced, dietary and genetic models of congenital diaphragmatic hernia share a common mechanism of pathogenesis // The American journal of pathology. - 2006. - Т. 169. - №. 5. - С. 1541-1549.

6. Migliazza L. et al. Heart hypoplasia in experimental congenital diaphragmatic hernia // Journal of pediatric surgery. - 1999. - Т. 34. - №. 5. - С. 706-711.

7. Ypsilantis P. et al. Ultrasonographic diagnosis of pregnancy in rats //Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. - 2009. - Т. 48. - №. 6. - С. 734-739.

8. https://www.medstatistic.ru/calculators/averagestudent.html

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальному акушерству и гинекологии. Еженедельно вводят крысам нитрофен после совмещения самок и самцов крыс. На 9-й день после спаривания крысам проводят ультразвуковое исследование (УЗИ), подтверждая беременность и оценивая размер плодов. После подтверждения 9-дневной беременности еженедельное пероральное введение нитрофена прекращают. На 21-й день беременности плоды крыс извлекают из матки оперативным путем. Способ позволяет получить модель для изучения патогенеза врожденной диафрагмальной грыжи, формирования изменений легочной ткани, исследования препаратов по коррекции гипоплазии легких. 2 табл., 4 ил., 1 пр.

Способ формирования модели врожденной диафрагмальной грыжи у плодов крыс с применением нитрофена «ЭКУМ», включающий введение крысам нитрофена еженедельно после совмещения самок и самцов крыс, на 9-й день после спаривания крысам проводят ультразвуковое исследование (УЗИ), подтверждая беременность и оценивая размер плодов, после подтверждения 9-дневной беременности еженедельное пероральное введение нитрофена прекращают, на 21-й день беременности плоды крыс извлекают из матки оперативным путем.