СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ИЗ РАПАНЫ RAPANA VENOSA VAL. Российский патент 2023 года по МПК A23L17/50 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для прижизненного получения из брюхоногого моллюска рапаны натуральных лечебно-профилактических продуктов, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК).

Черноморская рапана - съедобный хищный брюхоногий моллюск, питающийся преимущественно мидиями [1]. Размножение рапаны хорошо изучено как в природных, так и лабораторных условиях [2, 3]. Во время нереста в июле самки откладывают оплодотворенные яйца в овотеки, имеющие снаружи липидную оболочку, а внутри заполнены белком, которым питаются развивающиеся личинки [4-6]. За сезон одна самка может отложить кладки 3-4 раза с интервалом 1-3 дня без промежуточного спаривания [1]. В каждой кладке около 100 овотек, а в каждой овотеке - от 984 до 1221 яйца, индивидуальная плодовитость самок рапаны может составлять от 320 тыс. до 450 тыс. яиц [1, 7]. При этом суммарная масса овотек может быть больше массы мягких тканей самки. Овотеки рапаны служат источником незаменимых ПНЖК [12] и других не менее ценных биологически активных веществ (БАВ).

Известен Способ получения биологически активной добавки (Пат. 2183414 C1, RU, МПК A23L 1/30 (2000.01), 2000). Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству биологически активной добавки к пище из мяса рапаны, содержащей омега-3 и омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в количествах не менее 45% от суммы жирных кислот; липидов не менее 0,8%. Способ осуществляют посредством кислотного гидролиза мяса рапаны. Недостатком данного способа, во-первых, является использование кислотного гидролиза. Для выделения жирных кислот из мяса рапаны существуют более простые методы, например, экстракция. Во-вторых, применение в качестве исходного сырья исключительно мяса рапаны. К источникам ПНЖК следует отнести не только мясо, но и овотеки, которые рапана способна прижизненно откладывать в количествах, достаточных для выделения ПНЖК.

Известен Способ получения лечебно-профилактической композиции (Пат. 2541463 C1 RU, МПК A61K 35/56, 2014), предусматривающий получение из морских моллюсков композиции лечебно-профилактического действия «Церебромид», которая может быть использована в геронтологической практике в качестве профилактики начальных форм атеросклероза у пациентов пожилого возраста. Способ получения композиции заключается в получении смеси кислотного гидролизата мяса рапаны и щелочного - мяса мидий. В составе композиции «Церебромид» идентифицировано 38 жирных кислот, из них 21 насыщенные и 17 ненасыщенные, в том числе входящие в состав групп омега-3 и омега-6 жирных кислот. Соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот составляет 1,1:1. Соотношение омега-6 к омега-3 составляет 1:1,6. В состав композиции входит более 30 микро- и макроэлементов (Са, K, Fe, Cu, Zn, Mn, Mg, Со, J, Ni и др.), что также способствует нормализации обмена и восстановлению нарушенных функций организма. Недостатками способа, во-первых, является неоправданное измельчение в электромясорубке замороженного мяса рапаны. В данном способе указано, что измельченный фарш переносят в реактор, добавляют 15 л 6%-го раствора соляной кислоты и нагревают до 80°С. При этой температуре и постоянном перемешивании проводят гидролиз в течение 20 ч. Следует отметить, указанные в прототипе жесткие условия гидролиза не требуют тщательного измельчения сырья. Во-вторых, в отделении полученного на первой стадии гидролизата от густого негидролизованного остатка, который затем повторно подвергают гидролизу в 8%-ной соляной кислоте при температуре кипения смеси в течение 24 ч. Удобнее проводить гидролиз в одну стадию при постоянной температуре 8%-ной соляной кислотой течение 48 часов, а затем отделять гидролизат. В-третьих, не рационально смешивать щелочной гидролизат из мидий и кислотный гидролизат из мяса рапаны, а затем объединять их в соотношении 10:1.

Известна Диетическая биодобавка «Раполан-С» (Пат. 151963 U1 RU, МПК A33L1/333, 2015), представляющая собой гидролизат, получаемый из мяса рапаны путем ферментативного гидролиза. Биодобавка дополнительно включает морской коллаген, витамин «С» и пищевую соль. Технологический процесс производства диетической добавки «Раполан-С» состоит из получения и смешивания гидролизата рапаны и коллагена натурального с дальнейшим добавлением витамина «С» и пищевой соли, гомогенизации ингредиентов с дальнейшей пастеризацией в течение 30 минут в двухтельном котле при постоянном перемешивании и температуре до 60-70°С. После этого готовый продукт расфасовывают в чистую, просушенную тару при температуре 50-55°С, герметизируют, маркируют и направляют на хранение. Среди недостатков данного способа можно обозначить отсутствие описания способа получения гидролизата рапаны (в патенте приведена ссылка на ТУ Украины (ТУ У 10.8-25133498-029-2013) и способа получения коллагена натурального из кожи бычка черноморского.

Задачей Способа получения биопрепаратов из рапаны Rapana venosa Val. является разработка технологии прижизненного получения из овотеков рапаны биологически активных ПНЖК в органической форме.

Технический результат от решения поставленной задачи заключается в получении продуктов, содержащих высокую концентрацию важнейших для жизнедеятельности человеческого организма ПНЖК, которые могут использоваться самостоятельно, а также стать основой для производства косметических, фармацевтических и пищевых препаратов.

Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что в Способе получения биопрепаратов из рапаны Rapana venosa Val., характеризующемся прижизненным получением овотеков рапаны, из которых ведут экстракцию ПНЖК спирто-хлороформенной смесью в соотношении 1:3 (овотеки: спирто-хлороформенная смесь) в темноте при температуре 20±5°С в течение 72 часов. Затем путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1:1,5 (спиро-хлороформенный экстракт: дистиллированная вода) отделяют не смешивающийся с водой хлороформенный слой, содержащий ПНЖК, который отфильтровывают и отгоняют с помощью роторного испарителя. Полученный остаток соединяют с 10%-ным масляным раствором витамина Е в соотношении 1: 10. Прижизненное получение овотеков рапаны включает сбор моллюсков рапаны из естественной среды обитания в сезон размножения, пересадку в аэрируемые пластмассовые садки, заполненные морской водой с температурой 20±5°С, в которых один раз в 24 часа меняют воду, а со стенок садков собирают овотеки рапаны. При этом, для экстракции ПНЖК используют спирто-хлороформенную смесь в соотношении 1:1 (96%-ный этанол: хлороформ). Кроме того, сбору подлежат моллюски рапаны с высотой раковины до 115 мм, возрастом от 2+ лет, которых кормят живыми мидиями с размером створок от 40 мм.

Отличительные признаки заявляемого способа от известных заключаются:

- в прижизненном получении овотеков рапан и использовании их в качестве источника ПНЖК. Получаемые овотеки легче перерабатывать, чем мясо рапаны, при этом сырая масса овотеков, которые способен отложить один моллюск, превышает сырую массу его мягких тканей. В овотеках содержание биологически активных веществ максимально в сравнении с мягкими тканями моллюска;

- в извлечении биологически активных ПНЖК экстракцией, а не путем гидролиза. Предложенные режимы экстракции подобраны экспериментальным путем и способствуют высокому выходу ПНЖК из овотеков рапаны. Выделение жирных кислот при помощи экстракции имеет ряд преимуществ перед гидролизом: технология более простая, низкая себестоимость процесса, при экстракции в раствор вместе с ПНЖК переходят другие биологически активные вещества, например, каротиноиды.

Заявляемый способ соответствует критериям новизна и изобретательский уровень, т.к. впервые предложены условия для прижизненного выделения ПНЖК из овотеков рапаны. Способ не требует сложного и дорогостоящего оборудования или привлечения дорогостоящих химических реактивов. Проведенные патентные исследования, а также изучение доступных научных публикаций, относящихся к теме изобретения, не обнаружили решений, имеющих признаки, сходные с заявляемым техническим решением, что подтверждает выводы о соответствии критериям патентоспособности.

Как показано в таблице 1, в овотеках низкое соотношение омега-6 / омега-3 ПНЖК (соб/соЗ<2), поэтому функциональные продукты из овотеков могут использоваться в качестве профилактики сердечно-сосудистых заболеваний [8].

У человека ЖК семейства омега-6 и омега-3 выполняют важную физиологическую роль при биосинтезе простагландинов [9]. Арахидоновая (С20:4ω6) и докозагексаеновая (С22:6ω3) кислоты являются предшественниками простагландинов - соединений, купирующих воспалительные реакции и играющих основную роль для нормальной работы иммунной системы [10, 11]. Докозагексаеновая (С22:6ω3) кислота необходима для адаптации клеток организма к изменениям условий окружающей среды [12]. Эйкозапентаеновая (С20:5ω3) кислота - одна из нескольких омега-3 ПНЖК, которая защищает структуру клеток от злокачественного перерождения [9].

Пример реализации способа

Рапаны собирали в период размножения - в августе 2022 г. в Севастопольской бухте в количестве 50 экз. на глубине от 9 до 15 м под мидийной фермой (внешний рейд Севастопольской бухты) при температуре воды 19°С. Размеры раковин моллюсков составляли от 30 до 115 мм, а возраст - от 2+ лет. В течение трех дней в лабораторных условиях получали овотеки. Для этого свежевыловленных моллюсков пересаживали в аэрируремые пластмассовые садки (сверху обшитыми делью для предотвращения выползания моллюсков), заполненные морской водой с температурой 20±2°С. Один раз сутки воду в садках меняли, а со стенок контейнера собирали овотеки, являющиеся источником ценных ПНЖК. Во время эксперимента моллюсков кормили живыми мидиями с размером створок от 40 мм, выращенными на мидийной ферме.

Экстракцию общих липидов проводили спирто-хлороформенной смесью (1:1 - 96%-ный этанол: хлороформ). Для этого к 100 г свежесобранных овотеков добавляли 300 г спирто-хлороформенной смеси. Все тщательно перемешивали и оставляли экстрагироваться в темном месте. Через 72 часа переносили смесь в делительную воронку, добавляли 150 мл дистиллированной воды и отделяли не смешивающийся со спиртом и водой хлороформенный слой, объем которого составил 150 мл. Хророформенный слой отфильтровывали через складчатый фильтр. Хлороформ упаривали на роторном испарителе. Содержание общих липидов определяли гравиметрически. В 100 г свежесобранных овотеков содержалось 1±0,02 г (р<0,05) общих липидов. Полученный продукт обладал характерным запахом и маслянистой консистенцией. Срок хранения полученного продукта при 5-7°С - 12 месяцев.

Полученный биопродукт массой 1 г растворяли в 10 мл 10%-ного масляного раствора витамина Е. Смесь отстаивали 72 часа в темноте при температуре 5-7°С. В результате получали 10 мл насыщенного жирными кислотами масляного раствора витамина Е лимонного цвета. Масляный раствор витамина Е использовали в качестве консерванта с целью предотвратить быстрое разложение ПНЖК. Хранение полученного экстракта - 24 месяца.

Таким образом, содержащие ценные ПНЖК липидные экстракты из овотеков рапаны перспективны для использования в пищевой и косметической промышленности. Объединение ПНЖК с масляными растворами, например, с 10%-ным масляным раствором витамина Е, способствует получению продукта с антиоксидантными свойствами. Окислительные процессы в такой композиции сведены к минимуму, что увеличивает срок ее хранения.

Источники литературы, принятые во внимание

1. Чухчин В.Д. Экология брюхоногих моллюсков Черного моря. Киев: Наукова думка, 1984. 176 с.

2. Pirkova A.V., Ladygina L.V. Embryonic and Larval Intracapsular Development of the Rapa Whelk Rapana venosa (Valenciennes, 1846) (Gastropoda, Muricidae) // Russian Journal of Biological Invasions. 2019. Vol. 10, No. 1. P. 39-47.

3. Saglam H, Duzgunes E. Deposition of egg capsule and larval development of Rapana venosa (Gastropoda: Muricidae) from the south-eastern Black Sea Mar // Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 2007. Vol. 87. P. 953-957. https://doi.org/10.1017/S0025315407056330

4. Чухчин В.Д. Размножение рапаны {Rapana bezoar L.) в Черном море // В сб.: Труды Севастопольской биологической станции / Отв. ред. В.А. Водяницкий. Севастополь. 1961а. Т. 14. С. 163-168.

5. Cesari P., Mizzan L. Osservazioni su Rapana venosa (Valenciennes, 1846) in cattivita (Gastropoda: Muricidae, Thaidinae // Bollettino del Museo Civico di Storia Naturalea di Venezia. 1993. No. 42. P. 9-21.

6. Harding J.M., Mann R., Kilduff C.W. Influence of environmental factors and female size on reproductive output in an invasive temperate marine gastropod Rapana venosa (Muricidae) // Marine Biology. 2008. Vol. 155. No. 6. P. 571-581.

7. Chung E.Y., Kim S.Y., Kim Y.G. Korean J. Reproductive ecology of the purple shell Rapana venosa (Gastropoda: Muricidae), with special reference to the reproductive cycle, depositions of egg capsules and hatchings of larvae // Malacology. 1993. No. 9. P. 1-15.

8. Махутова O.H., Гладышев М.И. Незаменимые полиненасыщенные жирные кислоты в физиологии и метаболизме рыб и человека: значение, потребности, источники // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2020. Т. 105, №5. С. 601-621. https://doi.org/l 0.31857/S0869813920050040

9. Левачев М.М. Жиры рыб в диетологии гиперлипопротеидемии и гипертонии / М.М. Левачев. Москва: Медицина, 1988. 150 с.

10. Гаврисюк В.К. Применение Омега-3 полиненасыщенных жирных кислот в медицине / В.К. Гаврисюк // Украинский пульмонологический журнал. 2001. №3. С. 5-10.

11. Подзолков В.И. Роль омега-3 полиненасыщенных жирных кислот в управлении сердечно-сосудистым риском / В.И. Подзолков, М.В. Писарев // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2020. Т. 19, №.3:2589. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2020-2589

12. Dernekbaşl S., Öksüz A., Dernekbasi S., Oksuz A., Celik M.Y., Karayiicel L, Karayucel S. The fatty acid composition of cultured mussels (M galloprovincialis Lamarck 1819) in offshore longline system in the Black Sea // Journal of Aquaculture & Marine Biology. 2015. Vol. 2, iss. 6. Art. no. 00049 (5 p.). https://doi.org/10.15406/jamb.2015.02.00049.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения натуральных лечебно-профилактических продуктов. Прижизненно полученные овотеки рапаны подвергают экстракции спирто-хлороформенной смесью в соотношении 1:3 (овотеки : спирто-хлороформенная смесь) в темноте при температуре 20±5°С в течение 72 часов. Затем путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1:1,5 (спиро-хлороформенный экстракт : дистиллированная вода) отделяют не смешивающийся с водой хлороформенный слой, содержащий ПНЖК, который отфильтровывают и отгоняют с помощью роторного испарителя. Полученный остаток соединяют с 10%-ным масляным раствором витамина Е в соотношении 1:10. Изобретение позволяет получать из овотеков рапаны функциональные продукты с повышенным содержанием ПНЖК. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ получения биопрепаратов из рапаны Rapana venosa Val., характеризующийся прижизненным получением овотеков рапаны, экстракцию ПНЖК из которых ведут спирто-хлороформенной смесью в соотношении 1:3 (овотеки: спирто-хлороформенная смесь) в темноте при температуре 20±5°С в течение 72 часов, затем путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1:1,5 (спиро-хлороформенный экстракт : дистиллированная вода) отделяют не смешивающийся с водой хлороформенный слой, содержащий ПНЖК, который отфильтровывают и отгоняют с помощью роторного испарителя, а остаток соединяют с 10%-ным масляным раствором витамина Е в соотношении 1:10, причем прижизненное получение овотеков рапаны включает сбор моллюсков рапаны из естественной среды обитания в сезон размножения, пересадку в аэрируемые пластмассовые садки, заполненные морской водой с температурой 20±5°С, в которых один раз в 24 часа меняют воду, а со стенок садков собирают овотеки рапаны.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для экстракции ПНЖК используют спирто-хлороформенную смесь в соотношении 1:1 (96%-ный этанол : хлороформ).

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что сбору подлежат моллюски рапаны с высотой раковины до 115 мм, возрастом от 2+ лет.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что собранных моллюсков кормят живыми мидиями с размером створок от 40 мм.