Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях в ультранизких концентрациях Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 G01N33/50 C12Q1/68 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) после проведения специфической амплификации фрагментов генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.

Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.

Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.

В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одно цепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-9, doi: 10.1126/science.aar6245].

He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, J.W. Lee et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science 356(6336) (2017) 438-42, doi: 10.1126/science.aam9321].

SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках [J.S. Gootenberg, О.О. Abudayyeh, M.J. Kellner et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Casl3, Casl2a, and Csm6, Science 360(6387) (2018) 439-44, doi: 10.1126/science.aaq0179].

На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ [С. Myhrvold, С.А. Freije, J.S. Gootenberg et al., Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3, Science 360(6387) (2018) 444-8, doi: 10.1126/science.aas8836].

В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.

Из уровня техники известны научные статьи, описывающие обнаружение 11 копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в составе модельной матрицы и 500 копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), выделенной из клинических образцов, с применением предварительной амплификации и детекции при помощи CRISPR-Cas 12а [Ding, X., Yin, К., Li, Z., & Liu, С.(2020). All-in-One Dual CRISPR-Cas 12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus S ARS-CoV-2 and HIV virus. bioRxiv: the preprint server for biology, 2020.03.19.998724. https://doi.org/10.1101/2020.03.19.998724].

Также известен способ обнаружения ВИЧ или ВГС с помощью CRISPR-Cas13a [WO2020051452, дата публикации 12.03.2020], где показано выявление 3,01×10³ копий/мл РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с применением CRISPR-Cas 13а и предварительной амплификации.

Кроме того, известны научные статьи, в которых описана разработка и получение направляющих РНК CRISPR-Cas12a для терапии инфекций, вызванных иммунодефицита человека (ВИЧ-1) [Fan, М., Berkhout, В., & Herrera-Carrillo, Е. (2022). A combinatorial CRISPR-Cas 12а attack on HIV DNA. Molecular therapy. Methods & clinical development, 25, 43-51. https://doi.Org/10.1016/j.omtm.2022.02.010].

Ближайшими аналогами заявляемого решения являются изобретения по патентам RU 2764023 «Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях» (дата приоритета 30.09.2021), RU 2720768 «Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека, интегрированной в геном человека, в ультранизких концентрациях» (дата приоритета 13.12.2019), RU 2747820 «Система CRISPR-Cas для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях» (дата приоритета 30.11.2020), RU 2782700 «Система CRISPR-Cas12 для выявления ДНК вируса гепатита В в ультранизких концентрациях» (дата приоритета 27.12.2021), направленные на получение направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления РНК SARS-CoV-2, ДНК ВИЧ-1, интегрированной в геном человека, ДНК вируса Джона Каннингема, ДНК вируса гепатита В на основе CRISPR технологий. Однако, для расширения спектра подобных диагностических систем и совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний и эпидемиологического надзора необходимо разрабатывать новые методы для выявления нуклеиновых кислот вирусов, вызывающих инфекционные заболевания человека.

Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий РНК на реакцию) РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) in vitro с помощью Cas12.

Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR-Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.

Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:

• высокая чувствительность;

• возможность проведения диагностики у постели больного;

• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;

• скорость и простота анализа;

• сниженная стоимость анализа;

• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;

• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.

Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в биологических образцах.

Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) до единичных (2,78) копий РНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) до 3,5 раз.

Технический результат достигается за счет:

• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQIDNO:l-5, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент РФ №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультра низких концентрациях (единичные копии).

• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-7, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

• определения условий проведения ультрачувствительной детекции РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и установления последовательности стадий метода.

Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR-Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Нуклеотидная последовательность, раскрытой в настоящей заявке, направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-5.

Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae.

Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQIDNO: 1;

• SEQIDNO: 2;

• SEQ ID NO: 3;

• SEQ ID NO: 4;

• SEQIDNO: 5;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления РНК вируса вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях (единичные копии).

Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК.

Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas пригоден для выявления единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.

Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), с инструкцией по применению.

Набор для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению.

При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.

Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-7.

Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:

• SEQ ID NO: 6;

• SEQ ID NO: 7;

• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,

• или комплементарной любой из них,

или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.

Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента pNL4-3 генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) (размером 228 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов 333 For 8 и 333 Rev 8 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:

1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,78×10⁶ копий модельной матрицы pNL4-3;

2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,78×10⁵ копий модельной матрицы pNL4-3;

3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,78×10⁴ копий модельной матрицы pNL4-3;

4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2780 копий модельной матрицы pNL4-3;

5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 278 копий модельной матрицы pNL4-3;

6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 27,8 копии модельной матрицы pNL4-3;

7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2,78 копии модельной матрицы pNL4-3;

8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pNL4-3;

М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).

Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента pNL4-3, обработанного рибонуклео порте иновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HIV №48 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pNL4-3 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HIV №48, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 9-16 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

9 - 2780000 копий/реакция;

10 - 278000 копий/реакция;

11 - 27800 копий/реакция;

12 - 2780 копий/реакция;

13 - 278 копий/реакция;

14 - 27,8 копий/реакция;

15 2,78 копий/реакция;

16 - mQ (отрицательный контроль).

Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента pNL4-3, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HIV №49 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pNL4-3 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HIV №49, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 17-24 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

17 - 2780000 копий/реакция;

18 - 278000 копий/реакция;

19 - 27800 копий/реакция;

20 - 2780 копий/реакция;

21 - 278 копий/реакция;

22 - 27,8 копий/реакция;

23 - 2,78 копий/реакция;

24 - mQ (отрицательный контроль).

Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента pNL4-3, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HIV №119 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pNL4-3 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HIV №119, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 25-32 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

25 - 2780000 копий/реакция;

26 - 278000 копий/реакция;

27 - 27800 копий/реакция;

28 - 2780 копий/реакция;

29 - 278 копий/реакция;

30 - 27,8 копий/реакция;

31 - 2,78 копий/реакция;

32 - mQ (отрицательный контроль).

Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента pNL4-3, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HIV №136 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pNL4-3 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HIV №136, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 33-40 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

33 - 2780000 копий/реакция;

34 - 278000 копий/реакция;

35 -27800 копий/реакция;

36 - 2780 копий/реакция;

37 - 278 копий/реакция;

38 - 27,8 копий/реакция;

39 - 2,78 копий/реакция;

40 - mQ (отрицательный контроль).

Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента pNL4-3, обработанного рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA HIV №137 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы pNL4-3 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA HIV №137, где:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;

- на кривых 41-48 показано количество копий нуклеиновой кислоты на реакцию, а именно:

41 - 2780000 копий/реакция;

42 - 278000 копий/реакция;

43 - 27800 копий/реакция;

44 - 2780 копий/реакция;

45 - 278 копий/реакция;

46 - 27,8 копий/реакция;

47 - 2,78 копий/реакция;

48 - mQ (отрицательный контроль).

Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента мишени pNL4-3, обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137, где посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указано количество копий модельной матрицы в реакции;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с использованием crRNA HIV №48;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с использованием crRNA HIV №49;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с использованием crRNA HIV №119;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с использованием crRNA HIV №136;

- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий модельной матрицы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с использованием crRNA HIV №137.

Фиг. 8. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного с клинических образцов фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137, где посредством графика визуализировано выявление РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:

- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;

- по горизонтали указаны идентификаторы образца;

- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HIV №48;

- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HIV №49;

- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HIV №119;

- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HIV №136;

- столбцом показана эффективность выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA HIV №137.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1) ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК

Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https: //www.benchling.com/molecular-biology/) и HIV databases (https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html). Был составлен перечень участков генома ВИЧ-1 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках генома (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативные участки генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.

ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1) МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ

Подготовку материала для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы, содержащей фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), использовали плазмидную ДНК инфекционного молекулярного клона ВИЧ-1 pNL4-3. Физическая карта pNL4-3 доступна по адресу https: //aidsreagent.org/reagentdetail.cfm?t=molecular_clones&id=633.

Предварительную амплификацию участка, соответствующего фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.

Продукт, кодирующий фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), получали в реакции изотермической амплификации с использованием специфических олигонуклеотидов 333 For 8 и 333 Rev 8 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента составлял 228 пар нуклеотидов. Амплификация для получения фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проводилась при температуре 37°С в течение 60 минут.

В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) методом предварительной амплификации проводили титрование модельной матрицы pNL4-3 путем приготовления серийных разведений (Таблица 2).

Для оценки эффективности предварительной амплификации полученный фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг. 1).

Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137, без предварительной очистки.

ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1)

Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) был разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 3. Получение направляющих РНК проводили в несколько этапов:

1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (табл.3), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;

2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1);

3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1);

4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HIV №48, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HIV 48 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HIV №48, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HIV №49, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HIV 49 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HIV №49, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HIV №119, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HIV 119 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HIV №119, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HIV №136, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HIV 136 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HIV №136, составлял 62 пары нуклеотидов.

ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA HIV №137, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA HIV 137 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA HIV №137, составлял 62 пары нуклеотидов.

Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:

1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;

2. 35 циклов амплификации:

95°С - 15 сек,

55°С - 45 сек,

72°С - 30 сек;

3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.

ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.

Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 тМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.

Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С. Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5].

Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.

Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRTSPR7CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ

Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

• 10× буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);

• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);

• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137);

• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);

• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1));

• вода mQ.

Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:

30-60 циклов:

37°С - 35 сек,

37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.

В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы плазмидной ДНК pNL4-3, содержащую в своем составе фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) размером 228 п.о.

Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированного фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), обработанного рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137 и белок LbCpf1, на Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4, Фиг. 5 и Фиг. 6, соответственно. Отметим, что в среднем уже на 12-ом цикле анализа (12 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (2,78 копий/реакция) РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 14-ому циклу (14 минут анализа) - в 10 и более раз.

В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе модельных матриц, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA HIV №119 > crRNA HIV №136 > crRNA HIV №137 > crRNA HIV №49 > crRNA HIV №48 (Фиг. 7).

ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ РНК ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ-1) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRTSPR7CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) (ранее подтверждено методом ПЦР в реальном времени).

Для обнаружения единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК.

Синтез кДНК фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) проводили методом обратной транскрипции с использованием специфического олигонуклеотида 333 Rev 8 с SEQ ID NO: 7 и обратной транскриптазы Superscript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°С. Продукт, кодирующий фрагмент генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), получали в реакции изотермической амплификации с использованием специфических олигонуклеотидов 333 For 8 и 333 Rev 8 (ГенТерра, Россия) и визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.

Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.

Обнаружение единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.

В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 15 цикле (15 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 18 циклу (18 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 4).

Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированного фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA HIV №48, crRNA HIV №49, crRNA HIV №119, crRNA HIV №136 и crRNA HIV №137 и белок LbCpf1, на Фиг. 8.

Эффективность выявления вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащегося в составе препаратов РНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA HIV №119 > crRNA HIV №136 > crRNA HIV №137 > crRNA HIV №48 > crRNA HIV №49 (Таблица 4).

Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), и способны обнаруживать его препаратах РНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, рибонуклеопротеиновым комплексам системы CRISPR-Cas, содержащим направляющие РНК, и наборам, содержащим рибонуклеопротеиновые комплексы системы CRISPR-Cas и специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации высоко консервативных участков генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Изобретение позволяет эффективно выявлять РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) после проведения специфической амплификации фрагментов генома этого вируса. Изобретение обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). 7 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Молекула направляющей РНК системы CRISPR-Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), где нуклеотидная последовательность направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-5.

2. Молекула направляющей РНК по п. 1, отличающаяся тем, что содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae.

3. Молекула направляющей РНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

4. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae и по меньшей мере одной направляющих РНК из пп. 1-3.

5. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas по п. 4, пригодный для выявления единичных копий РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

6. Набор для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащий:

(i) (a) молекулу направляющей РНК системы CRISPR-Cas по любому из пп. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу LbCpf1 из Lachnospiraceae;

или

(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп. 4, 5;

и

(ii) инструкцию по применению.

7. Набор для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), содержащий:

(i) (a) молекулу направляющей РНК системы CRISPR-Cas по любому из пп. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу LbCpf1 из Lachnospiraceae;

или

(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп. 4, 5;

и

(ii) один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-7,

и

(iii) инструкцию по применению.