СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ТЯЖЁЛОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/686 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к пульмонологии и аллергологии, может быть использовано для прогнозирования риска развития тяжелой бронхиальной астмы (ТБА).

Бронхиальная астма (БА) - это гетерогенное заболевание, характеризующееся хроническим воспалением дыхательных путей.

ТБА является подгруппой трудно поддающейся лечению БА и означает ту БА, которая остается неконтролируемой, несмотря на приверженность, максимально оптимизированную терапию и коррекцию сопутствующих заболеваний.

Пациенты с ТБА составляют всего 5-10% от общей популяции больных БА, но на них приходится значительная доля ресурсов здравоохранения.

Известен способ прогнозирования течения бронхиальной астмы, характеризующийся тем, что у больных берут пробу крови, получают фракцию лейкоцитов и плазму, обогащенную и бедную тромбоцитами, затем в лейкоцитах определяют хемилюминесцентным методом интенсивность генерации активных форм кислорода, индуцируемой двуокисью кремния в системе с люминолом, затем в плазме, бедной тромбоцитами, определяют малоново-диальдегидоподобные продукты и антиперекисную активность плазмы по тушению Н₂О₂- индуцируемой хемилюминесцензии, сравнивают изменения хемилюминесцентным методом интенсивности генерации активных форм кислорода лейкоцитами после добавления плазмы, бедной тромбоцитами, и плазмы, обогащенной тромбоцитами, и рассчитывают прогностический показатель по формуле где K - прогностический показатель; А - интенсивность стимулированной двуокисью кремния хемилюминесценции в расчете на лейкоцит, имп/с.лейкоцит; В - содержание малоново-диальдегидоподобных продуктов в плазме, мкМ/л; С - отношение интенсивности хемилюминесценции плазмы в присутствии перекиси водорода и ее отсутствии; Т - коэффициент ингибирующего влияния тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами крови; 880 - числовой коэффициент, и при значении этого показателя, равном 2885 и более, прогнозируют тяжелое течение, а при значении, равном 2885 и менее, - легкое и среднетяжелое течение болезни [патент RU 2038599, 1995].

Известен способ прогноза тяжести обострения атопической бронхиальной астмы, который заключается в следующем. В начале обострения заболевания в лимфоцитах больного определяют показатели активности ферментов глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и НАД-зависимой малатдегидрогеназы и при показателях ниже 0,297 мкЕ/10000 клеток для ГЗФДГ и 0,638 мкЕ/10000 клеток для НАДМДГ прогнозируют тяжелую степень обострения заболевания [патент RU 2190217, 2002].

Известен способ прогнозирования неконтролируемого течения тяжелой бронхиальной астмы, характеризующийся тем, что определяют параметры функции внешнего дыхания: ПСВ, ФЖЕЛ, МОС25, МОС50, МОС75, ОФВ1 и ОФВ1 после теста с сальбутамолом, рассчитывая ΔОФВ1. Также учитывают значение АСТ-теста и показатели концентрации газов в выдыхаемом воздухе - СО, NO, NO₂. После чего рассчитывают показатели вероятности отнесения индивида к группе с высоким (R1) и низким (R2) риском развития неконтролируемого течения тяжелой БА по определенным математическим формулам. При R1>R2 - прогнозируют высокий риск развития, при R1<R2 - низкий риск развития неконтролируемого течения данного заболевания [патент RU 2470582, 2012].

Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования дыхательной недостаточности у больных бронхиальной астмой, заключающийся в том, что проводят генотипирование полиморфного локуса rs1837253 гена TSLP методом ПЦР. При выявлении генотипа СС прогнозируют риск развития дыхательной недостаточности у больных бронхиальной астмой. Изобретение обеспечивает получение критериев прогноза развития дыхательной недостаточности у больных бронхиальной астмой [патент RU 2639122, 2017]. Данный способ предполагает прогнозирование развития осложнения БА и лишь только косвенно может прогнозировать тяжесть БА.

В основе патогенеза БА лежит воспаление, обуславливающее гиперреактивность дыхательных путей и бронхоспазм, который возникает в том числе и при участии нейропептидов. Нейроиммунные взаимодействия широко изучаются при БА. Было установлено, что под действием цитокинов увеличивается образование рецепторов мембранного катионного канала (TRPA1), что в свою очередь может модулировать степень бронхиальной обструкции.

В геноме человека существует два гена, которые кодируют тахикинины - ТАС1 и ТАС3. Ген ТАС1 кодирует четыре нейротрансмиттера тахикининового семейства - субстанцию Р, нейрокинин А, а также родственные пептиды: нейропептид К и нейропептид гамма. Для гена ТАС1 было обнаружено несколько вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы. Полиморфный локус rs2072100 находится в интроне 1 гена ТАС1, вследствие этого он может влиять на модуляцию экспрессии данного гена.

По литературным данным вазоактивный интестинальный пептид (VIP) обладает мощным вазо- и бронходилатирующим эффектом.

В настоящее время использование VIP в качестве биомаркера в повседневной клинической практике представляется сложным из-за трудоемкости и низкой точности иммуноферментного анализа. В связи с этим были проведены исследования по поиску взаимосвязей между уровнем VIP в сыворотке крови и вариациями в последовательности ДНК гена VIP и как они были связаны с его экспрессией. Рядом авторов (Seoane I.V., С., R. и другие) показано, что пациенты с одним минорным аллелем локуса rs35643203 имели более низкий уровень VIP в сыворотке крови, чем гомозиготные пациенты по основному аллелю. Кроме того, у пациентов с одним минорным аллелем rs3823082 и rs7755568, была выявлена незначительная тенденция к низким показателям уровня VIP, чем у пациентов с двумя копиями основного аллеля. Была установлена связь между генотипом СС локуса rs688136 и более высоким уровнем VIP.

Поскольку VIP влияет на тонус дыхательных путей, можно предположить, что он влияет на течение БА, а изучение молекулярно-генетических аспектов может дать новые диагностические маркеры течения БА.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования раннего развития ТБА.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогноза за счет получения критериев риска развития ТБА на ранних стадиях заболевания.

Предлагаемый способ прогнозирования осуществляется следующим образом:

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; - 1984.- V. 2. - P. 31-34].

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисНСl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин. при 4000 об. /мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисНCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об. /мин. в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательность олигонуклеотидных праймеров для полиморфного локуса rs896 F - 5'-САСТАСССТАТТСТСТСТТТ-3', R - 5'-GGGGAACCACTAAGATAGGT-3' гена рецептора вазоинтестинального пептида; полиморфного локуса rs3823082 F - 5'-TGTGGTAGAACTATTCAGAT-3', R - 5'-GCTATTAGTGTTCTCTGTGA-3' гена вазоинтестинального пептида; полиморфного локуса rs 3771829 F - 5'-GTTTGTGTGGTCTCTTGGCC-3' R - 5'-GCTAACCCCAATCCCTGACT-3' гена рецептора субстанции Р; полиморфного локуса rs2072100 F - 5'-CGGATGAACCAAGATCAAAA-3', R - 5'-CAGGGAGAAGAGGGTTGGAG-3' гена субстанции P.

Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 0.3 мкМ ДНК-зондов, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 5 минуты при 95°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы. Режим амплификации: 40 циклов со следующими параметрами: 94°С - 45 секунд, 55°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд.

Затем определяют вероятность развития ТБА по уравнению логистической регрессии:

у=ехр(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)/[1+ехр(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)]

где:

у - вероятность развития ТБА,

b0- константа, равная -1,763,

x1 - коэффициент полиморфного локуса rs896, равный -0,181 при генотипе СС, или 0,314 при генотипе СТ, или 0 при генотипе СС,

х2 - коэффициент полиморфного локуса rs2072100, равный -1,053 при генотипе АА, или 0,790 при генотипе AG, или 0 при генотипе GG,

х3 - коэффициент полиморфного локуса rs3771829, равный 1,316 при генотипе СС, или 0 при генотипе CG,

х4 - коэффициент полиморфного локуса rs3823082, равный -0,168 при генотипе СС, или 0,413 при генотипе СТ, или 0 при генотипе ТТ.

При значении вероятности 0,57 и больше прогнозируют высокий риск развития тяжелой бронхиальной астмы.

Нами было обследовано 174 пациента, находившихся на стационарном лечении в отделении профессиональной аллергологии и иммунореабилитации клиники ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» с диагнозом БА. Пациентам при поступлении в отделение проводились обязательные общеклинические и дополнительные методы исследования. Выделена основная группа пациентов - больные ТБА - 80 человек и группа сравнения - пациенты со среднетяжелым течением БА - 94 человека.

Для прогнозирования риска развития тяжелой БА на основе генотипирования полиморфных локусов генов, задействованных в патогенезе БА, была построена номинальная регрессионная модель, которая включала 4 полиморфных локуса: rs896, rs2072100, rs3771829, rs3823082. Расчет коэффициентов представлен в таблице.

Для определения риска развития ТБА необходимы результаты генотипирования 4-х полиморфных локусов. В зависимости от генотипа каждого полиморфного локуса ставят коэффициенты согласно таблице в уравнение логистической регрессии:

y=exp(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)/[1+ехр(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)]

где:

у - вероятность развития ТБА,

b0- константа (-1,763),

x1 - коэффициент полиморфного локуса rs896, равный -0,18 при генотипе СС, или 0,314 при генотипе СТ, или 0 при генотипе СС,

х2 - коэффициент полиморфного локуса rs2072100, равный -1,053 при генотипе АА, или 0,790 при генотипе AG, или 0 при генотипе GG,

х3 - коэффициент полиморфного локуса rs3771829, равный 1,316 при генотипе СС, или 0 при генотипе CG,

х4 - коэффициент полиморфного локуса rs3823082, равный -0,168 при генотипе СС, или 0,413 при генотипе СТ, или 0 при генотипе ТТ.

Если вероятность составляет 0,57 и больше, то прогнозируют высокий риск развития ТБА, если ниже 0,57, то прогнозируют низкий риск развития ТБА.

Для анализа прогностической значимости построенной номинальной регрессии был произведен анализ ROC-кривых. В итоговую совокупность вошли 48 пациентов с тяжелой БА и 54 пациентов со среднетяжелой БА. Площадь под ROC-кривой, соответствующей взаимосвязи прогноза тяжести БА и коэффициента риска развития тяжелой БА, составила 0,731±0,051 с 95% ДИ: 0,63-0,83. Модель была статистически значимой р=0,001. Пороговое значение коэффициента риска развития тяжелой БА точке cut-off - 0,57.

При коэффициенте, равном или выше указанного, прогнозировался высокий риск тяжелого течения БА (чувствительность - 70,8%, специфичность - 74,1%).

Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример №1. Больная С., 1959 года рождения, город Нефтекамск, Республика Башкортостан, работает бухгалтером.

Страдает бронхиальной астмой в течение 5 лет. Проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфных участков генов и в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 0.3 мкМ ДНК-зондов, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 mM MgCl2, 16,6mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20.

В результате генотипирования у пациентки С. были выделены следующие генотипы: генотип rs896 определился СС, генотип rs2072100 АА, генотип rs3771829 CG и генотип rs 3823082 - СС.

При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования:

у=ехр(-1,763-0,181-1,053+0-0,168)/(1+ехр(-1,763-0,181-1,053+0-0,168))=0,041.

При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования была получена вероятность, равная 0,041. Пациентке С.был спрогнозирован низкий риск развития ТБА.

В дальнейшем при повторном визите через 6 месяцев пациентке подтверждена бронхиальная астма средней степени тяжести.

Пример №2. Больная К., 1970 года рождения, работает процедурной медсестрой в городской больнице. Диагноз БА установлен в ноябре 2005 года. Проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больная К. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился СС, генотип rs2072100 АА, генотип rs3771829 СС и генотип rs 3823082 - СТ. При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования:

у=ехр(-1,763-0,181-1,053+1,316+0,413)/(1+ехр(-1,763-0,181-1,053+1,316+0,413))=0,220,

была получена вероятность равная 0,220, что соответствует низкому риску развития тяжелой бронхиальной астмы.

В процессе обследования пациентке было рекомендовано модифицировать факторы риска (была переведена медицинской сестрой кабинета статистики, исключив контакт с лекарственными препаратами), вести гипоаллергенный быт. В дальнейшем при наблюдении через 3 месяца при модификации факторов риска пациентке удалось снизить объем базисной терапии в 2 раза, в настоящий момент диагноз: бронхиальная астма средней степени тяжести. В процессе наблюдения за пациенткой через 6 месяцев, ТБА не была подтверждена.

Пример №3. Больной А., 1958 года рождения, работал электрогазосварщиком. Бронхиальной астмой страдает в течение 3-х лет. Проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больной А. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился СТ, генотип rs2072100 AG, генотип rs3771829 CG и генотип rs 3823082 - СТ. При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования:

у=ехр(-1,763+0,314+0,79+0+0,413)/(1+ехр(-1,763+0,314+0,79+0+0,413))=0,439

Прогнозируют низкий риск ТБА. В дальнейшем при динамическом наблюдении через 6 месяцев пациенту был выставлен диагноз бронхиальная астма средней степени тяжести.

Пример №4. Больной Р., 1977 года рождения, работает поваром. Бронхиальной астмой страдает в течение 2-х лет. Проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больной Р. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился ТТ, генотип rs2072100 AG, генотип rs3771829 СС и генотип rs 3823082 - СТ. При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования:

у=ехр(-1,763+0+0,79+1,316+0,413)/(1+ехр(-1,763+0+0,79+1,316+0,413))=0,681

была получена вероятность равная 0,681, что соответствует высокому риску развития тяжелой бронхиальной астмы.

Пациент ежегодно находился в клинике на стационарном лечении по поводу обострения БА. В дальнейшем пациенту через 4 года была диагностирована ТБА.

Пример №5. Больная А., 1980 года рождения, работает продавцом. Бронхиальной астмой страдает в течение 7 лет. Пациентке было проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больная А. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился СТ, генотип rs2072100 AG, генотип rs3771829 СС и генотип rs 3823082 - СТ. При расчете уравнения логистической регрессии для данных результатов генотипирования:

у=ехр(-1,763+0,314+0,79+1,316+0,413)/(1+ехр(-1,763+0,314+0,79+1,316+0,413))=0,755

была получена вероятность равная 0,755, что соответствует высокому риску развития тяжелой бронхиальной астмы. В процессе наблюдения за пациенткой через 1 год констатировано тяжелое течение бронхиальной астмы.

Пример №6. Больной М., 1955 года рождения, не работает, в прошлом водитель. Бронхиальной астмой страдает в течение 12 лет. Пациенту было проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больной М. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился ТТ, генотип rs2072100 AG, генотип rs3771829 СС и генотип rs 3823082 - ТТ.

у=ехр(-1,763+0+0,79+1,316+0)/(1+ехр(-1,763+0+0,79+1,316+0))=0,585

Соответственно у пациентки М. прогнозируется высокий риск развития ТБА. В процессе диагностики, сбора анамнеза и лечения пациенту подтверждено тяжелое течение бронхиальной астмы.

Пример №7. Больной У., 1987 года рождения, работает менеджером. Бронхиальной астмой страдает в течение 5 лет. Пациенту было проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больной У. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился СТ, генотип rs2072100 GG, генотип rs3771829 СС и генотип rs 3823082 - СТ.

у=ехр(-1,763+0,314+0+1,316+0,413)/(1+ехр(-1,763+0,314+0+1,316+0,413))=0,57

Соответственно пациенту У. прогнозируют высокий риск развития ТБА. Через 2 года в процессе динамического наблюдения за пациентом контроль над симптомами БА был достигнут на пятой ступени терапии БА и была выставлена ТБА.

Пример №8. Больная В., 1956 года рождения, не работает. Бронхиальной астмой страдает в течение 4-х лет. Пациентке было проведено исследование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида по предлагаемой методике. В результате выявлено, что больная В. является носителем следующих генотипов: генотип rs896 определился ТТ, генотип rs2072100 АА, генотип rs3771829 CG и генотип rs 3823082 - ТТ.

у=ехр(-1,763+0-1,053+0+0)/(1+ехр 1,763+0-1,053+0+0))=0,056

Соответственно у пациентки В. прогнозируется низкий риск развития ТБА. В процессе диагностики, сбора анамнеза и лечения пациенту подтверждена бронхиальная астма средней степени тяжести.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ прогнозирования риска развития тяжелой бронхиальной астмы (ТБА). Проводят генотипирование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида. Определяют вероятность развития ТБА с учетом коэффициента генотипа каждого полиморфного локуса по уравнению логистической регрессии. При значении вероятности 0,57 и больше прогнозируют высокий риск развития тяжелой бронхиальной астмы. Использование изобретения обеспечивает повышение точности прогноза за счет получения критериев риска развития ТБА на самых ранних стадиях развития заболевания. 1 табл., 8 пр.

Способ прогнозирования риска развития тяжелой бронхиальной астмы (ТБА), включающий генотипирование методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфных локусов rs896 гена рецептора вазоинтестинального пептида, rs2072100 гена субстанции Р, rs3771829 гена рецептора субстанции Р, rs3823082 гена вазоинтестинального пептида, после чего определяют вероятность развития ТБА по уравнению логистической регрессии:

у=ехр(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)/[1+ехр(b₀+x₁+x₂+x₃+x₄)],

где у - вероятность развития ТБА,

b0 - константа, равная -1,763,

x1 - коэффициент полиморфного локуса rs896, равный -0,181 при генотипе СС, или 0,314 при генотипе СТ, или 0 при генотипе СС,

х2 - коэффициент полиморфного локуса rs2072100, равный -1,053 при генотипе АА, или 0,790 при генотипе AG, или 0 при генотипе GG,

х3 - коэффициент полиморфного локуса rs3771829, равный 1,316 при генотипе СС, или 0 при генотипе CG,

х4 - коэффициент полиморфного локуса rs3823082, равный -0,168 при генотипе СС, или 0,413 при генотипе СТ, или 0 при генотипе ТТ,

и при значении вероятности 0,57 и больше прогнозируют высокий риск развития тяжелой бронхиальной астмы.