СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для прогнозирования риска развития бронхиальной астмы.

Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, которое развивается в результате взаимодействия многочисленных факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Хроническое рецидивирующее течение БА, накладывающее значительные ограничения на повседневную жизнь больных, увеличение доли лиц с тяжелой формой заболевания, высокая распространенность и неуклонный рост заболеваемости БА во всем мире свидетельствуют об актуальности изучения сложных механизмов развития этого заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики и профилактики с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. Исследование многофакторной природы заболевания предполагает идентификацию главных генов, которые наиболее важны для формирования наследственной предрасположенности, и генов-модификаторов, ускоряющих и усугубляющих патологический процесс. Составление генной сети для каждого многофакторного заболевания и разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляет основу нового, быстро развивающегося направления - предиктивной медицины. Существует несколько подходов идентификации генов при исследовании многофакторных заболеваний. Наиболее распространенным подходом является анализ ассоциации заболевания с полиморфными вариантами и мутациями генов-кандидатов, выбор которых основывается на тщательном изучении этиопатогенеза заболеваний с учетом функции белковых продуктов отобранных генов (функциональные гены-кандидаты), а также локализации генов в областях сцепления, определенных при позиционном картировании (позиционно-клонированные гены-кандидаты). Основным недостатком этого метода является отсутствие принципиально новой информации о генах, так как метод существенно ограничен уже имеющимися знаниями. Одним из наиболее перспективных современных методов изучения сложных признаков и многофакторных заболеваний является метод полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies - GWAS), в котором проводят генотипирование и тестирование ассоциации с заболеванием сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), распределенных по всему геному человека (Manolio et al., 2010). Проведенные в ряде популяций полногеномные анализы ассоциации- бронхиальной, астмы значительно расширили знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной предрасположенности к данной патологии, выявили множество новых ассоциированных полиморфных локусов и генов, для подтверждения роли которых в развитии этого заболевания проводятся репликативные и функциональные исследования.

Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению бронхиальной астмы, проблема прогнозирования риска развития этого сложного многофакторного заболевания остается практически нерешенной. Опубликованные к настоящему времени результаты исследований свидетельствуют о существовании межпопуляционных различий в подверженности к этой патологии. Вклад полиморфных локусов разных генов в формирование генетической предрасположенности к БА существенно различается в этнических группах, в связи с чем оценка генетического риска для пациента требует наличия информации о маркерах риска, о распределении частот аллелей и генотипов генов-кандидатов развития заболевания именно в той этнической группе, к которой он принадлежит. Кроме того, анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формирования наследственной предрасположенности, поскольку отдельные генетические варианты имеют слабый индивидуальный эффект в отношении фенотипа. В основе возникновения многофакторной патологии лежат сложные межгенные взаимодействия, и эффект того или иного полиморфного варианта может значительно увеличиваться в синергизме с другими вариантами, в связи с чем при прогнозировании риска развития заболевания и разработке профилактических мероприятий необходимо учитывать ген-генные взаимодействия.

Таким образом, актуальными для разработки способа прогнозирования риска развития бронхиальной астмы являются поиск маркеров риска и определение моделей межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию данного заболевания в различных этнических группах. Выявление популяционных и этнических особенностей молекулярно-генетических основ наследственно обусловленного заболевания дает возможность разработать оптимальные для конкретных регионов и этнических групп надежные способы прогнозирования риска его развития, а также разработать наиболее эффективные методы идентификации ассоциированных полиморфных вариантов.

Известен способ прогнозирования риска возникновения БА, заключающийся в том, что пациенту проводят пробы на пыльцевую, пылевую и пищевую аллергии, на непереносимость антибиотиков, анальгетиков, аспирина и при положительных пробах, а также при наличии родственников, страдающих БА, подверженности респираторным инфекциям более двух раз в году, атопического дерматита, экземы, крапивницы и других аллергических синдромов, заболеваний желудочно-кишечного тракта или печени, и профессиональной вредности прогнозируют риск развития заболевания по определенной формуле (патент РФ 2275863, 2006). Несмотря на то, что данный способ основан на расчете риска заболевания по целому ряду различных признаков, в нем не учитываются индивидуальные генетические особенности больного, определяющие генетическую предрасположенность к развитию заболевания.

Известен способ прогнозирования пыльцевой бронхиальной астмы путем иммуногенетического исследования, отличающийся тем, что в венозной крови методом полимеразной цепной реакции определяют гены локусов DRB1 и DQB1 системы HLA и при наличии специфичностей HLA-DRB1*01 и/или DQBP05 прогнозируют высокий риск развития пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом; при наличии специфичности HLA-DQB1*06 прогнозируют резистентность к развитию пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом (патент РФ 2441242, 2010). Данный способ касается прогнозирования только пыльцевой бронхиальной астмы и является неспецифичным в отношении прогнозирования риска развития бронхиальной астмы в целом.

Известен способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, заключающийся в определении в крови человека генотипов и аллельных вариантов однонуклеотидных замен, отличающийся тем, что определяют полиморфные варианты генов SOCS7 (rs3890580), PIASX (rs9304337), дополнительно учитывают факт наличия/отсутствия описторхоза и рассчитывают вероятность отнесения индивида к группе с низким R1 и высоким R2 риском развития бронхиальной астмы (патент РФ 2383019, 2008). Существующий способ имеет ограниченную область применения, поскольку изученные гены малочисленны. Исследование проводилось с помощью "кандидатного" подхода, недостатком которого является невозможность получения принципиально новой информации о генах. К настоящему времени внедрены более эффективные методы идентификации генов-кандидатов, ассоциированных с многофакторными заболеваниями, основным из которых является метод полногеномного анализа ассоциаций (GWAS).

Кроме этого следует отметить, что известные способы прогнозирования риска развития бронхиальной астмы не учитывают межгенных взаимодействий, которые необходимо принимать во внимание при прогнозировании риска развития заболевания и разработки профилактических мероприятий.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития бронхиальной астмы с помощью прогностической модели, основанной на данных генотипирования полиморфных вариантов генов предрасположенности, идентифицированных с привлечением нового мощного подхода - полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) БА с сотнями тысяч полиморфных локусов, и исследования межгенных взаимодействий.

Техническим результатом изобретения является получение критериев оценки риска развития бронхиальной астмы с высокой прогностической значимостью. Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, включающим:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфных вариантов генов гасдермина В (GSDMB), бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1), и белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3);

- прогнозирование риска возникновения бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности с точностью 65,05% в случае идентификации одного из сочетаний генотипов: GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/T.

Из уровня техники неизвестна возможность прогнозирования риска развития бронхиальной астмы по наличию сочетаний генотипов повышенного риска по полиморфным локусам генов гасдермина В (GSDMB), бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1), белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3).

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Кровь набирают в пробирку с консервантом, в качестве которого используют глюгицир в соотношении с кровью 1:4 или антикоагулянт К₂ЭДТА. Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляют 30 мл лизирующего буфера (320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl, pH 7,6) и центрифугируют при 4°C и 4000 об./мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 20 мл лизирующего буфера и центрифугируют при тех же условиях в течение 10 минут. К полученному осадку добавляют 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, pH 8,0, 75 мМ NaCl). Затем ресуспензируют полученный раствор и переносят его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки, добавляют 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°C в течение 16 часов. Экстракцию ДНК проводят в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCl, pH 7,8), смесью фенола - хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин, центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждают из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объемом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывают 70% раствором этилового спирта, подсушивают на воздухе, растворяют в деионизированной воде и хранят при -20°C.

Исследование полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 может осуществляться с помощью разнообразных молекулярно-генетических методов: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов после полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ), ПНР с использованием аллель-специфичных праймеров, ПНР в реальном времени, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализа), биочипы, секвенирование и др.

В качестве точного и быстрого способа исследования ДНК-локусов (rs7216389 гена GSDMB, rs12342831 гена B4GALT1, rs1496499 гена IGFBP3) применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией. Амплификацию и детекцию результатов проводят на амплификаторах с возможностью анализа флуоресценции по конечной точке - «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия); «iQiCycler», «iQ5», «CFX96» («BioRad», США), ABI 7300/7500/7900 («Applied Biosystems», США) или аналогичных.

ПЦР синтеза ДНК проводят в 10 мкл общего объема смеси, содержащей 2 мкл универсального буфера (670 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 0,1% Tween-20, 2 мМ dNTPs, 10 мМ праймеров, 5 мМ зондов), 0,2 мкл Taq-полимеразы и 30 нг геномной ДНК. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, зондов, размеры амплифицируемых фрагментов и температурные режимы ПЦР представлены в таблице 1.

Интерпретацию результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени проводят с помощью программных средств используемого реал-тайм амплификатора в автоматическом режиме.

Критерии предлагаемого способа оценки риска развития бронхиальной астмы были разработаны на основании анализа данных клинико-генетических исследований 1149 неродственных индивидов в возрасте от 1 года до 67 лет русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан. Этническая принадлежность обследуемых определялась до третьего поколения путем личного опроса каждого человека. Выборка больных БА составила 560 человек. Обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета, пульмонологического и аллергологического отделений городской клинической больницы №21 г.Уфы, аллергологического отделения Республиканской клинической детской больницы г.Уфы. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и инструментальных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний.

В качестве контроля исследована группа, состоящая из 589 практически здоровых лиц, не имеющих проявлений аллергических заболеваний и отягощенной наследственности.

Полногеномное генотипирование 727 образцов ДНК (358 больных БА и 369 индивидов контрольной группы) выполнено на Illumina Platform с использованием биочипа Illumina Human610-Quad BeadChip в Национальном центре генотипирования в г.Эври (Франция). Математическую обработку результатов полногеномного анализа ассоциации полиморфных локусов выполняли с помощью пакета программ PLINK 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml). Провели строгий контроль качества образцов ДНК и прогенотипированных маркеров. Из анализируемой выборки исключили дуплицированные образцы ДНК, а также образцы ДНК, в которых не прошло генотипирование более чем 5% маркеров и образцы ДНК, у которых выявлено несоответствие между обозначенным и установленным при генотипировании полом. Из дальнейшего анализа также исключили ОНП, по которым не прошло генотипирование более чем у 5% индивидов, ОНП с частотой редкого аллеля менее 0,01 и ОНП со статистически значимым отклонением (p<0,001) от равновесия Харди-Вайнберга. Полногеномный уровень значимости p≤4,79×10^-7, при котором ожидаемая доля ложноположительных результатов не превышает 5% (5% false discovery rate), определили с использованием функции q value в среде программирования R (www.r-proiect.org) (Benjamini, Hochberg, 1995; Storey, Tibshirani, 2003). Для учета популяционной гетерогенности исследуемых выборок больных и контроля провели EIGENSTRAT-анализ, позволяющий сделать поправку на наличие популяционной стратификации в полногеномном масштабе (Price et al., 2006).

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий χ² (p) для таблиц сопряженности 2×2. Для выявления факторов повышенного и пониженного риска развития бронхиальной астмы, проводили оценку показателя соотношения шансов (OR - odds ratio), а также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака. Степень ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле:

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; с и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. При OR=1 нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация с аллелем или генотипом («фактор повышенного риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор пониженного риска»).

Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction) [Ritchie M.D. et al., 2001] и ее модифицированной версии GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou X.Y. et al., 2007; Chen G.B. et al., 2011] (www.healthsystem.virginia.edu/internet/addictiongenomics/Software). Метод MDR позволяет оценить вклад каждого из исследуемых генотипов, их взаимодействия, учитывая как снижающие, так и усиливающие влияния отдельных маркеров на возникновение заболевания, что дает возможность уменьшить размерность числа рассчитываемых параметров при одновременной оценке большого числа маркеров. Вклад каждого гена и/или их взаимодействия оценивается величиной энтропии Н (величиной информации, снятой неопределенности в терминах теории информации), выраженной в %, где 100% - генотип однозначно определяет к какому классу (больных или здоровых) относится индивид, соответственно 0% - генотип не играет никакой роли в предрасположенности к заболеванию. В программах MDR и GMDR путем многократного перекрестного пересчета вводимых первичных данных выбирается оптимальная модель ген-генного или ген-средового взаимодействия, позволяющая с высокой точностью предсказать человеку наличие или отсутствие предрасположенности к определенному заболеванию. Для каждой из этих моделей программы определяют сбалансированную точность (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности и специфичности модели, определенными по доле верно и неверно классифицированных моделью случаев при многократных перекрестных проверках.

Чувствительность модели (Sensitivity, Se) - это доля истинно положительных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:

Se=(TP/(TP+FN))×100%, где

ТР (True Positives) - верно классифицированные положительные примеры (истинно положительные случаи). При прогнозировании вероятности наличия заболевания положительным случаем является «больной».

FN (False Negatives) - положительные примеры, ложно классифицированные как отрицательные (ложно отрицательные примеры).

Специфичность модели (Specificity, Sp) - доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:

Sp=(TN/(TN+FP))×100%, где

TN (True Negatives) - верно классифицированные отрицательные примеры (истинно отрицательные случаи);

FP (False Positives) - отрицательные примеры, классифицированные как положительные (ложно положительные случаи).

Сбалансированная точность (Balanced Accuracy, Bal.Acc.) и ошибка предсказания (Prediction Error) модели определяются, исходя из специфичности и чувствительности модели, и отражают не только возможность предсказания того или иного события (в частности, наличия или отсутствия заболевания), но и вероятность (точность) развития данного события:

Bal.Acc.=(Sp+Se)/2,

Prediction Error=100-Balanced Accuracy

Проведенный полногеномный анализ ассоциации БА выявил наиболее статистически значимые генетические маркеры риска, предрасполагающие к развитию БА, большинство из которых были обнаружены впервые в мире. Установлена ассоциация полиморфных локусов, локализованных на длинном плече хромосомы 17 в области 17q12-q21, с развитием БА. Пять ОНП были ассоциированы с БА с полногеномным уровнем значимости p≤4,79×10^-7 (rs9303277, rs8067378, rs2290400, rs7216389, rs4795405). С наиболее высоким уровнем значимости с БА был ассоциирован ОНП rs7216389 (с.236-1199С>Т), расположенный в первом интроне гена GSDMB (р=1,01×10^-7). Ген GSDMB кодирует один из белков семейства гасдерминдомен-содержащих протеинов - гасдермин В, экспрессируется в эпителиальных клетках, лимфоцитах, желудке, кишечнике, печени, легких и других тканях и принимает участие в терминальной дифференцировке эпителиальных клеток (Carl-McGrath et al., 2008). Частота встречаемости аллеля rs7216389*T у больных БА была выше (59,55%), чем в контрольной группе - 45,04% (р=1,01×10^-7; OR=1,8 (CI95% 1,45-2,23)). Гомозиготный генотип rs7216389*T/T в группе пациентов определялся в 37,27% случаев, в контроле - в 21,87% (р=1,2×10^-5, OR=2,12 (CI95% 1,51-2,98)).

В проведенном полногеномном анализе ассоциации было выявлено еще несколько полиморфных локусов, ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости порядка 10^-6. Один из них, rs12342831 (с.649-4268Т>С), локализован в области 9р13 во втором интроне гена бета1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1. Установлено, что аллель rs12342831*T, определенный с частотой 77,36% у больных и 66,03% в контрольной группе, является маркером повышенного риска развития БА (р=4,2×10^-6; OR=1,76 (CI95% 1,38-2,24). Генотип rs12342831*Т/Т у больных БА встречается с частотой 58,05%, у индивидов контрольной группы - 41,98% (p=3,1×10^-5; OR=1,91 (CI95% 1,41-2,59)). Ген B4GALT1 является одним из семи генов бета1,4-галактозилтрансферазы и кодирует две изоформы белка, различающиеся по длине цитоплазматического домена (www.ncbi.nlm.nih.gov). Обе изоформы beta-1,4-GalT-I экспрессируются в моноцитарных дендритных клетках и CD4(+) Т лимфоцитах человека и являются одними из ключевых молекул клеточной адгезии, участвующими во взаимодействии дендритных клеток с Т-лимфоцитами (Han et al., 2009; Cheng et al., 2010).

При полногеномном анализе установлена также выраженная ассоциация БА с ОНП rs1496499 (g.45979023T>G), локализованным в области 7р12.3 (р=4,77×10^-6). Аллель rs1496499*T, обнаруженный с частотой 55,78% у больных и 43,29% - у здоровых индивидов, оказался маркером повышенного риска развития БА (р=4,77×10^-6; OR=1,65 (CI95% 1,33-2,05)). Генотип rs1496499*T/T встречался у больных БА с частотой 30,09%, в контрольной группе - 20,12% (р=0,0028; OR=1,71 (CI95% 1,2-2,43)). Ближайшим геном, расположенным на расстоянии около 18 т.п.н. от ОНП rs1496499, является ген IGFBP3, который кодирует белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II. В ряде работ было выявлено, что инсулиноподобные факторы роста активируются при воспалении дыхательных путей и индуцируют пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных клеток, стимулируя выработку коллагена, ангиогенез и гиперплазию гладкомышечных клеток - основных процессов, происходящих при ремоделировании легких (Pascual, Peters, 2005; Veraldi et al., 2009; Kaplan et al., 2011).

Для подтверждения ассоциации полиморфных локусов генов GSDMB (rs7216389), B4GALT1 (rs12342831) и IGFBP3 (rs1534151) с развитием БА, проведен анализ данных локусов в независимой выборке больных БА (202 человека) и в контрольной группе (220 человек), который подтвердил наличие их ассоциации с развитием БА.

Проведено исследование роли межгенных взаимодействий исследованных при полногеномном анализе полиморфных локусов в детерминации риска развития бронхиальной астмы с помощью программы MDR [Ritchie M.D. et al., 2001] и ее модифицированной версии - GMDR (Generalized MDR) [Lou X.Y. et al., 2007; Chen G.B. et al., 2011]. Установлены ДНК-локусы исследованных генов, взаимодействующие при развитии наследственной предрасположенности к бронхиальной астме.

С помощью математического моделирования получена модель межгенных взаимодействий, демонстрирующая взаимовлияние изученных нами полиморфных локусов генов GSDMB (rs7216389), B4GALT1 (rs12342831) и IGFBP3 (rs1496499) в формировании предрасположенности к бронхиальной астме. Все три локуса, входящие в эту модель, вносят приблизительно одинаковый вклад в развитие БА с незначительным преимуществом полиморфного локуса гена GSDMB. Показатели энтропии составляют H_GSDMB=2,91%; HB_4GALT1=2,7% и H_IGFBP3=2,38%. Установлено, что полиморфные варианты гена GSDMB и гена B4GALT1, а также генов B4GALT1 и IGFBP3 действуют синонимично, аддитивный эффект проявляют полиморфные варианты генов GSDMB и IGFBP3. Сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 65,05%, чувствительность (Se) - 60,86%, специфичность (Sp) - 69,15%, воспроизводимость результата (CV Consistency) - 10/10. Выявлены статистически значимые сочетания генотипов, являющиеся маркерами повышенного риска развития БА:

GSDMB*rs7216389C/T - B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G (p=0,004; OR=2,19, CI95% 1,26-3,79);

GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G (p=0,0001; OR=3,08, CI95% 1,70-5,59);

GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/T (p=0,009; OR=2,63, CI95% 1,24-5,59).

В целом, проведенное полногеномное исследование однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных БА и индивидов контрольной группы показало наличие ассоциации БА с полиморфными локусами, локализованными в области 17q12-q21 (в гене GSDMB) и, по данным литературы, ассоциированными с развитием БА в популяциях различного этнического происхождения. Кроме того, впервые в мире обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами генов B4GALT1 и IGFBP3. Выявлены статистическим значимые модели межгенного взаимодействия полиморфных локусов генов, с помощью которых можно с высокой точностью прогнозировать риск развития бронхиальной астмы.

В связи с вышесказанным, нами разработан способ прогнозирования бронхиальной астмы, основанный на генотипировании полиморфных локусов rs7216389, rs12342831, и rs1496499, ассоциированных с развитием БА по данным проведенного полногеномного анализа, идентификации маркеров повышенного риска развития заболевания и прогнозировании риска развития бронхиальной астмы.

Примеры прогнозирования риска бронхиальной астмы.

Пример 1. Больная Н., 1982 г.р., смешанного этнического происхождения (мать - башкирка, отец - татарин).

Клинический диагноз: Бронхиальная астма, тяжелое течение, стадия обострения. Для проведения анализа полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 у больной было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больная Н. является носителем сочетаний генотипов GSDMB*rs7216389T/T - B4GALT1*rs12342831T/T - IGFBP3*rs1496499T/T - маркеров повышенного риска БА.

Пример 2. Больной Г., 2001 г.р., русский (этническое происхождение установлено до третьего поколения путем личного опроса).

Клинический диагноз: Бронхиальная астма, средней степени тяжести, стадия обострения. Сопутствующие: аллергический ринит.

С целью проведения анализа полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 у больного было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больной Г. является носителем сочетаний генотипов GSDMB*rs7216389T/T - B4GALT1*rs12342831T/Т - IGFBP3*rs1496499T/G - маркеров повышенного риска БА.

Проведенное обследование пациентов подтвердило высокую точность прогноза БА с применением предложенного способа. Использование данного способа выявления сочетаний генотипов повышенного риска развития бронхиальной астмы на доклинической стадии заболевания позволило бы провести у носителей генотипов риска профилактические мероприятия, ограничивающие воздействие факторов внешней среды, способствующих развитию бронхиальной астмы.

Таблица 1 Праймеры, зонды и условия проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени Полиморфный локус Локализация Праймеры и зонды Длина продукта Режим амплификации rs1496499 7р12.3 FJ, GCTTCCTCTTCATACTAC 194 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00 RJ, TCCAGATCATTCTTTCAG 40 циклов амплификации 94°C - 0:10 FAM-taTgAcAcAtTcatct-BHQ-1 56°C - 1:30 VIC-taTgAcCcAtTcatct-BHQ-2 rs12342831 9р13 FJ, AAGGCTCAAGGGAATTAG 99 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00 RJ, CTTCCTACGCATTTCACA 40 циклов амплификации 94°C - 0:10 FAM-attagAgtCtcTcaCagc-BHQ-1, 56°C - 1:30 VIC-attagAgtTtcTcaCagc-BHQ-2, rs7216389 17q12-21 FJ, GTCGCTGTTGTTTGTATG 103 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00 RJ, CCCTTATTAGTGCCTGATC 40 циклов амплификации 94°C - 0:10 FAM-cacaaAcaCgcatggac-BHQ-1 60°C - 1:00 VIC-cacaaAcaTgcatggac-BHQ-2

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Осуществляют выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного. Проводят генотипирование полиморфных вариантов rs7216389 гена гасдермина В (GSDMB), rs12342831 гена бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1) и rsl496499 гена белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3). При выявлении одного из сочетаний генотипов по трем полиморфным локусам генов: GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/Т-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/T, прогнозируют риск развития бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности. Изобретение обеспечивает эффективный способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы и способствует разработке профилактических мероприятий с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. 1 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного варианта rs7216389 гена гасдермина В (GSDMB), полиморфного варианта rs12342831 гена бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1) и полиморфного варианта rs1496499 гена белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3), и при выявлении одного из сочетаний генотипов по трем полиморфным локусам генов
GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rsl496499T/G;
GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G:
GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-1GFBP3*rs1496499T/T
прогнозируют риск развития бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности