Способ оценки метаболической активности микробиоты кишечника у детей раннего возраста Российский патент 2023 года по МПК G01N33/92 G01N33/497 G01N30/12 

Изобретение относится к медицине, а именно к сфере педиатрии, и может найти применение в оценке состояния микробиоты кишечника по изменению уровня ее метаболической активности у детей возрастного интервала от 1 месяца до 3 лет.

Известен способ оценки состояния дисбиоза ротоглотки у детей (пат. RU 2741709 С1, 2021). В слюне ребенка методом газожидкостной хроматографии определяют содержание уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной и капроновой кислот. Затем с использованием классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа рассчитывают значение диагностических коэффициентов, оценивающих состояние дисбиоза - F₁ и F₂. Способ обеспечивает возможность быстрой и достоверной оценки состояния дисбиоза ротоглотки у детей за счет идентификации специфического соотношения концентраций одноцепочечных жирных кислот в слюне.

Известен способ разделения смеси жирных кислот фракции С - С методом газожидкостной хроматографии (пат. RU 2220755 С1, 2004). Способ позволяет проводить выделение, разделение и определение короткоцепочечных жирных кислот с высокой точностью при уменьшении веса (или объема) пробы биологического образца. Известен способ разделения смеси жирных кислот фракции С - С методом газожидкостной хроматографии (пат. RU 2145511 С, 2000). Способ позволяет проводить выделение, разделение и определение летучих жирных кислот для анализа биологических и иных объектов с высокой точностью.

Известные изобретения направлены на создание высокочувствительных способов разделения жирных кислот фракции С₂-С₆ из биологических субстратов при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах методом газожидкостной хроматографии при обеспечении высокой степени разделения.

Задачей настоящего изобретения является создание способа оценки метаболической активности микробиоты кишечника у детей раннего возраста по содержанию низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот в кале.

Кишечная микробиота человека в настоящее время является предметом пристального изучения ученых всего мира в связи с тем, что обеспечивает биохимическое, метаболическое, иммунологическое равновесие и колонизационную резистентность к инфекционным возбудителям, необходимые для поддержания гомеостаза человеческого организма [1-5]. На данном этапе медицины активно внедряются в клиническую практику химические методы: газожидкостная хроматография и масс-спектрометрия, основанные на выявлении специфических бактериальных метаболитов в содержимом тощей кишки или в кале. С помощью данных методов можно косвенно определить состав и количество микроорганизмов соответствующих биотопов и изучить метаболическую активность кишечной микрофлоры по спектру и уровню короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), обнаруживаемых в фекалиях [6-8]. Одним из самых перспективных методов метаболомики в плане оценки состояния микробиоценоза различных биотопов человеческого организма считается определение КЖК, являющихся продуктами жизнедеятельности различных родов микроорганизмов, методом газожидкостного хроматографического (ГЖХ) анализа [9].

Спектр КЖК в кале определялся с помощью метода ГЖХ, который проводился согласно медицинской технологии «Способ определения короткоцепочечных жирных кислот фракции С₂-С₆ с изомерами в различных биологических субстратах методом газожидкостной хроматографии» [10]. Определение содержания КЖК методом ГЖХ основывается на выявлении продуктов микробного метаболизма: уксусной кислоты (С₂), пропионовой кислоты (С₃), масляной кислоты (C₄), изокислот (iCn). Измеряется концентрация каждой кислоты (абсолютное содержание, мг/г), рассчитывается их относительное содержание, суммарное содержание (Е), анаэробный индекс (АИ). Уксусная кислота (С₂) является метаболитом облигатной микрофлоры (Bifidobacterium, Lactobacillus, E. coli) и снижение ее доли свидетельствует о снижении активности и численности молочнокислых микроорганизмов. Увеличение доли пропионовой (С₃) и масляной (С4) кислот указывает на активацию условно-патогенной флоры и строгих анаэробов (Veillonella, Bacteroides, Clostridium, Eubacterium). Результаты изучения анаэробного индекса (АИ) указывают на «анаэробизацию» среды, при которой происходит угнетение жизнедеятельности облигатных анаэробов за счет блокирования терминальных ферредоксинсодержащих ферментов, и на этом фоне активизируются их факультативные и остаточные штаммы [11]. В современной доступной отечественной и зарубежной литературе имеются данные, посвященные изучению метаболической активности кишечника у новорожденных детей, у детей раннего возраста при функциональных нарушениях кишечника, в зависимости от вида вскармливания, у детей с аллергическими заболеваниями [12-14]. В то же время данных о показателях метаболической активности кишечной микробиоты, систематизированных с помощью метода перцентильного распределения, позволяющего формировать нормативные значения для возрастной популяции 1-3 года, нам не встретилось.

Авторами проведено проспективное когортное исследование у 213 детей раннего возраста. Дети были разделены на три группы в соответствии с возрастом: в первую группу (1) наблюдения вошли дети в возрасте от 1 месяца до 1 года (n=147); во вторую (II) группу от 1 до 2 лет (n=41); третья группа (III) - с 2-3 лет (n=25). Все дети относились к I, II группам здоровья: к I группе здоровья относились здоровые дети, имеющие нормальное физическое и психическое развитие, не имеющие анатомических дефектов, функциональных и морфофункциональных отклонений, ко II группе здоровья относились дети, у которых отсутствуют хронические заболевания, но имеются некоторые функциональные и морфофункциональные нарушения, реконвалесценты, особенно перенесшие тяжелые и средней тяжести инфекционные заболевания; дети с общей задержкой физического развития без эндокринной патологии, дети с дефицитом массы тела или избыточной массой тела, дети часто и/или длительно болеющие острыми респираторными заболеваниями; дети с физическими недостатками, последствиями травм или операций при сохранности соответствующих функций [15]. Критериями включения в исследование являлись возраст от 1 мес.до 3 лет, отсутствие жалоб со стороны желудочно-кишечного тракта, отсутствие антибактериальной терапии и пробиотических препаратов за 3 месяца до начала исследования. Исследование выполнено с учетом всех необходимых этических принципов и было подтверждено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России (протокол №10 от 20.12.2019). Анализ данных был выполнен с помощью пакета статистических программ STATISTICA, версия 10,0 (StatSoft Inc, США).

На основании определения КЖК в кале изучена метаболическая активность микробиоты кишечника и разработаны оценочные таблицы значений КЖК с использованием перцентильного метода для детей в возрасте от 1 месяца до 3-х лет. Определены нормативные значения для уровня КЖК в кале у здоровых детей (Me [10%о-90%о]) данной возрастной популяции.

Концентрация КЖК в кале определялась газохроматографическим методом. Полученные данные были распределены с выделением интервалов значений: средних, ниже среднего, выше среднего, низких, высоких. Приведены значения медианы, или 50-го перцентиля - свойственные половине здоровых детей данного возраста.

Для удобства интерпретации результатов было использовано «правило светофора», отражающее принадлежность определенного цветового поля к перцентилям.

«Зеленый блок» - значения в интервале 25-75%о, данный интервал показывает количественные границы признака у 68,8% детей данного возраста. «Желтый блок» - значения, которые находятся в интервалах 25-10%о (значения ниже среднего) и 75-90%о (значения выше среднего). Эти показатели отражают незначительные отклонения метаболической активности микробиоты кишечника, требующие коррекции при наличии клинических проявлений. Значения, находящиеся в «желтом» и «зеленом» блоках (10-90%о), показывают количественные интервалы признака у 95,4% детей данного возраста, или находятся в диапазоне значений М (среднее) ± 2SD, что условно соответствует нормативным значениям изучаемого показателя - КЖК.

«Красный блок» - значения, которые находятся в интервалах 10-3%о (значения низкие) и 90-97%о (значения высокие) - отражают более выраженные отклонения в состоянии кишечной микробиоты, требующие динамического наблюдения и коррекции при наличии соответствующих клинических проявлений. Значения КЖК, располагающиеся в интервалах ниже 3%о или выше 97%о, что встречается у 6% (3% и 3%) детей данной возрастной группы, свидетельствуют о выраженных нарушениях метаболической активности кишечной микробиоты. Это зона повышенного внимания, требующая дополнительного обследования с целью выявления патологических состояний со стороны кишечника у детей. На Фиг. 1 представлена - Оценочная таблица значений КЖК в кале у детей раннего возраста; На Фиг. 2 - Интерпретация результатов оценочной таблицы.

Сущность изобретения - оценка нарушений метаболической активности кишечной микробиоты с помощью определения концентрации низкомолекулярных КЖК в кале, и сопоставлении этих значений с разработанными оценочными таблицами перцентильного распределения значений КЖК в кале у детей указанной возрастной группы. Полученные результаты позволяют определять отклонения в состоянии кишечной микробиоты и принимать решения по дальнейшей тактике наблюдения. Метаболическая активность микробиоты кишечника у здоровых детей на протяжении трех лет жизни меняется. Отмечается достоверное снижение маркеров облигатной флоры (С₂) начиная со второго полугодия первого года к трем годам (0,809 мг/г - 0,705 мг/г - 0,635 мг/г), маркеры анаэробной флоры - С₃ в кале повышалось на протяжении всего периода наблюдения; С₄ тоже достоверно увеличивался с возрастом ребенка. АИ повышался с возрастом и достигал максимальных значений у детей третьего года жизни. Сумма кислот на протяжении всех трех лет оставалась статистически стабильна. Данные изменения отражают усиление процессов анаэробизации кишечной микробиоты, на фоне снижения активности аэробной флоры с увеличением возраста ребенка. Изокислоты, продукты микробного переваривания аминокислот, являются маркерами протеолитической флоры. В группе детей первого года жизни были выявлены статистически значимо более низкие значения суммы изокислот в кале, что является отражением особенностей питания детей первого года жизни (таблица 1).

Техническим результатом способа является упрощение способа и достоверная оценка состояния метаболической активности кишечной микробиоты у детей первых трех лет жизни.

Осуществление изобретения:

Предложенный способ с оценочной таблицей (с перцентильным распределением значений КЖК) был использован в скрининговой диагностике нарушений микробиоты кишечника у детей раннего возраста, имеющих отклонения в состоянии здоровья: детей, перенесших резекцию кишечника на первом году жизни, и детей с атопическим дерматитом. У детей, перенесших резекцию кишки, к возрасту 3 лет в кале определялись высокое содержание суммы кислот, тенденция к снижению С₃ и вместе с этим к снижению АИ(-), преобладание количества детей с низкими и высокими значениями С₄ (зона «красного блока»). Спектр КЖК в кале у детей с аллергией характеризовался высокими значениями С₄, что свидетельствовало об активации анаэробной флоры и воспалительном процессе в кишечнике (таблица 2).

Примеры оценки активности микробиоты кишечника с использованием оценочной таблицы (Фиг. 1).

Пример 1 (М. 1 г. 11 мес.) показатели метаболической активность микробиоты кишечника по показателям аэробной (С2-0,706) и анаэробной флоры (С3-0,174; С4- 0,118, АИ- 0,414) укладываются в средние значения для данного возраста в интервал 25-75%о («зеленая зона»). Маркер протеолитической активности (EiCn- 0,080) и сумма кислот (Е- 10,611) имеют значения выше среднего, в интервал ≥75<90 («желтая зона»). Заключение: У данного пациента метаболическая активность сопоставима со средними показателями у здоровых детей по показателям анаэробной (С3, С4, АИ) и аэробной флоры (С2). Значения суммы кислот (Е) и суммы изокислот (EiCn) имеют незначительные отклонения, требующие дообследования и коррекции только при наличии клинических проявлений.

Пример 2 Щ. 2 г. 6 мес.) Маркеры облигатной флоры (С2 - 0,898) находятся в интервале очень высоких значений ≥90<97, напротив маркеры анаэробной флоры (С3-0,022; АИ-0,113) находятся в интервалах очень низких значений ≤3%о, что отражает отклонения, в сравнении со средними значениями в данном возрасте у здоровых детей. Сумма кислот (Е- 2,407), отражающая видовое разнообразие микробиоты, находится в интервале очень низких значений ≤3%о. Заключение: Таким образом, у данного пациента выявлены выраженные изменения метаболической активности микробиоты кишечника («красные зоны»), что требует обязательного дальнейшего дообследования.

Пример 3 (Р, 11 мес.) Маркеры облигатной флоры (С2=0,925) имеют значения выше среднего, но укладываются в показатели средних значений в данном возрастном периоде ≥75<90 («желтая зона»). Анаэробные показатели (С3=0,048; С4=0,025) и сумма изокислот (EiCn=0,039) находятся в пределах средних значений 25-75%о («зеленая зона»). Сумма кислот (Е=18,141) находится в интервале выше среднего ≥75<90, АИ=0,080 - ниже среднего >10%о≤25%о («желтая зона»). Заключение: Таким образом, у данного пациента показатели метаболической активности микробиоты кишечника имеют незначительные отклонения и требуют коррекции только при наличии клинических проявлений.

Таким образом, предлагаемый способ прост в исполнении и позволяет достоверно по значениям КЖК оценивать нарушения состояния кишечной микробиоты при функциональных и патологических состояниях кишечника у детей возрастной группы 1-3 лет.

Литература:

1. Николаева И.В., Шайхиева Г.С., Анохин В.А., Царегородцев А.Д., Шарафутдинов И.Х. Метаболическая активность кишечной микрофлоры у новорожденных детей при различном способе родоразрешения. Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2019. - Т. 64. - №2. - С.81-86. - DOI 10.21508/1027-4065-2019-64-2-81-86.

2. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2007.

3. Thursby Е., Juge N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J 2017; 474(11): 1823-1836. DOI: 10.1042/BCJ20160510.

4. Успенский Ю.П., Барышникова H.B., Суворова M.A., Людыно В.И., Иванова А.В., Суворов А.Н. Особенности микробиоты кишечника у больных воспалительными заболеваниями кишечника. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2020. №1-2. С.92.

5. Ивашкин В.Т., Зольникова О.Ю. Синдром раздраженного кишечника с позиций изменений микробиоты. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2019;29(1):84-92. https://doi.org/10.22416/1382-4376-2019-29-1-84-92

6. Костюкевич О.И., Современные проедставления о микробиоценозе кшечника. Дисбактериоз и его коррекция. РМЖ-2007

7. Guilarte М, Santos J, de Torres I, Alonso C, Vicario M, Ramos L, Mar tinez C, Casellas F, Saperas E, Malagelada JR. Diarrhoea-predominant IBS patients show mast cell activation and hyperplasia in the jejunum // Gut. -2007. - Vol.56.

8. Biasucci G., Rubini M., Riboni S., Morelli L., Bessi E., Retetangos C. Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut. Early Hum Dev 2010; 86(1):13-18. DOI: 10.1016/j.earlhumdev.2010.01.004

9. Ардатская М.Д., Гарушьян Г.В., Мойсак Р.П., Топчий Т. Б. Роль короткоцепочечных жирных кислот в оценке состояния микробиоценоза кишечника и его коррекции у пациентов с НАЖБП различных стадий. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2019;161(1): 106-116. DOI: 10.31146/1682-8658-ecg-161-1-106-116

10. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Иконников Н.С.Способ определения короткоцепочечных жирных кислот (фракции С2-С6 с изомерами) в различных биологических субстратах методом газожидкостной хроматографии: метод, рекомендации для врачей, руководителей органов управления здравоохранением и ЛПУ. Российская медицинская академия последипломного образования. Москва; 2005.

11. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта. Автореферат дис. докт. мед. наук. - М., 2003., 45 с.

12. Rao S.C., Esvaran М., Patole S.K., et al. Gut microbiota in neonates with congenital gastrointestinal surgical conditions: a prospective study. Pediatr Res 2020; 88(6):878-886. doi: 10.1038/s41390-020-0824-7.

13. Сугян Н.Г. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при функциональных нарушениях желудочно-кишечного тракта у детей раннего возраста: автореф. дис.... канд. мед. наук. - М.; 2010. - С.5-23.

14. Носкова О.Ю., Григорович М.С., Ардатская М.Д. Функциональная активность микробиоты кишечника у детей раннего возраста в зависимости от свойств кисломолочного прикорма // Медицинский альманах. - 2015. - №2(37). - С.102-106.

15. Приложение N2 к Порядку проведения профилактических медицинских осмотров несовершеннолетних, утвержденному приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 10 августа 2017 г. N 514н.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для оценки метаболической активности микробиоты кишечника у детей в возрасте от 1 месяца до 3 лет. Проводят определение содержания низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот - КЖК в пробах биологических объектов методом газожидкостной хроматографии. В кале ребенка определяют концентрацию в мг/г: уксусной кислоты - С₂, пропионовой кислоты - С₃, масляной кислоты - С₄ и изокислот: изомасляной, изовалериановой, изокапроновой – iCn. Рассчитывают сумму изокислот EiCn, анаэробный индекс – АИ и суммарное содержание кислот – Е. Сравнивают полученные показатели значений КЖК и расчетные величины EiCn, АИ, Е со значениями оценочной таблицы, представленной на фиг.1, согласно возрастной группе. Если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервал значений выше 10‰, но ниже или равный 25‰ или выше или равный 75‰, но ниже 90‰, это свидетельствует о том, что метаболическая активность кишечной микробиоты имеет незначительные отклонения, требующие коррекции только при наличии клинических проявлений. Если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервал значений выше 3‰, но ниже или равный 10‰ или выше или равный 90‰, но ниже 97‰, то значения считают соответственно низкими или высокими, что отражает отклонения в состоянии кишечной микробиоты и требует динамического наблюдения и коррекции при наличии соответствующих клинических проявлений. Если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервалы значений ниже 3‰ или выше 97‰, то это свидетельствует о выраженных нарушениях метаболической активности кишечной микробиоты, что требует дополнительного обследования для выявления патологических состояний со стороны кишечника у детей. Способ обеспечивает возможность оценки метаболической активности микробиоты кишечника у детей в возрасте от 1 месяца до 3 лет за счет определения содержания низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот в кале, что позволяет достоверно оценивать нарушения состояния кишечной микробиоты при функциональных и патологических состояниях кишечника у детей. 2 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ оценки метаболической активности микробиоты кишечника у детей в возрасте от 1 месяца до 3 лет, включающий определение содержания низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот - КЖК в пробах биологических объектов методом газожидкостной хроматографии, отличающийся тем, что в кале ребенка определяют концентрацию в мг/г: уксусной кислоты - С₂, пропионовой кислоты - С₃, масляной кислоты - С₄ и изокислот: изомасляной, изовалериановой, изокапроновой – iCn, рассчитывают сумму изокислот EiCn, анаэробный индекс – АИ и суммарное содержание кислот - Е, сравнивают полученные показатели значений КЖК и расчетные величины EiCn, АИ, Е со значениями оценочной таблицы, представленной на фиг.1, согласно возрастной группе, и

- если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервал значений выше 10‰, но ниже или равный 25‰ или выше или равный 75‰, но ниже 90‰, это свидетельствует о том, что метаболическая активность кишечной микробиоты имеет незначительные отклонения, требующие коррекции только при наличии клинических проявлений;

- если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервал значений выше 3‰, но ниже или равный 10‰ или выше или равный 90‰, но ниже 97‰, то значения считают соответственно низкими или высокими, что отражает отклонения в состоянии кишечной микробиоты и требует динамического наблюдения и коррекции при наличии соответствующих клинических проявлений;

- если показатели значений КЖК и расчетных величин попадают в интервалы значений ниже 3‰ или выше 97‰, то это свидетельствует о выраженных нарушениях метаболической активности кишечной микробиоты, что требует дополнительного обследования для выявления патологических состояний со стороны кишечника у детей.