СПОСОБ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЗМА ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ И ХОЛЕСТЕРИНА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/15 G01N33/48 G01N33/49 G01N33/92 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии, терапии, гепатологии, и может быть использовано для оценки метаболизма желчных кислот (ЖК) и холестерина (ХС).

Ряд заболеваний, обусловленных нарушением метаболизма ЖК и ХС, в частности такое мультифакторное заболевание, как желчно-каменная болезнь (ЖКБ) (или рецидив холелитиаза у больных после холецистэктомии), диагностируется в основном на стадии формирования желчных камней и хронического калькулезного холецистита (при проведении УЗИ), что сказывается на своевременности и эффективности проведения адекватной терапии и принятии профилактических мер.

Заболевания, протекающие с нарушением метаболизма ЖК и ХС, вследствие нарушения энтерогепатической циркуляции ЖК и ХС (неспецифический язвенный колит, оперативные вмешательства на кишечнике, в частности гемиколэктомии, формирование анастомозов и др.), также в ряде случаев требуют проведения мероприятий, направленных на лечение и предотвращение холелитиаза.

В этой связи актуальной представляется диагностика начальной, предкаменной (физико-химической) стадии заболевания, т.к. именно на этом этапе необходимо принимать меры профилактики для предотвращения перехода ЖКБ в стадию формирования желчных камней.

Однако, как известно, формирование желчи можно условно разделить на несколько этапов: печеночный (печеночно-клеточный, каналикулярный, дуктулярный), пузырный, интестинальный. Механизмы нарушения формирования желчи на этих этапах различны (Яковенко Э.П. Нарушения желчеобразования и методы их коррекции. //Consilium medicum Экстра-выпуск, 2002, с.3-5).

Основным способом диагностики ранних стадий ЖКБ, обусловленных нарушением метаболизма ЖК и ХС, является этапное хроматическое дуоденальное зондирование (ЭХДЗ). В результате проведения ЭХДЗ с изучением стимулированного дебита желчи и ее компонентов возможно диагностировать нарушения процессов желчеобразования, желчеотделения, моторики билиарного тракта и выявлять степень билиарной недостаточности. ЭХДЗ позволяет получить различные порции желчи, достоверно дифференцированные по своему происхождению, что дает возможность при проведении биохимических исследований определить качественный состав каждой порции желчи. Метод позволяет также верифицировать литогенную желчь и объектизировать процессы воспаления. Также с помощью ЭХДЗ возможно выявить нарушения в работе сфинктерного аппарата билиарного тракта, определить тип дискинетических расстройств и констатировать уровень секреторного давления печени (Максимов В.А., Чернышев А.Л., Тарасов К.М. Дуоденальное исследование. Москва, 1998, ЗАО «Медицинская газета»; с.85-87).

Недостатками этого способа является инвазивность исследования, трудность воспроизведения методики и наличие противопоказаний (общее тяжелое состояние больного, реконструктивные операции на желудке и органах панкреатодуоденальной зоны, стриктуры верхних отделов желудочно-кишечного тракта).

Кроме того, одним из методов, позволяющих оценить способность желчи к нуклеации при диагностике ранних стадий ЖКБ, является холодово-осадочная проба (С.Н.Крутиков, 1992). Суть метода заключается в следующем: при ЭХДЗ берутся две пробирки с желчью, одна с 5 мл пузырной, а вторая с 5 мл печеночной желчи. Пробирки ставятся на 12 часов в холодильник (+4°С). Через 12 часов определяется наличие осадка на дне пробирки (положительная проба). Холодово-осадочная проба положительна у лиц с явными нарушениями коллоидальных свойств желчи.

Способ холодово-осадочной пробы легко воспроизводим, но не специфичен. Недостатками этого метода являются: забор желчи инвазивным путем и оценка изменений лишь на уровне билиарного тракта.

Существует способ оценки литогенности желчи, а следовательно, и изменений метаболизма ЖК и ХС, связанный с наличием нуклеирующих факторов в пузырной желчи (Мансуров Х.Х., Желчно-каменная болезнь. Душанбе. 1991; «Ирфон»; с.75-82). Авторами проводилось сравнительное изучение времени появления осадков желчи и изменения концентрации ионов водорода (рН), а также природы осаждаемых компонентов в норме и у больных ЖКБ. Исследовали пузырную (порция В) и печеночную (порция С) желчь, полученную при ЭХДЗ у больных ЖКБ и у практически здоровых лиц. Время выпадения в осадок определяли визуально. Заметное помутнение желчи и выпадение осадка у больных ЖКБ наступало к концу первых суток, что в 3-4 раза выше, чем у практически здоровых лиц. С целью выяснения природы осаждаемых компонентов желчи определяли содержание ХС, который является основным компонентом во всех осадках (50-70%). Среди различных факторов нуклеации отмечены следующие: муцин, продукция которого усиливается слизистой оболочкой пузыря у больных ЖКБ, пронуклеирующие белки, не всасывающиеся стенкой желчного пузыря, а также билирубинат кальция, другие кальциевые соли, слущенный эпителий со стенок желчного пузыря, бактерии, паразитарные фрагменты.

Основными недостатками этого метода также являются инвазивный забор желчи и оценка изменений лишь на уровне билиарного тракта.

Учитывая то, что вторичный обмен желчных кислот и холестерина происходит в толстой кишке путем 7-альфа-дегидроксилирования их микроорганизмами, развитие ЖКБ рассматривают в тесной взаимосвязи с деятельностью микробиоты желудочно-кишечного тракта.

Для определения состояния микрофлоры используется метод бактериологического исследования кала («Руководство по медицинской микробиологии»// Э.Джавец, Дж.Л.Мельник, Э.А.Эйдельберг. Пер. с англ. под ред. д.м.н. Т.В. Перадзе, Москва, Медицина, 1982). Однако метод имеет ряд общепринятых недостатков, и основным из них в данном аспекте является невозможность определения целого ряда анаэробных микроорганизмов, принимающих участие в 7-альфадегидроксилировании ЖК и ХС.

В последнее время определение метаболической активности микрофлоры кишечника (участвующей в метаболизме ЖК и ХС) проводится путем изучения содержания короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кале методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Данный метод широко используется и обсуждается в литературе (Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Масловский Л.В. Роль кишечной микрофлоры в патогенезе желчнокаменной болезни (по результатам изучения короткоцепочечных жирных кислот в кале). - «Функциональные заболевания и расстройства функций. Гастроэнтерологическая онкология». Смоленск-Москва. 2001, с.77-83; Бабин В.Н. и соавт. «Определение метаболической активности микрофлоры кишечника для комплексной оценки микроэкологических и функциональных нарушений толстой кишки и выбора терапевтических схем». Пособие для врачей. ООО НИФ «Ультрасан»; Москва 2002, Петухов В.А. «Желчно-каменная болезнь и синдром нарушенного пищеварения». Изд. «Веди», 2003; с.59-69).

Основным недостатком этого метода является оценка изменений лишь на уровне микрофлоры кишечника.

В литературе существует указание на изучение КЖК в кале и сыворотке крови больных ЖКБ (Минушкин О.Н., Прихно Н.И., Ардатская М.Д., Масловский Л.В., Иконников Н.С. //Изучение состава и значения короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях и сыворотке периферической крови у пациентов с желче-каменной болезнью. Клиническая медицина, №4, 2001, с.37-39), которое можно рассматривать как ближайший аналог изобретения. Определяли количественный и качественный состав КЖК, при этом относительное содержание КЖК составляло: в кале (С2-0,505±0,011; С3-0,214±0,018; С4-0,179±0,01; С5-0,039±0,003; С6-0,004±0,003 ед), в сыворотке крови (С2-0,835±0,01; С3-0,53±0,002; С4-0,029±0,002; С5-0,01±0,005; С6-0,016±0,001 ед). Изменения КЖК в кале по данным авторов свидетельствовали о нарушении микробиоценоза, а изменения КЖК в кале и сыворотке крови рассматривали как диагностические маркеры ЖКБ. Исследование не ставило целью определение КЖК в качестве критерия оценки нарушения метаболизма ЖК и ХС на разных уровнях (печеночном и интестинальном).

Задачей настоящего изобретения является создание неинвазивного способа оценки метаболизма желчных кислот и холестерина на разных уровнях при значительном сокращении времени получения результатов и их высокой воспроизводимости, низкой стоимости исследования.

Способ основан на определении количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот фракции С₂-С₄ в кале и сыворотке крови. К короткоцепочечным жирным кислотам фракции С₂-С₄ относят уксусную, пропионовую, масляную кислоты.

Результат, который может быть достигнут при осуществлении способа, - высокая точность оценки состояния метаболизма желчных кислот и холестерина на различных уровнях (печеночном, пузырном, интестинальном), а также его изменений при заболеваниях, обусловленных и сопровождающихся нарушением их метаболизма, при значительном сокращении времени получения результатов, низкой стоимости исследования, высокой воспроизводимости результатов.

В нашей работе исследования были выполнены у пациентов с заболеваниями, обусловленными и сопровождающимися нарушением метаболизма ЖК и ХС: у 30 больных ЖКБ; у 30 больных хроническим бескаменным холециститом (ХБХ); у 30 больных хроническим гепатитом (ХГ); у 40 больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК); у 25 больных, перенесших гемиколэктомию.

Изобретение основано на выявленном нами закономерном факте, представляющем по сути технический результат и заключающемся в том, что при определении концентрации и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) фракции С₂-С₄ у больных заболеваниями, обусловленными и сопровождающимися нарушением метаболизма ЖК и ХС,

- в сыворотке крови происходит изменение относительного содержания пропионовой (С₃) и масляной кислот (С₄), выражающееся в снижении процентного содержания пропионовой с 6,5% и менее и увеличении масляной кислоты с 2,9% и более в суммарном содержании С₂-С₄; при сравнении с нормальными показателями (р<0,05), что отражает нарушение синтеза холестерина и желчных кислот гепатоцитами и изменение биохимического состава печеночной и пузырной желчи;

- в кале происходит изменение относительного содержания пропионовой (С₃) и масляной кислот (С₄), выражающееся в увеличении процентного содержания пропионовой с 19,9% и более и увеличении масляной кислоты с 18,9% и более в суммарном содержании С₂-С₄; при сравнении с нормальными показателями (р<0,05 по отношению к норме), что отражает нарушение вторичного обмена холестерина и желчных кислот на интестинальном уровне.

Данные изменения происходят в совокупности.

В норме в сыворотке крови показатели относительного содержания пропионовой - от 6,6% до 7,4% и масляной кислоты - от 2,4% до 2,8% в суммарном содержании С₂-С₄; в кале - показатели содержания пропионовой - от 18,1% до 19,8% и масляной кислоты - от 16,9% до 18,8% в суммарном содержании С₂-С₄.

Способ осуществляют следующим образом.

Больному для оценки нарушений метаболизма ЖК и ХС проводят забор крови из периферической вены, для получения сыворотки (0,5-1 мл), и кала в стерильную бакпечатку (0,5-1,5 г). Исследуют количественное содержание и качественный состав короткоцепочечных жирных кислот в сыворотке крови и кале. По результатам исследования делают вывод о нарушении метаболизма ЖК и ХС (как было указано выше) и определяют уровень нарушения.

Достоверность способа подтверждена установлением высокой степени (r=0,82) корреляционной взаимосвязи содержания холевой кислоты желчи (порции «В» и «С») и уровня пропионовой кислоты в сыворотке крови, которые находятся в прямо пропорциональной зависимости. Результат изучения корреляции содержания холестерина желчи (порции «В» и «С») с уровнем пропионовой кислоты сыворотки крови показал также высокие корреляционные взаимоотношения (r=0,84) между этими показателями, которые находились в обратно пропорциональной зависимости. Высокая степень корреляции (r=0,85) отмечалась и при изучении уровня фосфолипидов желчи (порции «В» и «С») с содержанием масляной кислоты в сыворотке крови больных с заболеваниями, обусловленными и сопровождающимися нарушением метаболизма ЖК и ХС.

Правильность выбранных параметров на основании изучения содержания КЖК в кале и сыворотке крови подтверждается эффективностью проведенной патогенетической терапии, при которой происходит достоверное изменение качественного состава КЖК в кале и сыворотке крови, отражающее различные уровни нарушения энтерогепатической циркуляции ЖК и ХС.

Таким образом, предлагаемый способ оценки нарушения метаболизма ЖК и ХС при заболеваниях, обусловленных и сопровождающихся нарушением метаболизма желчных кислот и холестерина, позволяет достигнуть высокой точности верификации уровня нарушения метаболизма ЖК и ХС в каждом конкретном случае, обладает низкой стоимостью исследования и значительным сокращением времени получения результатов.

Ниже приведены примеры оценки нарушения метаболизма ЖК и ХС при заболеваниях, обусловленных и сопровождающихся нарушением метаболизма ЖК и ХС, подтверждающие возможность использования данного способа, который не ограничивается ими.

Пример 1.

Больная Н., 46 лет. Диагноз: ЖКБ. Поступила с жалобами: на периодически возникающие боли в правом подреберье, ноющего характера, тошноту.

Из анамнеза известно: считает себя больной в течение 6 месяцев, когда впервые, после погрешности в диете (жареная, жирная пища) появились ноющие боли в области правого подреберья, тошнота. Настоящее ухудшение в течение последней недели, когда после злоупотребления жирной пищей и нервно-психической нагрузки появились вышеуказанные жалобы. При поступлении: Больная повышенного питания, вес 75 кг, рост 165 см. Кожные покровы и склеры нормальной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Cor тоны - ясные ритмичные, шумов нет. Живот чувствительный при пальпации в правом подреберье и в точке проекции желчного пузыря. Симптом Мерфи слабо положительный. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется.

Проведенное обследование: общий анализ крови - эритроциты - 4,1 млн., гемоглобин 145 г/л, лейкоциты 5,9 тыс., тромбоциты 194 тыс., лимфоциты 37% в 1 мкл, СОЭ 10 мм/ч. Общий анализ мочи - без патологии. Биохимическое исследование: сахар 4,2 ммоль/л, холестерин 5,0 ммоль/л, белок общий 84,0 г/л, альбумины 48,0 г/л, глобулины 31,9 г/л, общий билирубин 18,4 мкмоль/л, АЛТ 25 Е/л ACT 15 Е/л, щелочная фосфатаза 180 Е/л.

Ультразвуковое исследование брюшной полости: Печень не увеличена, структура однородная, эхогенность равномерная, внутрипеченочные сосуды и желчные ходы не расширены. Селезенка объемом 160 см³ (норма до 200). Желчный пузырь объемом до 34 мл³, размером 7,8 на 3,0 см, стенки не утолщены, уплотнены. В полости конкремент размером 0,4 см, без УЗ-тени. Поджелудочная железа и почки без особенностей.

Эзофагогастродуоденоскопия. Заключение: Поверхностный гастрит.

Рентгеноскопия органов грудной клетки и средостения: Очаговых и инфильтративных изменений не выявлено. Сердце и сосуды в пределах возрастной нормы.

Проведен забор крови из периферической вены и кала на исследование количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот.

Учитывая наличие у больной конкремента в желчном пузыре, ЭХДЗ не проводилось.

При исследовании сыворотки периферической крови выявлены следующие изменения: в качественном составе короткоцепочечных жирных кислот выявлено снижение процента (4,8%) пропионовой (С3) кислоты и повышение процента (4,2%) масляной кислоты (С4), что свидетельствует о нарушении метаболизма ЖК и ХС на печеночном уровне.

При исследовании содержания КЖК в кале выявлено: увеличение процентного содержания С3 и С4 кислот (21,4% и 19,3% соответственно), что свидетельствует о нарушении метаболизма ЖК и ХС на интестинальном уровне.

К проводимому лечению, включающему назначение диеты (стол №5), симптоматическую терапию (обезболивающие и спазмолитические препараты: раствор папаверина 2,0 мл и платифиллина 1,0 мл, в/м 2 раза в сутки), добавлен урсосан 10 мг/кг/сут (750 мг) 1 раз в сутки, вечером в течение 6 месяцев.

На фоне терапии отмечается улучшение общего состояния пациента, купирование болевого синдрома. Назначенный препарат (урсосан) пациентка переносила хорошо. Больная была выписана с рекомендациями по диете и приему урсосана (750 мг/сут.) в течение 6 месяцев. Амбулаторное обследование для контроля за эффективностью лечения через 6 мес.

При контрольном УЗИ: Печень не увеличена, эхоструктура однородная. Внутрипеченочные желчные ходы не расширены. Желчный пузырь нормальных размеров, стенки уплотнены, не утолщены. В полости конкрементов нет. Поджелудочная железа не увеличена, эхогенность не изменена, структура однородная. Почки, селезенка без особенностей.

При контрольном исследовании сыворотки периферической крови отмечается: увеличение процента (6,8%) пропионовой кислоты и снижение процента масляной кислоты (2,7%); при контрольном исследовании кала отмечается снижение процентного содержания С3 и С4 кислот до 19,5% и 18,6% соответственно. Изменения параметров КЖК в кале и сыворотке крови подтверждает эффективность проведенной терапии и свидетельствует о нормализации энтерогепатической циркуляции ЖК и ХС.

Пример 2.

Больной М., 51 года. Диагноз: ЖКБ, физико-химическая стадия. Состояние после правосторонней гемиколэктомии в 1998 г. по поводу рака 2 ст. восходящей части ободочной кишки. Поступил с жалобами: на периодически возникающие ноющие боли в животе и правом подреберье, послабление стула до 2-х раз в день. Из анамнеза известно: считает себя больным в течение года, когда впервые отметил появление периодически возникающих ноющих болей в правом подреберье. Факторы, провоцирующие появление болей, определить затрудняется. Тогда же отметил послабление стула до 4-х раз в день. Неоднократно проходил амбулаторное лечение: диетотерапия (стол №5), спазмолитические (ношпа 1 т. 2 р/день) и обезболивающие препараты (анальгин), холеретики (аллохол 1 т./3 р/день), закрепляющие препараты (имодиум 1 к./2 р/день) с кратковременным положительным эффектом. Настоящее ухудшение в течение последних двух недель, когда участились ноющие боли в правом подреберье. При поступлении: Телосложение нормальное. Рост 180 см, вес 78 кг. Кожные покровы и склеры нормальной окраски. Периферические лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание везикулярное с жестким оттенком. Cor тоны - ясные ритмичные, шумов нет. Живот болезненный при пальпации в правом подреберье, по ходу толстой кишки. Печень не увеличена. Селезенка не пальпируется. Стул кашицеобразный до 4-х раз в день.

Проведенное обследование: общий анализ крови - эритроциты - 4,5 млн., гемоглобин 155 г/л, лейкоциты 8,1 тыс., тромбоциты 310 тыс., лимфоциты 39% в 1 мкл, СОЭ 13 мм/ч. Общий анализ мочи - без патологии. Биохимическое исследование: сахар 3,7 ммоль/л, холестерин 4,9 ммоль/л, белок общий 75,0 г/л, альбумины 50,0 г/л, глобулины 25 г/л, общий билирубин 18,8 мкмоль/л, АЛТ 25 Е/л ACT 27 Е/л, щелочная фосфатаза 195 Е/л.

Ультразвуковое исследование брюшной полости: Печень не увеличена, структура однородная. Желчный пузырь нормальных размеров, стенки уплотнены, содержимое негомогенное, желчь в виде «хлопьев». Поджелудочная железа не увеличена, эхогенность неоднородная. Почки, селезенка без особенностей. Эзофагогастродуоденоскопия. Заключение: Поверхностный гастрит. Очаговый бульбит.

Рентгеноскопия органов грудной клетки и средостения: Очаговых и инфильтративных изменений не выявлено. Сердце и сосуды в пределах возрастной нормы.

Проведен забор крови из периферической вены и кала на исследование количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот.

При исследовании сыворотки крови выявлены следующие изменения: в качественном составе короткоцепочечных жирных кислот выявлено снижение процента (5,1%) пропионовой кислоты при увеличении процента масляной кислоты (3,9%); при исследовании кала выявлено увеличение процентного содержания пропионовой и масляной кислот (23,5 и 24,3% соответственно), что свидетельствует о нарушении метаболизма ЖК и ХС на печеночном (печеночно-клеточном, пузырном) и интестинальном уровнях.

При проведении ЭХДЗ с биохимическим исследованием желчи получены следующие результаты:

Табл. 1порции желчихолевая кислота (моль/л)Холестерин (ммоль/л)Фосфолипиды (ммоль/л)норма норма норма «В»19,48± 0,1312,018,04± 0,7213,43,63± 0,410,6«С»3,76± 0,311,582,38± 0,273,350,38± 0,030,3

Выявлено снижение содержания холевой кислоты в порциях «В» и «С» желчи, повышение уровня холестерина в порции «В» и снижение содержания фосфолипидов в порциях «В» и «С».

К проводимому лечению, включающему назначение диеты (стол №5), была добавлена комбинация препаратов: урсосан в дозе 500 мг/сут вечером и энтеросан 4 капс. на ночь в течение 6 месяцев.

На фоне терапии отмечается улучшение общего состояния пациента, купирование болевого синдрома, нормализация частоты и характера стула.

При контрольном ЭХДЗ отмечается положительная динамика со стороны биохимических показателей желчи порций «В» и «С»:

повышение уровня холевой кислоты до 19,41 ммоль/л и 3,75 ммоль/л соответственно; снижение уровня холестерина до 8,04 (порция «В») и 2,39 ммоль/л (порция «С»); повышение уровня фосфолипидов в порции «В» до 3,01 ммоль/л и в порции «С» 0,3 ммоль/л. Эти данные подтверждают эффективность проведенной комбинированной терапии.

При контрольном ультразвуковом исследовании брюшной полости:

Печень не увеличена, структура однородная. Желчный пузырь нормальных размеров, стенки уплотнены, содержимое гомогенное. Поджелудочная железа не увеличена, эхогенность однородная. Почки, селезенка без особенностей.

При контрольном исследовании сыворотки крови отмечается увеличение процента пропионовой кислоты (6,9%) при снижении процента масляной (2,4%); при контрольном исследовании кала отмечается уменьшение процентного содержания пропионовой и масляной кислот до 19,5 и 18,3% соответственно, что подтверждает эффективность проведенной терапии и свидетельствует о нормализации энтерогепатической циркуляции ЖК и ХС.

Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии, терапии, гепатологии, и может быть использовано для оценки метаболизма желчных кислот и холестерина и коррекции его нарушений при заболеваниях, обусловленных и сопровождающихся нарушениями метаболизма желчных кислот и холестерина. Способ основан на определении количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот фракции С2-С4 в кале и сыворотке периферической крови, позволяющем оценить метаболизм желчных кислот и холестерина на различных уровнях (печеночном, пузырном и интестинальном) и своевременно и доказательно начать терапию. Изобретение позволяет создать неинвазивный способ оценки метаболизма желчных кислот и холестерина на разных уровнях при значительном сокращении времени получения результатов и их высокой воспроизводимости, низкой стоимости исследования. 1 табл.

Способ оценки метаболизма желчных кислот и холестерина, включающий определение концентрации и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот фракции С₂-С₄ в сыворотке крови и кале, при этом изменения относительного содержания пропионовой и масляной кислот, выражающееся в снижении процентного содержания пропионовой с 6,5% и менее и в увеличении масляной кислоты с 2,9% и более в суммарном содержании С₂-С₄ в сыворотке крови, отражают нарушение синтеза холестерина и желчных кислот гепатоцитами и изменения биохимического состава печеночной и пузырной желчи, изменения относительного содержания пропионовой и масляной кислот, выражающееся в увеличении процентного содержания пропионовой с 19,9% и более и в увеличении масляной кислоты с 18,9% и более в суммарном содержании С₂-С₄ в кале, отражают нарушение вторичного обмена холестерина и желчных кислот на интестинальном уровне.