СПОСОБ ДИНАМИЧЕСКОЙ ФИЛЬТРАЦИИ ПОПЕРЕЧНО-СШИТОГО ГИДРОГЕЛЯ Российский патент 2023 года по МПК C08B37/08 C08B37/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[1] Настоящее изобретение относится к способу динамической фильтрации поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера для удаления нежелательных молекул из геля. В частности, настоящее изобретение относится к динамической фильтрации гидрогеля гиалуроновой кислоты с применением конструкции динамической фильтрации с вращающимися и полупроницаемыми фильтрующими дисками.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Гиалуроновая кислота представляет собой естественный для организма полимер, который с некоторого времени применяют в медицине в различных областях, таких как ортопедия и офтальмология. В настоящее время гиалуроновую кислоту все чаще применяют в эстетической медицине и в пластической хирургии. Широкое применение гиалуроновой кислоты связано, в частности, с ее очень высокой связывающей способностью в отношении воды. В водной среде даже при низкой концентрации гиалуроновой кислоты образуются вязкоупругие гели, которые являются биоразлагаемыми и обладают полезными свойствами.

[3] Чистая гиалуроновая кислота относительно быстро разлагается в организме человека. По этой причине молекулы гиалуроновой кислоты часто являются поперечно-сшитыми друг с другом химически, в результате чего разложение сильно снижается, а желаемые эффекты сохраняются в течение периода примерно от шести до двенадцати месяцев. Таким образом, гели поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, среди прочего, часто применяют в эстетической медицине для лечения морщин, коррекции контуров и увеличения объема верхней и нижней губы, улучшения контуров щек и подбородка и для коррекции носа и т.д.

[4] Известные гели гиалуроновой кислоты можно грубо разделить на два различных типа, а именно на однофазные и двухфазные гели. Однофазные гели гиалуроновой кислоты состоят из одной фазы и не содержат частиц. Получение таких однофазных гелей описано, например, в WO 2008/068297, US 8450475, US 8455465, US 7741476 и US 8052990. Известными коммерческими однофазными гелями гиалуроновой кислоты являются, например, Juvéderm^®, Teosyal^®, Glytone Professional^® и однофазные гели гиалуроновой кислоты с двойными поперечными связями, которые известны как Belotero^®, Esthélis^®, Fortélis^® Extra и Modélis^® Shape.

[5] Двухфазные гели гиалуроновой кислоты содержат материал поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты, который диспергирован в жидкой фазе. Такие гели содержат частицы и могут быть получены, как описано, например, в EP 0466300. Коммерчески доступные двухфазные гели представляют собой, например, Hylaform^®, Restylane^® и Perlane^®.

[6] Получение гелей поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты происходит многоступенчатым способом и более подробно описано в WO 2005/085329.

[7] Способы получения гелей на основе полисахаридов, таких как гиалуроновая кислота, дополнительно раскрыты в WO 2014/064633, US 2013/210760, US 2013/203696, WO 2010/115081, WO 2012/062775, WO 2013/185934, WO 2009/077399 и WO 2008/034176.

[8] Традиционные способы диализа гелей гиалуроновой кислоты часто требуют относительно больших затрат времени ручной работы и усилий. Это невыгодно, поскольку качество и воспроизводимость снижаются, а время производства и затраты увеличиваются. Кроме того, риск микробного заражения увеличивается с увеличением продолжительности стадии диализа.

[9] Часто 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE) применяют в качестве поперечно-сшивающего агента для гидрогелей гиалуроновой кислоты. Однако BDDE может быть токсичным, и существует потребность в получении гидрогелей, содержащих меньше нежелательных молекул.

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

[10] Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенного способа удаления нежелательных молекул, которые образуются во время получения поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[11] Настоящее изобретение относится к способу динамической фильтрации поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера с применением устройства динамической фильтрации, которое оснащено полупроницаемым фильтрующим диском (дисками) для удаления нежелательных молекул, включающему стадии: i) концентрирование геля путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар до заданной концентрации; или закачивание геля непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации; ii) проведение диафильтрации для снижения количества нежелательных молекул путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[12] Фигура 1: Сравнение отклонения частоты между гелем, обработанным в соответствии с изобретением («гель DCF»; модуль упругости (G') 200 Па), и гелем, обработанным в соответствии со стандартным способом («стандартный гель»; модуль упругости (G') 216 Па).

1 (пунктирная линия) = гель DCF: G'

2 (непрерывная линия): стандартный гель: G'

3 (пунктирная линия) = гель DCF: G''

4 (непрерывная линия): стандартный гель: G'

5 (пунктирная линия) = гель DCF: комплексная вязкость

6 (непрерывная линия) = стандартный гель: комплексная вязкость

[13] Фигура 2: Сравнение отклонения амплитуды между гелем, обработанным в соответствии с изобретением («гель DCF»; модуль упругости (G') 241 Па), и гелем, обработанным в соответствии со стандартным способом («стандартный гель»; модуль упругости (G') 249 Па). Точка пересечения = точка текучести

1 (пунктирная линия) = гель DCF: G'

2 (непрерывная линия): стандартный гель: G'

3 (пунктирная линия) = гель DCF: G''

4 (непрерывная линия): стандартный гель: G''

[14] Фигура 3:

1: гель DCF: G'

2: гель DCF G''

3: гель DCF: комплексная вязкость

[15] Фигура 4: Отклонение частоты геля в соответствии с примером 3 / испытание 4

непрерывная линия с треугольником ▲: модуль потерь G''

непрерывная линия с квадратом■: модуль упругости G'

непрерывная линия с кругом●: комплексная вязкость [η*]

[16] Фигура 5: Отклонение амплитуды геля в соответствии с примером 3 / испытание 4

непрерывная линия с треугольником ▲: модуль потерь G''

непрерывная линия с квадратом■: модуль упругости G'

точка пересечения G'' = G': напряжение сдвига 440 Па; модуль упругости 54 Па

[17] Фигура 6: Отклонение частоты геля в соответствии с примером 3 / испытание 5

непрерывная линия с треугольником ▲: модуль потерь G''

непрерывная линия с квадратом■: модуль упругости G'

непрерывная линия с кругом ●: комплексная вязкость [η*]

[18] Фигура 7: Отклонение амплитуды геля в соответствии с примером 3 / испытание 5

непрерывная линия с треугольником ▲: модуль потерь G''

непрерывная линия с квадратом ■: модуль упругости G'

точка пересечения G'' = G': напряжение сдвига 350 Па; модуль упругости 98 Па

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[19] Настоящее изобретение будет легче понять, обратившись к нижеследующему подробному описанию настоящего изобретения и включенному в него примеру.

[20] В настоящем документе термин «устройство динамической фильтрации» относится к средствам, в которых применяется полый фильтрующий элемент в форме пластины или диска, который установлен с возможностью перемещения на полом валу. За счет относительного движения элемента в фильтруемой среде возникает турбулентность, в результате чего поверхность фильтрующего элемента очищается. Такое фильтрующее устройство описано, например, в WO 00/47312. Вращающийся фильтрующий элемент позволяет устранить связь скорости переливания и трансмембранного давления (TMP). Комбинация центробежных и сдвиговых сил в модулях динамической фильтрации улучшает контроль нарастания покровного слоя. Применение данной технологии снижает образование закупоривающего слоя. Кроме того, относительное движение обеспечивает перемешивание ретентата в фильтрующем аппарате. Такое устройство динамической фильтрации можно приобрести у разных компаний, например у Andritz AG (головной офис в Граце, Австрия). Ключевым элементом устройства динамической фильтрации является мембранный диск. Его диаметр, количество дисков и расположение могут меняться в зависимости от предполагаемого масштаба.

[21] Согласно настоящему изобретению, способ динамической фильтрации можно применять для различных поперечно-сшитых гидрогелей на основе биополимеров (далее также называемых «гидрогелями»). Способы получения поперечно-сшитых гидрогелей на основе биополимеров хорошо известны в данной области техники, например, получение гелей поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты описано в WO 2005/085329 A1. Дополнительные способы получения гелей на основе полисахаридов раскрыты в WO 2014/064633, US 2013/210760, US 2013/203696, WO 2010/115081, WO 2012/062775, WO 2013/185934, WO 2009/077399 и WO 2008/034176.

[22] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу динамической фильтрации поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера, включающему стадии:

а) переноса поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера в устройство динамической фильтрации, которое оснащено полупроницаемым фильтрующим диском (дисками), и диафильтрации геля, включающей стадии:

i) концентрирования геля путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар до заданной концентрации; или закачивание геля непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации;

II) проведения диафильтрации для снижения количества нежелательных молекул путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар;

b) необязательно добавления к гелю смеси, содержащей несшитый полимер, в частности несшитую гиалуроновую кислоту, и воду.

[23] В настоящем документе термин «диафильтрация» применяют для обозначения непрерывной диафильтрации (также называемой диафильтрацией постоянного объема), которая включает вымывание исходных буферных солей или других низкомолекулярных частиц в ретентате (образце) путем добавления воды или нового буфера к ретентату со скоростью фильтрации.

[24] В настоящем документе термин «нежелательные молекулы» относится к нереагирующим или несвязанным полимерным поперечно-сшивающим молекулам (например, BDDE) и продуктам их разложения.

[25] Неожиданно было обнаружено, что способ согласно настоящему изобретению в значительной степени удаляет нежелательные молекулы из геля, в то время как структурная стабильность геля сохраняется, несмотря на напряжение сдвига, возникающее вследствие вращающихся фильтровальных дисков. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что необходимое время процесса и необходимое количество буфера для осуществления способа согласно настоящему изобретению были значительно сокращены по сравнению с традиционны диализом. Еще одно преимущество способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что скорость потока увеличивается (от двух до десяти раз) по сравнению с традиционной фильтрацией с поперечным потоком, и что ретентат может быть более концентрированным. Данные преимущества приводят к усовершенствованному способу удаления нежелательных молекул из поперечно-сшитых и высоковязких гидрогелей.

[26] Гидрогель на основе биополимера состоит из биологически разлагаемого полимера, например: гиалуроновой кислоты, гепарозана, альгината, пектина, геллановой камеди, хондроитинсульфата, кератана, кератансульфата, гепарина, гепаринсульфата, целлюлозы, хитозана, каррагинана, ксантана, их солей или производных или их комбинаций. Термин «гиалуроновая кислота» применяют как синоним термина «гиалуронан».

[27] Хотя далее настоящее изобретение описано с помощью гидрогеля гиалуроновой кислоты, это не означает, что настоящее изобретение каким-либо образом ограничивается гидрогелем гиалуроновой кислоты. Скорее, любой гидрогель на основе биополимера можно применять вместо гидрогеля гиалуроновой кислоты, в частности гидрогели, которые изготовлены из одного из вышеупомянутых типичных полимеров.

[28] Гидрогель на основе биополимера сшивают с помощью химического сшивающего агента, и гидрогель содержит избыток использованного химического сшивающего агента. Избыток химического сшивающего агента удаляют из гидрогеля способом согласно настоящему изобретению. Кроме того, другие нежелательные молекулы также могут быть удалены из гидрогеля способом согласно настоящему изобретению.

[29] Термин «поперечно-сшивающий агент» включает все соединения, содержащие по меньшей мере две группы, которые способны взаимодействовать с одной или более функциональными группами гидрогеля на основе биополимера и поперечно сшивать их, например, с гидроксильными группами. Подходящие группы поперечно-сшивающего агента для поперечной сшивки могут быть выбраны из карбоксильных, эпоксидных, галогеновых, винильных, изоцианатных или защищенных изоцианатных групп. Примеры соединений, которые можно применять в качестве поперечно-сшивающего агента, представляют собой, например, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE), поливинилсилан (PVS), поперечно-сшивающие агенты на основе PEG, дивинилсульфон (DVS). В конкретных вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению удаляет несвязанный или избыточный 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (BDDE) и/или другие нежелательные молекулы из гидрогеля.

[30] Предпочтительно, чтобы поперечно-сшитый гидрогель на основе биополимера (в частности, гидрогель, полученный из гиалуроновой кислоты) имел начальную концентрацию в диапазоне от 10 до 70 мг/г, предпочтительно от 20 до 50 мг/г. В рамках настоящего изобретения концентрация поперечно-сшитого гидрогеля означает количество биополимера (указанное в мг) в расчете на общее количество гидрогеля (указанное в г). Обычно начальная концентрация представляет собой концентрацию гидрогеля, который переносят в устройство динамической фильтрации на стадии а) и который необязательно концентрируют или закачивают непосредственно в рабочую камеру на стадии i).

[31] В другом варианте реализации настоящего изобретения гидрогель может быть разбавлен (например, с применением буферного раствора, применяемого при диафильтрации) перед его переносом в устройство динамической фильтрации, например, для облегчения заполнения, и предпочтительно концентрирован на необязательной стадии i) перед диафильтрацией. Предпочтительно гидрогель концентрируют на необязательной стадии i), начиная с концентрации гидрогеля в диапазоне от 3 до 30 мг/г, предпочтительно от 5 до 20 мг/г, более предпочтительно от 5 до 10 мг/г.

[32] Предпочтительно гидрогель концентрируют на необязательной стадии i) до достижения желаемой концентрации и по большей мере до максимальной концентрации 70 мг/г. В частности, концентрация гидрогеля после необязательной стадии концентрирования i) находится в диапазоне от 10 до 70 мг/г, предпочтительно от 20 до 50 мг/г, более предпочтительно от 20 до 35 мг/г.

[33] Предпочтительно диафильтрацию на стадии ii) проводят при концентрации гидрогеля в диапазоне от 10 до 70 мг/г, предпочтительно от 20 до 50 мг/г, более предпочтительно от 20 до 35 мг/г, также предпочтительно от 23 до 70 мг/г. Обычно концентрацию гидрогеля (в частности, гидрогеля из гиалуроновой кислоты) поддерживают почти на том же уровне во время стадии диафильтрации ii).

[34] Предпочтительно диафильтрацию на стадии ii) проводят до тех пор, пока количество нежелательных молекул (таких как BDDE) в гидрогеле не станет ниже предела количественного определения. Например, диафильтрацию на стадии ii) проводят в течение периода от 1 до 8 часов, предпочтительно от 2 до 6 часов.

[35] Предпочтительно диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением буферного раствора, предпочтительно фосфатного буферного раствора, например буферного раствора на основе фосфата натрия, такого как Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄. В частности, диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением буферного раствора, имеющего значение pH в диапазоне от 6 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5.

[36] Предпочтительно гидрогель концентрируют на стадии i) с применением скорости вращения в диапазоне от 70 1/мин до 500 1/мин, предпочтительно от 70 1/мин до 300 1/мин, более предпочтительно от 100 1/мин до 300 1/мин. Предпочтительно гидрогель концентрируют на стадии i) с применением избыточного давления в диапазоне от 1 до 3 бар.

[37] Предпочтительно диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением скорости вращения в диапазоне от 70 1/мин до 500 1/мин, предпочтительно от 70 1/мин до 300 1/мин, более предпочтительно от 100 1/мин до 300 1/мин. Предпочтительно диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением избыточного давления в диапазоне от 1 до 3 бар.

[38] В конкретных вариантах реализации устройство динамической фильтрации, которое применяют в способе согласно настоящему изобретению, оснащено полупроницаемым фильтрующим диском (дисками) с размером пор от 5 нм до 2 мкм, в частности с размером пор от 30 нм до 600 нм, более конкретно с размером пор от 80 нм до 300 нм, в частности, с размером пор от 5 нм до 60 нм.

[39] В конкретных вариантах реализации устройство динамической фильтрации, которое применяют в способе согласно настоящему изобретению, оснащено одним или более полупроницаемым фильтрующим диском (дисками). В предпочтительном варианте реализации устройство динамической фильтрации оснащено полупроницаемыми фильтровальными дисками в количестве от 1 до 10, предпочтительно от 4 до 6. Полупроницаемые фильтрующие диски могут иметь одинаковые или разные размеры. Неожиданно было обнаружено, что количество полупроницаемых фильтрующих дисков может быть увеличено до 10 или предпочтительно до 6 без отрицательного воздействия на вязкость и поперечно-сшитую структуру гидрогеля. Обычно сдвиговые силы возрастают с увеличением количества дисков и скорости вращения.

[40] В конкретных вариантах реализации устройство динамической фильтрации оснащено полупроницаемым фильтрующим диском (дисками), который изготовлен из керамики, металла или полимерного материала.

[41] В конкретных вариантах реализации гидрогель на основе биополимера получают из гиалуроновой кислоты, и гель концентрируют путем применения скорости вращения в диапазоне от примерно 20 1/мин до 150 1/мин и давления в диапазоне примерно от 0,5 до 2 бар до конечной концентрации от 10 до 30 мг/г, и при этом диафильтрацию проводят с применением скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 150 1/мин и давления в диапазоне от 0,5 до 2 бар.

[42] В предпочтительном варианте реализации гидрогель на основе биополимера получают из гиалуроновой кислоты, диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин, предпочтительно от 70 до 300 1/мин и давления в диапазоне от 0,5 до 3 бар, предпочтительно от 1 до 3 бар, и диафильтрацию на стадии ii) проводят при концентрации гидрогеля в диапазоне от 10 до 70 мг/г, предпочтительно от 20 до 50 мг/г, более предпочтительно от 20 до 35 мг/г.

[43] В предпочтительном варианте реализации гидрогель на основе биополимера получают из гиалуроновой кислоты, гель закачивают непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации на стадии (i) (т.е. без необязательной стадии концентрирования) и на стадии ii) проводят диафильтрацию с применения скорости вращения в диапазоне от 70 1/мин до 500 1/мин, предпочтительно от 70 до 300 1/мин, и давления в диапазоне от 1 до 3 бар, при этом диафильтрацию на стадии ii) проводят при концентрации гидрогеля в диапазоне от 10 до 70 мг/г, предпочтительно от 20 до 35 мг/г, и при этом устройство динамической фильтрации оснащено полупроницаемыми фильтрующими дисками в количестве от 1 до 10, предпочтительно от 4 до 6.

[44] Во время или после диафильтрации гидрогеля к гелю могут быть добавлены дополнительные вещества, например: соли, буферные вещества, витамины (например, витамин E, C, B6), антиоксидант (например, аскорбиновая кислота или ее производные, оксид цинка), полиолы (например, глицерин, маннит), частицы трикальцийфосфата (например, частицы альфа- и бета-трикальцийфосфата и гидроксиапатита), агенты (например, анестетики, противовоспалительные агенты, агенты, снижающие стимуляцию, сосудосуживающие агенты или сосудорасширяющие агенты, антикоагулянты, вещества, обеспечивающие влажность, иммунодепрессанты, антибиотики и т.д.), а также факторы роста, пептиды или белки (например, нейротоксины). В частности, к гелю может быть добавлен анестетик, такой как лидокаин. Предпочтительно лидокаин содержится в геле в концентрации от 0,05 до 5,0% масс., от 0,1 до 2,0% масс., от 0,1 до 1,0% масс., от 0,1 до 0,5% масс., от 0,1 до 0,4% масс., от 0,2 до 0,4% масс. или от 0,2 до 0,3% масс. в расчете на общую массу композиции.

[45] Предпочтительно необязательное концентрирование на стадии i) и/или диафильтрацию на стадии ii) проводят при температуре в диапазоне от 15°C до 80°C, предпочтительно от 20°C до 70°C.

[46] В предпочтительном варианте реализации диафильтрацию на стадии ii) и необязательно стадию i) концентрирования проводят при температуре в диапазоне от 60°C до 70°C, предпочтительно при температуре в диапазоне от 60°C до 70°C и в течение периода времени от 2 до 4 часов (например, 3,5 часов). В частности, температура в диапазоне от 60°C до 70°C является предпочтительной вследствие пониженной вязкости гидрогеля.

[47] В конкретных вариантах реализации на стадии а) гель дополнительно подвергают термической обработке для снижения количества нежелательных молекул, при этом 60°C применяют в течение не более четырех часов.

[48] Устройство динамической фильтрации может содержать средство стерилизации, предпочтительно чистый пар, для ополаскивания устройства и/или канала паром, стерилизационную жидкость, в частности промывочную жидкость, предпочтительно фильтрованную воду и/или стерилизованный воздух, не содержащий частиц. Средство стерилизации может содержать блок подачи, содержащий стерилизационную жидкость, и блок хранения стерилизационной жидкости.

[49] В конкретных вариантах реализации гель стерилизуют в устройстве динамической фильтрации при температуре от 121°C до 135°C с временем выдержки примерно от 2 до 30 минут.

[50] В конкретных вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению осуществляют менее чем за 10 часов, в частности менее чем за 5 часов.

[51] Способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать следующие стадии:

i) дегазации геля для удаления пузырьков воздуха под вакуумом (от 20 до 200 мбар),

II) заполнения гелем шприцов,

iii) стерилизации геля в шприце нагреванием в автоклаве.

[52] В другом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю на основе биополимера, который может быть получен способом согласно настоящему изобретению.

[53] В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера, полученного способом согласно настоящему изобретению, для эстетического применения, в частности для увеличения (наращивания) мягких тканей.

ПРИМЕРЫ

[54] Далее способ согласно настоящему изобретению описан более подробно.

Пример 1: Способ, включающий стадию разбавления, концентрирования и диафильтрации геля

[55] Гидрогель гиалуроновой кислоты, поперечно-сшитый посредством BDDE (см., например, WO 2005/085329) и имеющий начальную концентрацию 24 мг/г, разбавляли в диапазоне от 1:4 до 1:8 с применением буфера, содержащего Na2HPO4*2H2O: 0,994 г/л; NaH2PO4*2H2O: 0,51 г/л; Маннит: 42 г/л и воду для инъекций. Разбавленный гель переносили в емкость, соединенную со входом устройства динамической фильтрации через трубу или трубку. Устройство динамической фильтрации состояло из динамического фильтра поперечного потока DCF 152/S Krauss Maffei (Andritz AG), имеющего один фильтрующий диск (площадь фильтрации 0,034 м², диаметр 152 мм и размер пор 7 нм), одной емкости в качестве резервуара для геля и второй емкости в качестве емкости для буфера. Оба контейнера подключали к входному отверстию DCF 152/S через трубопровод и шаровой клапан для выбора соответствующей среды на различных стадиях способа. Двойную рубашку корпуса DCF 152/S соединяли с охлаждающим термостатом для поддержания заданной температуры в двойной рубашке 20°C. Фильтрат DCF 152/S собирали в емкость, помещенную на весы для определения количества фильтрата. Применяли следующие стадии:

i) концентрирование геля путем приложения давления (1,5 бар) к закрытой емкости с гелем, содержащей разбавленный гель, открытие пути к входному отверстию DCF 152/S и удаление фильтрата с помощью фильтрующих дисков и полого вала (см. WO 00/47312). Фильтрующий диск вращался со скоростью 150 об/мин. Гель концентрировали до тех пор, пока концентрация гиалуроновой кислоты в геле не составила 24 мг/г.

ii) проведение диафильтрации с буферным раствором, содержащим Na₂HPO₄*2H₂O: 0,994 г/л; NaH₂PO₄*2H₂O: 0,51 г/л; Маннит: 42 г/л и воду для инъекций путем приложения давления (1,5 бар) к закрытой емкости для буфера, содержащей буфер, открытие пути к входному отверстию DCF 152/S и удаление фильтрата через фильтрующие диски и полый вал (см. WO 00/47312). Буферный раствор может содержать лидокаин (0,27-0,33% масс.). В качестве альтернативы после диафильтрации можно добавлять лидокаин. Фильтрующий диск вращался со скоростью 150 об/мин. Гель фильтровали до тех пор, пока уровень BDDE не составлял ниже предела количественного определения.

[56] Количество BDDE определяли по следующему способу:

1. Подготовка образца:

а. Ферментативное разрушение ГК

ГК подвергали разрушению посредством добавления раствора гиалуронидазы и последующей инкубации в течение от 1 до 4 часов при легком встряхивании до снижения вязкости.

b. Экстракция BDDE

BDDE экстрагировали из разрушенного образца (описанного в а) добавлением этилацетата (5% об./об.) и орбитальным встряхиванием в течение 20 мин при 400 об/мин. Раствор центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин для разделения органической и водной фаз. Органическую фазу, содержащую BDDE, переносили в пробирку для ГХ.

2. Газохроматографическое определение

а. 5 мкл образца (описанного в пункте 1b) вводили в ГХ (инжектор с делением потока, соотношение деления потока 1:5, 250°C) и разделяли на колонке DB-1 (Agilent DB-1, 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, пленка 0,25 мкм) с линейным изменением температуры 100°C - 40°C/мин - 280°C и окончательной выдержкой при 280°C в течение 30 секунд. В качестве детектора применяли ПИД.

b. Оценку данных проводили по способу внутреннего стандарта в соответствии с главой 2.2.46 Европейской фармакопеи.

Результат одного эксперимента согласно Примеру 1 показан в следующей таблице 1:

Таблица 1: Диск
[нм] Давление
[бар] Т [°C] Продолжительность
[ч:м] BDDE в геле
Начальное содержание BDDE
[ppm] BDDE DCF
Конечное содержание BDDE
[ppm] 7 1,5 20 6:00 > 150 ниже предела количественного определения (LOQ)

[57] Структурную стабильность геля поддерживали во время осуществления способа согласно настоящему изобретению, как видно из фигуры 1, на которой показано сравнение двух различных гелей. Один гель обрабатывали согласно настоящему изобретению («гель DCF»), и другой гель обрабатывали стандартным способом («стандартный гель»).

[58] Непрерывные линии представляют собой характеристическую динамику G', G'' и η геля после диализа, который был получен в соответствии со стандартным способом, тогда как пунктирные линии представляют характеристическую динамику геля, который был обработан согласно настоящему изобретению.

[59] Очевидно, что не было никаких существенных различий в отношении динамики кривой, показанной в частотном тесте, который обычно применяют для характеризации гелей. Кривые, относящиеся к гелю согласно настоящему изобретению, немного ниже кривых, относящихся к стандартному гелю, поскольку концентрация ГК в геле немного ниже. Что касается структурной стабильности геля, параллельное увеличение G' и G'' (G' > G'') ясно указывает на то, что гель сохранил свою поперечно-сшитую структуру во время способа согласно настоящему изобретению.

[60] Кроме того, на фигуре 2 показано, что точки текучести обоих гелей («гель DCF» и стандартный гель»; см. выше) идентичны, что дополнительно указывает на то, что структурная стабильность геля, обработанного в соответствии с настоящим изобретением, сохранялась.

Пример 2: Способ диафильтрации геля без стадии разбавления геля

[61] Гидрогель гиалуроновой кислоты, поперечно-сшитый посредством BDDE (см., например, WO 2005/085329) и имеющий концентрацию 32-35 мг/г, закачивали непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации. Гель содержал 226,8 ppm несвязанного BDDE. Устройство динамической фильтрации состояло из динамического фильтра поперечного потока DCF 152/S Krauss Maffei (Andritz AG), имеющего один фильтрующий диск (площадь фильтрации 0,034 м², диаметр 152 мм и размер пор 5 нм), одной емкости в качестве резервуара для геля и второй емкости в качестве емкости для буфера. Обе емкости подключали к входному отверстию DCF 152/S через трубопровод и шаровой клапан для выбора соответствующей среды на различных стадиях способа. Двойную рубашку корпуса DCF 152/S соединяли с охлаждающим термостатом для поддержания заданной температуры в двойной рубашке 20°C. Фильтрат DCF 152/S собирали в емкость, помещенную на весы для определения количества фильтрата. Применяли следующую стадию:

i) проведение диафильтрации с буферным раствором, содержащим Na₂HPO₄*2H₂O: 5,96 г/л; NaH₂PO₄*2H₂O: 2,57 г/л; NaCl: 2,29 г/л и воду для инъекций, путем приложения давления (1,5 бар) к закрытой емкости для буфера, содержащей буфер, открытие пути к входному отверстию DCF 152/S и удаление фильтрата через фильтрующие диски и полый вал (см. WO 00/47312). Буферный раствор может содержать лидокаин (0,27 - 0,33% масс.). В качестве альтернативы после диафильтрации можно добавлять лидокаин. Фильтрующий диск вращался со скоростью 150 об/мин (1/мин). Гель фильтровали до тех пор, пока количество несвязанного BDDE не составляло ниже предела количественного определения (LOQ). Количество BDDE определяли, как описано выше (см. пример 1). Способ динамической фильтрации осуществляли в течение 2 часов и 1 минуты.

Результаты дополнительных экспериментов представлены в следующей таблице 2:

Таблица 2: Испытание Диск
[нм] Давление
[бар] Т
[°C] Продолжительность [ч:м] BDDE в геле
Начальное содержание BDDE [ppm] BDDE DCF
Конечное содержание BDDE [ppm] 1 5 1,5 20 03:17 226,8 ниже предела количественного определения (LOQ) 2 30 1,5 20 02:18 226,8 ниже LOQ 3 2000 1,5 20 02:01 226,8 ниже LOQ

[62] Еще один пример того факта, что структурная стабильность геля сохранялась во время способа согласно настоящему изобретению, можно увидеть на фигуре 3. После применения способа согласно примеру 2 гель анализировали с помощью частотного теста, который обычно применяют для характеризации гелей. Применяемый частотный диапазон составлял от 0,1 до 10 Гц. Параллельное увеличение G' и G'' (G' > G'') ясно указывает на то, что гель («гель DCF») сохранил свою поперечно-сшитую структуру во время способа согласно примеру 2.

Пример 3: Способ диафильтрации геля без стадии разбавления геля и с применением устройства динамической фильтрации с шестью фильтрующими дисками

[63] Пример 3 осуществляли в соответствии с примером 2, описанным выше, с той разницей, что применяемое устройство динамической фильтрации представляло собой динамический фильтр поперечного потока Krauss Maffei DCF 152/S (Andritz AG) с шестью (вместо одного, как в примерах 1 и 2) фильтрующими дисками (площадь фильтрации 0,034 м², диаметр 152 мм и размер пор 5 нм). Гидрогель гиалуроновой кислоты, поперечно-сшитый посредством BDDE (см., например, WO 2005/085329) и имеющий концентрацию 66 мг/г, разбавляли с коэффициентом 1:2 с применением буферного раствора, как описано в примерах 1 и 2. Гидрогель гиалуроновой кислоты, имеющий концентрацию примерно 33 мг/г, закачивали непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации. Гель содержал 226,8 ppm несвязанного BDDE.

[64] Диафильтрацию проводили, как описано в примере 2, при этом различные условия способа приведены в таблице 3. Диафильтрацию проводили до тех пор, пока уровень BDDE не составлял ниже предела количественного определения и обычно до тех пор, пока объем фильтрата не превысил в семь раз объем камеры устройства фильтрации.

Таблица 3 Испытание Размер пор диска [нм] Количество дисков Давление
[бар] Скорость вращения
[1/мин] Т [°C] Продолжительность
[ч:м] BDDE в геле
[ppm] BDDE DCF [ppm] 4 5 6 2 177 45 04:23 226,8 ниже LOQ 5 5 6 3 77 70 07:50 226,8 ниже LOQ

LOQ: предел количественного определения;

BDDE в геле: начальное содержание BDDE;

BDDE DCF: Конечное содержание BDDE в гидрогеле после фильтрации.

[65] Структурную стабильность геля поддерживали во время осуществления способа DCF согласно испытаниям 4 и 5 согласно примеру 3, как показано на фигурах 4 (испытание 4) и 5 (испытание 5). После применения способа согласно примеру 3 гели анализировали с помощью частотного теста, который обычно применяют для характеризации гелей. Применяемый частотный диапазон составлял от 0,1 до 10 Гц. Параллельное увеличение G' и G'' (G' > G'') ясно указывает на то, что гели сохранили свою поперечно-сшитую структуру во время способа согласно примеру 3 (испытания 4 и 5).

[66] Неожиданно было обнаружено, что увеличение количества фильтрующих дисков, а также скорости вращения по сравнению с примером 2 не оказывают отрицательного влияния на структуру гидрогеля (т.е. сохраняется поперечно-сшитая структура). Обычно сдвиговые силы возрастают с увеличением количества дисков и скорости вращения.

Настоящее изобретение относится к способу динамической фильтрации гидрогеля на основе поперечно-сшитого биополимера для удаления нежелательных молекул из геля. Способ динамической фильтрации поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера включает перенос поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера в устройство динамической фильтрации, которое оснащено одним или более полупроницаемыми фильтрующими дисками, и диафильтрацию геля. Диафильтрация геля включает концентрирование геля путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар до заданной концентрации или закачивания геля непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации, проведение диафильтрации для снижения количества нежелательных молекул, включающих нереагирующие или несвязанные полимерные поперечно-сшивающие молекулы и продукты их разложения, путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар. Далее необязательно добавляют к гелю смесь, содержащую несшитый полимер, в частности несшитую гиалуроновую кислоту, и воду. Причем гидрогель на основе биополимера изготовлен из биологически разлагаемого полимера, выбранного из гиалуроновой кислоты, гепарозана или их солей или производных или их комбинаций. Гидрогель на основе биополимера сшивают посредством химического поперечно-сшивающего агента, содержащего по меньшей мере две группы, которые способны взаимодействовать с одной или более функциональными группами гидрогеля на основе биополимера. Изобретение направлено на удаление нежелательных молекул из геля при сохранении структурной стабильности геля. 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Способ динамической фильтрации поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера, включающий следующие стадии:

а) переноса поперечно-сшитого гидрогеля на основе биополимера в устройство динамической фильтрации, которое оснащено одним или более полупроницаемыми фильтрующими дисками, и диафильтрации геля, включающей стадии:

i) концентрирования геля путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар до заданной концентрации; или закачивания геля непосредственно в рабочую камеру устройства динамической фильтрации;

ii) проведения диафильтрации для снижения количества нежелательных молекул, включающих нереагирующие или несвязанные полимерные поперечно-сшивающие молекулы и продукты их разложения, путем применения скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и избыточного давления в диапазоне от 0,5 до 6 бар;

b) необязательно добавления к гелю смеси, содержащей несшитый полимер, в частности несшитую гиалуроновую кислоту, и воду;

где гидрогель на основе биополимера изготовлен из биологически разлагаемого полимера, выбранного из гиалуроновой кислоты, гепарозана или их солей или производных или их комбинаций; и

где гидрогель на основе биополимера сшивают посредством химического поперечно-сшивающего агента, содержащего по меньшей мере две группы, которые способны взаимодействовать с одной или более функциональными группами гидрогеля на основе биополимера.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гидрогель содержит избыток химического поперечно-сшивающего агента, причем избыток химического поперечно-сшивающего агента и/или другие нежелательные молекулы, включающие нереагирующие или несвязанные полимерные поперечно-сшивающие молекулы и продукты их разложения, удаляют.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что один или более полупроницаемых фильтрующих дисков имеют размер пор от 5 нм до 2 мкм, в частности размер пор от 30 нм до 600 нм, в частности размер пор от 80 нм до 300 нм, в частности размер пор от 5 нм до 60 нм.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что устройство динамической фильтрации оснащено полупроницаемыми фильтрующими дисками в количестве от 1 до 10.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что один или более полупроницаемых фильтрующих дисков изготовлены из керамики, металла или полимерного материала.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что гидрогель поперечно сшивают посредством BDDE, и гидрогель содержит избыток BDDE, при этом избыток BDDE и/или других нежелательных молекул, включающих нереагирующие или несвязанные полимерные поперечно-сшивающие молекулы и продукты их разложения, удаляют.

7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что гидрогель на основе биополимера изготовлен из гиалуроновой кислоты, диафильтрацию на стадии ii) проводят с применением скорости вращения в диапазоне от 20 1/мин до 500 1/мин и давления в диапазоне от 0,5 до 3 бар, и диафильтрацию на стадии ii) проводят при концентрации гидрогеля в диапазоне от 10 до 70 мг/г.

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что во время или после диафильтрации к гелю добавляют анестетик.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что во время или после диафильтрации к гелю добавляют лидокаин.

10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что диафильтрацию на стадии ii) и, необязательно, на стадии i) концентрирования проводят при температуре в диапазоне от 60°C до 70°C и в течение периода времени от 2 до 4 часов.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что гель стерилизуют в устройстве при температуре от 121°C до 135°C с временем выдержки примерно от 2 до 30 минут.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что способ выполняют менее чем за 10 часов, в частности менее чем за 5 часов.