МОДИФИЦИРОВАННАЯ АЛЬДЕГИДОМ ГИАЛУРОНОВАЯ КИСЛОТА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C08B37/08 C08J3/75 C08L5/08 A61K8/73 

Настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, способам его получения и его применению. Новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[1] Инъекционные филлеры сегодня используют для многих терапевтических и эстетических целей для увеличения объема мягких тканей. В эстетической медицине кожные филлеры все больше используют для омоложения лица и некоторых зон тела. Они обеспечивают возможность улучшения черт лица (например, щек и губ), уменьшения морщин (например, носогубных складок) и складок, а также могут восстанавливать часть утраченного объема и эластичности кожи и подлежащих тканей, которые возникают с возрастом. Это делает кожу более гладкой и объемной и, таким образом, кожа выглядит моложе.

[2] Для применения в качестве филлеров для мягких тканей известно множество материалов. Большинство указанных материалов оказывают временный эффект (примерно от трех до восемнадцати месяцев), поскольку они ресорбируются в организме (например, коллаген, гиалуроновая кислота (HA), поли-L-молочная кислота (PLLA)). Также существует небольшое количество перманентных (т.е. неабсорбируемых) филлеров, таких как одобренный FDA материал-филлер на основе полиметилметкарилатных гранул (микросфер PMMA). Некоторые из известных филлеров для мягких тканей содержат лидокаин (местный анестезирующий агент), который добавляют для облегчения боли или дискомфорта, связанных с инъекцией.

[3] Сегодня наиболее распространенным материалом, используемым в наполнителях для мягких тканей во всем мире, является гиалуроновая кислота (HA). Это обусловлено ее превосходной способностью создавать объем и благоприятным профилем безопасности. HA представляет собой природный гликозаминогликан, присутствующий во внеклеточном матриксе, например, дермы, и состоит из чередующихся остатков β-D-(1→3) глюкуроновой кислоты (GlcUA) и β-D-(1→4)-N-ацетилглюкозамина (GIcNAc). HA может соединяться с водой и набухать с образованием геля, создавая эффект разглаживания/наполнения. В большинстве случаев HA, используемая в кожных филлерах, является поперечно-сшитой для продления ее действия в организме (до восемнадцати месяцев).

[4] В данной области техники известны различные подходы к поперечному сшиванию для ковалентного связывания полимерных цепей молекул полисахаридов (например, HA) друг с другом с образованием матрицы материала-филлера с меж- и внутримолекулярными поперечными связями. Широко используемый подход заключается в химическом сшивании с применением химических агентов. Указанные агенты обычно взаимодействуют с гидроксильными и/или карбоксильными функциональными группами полисахарида. Традиционно используемые сшивающие агенты включают, без ограничения, DVS (дивинилсульфон), ди- или полифункциональные эпоксиды (например, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (BDDE)), 1,2-бис(2,3-эпоксипропокси)этилен (EGDGE) и 1,2,7,8-диэпоксиоктан (DEO)), сшивающие агенты на основе ПЭГ (например, тетраглицидиловый эфир пентаэритрита (PETGE)), бискарбодиимиды (BCDI) (например, фениленбис-(этил)-карбодиимид и 1,6-гексаметиленбис-(этилкарбодиимид)), диаминные или полиаминные сшивающие агенты (например, гексаметилендиамин (HMDA) и 3-[3-(3-аминопропокси)-2,2-бис(3-аминопропоксиметил)пропокси]пропиламин (4 AA)), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), 1-(2,3-эпоксипропил)-2,3-эпоксициклогексан, эпихлоргидрин, альдегиды (например, формальдегид и глутаральдегид) и гидразиды (бис-, трис- и поливалентные гидразиддные соединения, например, дигидразид адипиновой кислоты (ADH)).

[5] Другие способы, которые используют для поперечного сшивания инъекционных гидрогелей полисахаридов, включают применение метакрилированных полимеров для фотохимического сшивания (Möller et al., Int. J. Artif. Organs 2011, 34:93-102), поперечного сшивания с присоединением Михаэля (Shu et al., Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311), поперечного сшивания по реакции с основанием Шиффа (Tan et al., Biomaterials 2009, 30:2499-2506), подходов «клик»-химии с применением реакций типа тиоленового взаимодействия или азид-алкинового циклоприсоединения (Hoyle et al., Chem. Soc. Rev. 2010, 39:1355-1387; van Dijk et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20:2001-2016). В данной области техники известны также фото-сшитые филлеры на основе полисахаридов для наполнения мягких тканей (см., например, US 2011/069475). Кроме того, в данной области техники изучена этерификация карбоксильных функциональных групп кислотных полисахаридов с гидроксильными группами молекул тех же или других полисахаридов с образованием «внутренних» меж- и/или внутримолекулярных поперечных связей на основе сложного эфира (упоминаемых как «ауто-сшитый полимер» или «ACP»). Кроме того, в US 2006/0084759 описан тирамин-модифицированный и поперечно-сшитый материал гидрогеля HA, в котором поперечное сшивание обеспечено дитираминовыми связями, опосредованными пероксидазой, которое может происходить in vivo.

[6] Наиболее широко распространенным подходом к получению поперечно-сшитых филлеров является осуществление сшивания с помощью BDDE. Однако BDDE и продукты его разложения являются низкомолекулярными соединениями, которые вредны с токсикологической точки зрения и, следовательно, их необходимо тщательно удалять из готового продукта. Верхний предел содержания BDDE в кожных филлерах (для большинства рынков) составляет менее 2 м.д. Таким образом, необходимо удостовериться, что по существу все молекулы BDDE (и продукты его разложения) удалены из продукта. Следовательно, важной, но и весьма трудоемкой частью процесса получения филлера, сшитого с помощью BDDE, является его очистка после поперечного сшивания. Широко используемой технологией очистки является диализ. Однако даже несмотря на то, что диализ весьма эффективен для удаления нежелательных токсичных примесей (т.е. BDDE и продуктов его разложения), он является весьма трудоемким, т.е. часто занимает до нескольких дней. Таким образом, получение филлеров, сшитых с помощью BDDE, состоит из множества достаточно сложных технологических стадий, занимающих много времени, обычно несколько дней, что существенно увеличивает стоимость готового продукта. Кроме того, поскольку диализ по большей части проводят вручную, он является потенциальным источником контаминации геля. Таким образом, весьма востребованы способы получения поперечно-сшитых филлеров, преодолевающих вышеуказанные недостатки.

[7] Кроме того, обычные предварительно полученные гидрогели часто имеют недостаток, который заключается в их высокой вязкости, что затрудняет их инъекцию через тонкие иглы. Одним из подходов к решению указанной проблемы заключается в использовании композиций гидрогеля, гелеобразование которых происходит in situ. Такие композиции инъецируют в ткань в жидкой форме, а не в форме предварительно полученного геля, и в результате поперечного сшивания в месте инъекции образуется гель, сшитый in situ. Другим подходом к решению указанной проблемы является добавлением смазывающей фазы (например, несшитого полисахарида, например, HA) к поперечно-сшитому гидрогелю, что обеспечивает уменьшение усилия при инъекции. Однако показано, что если инъецируемый гидрогель имеет достаточно низкую вязкость, то смазывающая фаза не является обязательно необходимой.

[8] Во многих гелях, образующихся in situ, используют модифицированное альдегидом производное полисахарида (например, HA), которое подвергается поперечному сшиванию in situ с другим производным полисахарида (например, HA), с образованием поперечно-сшитого геля. Кроме того, использование модифицированного альдегидом производного полисахарида (например, HA), которое образует поперечно-сшитый гель при взаимодействии с другим комплементарным производным полисахарида (например, HA), позволяет преодолеть вышеупомянутые проблемы, связанные с поперечным сшиванием BDDE, поскольку BDDE не требуется. Таким образом, модифицированные альдегидом производные полисахарида (например, HA), являются перспективными кандидатами для получения сшитых филлеров без BDDE.

[9] В этом отношении может быть сделана ссылка на WO 00/016818, где описано in situ получение гидрогеля посредством поперечного сшивания альдегид- (или амин-) функционализированного производного HA (например, адипиновый дигидразидо-HA) с гомо- или гетеробифункциональным сшивающим агентом (например, сшивающим агентом на основе бифункционального N-гидроксисукцинимидного эфира, такого как (SPA)₁-ПЭГ). Кроме того, в WO 2011/100469 описан поперечно-сшитый гидрогель HA для применения в качестве стекловидного биоматериала-заменителя, полученного взаимодействием окисленной HA, содержащей альдегидные функциональные группы (окси-HA), и дигидразидным сшивающим агентом, например, дигидразидом адипиновой кислоты (ADH). В WO 2009/108100 описан гидрогель на основе HA, полученный in situ посредством смешивания модифицированной альдегидом HA и сшивающего агента на основе модифицированного гидразидом поливинилового спирта (PVAH) с образованием поперечно-сшитой структуры, содержащей множество гидроксильных групп.

[10] Кроме того, в WO 2011/069475 описан способ получения производного альдегид-HA, содержащего альдегидную группу, посредством окисления первичной гидроксильной группы у C6 глюкозаминного повторяющегося звена с применением системы TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-пиперидинилоксил)совместного окислителя, и использования указанного производного альдегид-HA для получения поперечно-сшитых гидрогелей HA посредством взаимодействия с диаминным соединением (например, гександиамином) или амин-HA (например, гександиамин-замещенной HA). Кроме того, в WO 2017/063749 описано применение первого производного гиалуроновой кислоты и второго производного гиалуроновой кислоты, причем первое производное гиалуроновой кислоты функционализировано гидразидным фрагментом, а второе производное гиалуроновой кислоты функционализировано альдегидным фрагментом, для in situ образования поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте. Второе альдегид-функционализированное производное гиалуроновой кислоты может быть получено окислением первичной гидроксильной группы (-CH₂OH) до альдегидной группы (-CHO).

[11] Кроме того, в непатентной литературе также описаны гели, полученные in situ с использованием альдегид-модифицированного производного полисахарида. Например, в публикации Dahlmann et al. (Biomaterials 2013, 34:940-951) описаны совершенно определенные альгинатные и HA гидрогели, поперечно сшиваемые in situ, для выращивания ткани миокарда. Указанные гидрогели получают взаимодействием альдегид- и гидразид-функционализированного альгината и HA в присутствии человеческого коллагена I типа и клеток сердца новорожденных крыс (NRHC) с получением биосинтетической сердечной ткани на основе гидрогеля, поперечно-сшитого гидразоном. Кроме того, в публикации Ossipov et al. (Biomacromolecules 2010, 11:2247-2254) описан синтез гидразид-функционализированной HA с применением специфического симметричного дифункционального реагента, имеющего центральную двухвалентную защитную группу, которая может подвергаться реакции амидного типа с карбоксилатным остаткам HA в водном растворе. Гидразид-функционализированная HA может быть использована для in situ получения гидрогеля на основе гидразона HA посредством смешивания с альдегидным производным HA.

[12] В публикации Varghese et al. (J. Am. Chem. Soc. 2009, 131:8781-8783) описано производное HA, которое дважды функционализировано гидразидной группой и аминометилен-бисфосфонатной группой и способно ковалентно связывать бисфосфонат (BP; антиостеокластическое и антинеопластическое низкомолекулярное лекарственное соединение). Смешивание указанной дважды функционализированной HA с альдегид-функционализированной HA приводит к in situ образованию гидрогеля HA, пригодного для инъекции, для контролируемого высвобождения лекарственного соединения BP в месте имплантации. В публикации Oommen et al. (Adv. Funct. Mater 2013, 323:1273-1280) описан гидрогель HA, полученный смешиванием альдегидного производного HA с карбодигидразид- (CDH) функционализированным производным HA с получением гидрогеля HA с гидразонными связями. Дополнительно описано, что in situ образование гидрогеля HA в присутствии терапевтического белка (например, рекомбинантного человеческого фактора роста BMP-2) приводит к образованию гидрогеля для in vivo применения, который может обеспечивать доставку факторов роста для регенерации костной ткани.

[13] Однако обычно используемые способы присоединения альдегидных функциональных групп к гиалуроновой кислоте имеют ряд недостатков. Например, внедрение альдегидных групп посредством периодатного окисления нефункционализированной гиалуроновой кислоты обычно приводит к разрыву циклических сахаридных колец полисахаридного скелета, что снижает общую стабильность гиалуроновой кислоты и увеличивает нежелательную гибкость полисахаридного скелета. В частности, традиционно используемые реакции для внедрения альдегидных функциональных групп в гиалуроновую кислоту, например, окисление с применением периодата натрия, занимают много времени и/или трудны для контролирования с точки зрения нежелательного окисления групп карбоновой кислоты.

[14] Кроме того, не существует универсального филлера, который подходит для всех областей применения или для каждого пациента. Например, для разных применений необходимы гели с разной жесткостью/твердостью (часто описываемой с помощью модуля упругости). С учетом относительно высоких динамических напряжений, возникающих при движении мышц лица, для коррекции в области носогубных складок и морщин марионетки (от уголков губ к подбородку) обычно необходимы гели более высокой жесткостью. Напротив, гели меньшей жесткости лучше подходят для тех областей, где стойкость к деформации не является критичной или где анатомия не требует жесткости, а важны объем и пластичность, например, в губах (см., например, Kablik et al., Dermatol Surg, 2009, 35, 302-312).

[15] Однако свойства, например, жесткость гидрогеля, полученного из модифицированного альдегидом производного полисахарида (например, HA) и комплементарного производного полисахарида (например, HA) (поперечно-сшитого in situ, т.е. после инъекции двух комплементарных полисахаридных производных; или поперечно-сшитого in vitro, т.е. до инъекции), в значительной степени зависит от свойств конкретного модифицированного полисахарида (например, модифицированной гиалуроновой кислоты), в частности, от его молекулярной массы и степени модификации. Например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, имеющая очень низкую степень альдегидной модификации (т.е. очень небольшое количество альдегидных групп), будет иметь относительно небольшое количество образованных поперечных связей и, следовательно, полученный гель будет достаточно мягким. Таким образом, для разных областей применения используют разные альдегид-модифицированные гиалуроновые кислоты. Если модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, обеспечивающая «более мягкие» гидрогели (например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота с низкой степенью модификации), может быть использована для филлеров для губ, то модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, обеспечивающая «более твердые» гидрогели (например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота с высокой степенью модификации), может быть использована для филлеров для носогубных складок или морщин марионетки.

[16] Таким образом, в целом, весьма востребованы способы получения модифицированной гиалуроновой кислоты, например, модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, для in vitro или in situ получения поперечно-сшитых гелей, которые обеспечивают возможность изменения (точного подбора) свойств готовой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом. В частности, необходимы способы, обеспечивающие возможность простого изменения свойств готовой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, без существенного изменения общего способа синтеза, т.е. с сохранением большинства параметров без изменений при изменении лишь легко регулируемых параметров, например, концентрации исходных материалов, количества окислительного агента и времени реакции. При наличии такого способа можно использовать одинаковые или схожие экспериментальные условия для получения различных гиалуроновых кислот, модифицированных альдегидом, демонстрирующих разные свойства (например, различную степень модификации и молекулярную массу).

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

[17] С учетом вышеизложенного, задачей настоящего изобретения является обеспечение универсального и удобного способа получения модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, подходящей для in vitro или in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты. Кроме того, задачей настоящего изобретения является обеспечение такой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, которая особенно подходит для применения в эстетической медицине. Кроме того, задачей настоящего изобретения является обеспечение гидрогеля, полученного из гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, который особенно подходит для применения в эстетической медицине.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[18] Вышеуказанная задача решена посредством обеспечения нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты (также упоминаемого в данном документе как «модифицированное альдегидом производное гиалуроновой кислоты» или «альдегид-модифицированная гиалуроновая кислота») и способа его получения. Новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит группу -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена, которая модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, и подходит для in vitro и in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля при его взаимодействии со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты.

[19] Указанные два функционализированных полисахаридных производных (т.е. новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второе полисахаридное производное) можно инъецировать вместе в жидкой форме, что обеспечивает возможность совместной инъекции с малым усилием выдавливания даже через тонкие иглы. Желательно, чтобы в результате in situ образования геля не образовывались вредные побочные продукты. Единственным побочным продуктом является вода, которая без труда абсорбируется образованным гидрогелем и/или окружающими тканями. Кроме того, образованный in situ гидрогель обладает требуемыми свойствами с точки зрения интеграции в ткань, улучшения кожи, способности обеспечивать форму ткани и способности к объемообразованию.

[20] Кроме того, было неожиданно обнаружено, что новое альдегид-модифицированное производное гиалуроновой кислоты подходит для in vitro получения поперечно-сшитых гелей посредством взаимодействия со вторым, комплементарным производным полисахарида, предпочтительно также производным гиалуроновой кислоты. В частности, обнаружено, что свойства такого полученного геля можно регулировать не только через свойства отдельных производных (например, степень модификации и молекулярную массу), но и посредством подбора концентраций соответствующих полисахаридных производных в среде, используемой для поперечного сшивания.

[21] Преимущественно, альдегидная группа, имеющая структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, является достаточно длинной для обеспечения оптимальной стерической доступности для поперечного сшивания, но и достаточно короткой, чтобы не слишком увеличивать эластичность поперечно-сшитого геля. Это обусловливает особенную пригодность нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты для in situ получения гелей в широком диапазоне значений жесткости. Например, использование нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты с высокой степенью модификации (т.е. с большим количеством альдегидных групп) приводит к образованию большого количества (вследствие большого количества стерически доступных альдегидных групп) относительно коротких поперечных связей, что обусловливает получение относительно твердого геля.

[22] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению может быть получено из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH посредством окисления указанной группы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидную группу, имеющую структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. Предложенный новый способ получения нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты позволяет избежать недостатков обычно используемых способов получения альдегид-модифицированных производных гиалуроновой кислоты, таких как продолжительное время реакции, резкое снижение молекулярной массы гиалуроновой кислоты или нежелательное окисление до группы карбоновой кислоты.

[23] Показано, что при использовании предложенного способа можно без труда регулировать свойства нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты, изменяя лишь базовые параметры, такие как концентрация исходного материала, количество окислительного агента и время реакции. Например, изменяя концентрацию исходного материала, количество окислительного агента и/или время реакции, можно точно регулировать степень модификации и/или молекулярную массу полученного нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты.

[24] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, где группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где Ac означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла.

[25] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного производного HA согласно настоящему изобретению. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которое характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH; b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом, предпочтительно периодатом, более предпочтительно периодатом натрия, для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты.

[26] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом согласно настоящему изобретению.

[27] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине.

[28] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для получения предварительно образованного поперечно-сшитого гидрогеля.

[29] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом согласно настоящему изобретению, для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения.

[30] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты обычно используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем второй полисахарид предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, и при этом второй полисахарид более предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:

где «Ac» является таким, как указано выше.

[31] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, содержащему следующее структурное звено:

где «Ac» и R являются такими, как указано выше.

[32] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному посредством приведения в контакт альдегид-модифицированного производного HA согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, и второго полисахаридного производного, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA, описанного в настоящем документе.

[33] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу, предпочтительно к косметологическому способу получения поперечно-сшитого гидрогеля, который включает следующие стадии: a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом согласно настоящему изобретению, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное, описанное в данном документе; b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; и c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма пациента с получением поперечно-сшитого геля в целевом месте.

[34] В десятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения поперечно-сшитого гидрогеля, предпочтительно предварительно полученного поперечно-сшитого гидрогеля.

[35] В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к набору для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащему (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, который содержит модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом согласно настоящему изобретению, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, который содержит второе полисахаридное производное, описанное в настоящем документе, и необязательно (iii) инструкции по применению.

[36] Конкретные варианты реализации настоящего изобретения изложены далее в прилагаемой формуле изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[37] Для более полного понимания настоящего изобретения сделана ссылка на следующее описание и сопроводительные графические материалы, где:

[38] На фиг. 1 представлена иллюстративная хроматограмма, полученная для определения молекулярной массы.

[39] На фиг. 2 представлен иллюстративный спектр ¹H ЯМР альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты с тирозиновой меткой.

[40] На фиг. 3 представлен динамический модуль упругости (G’) гелей 1 и 2, которые хранили при 40°C.

[41] На фиг. 4 представлен коэффициент потерь (tanδ) гелей 1 и 2, которые хранили при 40°C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[42] Настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженном факте, что модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота может быть без труда получена из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты. В частности, обнаружено, что получение модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты не имеет недостатков, обычно встречающихся при получении модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, таких как резкое снижение молекулярной массы, продолжительное время реакции и нежелательные побочные реакции (например, окисление до карбоновой кислоты). Более того, было обнаружено, что свойства полученного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, можно без труда модифицировать (точно регулировать) посредством изменения лишь базовых параметров, таких как концентрация исходного материала, количество окислительного агента и время реакции.

[43] В частности, обнаружено, что степень модификации и молекулярную массу получаемого производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, можно точно регулировать посредством изменения концентрации исходного материала (т.е. концентрации модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты), количества окислительного агента и времени реакции. Это особенно предпочтительно, поскольку степень модификации и молекулярная масса готового производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, напрямую влияют на характеристики гелеобразования указанного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом. Таким образом, с применением лишь одного общего способа синтеза могут быть получены производные гиалуроновой кислоты, модифицированные альдегидом, с различными свойствами и, следовательно, обеспечивающие получение поперечно-сшитых гелей с разными свойствами, например, твердостью.

[44] Кроме того, было обнаружено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению особенно подходит для in situ и in vitro образования поперечно-сшитого гидрогеля, т.е. оно демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания. В частности, обнаружено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты. В этом отношении установлено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное подвергаются быстрому и эффективному поперечному сшиванию с образованием ковалентно сшитого гидрогеля, например, в требуемом месте организма. Для инициации реакции поперечного сшивания не нужны ни добавки, ни катализаторы, ни изменение рН, ни УФ излучение, а также любые другие внешние факторы воздействия (или «активаторы»). В частности, не используют или нет необходимости в сшивающем агенте. Единственным побочным продуктом, образующемся в реакции поперечного сшивания, обычно является вода, которая легко абсорбируется гидрогелем и/или окружающими тканями, если сшивание происходит in situ.

[45] В данном контексте термин «модифицированная глицерином гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH. Модифицированная глицерином гиалуроновая кислота доступна в продаже у компании HTL Biotech, Франция, или может быть получена прививкой глицидола на гиалуроновую кислоту в соответствии со следующей схемой реакции:

[46] Предпочтительно, помимо групп -OH, связанных с углеродом C6 в звене GIcNac, другие группы не подвергаются модификации в результате реакции с глицидолом. Предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит от 1 до 100, предпочтительно от 2 до 50, более предпочтительно от 5 до 20 и наиболее предпочтительно от 10 до 20 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в гиалуроновой кислоте. Показано, что такая степень модификации особенно подходит для дальнейшего получения производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению, которое имеет требуемую степень (альдегидной) модификации для получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине, посредством взаимодействия с комплементарным вторым полисахаридным производным, предпочтительно производным гиалуроновой кислоты. Следует обратить внимание на то, что в контексте настоящего изобретения другие функциональные группы гиалуроновой кислоты, т.е. другие группы -OH и группы -COOH, в частности, другие (вторичные) группы -OH, могут быть модифицированы глицерином, хотя и в гораздо меньшей степени. Однако в контексте настоящего изобретения глицерин-содержащий фрагмент предпочтительно присутствует только, по существу только или преимущественно у атома углерода C6 звена GIcNac.

[47] В данном контексте термин «in situ» означает в месте введения, т.е. внутри организма пациента. Таким образом, для получения гидрогеля «in situ», т.е. в месте введения, модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению обычно вводят вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, или указанные соединения иным образом вводят вместе в определенном положении (целевом месте) в организме пациента, например, в положении, нуждающемся в наращивании ткани по эстетическим причинам, и оставляют для ковалентного сшивания в очаге совместной инъекции. В контексте настоящего изобретения термины «in situ» и «in vivo» могут быть использованы взаимозаменяемо. «Пациент» в значении согласно настоящему изобретению может быть любым индивидуумом или субъектом, например, млекопитающим и предпочтительно человеком, нуждающимся в «лечении» определенного состояния, статуса или заболевания, например, с косметической, эстетической или терапевтической целью. Таким образом, следует понимать, что термин «лечение» в данном контексте не только относится к терапевтическому/медицинскому лечению, но и включает, например, косметическое и эстетическое лечение.

[48] В данном контексте термин «in vitro» означает вне организма человека или животного. Аналогично, термин «предварительно полученный гидрогель», «предварительно полученный гель» или т.п. в данном контексте относится к гидрогелю, который получен вне организма человека или животного. Таким образом, следует понимать, что термины «предварительно полученный» и «in vitro» описывают, что гидрогель получен вне организма человека или животного до инъекции. Таким образом, гель, который получен «in vitro», является «предварительно полученным» гелем, т.е. гелем, который получен вне организма человека или животного.

[49] В данном контексте термин «искусственный контейнер» относится к любому контейнеру, который не является организмом человека или животного или его частью. Предпочтительно, искусственный контейнер изготовлен из небиологического материала, предпочтительно стеклянного или пластикового материала, более предпочтительно из стекла.

[50] В контексте настоящего изобретения термин «совместная инъекция» обычно означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное производное инъецируют вместе в форме одной жидкой композиции, например, раствора, в требуемое место тела пациента. Термин «пригодный для инъекций» или «инъекционный» в данном контексте означает, что композиция, образующая гидрогель in situ, может быть выдавлена из шприца или шприцевой системы. В частности, термин «совместная инъекция» предпочтительно означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное производное смешивают, в частности, однородно смешивают до их выхода через кончик иглы и попадания в целевое место тела пациента, и затем инъецируют в форме смеси в целевое место тела пациента. В контексте настоящего изобретения термины «инъекция» или «совместная инъекция» могут относиться к интра-, интер- или субдермальной инъекции, или к подкожной инъекции. Кроме того, термин «игла» в данном контексте включает или является синонимом «канюли» или любых других иглоподобных элементов, подходящих для инъекции.

[51] Термины «гидрогель» или «гель» в данном контексте означают набухшую в воде трехмерную сетчатую структуру, состоящую из ковалентно сшитых полимерных цепей. Предпочтительно, поперечно-сшитый (или «гелеобразный») гидрогель является когезивным. Термин «когезивный» или «когезивность» в контексте настоящего изобретения определяют как способность материала (например, гидрогеля) не подвергаться диссоциации вследствие аффинности его молекул друг к другу. Когезивность является ключевой характеристикой гелевых имплантатов (например, in situ превращенных в гель гидрогелей, описанных в настоящем документе) и считается необходимой для сохранения интактности твердой и жидкой фаз геля и, следовательно, целостности геля. В контексте настоящего изобретения когезивность полисахаридного гидрогеля, в частности, гидрогеля на основе HA, может быть определена по шкале когезивности Гаварда-Сундарама (Sundaram et al., Plast. Reconstr. Surg. 136:678-686, 2015).

[52] Термин «самопроизвольный» или «самопроизвольно» в данном контексте относится к тому факту, что альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и нуклеофильная группа второго полисахаридного производного образуют ковалентную связь без каких-либо внешних воздействий (также называемых «активаторами»), таких как нагревание или УФ свет. В частности, обнаружено, что гидрогель может самопроизвольно образовываться в условиях in vivo, т.е. после совместной инъекции в требуемое место организма пациента, без каких-либо внешних воздействий (также называемых «активаторами»), таких как нагревание или УФ свет, что приводит к in situ образованию поперечно-сшитого полисахаридного гидрогеля в требуемом месте.

[53] В контексте настоящего изобретения образованный in situ (или in vivo) гидрогель, в целом, подходит для применения и/или действует как филлер мягких тканей. Термин «филлер мягких тканей» в данном контексте, в целом, относится к материалу, выполненному с возможностью заполнения полостей и/или увеличения объема в зонах недостатка мягкой ткани. Он включает, например, увеличение объема, наполнение или замену мягких тканей. В данном контексте термин «мягкая ткань», в целом, относится к тканям, которые соединяют, поддерживают или окружают другие структуры и органы тела. Мягкие ткани включают, например, мышцы, сухожилия (пучки волокон, которые соединяют мышцы с костями), волокнистые ткани, жир, кровеносные сосуды, нервы и синовиальные ткани (ткани вокруг суставов). В контексте настоящего изобретения филлер мягкой ткани предпочтительно представляет собой кожный филлер.

[54] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, где группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.

[55] Как указано выше, было обнаружено, что предложенное модифицированное производное гиалуроновой кислоты демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что подходящие свойства поперечного сшивания обусловлены стерическими свойствами альдегидной группы, внедренной способом согласно настоящему изобретению, т.е. группы -CH₂-OH по меньшей мере одного звена GIcNAc, модифицированной до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. В частности, полагают, что указанная альдегидная группа является достаточно длинной для обеспечения оптимальной стерической доступности для поперечного сшивания, но и достаточно короткой, чтобы не слишком увеличивать эластичность поперечно-сшитого геля.

[56] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты не содержит других химических модификаций, кроме альдегидной группы, предпочтительно альдегидной группы, присутствующей у атома углерода C6 звена GIcNAc и имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.

[57] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению имеет степень модификации от 1,0% до 20,0%, более предпочтительно от 1,0% до 15,0%, еще более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, еще более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, еще более предпочтительно от 2,0% до 6,9%. Степень модификации (MoD) определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты. Например, MoD 15,0% означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит 15 групп -CH₂-O-CH₂-CHO на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев. MoD 37,0% означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит 37 групп -CH₂-O-CH₂-CHO на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев и т.д. Обнаружено, что такая достаточно низкая степень модификации особенно подходит для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине, где необходимы гидрогели со сравнительно низкой вязкостью. Кроме того, такие низковязкие гидрогели все еще пригодны для инъекции через тонкие иглы, чтоб обеспечивает возможность in vitro получения гидрогеля (т.е. образования предварительно полученного гидрогеля), свойства которого могут быть тщательно определены и проверены до инъекции, что однако невозможно, если гидрогель получен in situ.

[58] Поскольку твердость (или жесткость; например, описанная модулем упругости) гидрогеля, полученного из модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, зависит от количества и плотности поперечных связей, образованных в указанном гидрогеле, а количество и плотность поперечных связей, образованных в указанном гидрогеле, напрямую зависит от степени модификации модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, то степень модификации напрямую влияет на твердость гидрогеля, полученного из модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению. Таким образом, степень модификации является важной характеристикой модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению.

[59] Степень модификации (MoD) может быть определена спектрометрическими и/или спектроскопическими аналитическими методами, такими как ¹H ЯМР, УФ/вид. и ИК, титрование, ВЭЖХ, эксклюзионная хроматография, измерение вязкости, среди прочих. Обычно степень модификации определяют с помощью ¹H ЯМР. Иллюстративный способ определения MoD представлен в разделе «Примеры».

[60] Молекулярная масса (также упоминаемая как молярная масса) является другой важной характеристикой модифицированного производного гиалуроновой кислоты, которая напрямую влияет на свойства геля, полученного из него. Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, более предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, еще более предпочтительно 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.

[61] Все числовые значения в данном документе, выражающие «молекулярную массу», «молярную массу», «среднюю молекулярную массу», «среднюю молярную массу», «средний молекулярный вес» и «средний молярный вес» полисахаридов (например, HA), следует понимать как означающие средневесовую молекулярную массу (или среднемассовую молекулярную массу, или средневесовую молярную массу) или M_w (w - масса) в Дальтонах (Да). Средневесовую молярную массу (M_w) определяют следующим образом: M_w =Σ_iN_iM_i²/Σ_iN_iM_i, где N_i представляет собой количество молекул с молярной массой M_i.

[62] В данном контексте могут быть использованы различные способы определения молекулярной массы HA, такие как измерение характеристической вязкости (например, Европейская фармакопея 7.0 - гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011), капиллярный электрофорез (CE) (например, в соответствии с Kinoshita et al., Biomed. Chromatogr., 2002, 16:141-45), гель-проникающая хроматография (ГПХ) (например, в соответствии с Kim et al., Food Chem., 2008, 109:63-770) и многоугловое рассеяние лазерного излучения, комбинированное с эксклюзионной хроматографией (SEC-MALLS) (например, в соответствии с Hokputsa et al., Eur. Biophys. J. Biophys. Lett., 2003, 32:450-456).

[63] В контексте настоящего изобретения средневесовую молекулярную массу (M_w) полимеров HA предпочтительно определяют гель-проникающей хроматографией (ГПХ) или вискозиметрией по уравнению Марка-Хаувинка. Технология ГПХ включает элюирование раствора полимера через матрицу из упакованных полимерных частиц при давлении до нескольких мегапаскаль (МПа). Как известно специалистам в данной области техники, использование стандартов с низкой дисперсностью обеспечивает возможность корреляции времени удерживания с молярной массой.

[64] В контексте настоящего изобретения среднечисловую молярную массу (M_w) также можно определять по уравнению Марка-Хаувинка, несмотря на тот факт, что обычно оно относится к средневязкостной молярной массе или M_v. Уравнение Марка-Хаувинка определяет взаимосвязь между характеристической вязкостью (η) и молекулярной массой M и обеспечивает возможность определения молекулярной массы полимера по данным характеристической вязкости и наоборот. В контексте настоящего изобретения характеристическую вязкость предпочтительно измеряют способом, описанным в Европейской фармакопее 7.0 (гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011). В контексте настоящего изобретения средняя молекулярная масса предпочтительно представляет собой средневязкостную молекулярную массу (M_n), которая может быть рассчитана на основании характеристической вязкости по уравнению Марка-Хаувинка.

[η] = K x Mη^a,

где [η] = характеристическая вязкость в м³/кг, Mη = средневязкостная молекулярная масса, K = 2,26 × 10^-5, и a = 0,796, причем, как указано выше, характеристическую вязкость предпочтительно измеряют в соответствии со способом, описанным в Европейской фармакопее 7.0 (гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011).

[65] Пример определения молекулярной массы также представлен в разделе «Примеры».

[66] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла. Следует понимать, что вместо протонированной формы (т.е. R = H), группа карбоновой кислоты также может существовать в депротонированной форме (т.е. R = отрицательный заряд) без какого-либо конкретного противоиона, присутствующего для уравновешивания отрицательного заряда. Такая ситуация возникает, например, в растворе, когда противоион, уравновешивающий отрицательный заряд, сольватирован и расположен в статистической близости от депротонированной карбоновой кислоты.

[67] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты может дополнительно содержать по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» является таким, как указано выше, и R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, иона щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.

[68] Предпочтительно, количество альдегидных групп, присутствующих у атома углерода C6 звена GIcNAc (т.е. R¹ = -CH₂-CHO), деленное на общее количество альдегидных групп, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты (включая альдегидные группы, присутствующие у атома C6 звена GIcNAc), равно от 0,60 до 1, предпочтительно от 0,65 до 1, более предпочтительно от 0,70 до 1, еще более предпочтительно от 0,75 до 1, еще более предпочтительно от 0,80 до 1, еще более предпочтительно от 0,85 до 1, еще более предпочтительно от 0,90 до 1, еще более предпочтительно от 0,95 до 1, еще более предпочтительно от 0,97 до 1, еще более предпочтительно от 0,98 до 1, еще более предпочтительно от 0,99 до 1, наиболее предпочтительно 1.

[69] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которое характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH; b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты.

[70] Предпочтительно, окислительный агент представляет собой периодат или ацетат свинца (IV), предпочтительно периодат. Более предпочтительно, окислительный агент представляет собой периодат натрия.

[71] Как указано выше, было обнаружено, что предложенный способ согласно настоящему изобретению не имеет недостатков, которые обычно возникают при получении модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, таких как резкое снижение молекулярной массы, продолжительное время реакции и нежелательные побочные реакции (например, окисление до карбоновой кислоты). Например, было обнаружено, что даже при использовании в качестве окислительного агента периодата натрия, который, как известно, окисляет полимерный скелет, что приводит к разрушению полимерного скелета и к уменьшению молекулярной массы гиалуроновой кислоты, в способе согласно настоящему изобретению не происходит или происходит незначительное окисление полимерного скелета.

[72] Причина такого неожиданного протекания процесса заключается в следующем: Периодат предпочтительно взаимодействует с цис-диолами, а не с транс-диолами; для окисления транс-диолов периодатом необходимы относительно жесткие условия и/или продолжительное время реакции. В то время как гидроксильные группы полимерного скелета транс-ориентированы относительно друг друга, группы -OH глицеринового фрагмента (например, -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH) вращаются свободно. Таким образом, вицинальный диол глицеринового фрагмента свободно доступен для окисления периодатом, и реакция окисления (т.е. стадия c)) может быть осуществлена в мягких условиях за относительно короткое время, в результате чего не происходит окисление полимерного скелета. Например, было обнаружено, что реакция окисления на стадии c) может быть осуществлена менее чем за один час, даже за 10 минут.

[73] Кроме того, было обнаружено, что свойства полученного модифицированного производного гиалуроновой кислоты по первому аспекту можно без труда модифицировать (точно регулировать) посредством изменения лишь базовых параметров, например, концентрации исходного материала, количества окислительного агента и времени реакции.

[74] Предпочтительно, способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает одну или более следующих стадий:

d) прекращение реакции на стадии c), предпочтительно посредством добавления этиленгликоля;

e) очистка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, предпочтительно посредством осаждения модифицированного производного гиалуроновой кислоты в органическом растворителе, предпочтительно этаноле, изопропаноле или их смеси, повторное растворение осадка в солевом растворе и повторное осаждение модифицированного производного гиалуроновой кислоты в указанном органическом растворителе;

f) сушка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного на стадии e).

[75] Предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 5,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 3,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 МДа, еще более предпочтительно от 1,1 до 1,9, еще более предпочтительно от 1,2 до 1,8 МДа, еще более предпочтительно от 1,3 до 1,7 МДа, еще более предпочтительно от 1,4 до 1,6 МДа. Модифицированная глицерином гиалуроновая кислота также может иметь средневесовую молекулярную массу от 2,0 до 5,0 МДа, или от 2,5 до 5,0 МДа, или от 3,0 до 5,0 МДа, или от 3,0 до 4,5 МДа, или от 3,0 до 4,0 МДа.

[76] Также предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет степень модификации от 5 до 25%, предпочтительно от 10 до 20%. В данном случае степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированной глицерином гиалуроновой кислоте. Например, MoD 25,0% означает, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит 25 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев. MoD 50,0% означает, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит 50 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев и т.д. Показано, что такая степень модификации особенно подходит для получения альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты, имеющего требуемую (достаточно низкую) степень альдегидной модификации для получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине.

[77] Предпочтительно, стадию c) проводят при температуре от 4 до 35 °С, более предпочтительно от 15 до 35 °С, еще более предпочтительно от 20 до 30 °С, еще более предпочтительно от 20 до 25 °С, еще более предпочтительно от 21 до 23 °С, еще более предпочтительно примерно 22 °С. Показано, что такие относительно низкие температуры реакции обеспечивают получение альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению с подходящей степенью модификации для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине.

[78] Также предпочтительно, стадию c) проводят на протяжении от 5 до 120 минут, предпочтительно от 5 до 65 минут, более предпочтительно от 10 до 60 минут, еще более предпочтительно от 10 до 50 минут, еще более предпочтительно от 10 до 40 минут, еще более предпочтительно от 10 до 30 минут, еще более предпочтительно от 10 до 20 минут. Показано, что такое относительно короткое время реакции также обеспечивает получение альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, которое имеет «правильную» степень модификации для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине.

[79] Было обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается при увеличении времени реакции, а молекулярная масса полученного модифицированного производного гиалуроновой кислоты немного снижается при увеличении времени реакции.

[80] Кроме того, предпочтительно, окислительный агент, предпочтительно периодат натрия, присутствует в количестве от 0,01 до 0,5 молярного эквивалента, предпочтительно от 0,01 до 0,3 молярного эквивалента, более предпочтительно от 0,04 до 0,3 молярного эквивалента, еще более предпочтительно от 0,04 до 0,1 молярного эквивалента относительно молярного количества дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином.

[81] Обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается с увеличением количества окислительного агента, а молекулярная масса уменьшается при увеличении количества окислительного агента.

[82] Кроме того, гиалуроновая кислота, модифицированная глицерином, предпочтительно присутствует в количестве от 2 до 50 г/л, предпочтительно от 2 до 40 г/л, более предпочтительно от 3 до 38 г/л, более предпочтительно от 4 до 36 г/л относительно общего объема реакционной смеси.

[83] Обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается с увеличением количества гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, а молекулярная масса уменьшается при увеличении количества гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином.

[84] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом, описанным во втором аспекте.

[85] Также в данном аспекте, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты не содержит других химических модификаций, кроме альдегидной группы, предпочтительно альдегидной группы, присутствующей у атома углерода C6 звена GIcNac и имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.

[86] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, имеет степень модификации от 1,0% до 20,0%, более предпочтительно от 1,0% до 15,0%, еще более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, еще более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, еще более предпочтительно от 2,0% до 6,9%.

[87] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.

[88] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» является таким, как указано выше, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла. Здесь также следует понимать, что вместо протонированной формы (т.е. R = H), группа карбоновой кислоты также может существовать в депротонированной форме (т.е. R = отрицательный заряд) без какого-либо конкретного противоиона, присутствующего для уравновешивания отрицательного заряда.

[89] Кроме того, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, может дополнительно содержать по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» является таким, как указано выше, и R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, иона щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.

[90] Кроме того, также в данном аспекте, предпочтительно количество альдегидных групп, присутствующих у атома углерода C6 звена GIcNAc (т.е. R¹ = -CH₂-CHO), деленное на общее количество альдегидных групп, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты (включая альдегидные группы, присутствующие у атома C6 звена GIcNAc), равно от 0,60 до 1, предпочтительно от 0,65 до 1, более предпочтительно от 0,70 до 1, еще более предпочтительно от 0,75 до 1, еще более предпочтительно от 0,80 до 1, еще более предпочтительно от 0,85 до 1, еще более предпочтительно от 0,90 до 1, еще более предпочтительно от 0,95 до 1, еще более предпочтительно от 0,97 до 1, еще более предпочтительно от 0,98 до 1, еще более предпочтительно от 0,99 до 1, наиболее предпочтительно 1.

[91] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля в области эстетической медицины.

[92] Применение в области эстетической медицины согласно настоящему изобретению не является терапевтическим. Предпочтительно, применение в области эстетической медицины согласно настоящему изобретению не является хирургическим.

[93] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, описанное в первом и третьем аспектах, используют для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для обработки морщин и складок кожи, включая межбровные морщины, носогубные складки, складки на подбородке, морщины марионетки, нижнюю часть овала лица, морщины на щеках, окологубные морщины и «гусиные лапки», атрофические рубцы, шрамы, виски, подкожное крепление бровей, жировые подушки на скулах и щеках, слезные борозды, нос, губы, щеки, подбородок, окологубную зону, подглазничную область и лицевую асимметрию.

[94] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для получения предварительно образованного поперечно-сшитого гидрогеля.

[95] Гидрогель предпочтительно получают посредством приведения во взаимодействие модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами. Использование модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для получения поперечно-сшитого гидрогеля имеет множество преимуществ по сравнению с традиционно используемыми способами получения на основе BDDE. Во-первых, поскольку не используются токсичные химические соединения, и предпочтительно в качестве побочного продукта образуется только вода, необходимо меньше времени на очистку полученного гидрогеля и, следовательно, процесс получения, в целом, гораздо проще и быстрее. Кроме того, поскольку очистка является потенциальным источником контаминации, может быть существенно снижен риск контаминации.

[96] Кроме того, поскольку для применения в эстетической медицине необходим достаточно низковязкий гидрогель, было обнаружено, что образованный предварительно полученный гидрогель демонстрирует достаточно высокую способность проходить через тонкие иглы при инъекции. Однако если необходимо уменьшить усилие при инъекции, в качестве смазывающей фазы может быть добавлен несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновая кислота.

[97] Гидрогель предпочтительно получают в буферной среде, предпочтительно в физиологическом буфере, более предпочтительно в фосфатном буфере, или цитратном буфере, или ацетатном буфере, еще более предпочтительно в фосфатном буфере. Предпочтительно, буфер находится в искусственном контейнере.

[98] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения, предпочтительно для лечения стрессового недержания мочи, сухости влагалища, везикоуретерального рефлюкса, недостаточности голосовых связок и медиализации голосовых связок.

[99] Предпочтительно, и это относится ко всем аспектам применения гидрогеля, полученного из производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению, модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA.

[100] Предпочтительно, и это относится ко всем аспектам применения второго полисахаридного производного, второе полисахаридное производное получено из природного полисахарида или полусинтетического полисахарида. Конкретные примеры подходящих полисахаридов включают целлюлозу, декстран, крахмал, альгинат, гиалуроновую кислоту, пектин, хитин, сульфат хондроитина, сульфат дерматана, гепарин, сульфат гепарина, гепарозан и т.п.

[101] Особенно предпочтительно, второе полисахаридное производное представляет собой производное гиалуроновой кислоты. В таком случае нуклеоифильная функциональная группа предпочтительно присоединена к скелету гиалуроновой кислоты через группу карбоновой кислоты фрагмента D-глюкуроновой кислоты.

[102] Предпочтительно, нуклеофильная функциональная группа, способная образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA, представляет собой амино, аминоокси, карбазатный или гидразидный фрагмент, и предпочтительно представляет собой гидразидный фрагмент.

[103] Термин «гидразидный фрагмент» в данном контексте включает гидразидную функциональную группу и группы или остатки с концевым гидразидным фрагментом, обычно имеющие общее количество атомов углерода не более 15, 10, 5, 4, 3 или 2. Гидразидный фрагмент предпочтительно представляет собой гидразидный (т.е. [полисахарид]-C(O)-NH-NH₂) или дигидразидный фрагмент, в частности, дигидразидный фрагмент общей формулы

[полисахарид]-C(=O)-NH-NH-R¹-C(=O)-NH-NH₂

где R¹ = ковалентная связь, C(=O), C(=O)-O-R² , (C=O)-R², причем R² = линейная или разветвленная C₁, C₂, C₃, C₄, C₅ или C₆ алкильная или алкенильная группа. Особенно предпочтительным для применения согласно настоящему описанию является карбодигидразид (CDH). Если CDH использован в качестве гидразидного фрагмента и связан с карбоксильной группой полисахарида, то полученный модифицированный полисахарид имеет следующий фрагмент с концевым боковым гидразидом: полисахарид-C(=O)-R, где R представляет собой -NH-NH-C(=O)-NH-NH₂.

[104] Предпочтительно, нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного присоединена к полисахаридному скелету через свободную группу карбоновой кислоты полисахарида, из которого получено второе полисахаридное производное. Модификация группы карбоновой кислоты может быть осуществлена любым способом, известным в данной области техники, с использованием растворимого в воде связующего реагента. Например, подходящий способ включает применение стандартной химии карбодиимидов, например, использование EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) в качестве связующего агента для связывания фрагмента с концевым гидразидом с карбоксильной группой с образованием соответствующих ацилгидразидов полисахаридов (см., например, WO 95/15168). Другие подходящие связующие реагенты представляют собой триазиновые соединения, такие как DMTMM (4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид; см, например, WO 2016/097211), активные сложные эфиры, такие как N,N-дисукцинимидилкарбонат, и соли тетраметиламиния (например, HATU).

[105] Предпочтительно, второй полисахарид представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:

где «Ac» является таким, как указано выше.

[106] При приведении в контакт друг с другом альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производства самопроизвольно образуют ковалентную связь при совместной инъекции модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в требуемое место тела субъекта, с образованием поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте. Альтернативно, альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при приведении их в контакт in vitro. В таком случае модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второй полисахарид предпочтительно находятся в буфере, указанном выше, причем указанный буфер предпочтительно находится в искусственном контейнере.

[107] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, содержащему следующее структурное звено:

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, и иона щелочноземельного металла.

[108] В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, поперечно-сшитый гидрогель представляет собой предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель. Предпочтительно, указанный предварительно полученный гидрогель находится в системе доставки, готовой для применения, такой как предварительно наполненный шприц. Предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель является стерильным и готовым для инъекции в тело пациента, предпочтительно в эстетических целях. Гидрогель предпочтительно стерилизуют влажным жаром (например, в автоклаве). Предпочтительно, гидрогелем сначала наполняют систему доставки, например, шприц, и затем подвергают стерилизации полученную систему доставки, готовую для применения, такую как предварительно наполненный шприц. Предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновую кислоту, в качестве смазывающей фазы. Смазывающая фаза снижает усилие при инъекции через тонкие иглы, обычно используемые в области эстетической медицины, и обеспечивает возможность инъекции гидрогелей через тонкие иглы, несмотря на то, что они находятся в поперечно-сшитой форме. Предпочтительно, несшитый полисахарид присутствует в количестве от 1% до 30% мас. относительно общего количества полисахарида, более предпочтительно т 5% мас. до 20% мас., еще более предпочтительно от 7% мас. до 5% мас., еще более предпочтительно от 8% мас. до 12% мас., еще более предпочтительно от 9% мас. до 11% мас., еще более предпочтительно примерно 10% мас. Также предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит местные анестезирующие агенты, предпочтительно лидокаин, полиспирты (также упоминаемые как полиолы), витамины, соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, металлы, антиоксиданты, аминокислоты и керамические частицы, предпочтительным анестетиком является лидокаин. Предпочтительно, местный анестезирующий агент присутствует в количестве от 0,05% мас. до 2% мас. относительно общей массы полисахарида, более предпочтительно от 0,1% мас. до 1% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,8% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,6% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,4% мас., еще более предпочтительно от 0,2% мас. до 0,4% мас., еще более предпочтительно примерно 0,3% мас. Предпочтительно, полиол присутствует в количестве от 0,5% мас. до 5,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., еще более предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас., еще более предпочтительно от 1,8% мас. до 2,2% мас., еще более предпочтительно примерно 2,0% мас. Предпочтительно, полиол представляет собой маннит.

[109] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному посредством приведения в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и второго полисахаридного производного, указанного выше, причем поперечно-сшитый гидрогель предпочтительно содержит следующее структурное звено:

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, и иона щелочноземельного металла.

[110] Предпочтительно, поперечно-сшитый гидрогель, описанный в седьмом и восьмом аспектах, имеет динамический модуль упругости при 1 Гц от 50 до 1000 Па, более предпочтительно от 50 до 500 Па, еще более предпочтительно от 50 до 300 Па, еще более предпочтительно от 50 до 150 Па или от 150 до 300 Па. Динамический модуль упругости может быть определено посредством реологических измерений, проведенных при 25 °С при колебательном напряжении 1 Па с использованием частотного сканирования от 1,0 до 10 Гц.

[111] В соответствии с одним вариантом реализации, приведение в контакт осуществляют in situ, т.е. внутри тела пациента. В соответствии с другим вариантом реализации, приведение в контакт осуществляют in vitro, т.е. за пределами тела человека или животного, предпочтительно в буферной среде, описанной выше. Предпочтительно, буферная среда находится в искусственном контейнере.

[112] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу, предпочтительно к косметологическому способу получения поперечно-сшитого гидрогеля. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное, описанное выше; b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; и c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма пациента с получением поперечно-сшитого геля в целевом месте.

[113] Предпочтительно, первый раствор предшественника и второй раствор предшественника, обеспечиваемые на стадии a), являются стерильными.

[114] Термин «стерилизованный» или «стерильный» в данном контексте относится к тепловой стерилизации, в частности, к стерилизации влажным жаром (например, паровой стерилизации) и предпочтительно относится к автоклавированию. Автоклавирование можно осуществлять при температуре от 120 °С до 132 °С в течение от 0,3 минуты до 20 минут, или при температуре от 121 °С до 130 °С в течение от 0,5 минуты до 10 минут, например, при температуре 121 °С в течение от 0,5 минуты до 2 минут.

[115] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, полученная на стадии b) без труда выдавливают через тонкие иглы, прилагая небольшое усилие для инъекции, обеспечивая, например, улучшение кожи, придание коже формы или оптимальный эффект увеличения объема. Это преимущественно обеспечивает возможность применения тонких игл, что, в свою очередь, повышает комфорт пациента (уменьшение боли при инъекции, снижение противодавления) и дополнительно обеспечивает возможность практикующему специалисту точно и безопасно (без закупоривания сосудов) инъецировать гидрогель в требуемые целевые зоны, такие как различные слои кожи.

[116] Смешивание и инъекцию можно осуществлять с помощью двухкамерного шприца, описанного ниже в данном документе, или любой другой подходящей шприцевой системы, в которой первый и второй растворы предшественников физически разделены до одновременного выдавливания и одновременного смешивания и инъекции смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, через иглу (или канюлю) в тело пациента. Таким образом, совместная инъекция должна быть осуществлена настолько быстро, чтобы избежать предварительного поперечного сшивания до введения смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма. С другой стороны, время гелеобразования должно быть достаточно коротким во избежание распространения смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в окружающие ткани.

[117] Таким образом, предпочтительно, на стадии a) первый и второй растворы предшественников находятся в различных камерах многокамерного шприца, предпочтительно двухкамерного шприца, и смешивание на стадии b) происходит во время выдавливания из указанного многокамерного шприца.

[118] Термин «многокамерный шприц» в данном контексте означает шприц, который содержит по меньшей мере две отдельные камеры и может иметь два или более поршней. Термин «двухкамерная шприцевая система» в данном контексте означает любую систему или устройство, обычно шприц, которое содержит две отдельные камеры и может иметь один или два поршня. Кроме того, многокамерная, например, двухкамерная шприцевая система обычно содержит колпачок наконечника, или иглу или канюлю с колпачком иглы или без него для закрывания конца(ов) шприцевой системы. Камеры обычно имеют емкость резервуара для вмещения достаточного количества первого и второго растворов предшественников. Камеры могут быть изготовлены из стекла, пластика или любого другого подходящего материала, и могут иметь разную геометрию, внутренние диаметры, состав материалов, прозрачность и т.д. Кроме того, многокамерная шприцевая система может представлять собой двухкамерную шприцевую систему в форме шприца, имеющего два шприца, соединенных как одно целое, т.е. две камеры, соединенных как одно целое, и моно- или двухпоршневой блок для выдавливания содержимого из камер. Кроме того, шприцевая система может содержать две камеры, соединенные разъемным образом, и два или один поршень, соединенный разъемным образом.

[119] Кроме того, первый раствор предшественника и/или второй раствор предшественника может содержать дополнительные вещества, такие как клетки, включая стволовые клетки и адипоциты, жиры, липиды, факторы роста, цитокины, лекарственные соединения и биоактивные вещества. Более конкретно, первый раствор предшественника и/или второй раствор предшественника могут содержать местные анестезирующие агенты, полиспирты (также упоминаемые как полиолы), витамины, соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, металлы, антиоксиданты, аминокислоты и керамические частицы.

[120] В контексте настоящего изобретения добавление местного анестетика особенно желательно с учетом его способности устранять боль при инъекции. Иллюстративные местные анестезирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, амбукамин, амоланон, амилокаин, беноксинат, бензокаин, бетоксикаин, бифенамин, бупивакаин, бутакаин, бутамбен, бутаниликаин, бутетамин, бутоксикаин, картикаин, хлорпрокаин, кокаэтилен, кокаин, циклометикаин, дибукаин, диметизоквин, диметокаин, диперодон, дицикломин, экгонидин, экгонин, этилхлорид, этидокаин, бета-эукаин, эупроцин, феналкомин, формокаин, гексилкаин, гидрокситетракаин, изобутил-п-аминобензоат, мезилат лейцинокаина, левоксадрол, лидокаин, мепивакаин, меприлкаин, метабутоксикаин, метилхлорид, миртекаин, наепаин, октокаин, ортокаин, оксетазаин, паретоксикаин, фенакаин, фенол, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамоксин, прилокаин, прокаин, пропанокаин, пропаракаин, пропипокаин, пропоксикаин, псевдококаин, пиррокаин, ропивакаин, салициловый спирт, тетракаин, толикаин, тримекаин, золамин и их соли.

[121] Предпочтительно, анестезирующий агент представляет собой лидокаин, например, в форме лидокаин.HCl. Первый и/или второй раствор предшественника может иметь концентрацию лидокаина, например, от 0,05% мас. до 8,0% мас., от 0,1% мас. до 4,0% мас., от 0,2% мас. до 3,0% мас., от 0,3% мас. до 2,0% мас. или от 0,4% мас. до 1,0% мас.

[122] Подходящие полиолы для применения согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, глицерин, маннит, сорбит, пропиленгликоль, эритрит, ксилит, мальтит и лактит. Особенно подходящими для применения согласно настоящему изобретению являются маннит и глицерин. Кроме того, полиол предпочтительно представляет собой гликоль, необязательно в комбинации с одним или более вышеупомянутыми полиольными соединениями, в частности, маннитом. Подходящие витамины включают витамин C, витамин E и витамины группы B, т.е. один или более витаминов B₂, B₃, B₅, B₆, B₇, B₉ и B₁₂. Витамины могут присутствовать для стимуляции и поддержания клеточного метаболизма и, следовательно, для ускорения выработки коллагена. Особенно предпочтительным для применения согласно настоящему изобретению является витамин C, витамин E и витамин B₆. Предпочтительная соль для применения в композиции филлера мягких тканей представляет собой цинковую соль. Керамические частицы предпочтительно представляют собой гидроксиапатитовые частицы, т.е. частицы гидроксиапатита кальция (CaHA).

[123] Альтернативно, первый раствор предшественника состоит из модифицированного производного гиалуроновой кислоты, и/или второй раствор предшественника состоит из второго полисахаридного производного.

[124] Кроме того, первый раствор предшественника может состоять из модифицированного производного гиалуроновой кислоты и водного буферного раствора, и/или второй раствор предшественника может состоять из второго полисахаридного производного и водного буферного раствора.

[125] Количество модифицированного производного гиалуроновой кислоты, присутствующего в первом растворе предшественника, может составлять от 0,1% мас. до 5,0% мас., предпочтительно от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас., и количество второго полисахаридного производного, присутствующего во втором растворе предшественника, может составлять от 0,1% мас. до 5,0% мас., предпочтительно от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас. Кроме того массовое соотношение модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного, которые вводят совместной инъекцией, предпочтительно составляет от 15:85 до 85:15, более предпочтительно от 30:70 до 70:30, и наиболее предпочтительно от 40:60 до 60:40 или 50:50 (модифицированного производного гиалуроновой кислоты ко второму полисахаридному производному).

[126] Первый и второй растворы предшественников обычно имеют низкую комплексную вязкость от 0,001 Па⋅с до 5,0 Па⋅с, в частности, от 0,005 Па⋅с до 3,0 Па⋅с, предпочтительно от 0,01 Па⋅с до 2,0 Па⋅с, более предпочтительно от 0,1 Па⋅с до 1,8 Па⋅с, по результатам колебательных реологических измерений при 1 Гц и 25 °С. Кроме того, первый и второй растворы предшественников могут характеризоваться низким усилием инъекции от 0,01 Н до 15 Н, предпочтительно от 0,1 Н до 10 Н, более предпочтительно от 0,5 Н до 7,5 Н, и наиболее предпочтительно от 0,01 Н до 50 Н или от 1,0 Н до 5,0 Н, при измерении через иглу 30G (TSK Laboratory) при скорости выдавливания примерно 0,21 мм/с с использованием стандартного стеклянного шприца объемом 1,0 мл (BD Hypak SCF, длинный шприц RF-PRTC объемом 1 мл, ISO 11040, внутренний диаметр 6,35 мм).

[127] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, предпочтительно имеет комплексную вязкость от 0,1 Па⋅с до 100 Па⋅с, или от 0,1 Па⋅с до 75 Па⋅с, или от 1,0 Па⋅с до 75 Па⋅с, более предпочтительно от 1 Па⋅с до 50 Па⋅с, или от 5 Па⋅с до 50 Па⋅с, при измерении так, как описано выше. Кроме того, усилие инъекции указанной композиции предпочтительно составляет от 0,01 Н до 20 Н, или от 0,01 до 10 Н, более предпочтительно от 0,1 Н до 10 Н, и наиболее предпочтительно от 1,0 Н до 5,0 Н, при измерении так, как описано выше.

[128] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, которая попадает в тело пациента, т.е. смесь двух растворов предшественников, предпочтительно имеет общее содержание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного от 0,1% мас до 5,0% мас.

[129] В соответствии с настоящим изобретением, общее количество гидразид- и альдегид-функционализированных производных HA, присутствующих в жидкой композиции, предпочтительно составляет от 0,1% мас. до 5,0% мас., в частности, от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас. Кроме того, модифицирующее отношение гидразид-функционализированного производного HA к альдегид-функционализированному производному HA предпочтительно составляет от 15:85 до 75:25, более предпочтительно от 25:75 до 60:40, особенно предпочтительно от 40:60 до 60:40, и наиболее предпочтительно составляет 50:50.

[130] Инъецированная смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, быстро и эффективно подвергается поперечному сшиванию in situ с образованием ковалентно сшитого гидрогеля в требуемом месте тела. Для инициации реакции поперечного сшивания не нужны ни добавки, ни катализаторы, ни изменение рН, ни УФ излучение, а также любые другие внешние факторы воздействия (или «активаторы»). В частности, не используют или нет необходимости в сшивающем агенте. Единственным побочным продуктом, образующемся в реакции поперечного сшивания, обычно является вода, которая легко абсорбируется гидрогелем и/или окружающими тканями.

[131] Кроме того, образованный in situ поперечно-сшитый гидрогель демонстрирует благоприятные механические, химические и реологические свойства для применения в качестве материала филлера мягких тканей. В частности, он имеет высокую способность к созданию объема. Кроме того, in situ сшитый гидрогель согласно настоящему изобретению имеет пролонгированное время пребывания in vivo, сохраняя при этом способность к биоразложению. Кроме того, он может при необходимости содержать анестезирующие агенты (например, лидокаин) и различные другие компоненты (например, клетки, включая стволовые клетки и адипоциты, жиры, липиды, факторы роста и витамины). Таким образом, композиция, способная к поперечному сшиванию in situ, согласно настоящему изобретению особенно подходит для применения в качестве кожного филлера для эстетических целей.

[132] В десятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения поперечно-сшитого гидрогеля. Следует понимать, что предложенный способ осуществляют за пределами тела человека или животного. Или иными словами: Поперечно-сшитый гидрогель, полученный предложенным способом, представляет собой предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель. Предложенный способ включает следующие стадии:

Стадия a): Обеспечение буфера, указанного выше.

Стадия b): Добавление модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению (или полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению) и добавление второго полисахаридного производного, описанного выше, в указанный буфер. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второе полисахаридное производное можно добавлять в буфер одновременно или последовательно в любом возможном порядке. Необязательно, в буфер на стадии b) может быть добавлен несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновая кислота. Несшитый полисахарид также можно добавлять одновременно или последовательно с любым из модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного.

Стадия c): Поперечное сшивание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в указанном буфере с получением поперечно-сшитого геля.

Стадия d): Необязательное добавление несшитого полисахарида, как указано выше.

Стадия е): Необязательно просеивание и дегазирование гидрогеля, полученного на стадии c) или d).

Стадия f): Необязательное наполнение контейнера, предпочтительно шприца, более предпочтительно готового для применения шприца гидрогелем, полученным на стадии c), d) или e).

Стадия g): Необязательная стерилизация контейнера, содержащего гель, полученного на стадии f).

[133] Предпочтительно, стадия d) является частью предложенного способа. Также предпочтительно, стадии e), f) и g) являются частью предложенного способа. Более предпочтительно, стадии d), e), f) и g) являются частью предложенного способа.

[134] Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля согласно настоящему изобретению является весьма преимущественным по сравнению со способом получения поперечно-сшитого гидрогеля на основе BDDE. В частности, предложенный способ существенно проще и менее подвержен ошибкам. Это обусловлено тем, что в то время как способ получения гидрогеля на основе BDDE включает следующие общие стадии:

1. Растворение HA

2. Добавление BDDE

3. Реакция поперечного сшивания при повышенной температуре

4. Нейтрализация

5. Наполнение диализных пробирок

6. Диализ против буфера (например, PBS)

7. Регулирование концентрации геля и добавление добавок (например, смазывающей фазы, лидокаина и т.д.)

8. Просеивание и дегазирование

9. Наполнение шприца

10. Стерилизация,

способ согласно настоящему изобретению включает лишь следующие общие стадии:

1. Растворение обоих компонентов в буфере

2. Добавление смазывающей фазы, при ее использовании

3. Ожидание (реакция поперечного сшивания протекает уже при комнатной температуре)

4. Просеивание и дегазирование

5. Наполнение шприца

6. Стерилизация.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению включает существенно меньшее количество технологических стадий, в результате способ согласно настоящему изобретению существенно проще, быстрее и, следовательно, дешевле. Кроме того, поскольку в способе согласно настоящему изобретению может быть исключена диализная очистка, которая относительно подвержена ошибкам, то способ согласно настоящему изобретению характеризуется существенно меньшим риском контаминации. Кроме того, поскольку в способе согласно настоящему изобретению не требуется вредный BDDE, то способ согласно настоящему изобретению несет меньше риска для здоровья и окружающей среды.

[135] Обнаружено, что свойства, в частности, реологические свойства геля можно точно регулировать посредством степени модификации модифицированного производного гиалуроновой кислоты (а также второго полисахаридного производного). Кроме того, свойства, в частности, реологические свойства геля можно точно регулировать посредством изменения концентрации полимера в буфере. В целом, высокая концентрация полимера приводит к получению поперечно-сшитого гидрогеля с высоким динамическим модулем упругости (G’). Предпочтительно, концентрация модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению в буфере составляет от 1 г/л до 40 г/л, более предпочтительно от 2 г/л до 30 г/л, еще более предпочтительно от 5 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 10 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 12 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 15 г/л до 25 г/л. Предпочтительно, концентрация второго полисахаридного производного в буфере составляет от 1 г/л до 40 г/л, более предпочтительно от 2 г/л до 30 г/л, еще более предпочтительно от 5 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 10 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 12 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 15 г/л до 25 г/л.

[136] Предпочтительно, поперечное сшивание на стадии c) осуществляют в течение от 1 часа до 24 часов, более предпочтительно от 2 часов до 20 часов, еще более предпочтительно от 2 часов до 18 часов, еще более предпочтительно от 2 часов до 16 часов, еще более предпочтительно от 3 часов до 16 часов, еще более предпочтительно от 4 часов до 15 часов, еще более предпочтительно от 4 часов до 14 часов, еще более предпочтительно от 5 часов до 12 часов, еще более предпочтительно 6 часов до 10 часов, еще более предпочтительно от 7 часов до 9 часов, еще более предпочтительно примерно 8 часов.

[137] Предпочтительно, поперечное сшивание на стадии c) осуществляют при температуре от 20°С до 35°С, более предпочтительно от 20°С до 30°С, еще более предпочтительно от 20°С до 25°С.

[138] В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, на стадии b) добавляют несшитый полисахарид. В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации, несшитый полисахарид добавляют на стадии d). В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации, несшитый полисахарид добавляют на стадиях b) и d). Предпочтительно, несшитый полисахарид добавляют на стадии b) и/или d), так что он присутствует в конечной концентрации от 1% мас. до 30% мас. относительно общего количества полисахарида, более предпочтительно от 5% мас. до 20% мас., еще более предпочтительно от 7% мас. до 15% мас., еще более предпочтительно от 8% мас. до 12% мас., еще более предпочтительно от 9% мас. до 11% мас., еще более предпочтительно примерно 10% мас.

[139] В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к набору для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащему (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, описанный выше, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, описанный выше.

[140] Следует понимать, что к данному аспекту также относятся различные варианты реализации первого и второго растворов предшественников, описанные выше. Они включают, например, предпочтительное присутствие первого и второго растворов предшественников в различных камерах многокамерного шприца, предпочтительно двухкамерного шприца. Система многокамерного шприца, содержащая первый и второй растворы предшественников в различных камерах, также может быть упомянута как «система доставки».

[141] Предложенный набор может дополнительно содержать инструкции по применению.

[142] Термин «контейнер» не имеет специального ограничения и включает, например, стеклянные или пластиковые бутылки, флаконы, карпулы или любой другой герметичный контейнер.

[143] «Инструкции по применению» предпочтительно представляют собой инструкции по применению в эстетических или терапевтических целях, в частности, для замены или заполнения биологической ткани, или увеличения объема биологической ткани с эстетической или терапевтической целью, как описано в данном документе, или, особенно предпочтительно, инструкции по применению в качестве кожного филлера для эстетического применения.

[144] Далее настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

[145] Химические реагенты

Химические реагенты, использованные в контексте настоящего изобретения, приобретали у следующих поставщиков и использовали без дополнительной очистки:

Материал Поставщик Модифицированная глицерином HA (Mw =1,4 МДа, MoD = 10-20%) HTL Biotechnology HA HTL Biotechnology Модифицированная гидразидом HA Merz Pharmaceuticals GmbH
Синтезирована способом D’Este et al., Carbohydr. Polym. 2014, 108:239-246 Периодат натрия Merck Этиленгликоль Sigma Aldrich NaCl Merck Этанол (денатурированный 1% метилэтилкетоном) VWR Очищенная вода Merz GmbH & Co. KGaA Гидразид тирозина Sigma Aldrich

[146] Оборудование

В контексте настоящего изобретения использовали следующее лабораторное оборудование:

Оборудование Описание Система очищенной воды ELIX 20 Различное лабораторное оборудование Весы, мензурки, мешалки, пипетки Вакуумная печь Memmert VO400 Реометр Реометр Anton Paar Physica MCR 302 Автоклав Systec HX 150

[147] Общий способ синтеза производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению

Модифицированную глицерином HA (в форме порошка или волокон) взвешивании, добавляли необходимое количество растворителя (очищенной воды или буфера) и перемешивали смесь с получением однородного раствора полимера. Затем добавляли окислительный агент (периодат натрия) и энергично перемешивали раствор в течение требуемого времени. Для остановки реакции добавляли гаситель (например, вицинальный диол (1,2-диол), предпочтительно этиленгликоль), затем добавляли NaCl. Осуществляли очистку, выливая реакционную смесь в органический растворитель (например, этанол или изопропанол). Собирали осадок и снова растворяли в солевом растворе, затем проводили повторное осаждение в органическом растворителе (например, этаноле). Продукт собирали, промывали органическим растворителем (например, этанолом) и сушили под вакуумом в течение некоторого времени (например, в течение ночи).

Определение характеристик

[148] 1. Молекулярная масса

Молекулярную массу материала определяли с помощью эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоугловым рассеянием света, рефрактометрического детектора и вискозиметра. Образец получали посредством растворения 2 мг высушенной модифицированной HA в 10 мл буфера PBS в течение 4 часов при 25°С и получением концентрации 0,2 мг/мл. Затем раствор образца фильтровали через 0,45 мкм фильтр в пробирку объемом 1,8 мл для хроматографии. Затем 50 мкл полученного раствора вводили в систему (элюент буфер PBS, скорость потока 0,7 мл/мин, температура колонки 35 °С). Иллюстративная хроматограмма представлена на фиг. 1.

[149] 2. Степень модификации

Степень модификации альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению измеряли с помощью ¹H ЯМР. А именно, полученное альдегид-модифицированное производное гиалуроновой кислоты сначала метили гидразидом тирозина: 66 мг альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты растворяли в 15 мл воды, затем добавляли 88 мг гидразида тирозина. Реакцию проводили в течение 20 часов и затем добавляли 150 мг NaCl. Реакционную смесь осаждали в 75 мл этанола. Осадок собирали и растворяли в солевом растворе (150 мг NaCl в 15 мл воды). Снова проводили осаждение в этаноле. Твердое вещество собирали и сушили под вакуумом. Затем меченое производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом, обрабатывали для проведения измерения ¹H ЯМР, расщепляя 20 мг материала с помощью 300 единиц гиалуронидазы при 40°С в течение ночи. Затем определяли MoD, сравнивая площадь пика при около 6,9 м.д. (ароматические протоны гидразида тирозина) с площадью пика при около 2,0 м.д. (протоны -CH₃ в полимерном скелете). Иллюстративный спектр ¹H ЯМР альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты с тирозиновой меткой представлен на фиг. 2.

[150] Пример 1 (вливание концентрации исходного материала (модифицированной глицерином HA) на молекулярную массу и MoD модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Время реакции поддерживали постоянным, 10 минут, использовали 0,1 экв. NaIO₄ и проводили реакцию при 22°С. Изменяли концентрацию модифицированной глицерином HA.

Влияние модифицированной глицерином HA на свойства полученных материалов показано в следующей таблице:

Пример c (модифицированной глицерином HA) / г л^-1 MoD / % Mw / МДа 1.1 4 2,1 1,1 1.2 12 4,5 0,9 1.3 24 5,7 0,7 1.4 36 6,1 0,6

[151] Пример 1.1

Брали навеску 1,49 г модифицированной глицерином HA (потери при высушивании (LoD) составили 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,074 г (0,35 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления быстро добавляли 3,9 мл (69 ммоль) этиленгликоля. Затем при перемешивании добавляли 1,75 г NaCl до получения однородной смеси и осаждали раствор в 1,75 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 1,75 г NaCl и растворяли компоненты в 350 мл воды. Однородную смесь выливали в 1,75 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 2,1% (моль/моль) и Mw 1,1 МДа.

[152] Пример 1.4

Брали навеску 13,4 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,663 г (3,1 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления быстро добавляли 34,7 мл (620 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 2800 мл воды и 16 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 16 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 16 г NaCl и растворяли компоненты в 3000 мл воды. Однородную смесь выливали в 16 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,1% (моль/моль) и Mw 0,6 МДа.

[153] Пример 2 (вливание количества окислительного агента (периодата натрия) на молекулярную массу и MoD модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Концентрацию модифицированной глицерином HA в реакционной смеси поддерживали постоянной при 12 г/л, время реакции составляло 10 минут, и реакцию проводили при комнатной температуре. Единственным параметром, который изменяли, было количество периодата натрия. Свойства полученных материалов представлены в следующей таблице (где указано количество эквивалентов NaIO₄ относительно молярной массы дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином):

Пример экв. NaIO₄ MoD / % Mw / МДа 2.1 0,05 2,9 1,0 2.2 0,1 4,5 0,9 2.3 0,15 5,9 0,8 2.4 0,2 6,8 0,6

[154] Пример 2.1

Брали навеску 4,48 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,11 г (0,51 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 11,6 мл (207 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 700 мл воды и 5,25 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 5 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 5,25 г NaCl и растворяли компоненты в 1000 мл воды. Однородную смесь выливали в 5 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 2,9% (моль/моль) и Mw 1,0 МДа.

[155] Пример 2.4

Брали навеску 4,48 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,44 г (2,1 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 11,6 мл (207 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 700 мл воды и 5,25 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 5 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 5,25 г NaCl и растворяли компоненты в 1000 мл воды. Однородную смесь выливали в 5 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,8% (моль/моль) и Mw 0,6 МДа.

[156] Пример 3 (влияние времени реакции на молекулярную массу и MoD производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Концентрацию HA, модифицированной глицерином, в реакционной смеси поддерживали постоянной при 12 г/л, использовали 0,1 экв. NaIO₄ и проводили реакцию при 22°С. Единственным параметром, который изменяли, было время реакции. Свойства полученных материалов представлены в следующей таблице:

Пример Время реакции / мин. MoD / % Mw / МДа 3.1 10 4,5 0,9 3.2 15 5,7 0,7 3.3 20 5,9 0,8 3.4 60 6,1 0,7

[157] Пример 3.4

Брали навеску 4,93 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 345 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,22 г (1,0 ммоль) периодата натрия, растворенного в 39 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 60 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 12,7 мл (227 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 770 мл воды и 6 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 6 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 6 г NaCl и растворяли компоненты в 1100 мл воды. Однородную смесь выливали в 6 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,1% (моль/моль) и Mw 0,7 МДа.

[158] Пример 4: Применение производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, для получения in situ гидрогелей

Гиалуроновую кислоту, содержащую альдегидные группы, можно использовать для получения in situ гидрогелей, способных к поперечному сшиванию. А именно, натриевая соль гиалуроновой кислоты, содержащая альдегидную группу (электрофильную группу), может ковалентно взаимодействовать с полисахаридом, содержащим нуклеофильную группу (например, гидразидную группу), с образованием in situ поперечно-сшитого геля. В зависимости от степени модификации и от молекулярной массы производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, могут быть получены гели с различными реологическими свойствами.

Для проверки характеристик гелеобразования полученного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, материал растворяли в воде или буфере, наполняли им стеклянные шприцы и стерилизовали. Таким же образом, натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом, также растворяли в воде или буфере, наполняли шприцы и стерилизовали. Затем смешивали содержимое двух растворов и оставляли полимеры для поперечного сшивания (химического взаимодействия) друг с другом. А именно, гидразидная группа одного полимера вступала во взаимодействие с альдегидной группой другого материала, и в результате образования гидразонной связи (см. приведенную ниже схему) получали гель. Описывали характеристики полученных гелей, измеряя их реологические свойства через 24 часа после смешивания. Динамический модуль упругости (G') измеряли при 25°С, используя реометр, оснащенный системой с геометрией типа «конус-плита» (диаметр 50 мм, угол 0,1°, CP50-1, размер зазора 0,1 мм). Образцы подвергали осцилляции при напряжении 1 Па, используя частотное сканирование от 0,1 до 10 Гц, при этом указанные значения получены при 1 Гц.

Пример 4.1:

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 1.1: MoD = 2,1%, Mw = 1,1 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22°С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 68 Па.

Пример 4.2:

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 2,1: MoD = 2,9%, Mw = 1,0 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22°С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 164 Па.

Пример 4.3:

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 2,4: MoD = 6,8%, Mw = 0,6 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22 °С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 277 Па.

[159] Пример 5 (важность применения HA, модифицированной глицерином, в реакции окисления)

Известно, что альдегидные группы могут быть внедрены в структуру углеводов посредством окисления периодатом натрия. Однако необходимое время реакции для такого синтеза является продолжительным, и реакция приводит к существенному уменьшению молекулярной массы полимера вследствие окисления полимерного скелета. Во избежание этого можно использовать для окисления HA, модифицированную глицерином, поскольку боковые глицериновые звенья более доступны для окисления, чем гидроксильные группы скелета HA. Для подтверждения этого проводили окисление нативной HA и HA, модифицированной глицерином, в одинаковых условиях и проверяли их свойства. Условия реакции: концентрация полимера: 12 г/л; температура реакции: 22°С и 0,1 экв. периодата натрия (относительно количества повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты). Характеристики гелеобразования окисленной нативной HA и окисленной HA, модифицированной глицерином, представлены в следующей таблице:

HA Время реакции / мин. G’ / Па модифицированная глицерином HA 10 138,0 нативная HA 10 0,3 модифицированная глицерином HA 60 304,1 нативная HA 60 0,2

Полученные результаты демонстрируют, что в мягких условиях, использованных для окисления модифицированной глицерином HA, нативная HA не может обеспечивать получение материала, способного образовывать гель при его смешивании с раствором гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом.

[160] Пример 6 (получение предварительно образованных гидрогелей)

Получали два геля с различными концентрациями [10 мг/мл (пример 6,1); 20 мг/мл (пример 6.2)].

Пример 6.1

2,5 г модифицированной гидразидом HA (средняя молекулярная масса 1,5 МДа и степень модификации 2,1%) и 2,5 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; средняя молекулярная масса 1,1 МДа и степень модификации 4,3%) взвешивали в чашке Kenwood, затем добавляли 450 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7, с содержанием 2% мас. маннита и 0,3% мас. лидокаина). Смесь перемешивали в течение 8 часов, затем добавляли 50 мл раствора, содержащего несшитую HA в концентрации 10 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, и затем наполняли полученным продуктом шприцы и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 минут. Описывали характеристики геля, измеряя реологические свойства (до и после стерилизации), усилие выдавливания (после стерилизации), рН и осмоляльность. Полученные данные представлены в следующей таблице:

Продукт Концентрация полимера / мг⋅мл^-1 G’ до стерилизации / Па G’ после стерилизации / Па Усилие выдавливания / Н (игла 30G TSK) pH Осмоляльность / мОсм⋅кг^-1 Гель, полученный в примере 6.1 10 152 24 28,4 6,86 341

Пример 6.2

5,0 г модифицированной гидразидом HA (средняя молекулярная масса 1,5 МДа и степень модификации 2,1%) и 5,0 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; средняя молекулярная масса 1,1 МДа и степень модификации 4,3%) взвешивали в чашке Kenwood, затем добавляли 450 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7, с содержанием 2% мас. маннита и 0,3% мас. лидокаина). Смесь перемешивали в течение 8 часов, затем добавляли 50 мл раствора, содержащего несшитую HA в концентрации 20 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, и затем наполняли полученным продуктом шприцы и стерилизовали при 127 °С в течение 6,5 минут. Описывали характеристики геля, измеряя реологические свойства (до и после стерилизации), усилие выдавливания (после стерилизации), рН и осмоляльность. Полученные данные представлены в следующей таблице:

Продукт Концентрация полимера / мг⋅мл^-1 G’ до стерилизации / Па G’ после стерилизации / Па Усилие выдавливания / Н (игла 27G TSK) pH Осмоляльность / мОсм⋅кг^-1 Гель, полученный в примере 6.2 20 823 243 23,4 6,77 371

Как показано в примерах 6.1 и 6.2, свойства полученного гидрогеля можно точно регулировать, просто изменяя концентрацию полимера.

[161] Пример 7 (теплостойкость гелей, полученных способом согласно настоящему изобретению)

Для испытания теплостойкости предварительно образованных гелей, полученных способом согласно настоящему изобретению, получали два состава и помещали в печь при 40°С. Реологические свойства геля определяли в разные моменты времени (0, 3, 6, 9 и 12 недель).

Гель 1:

0,45 г модифицированной гидразидом HA (молекулярная масса 1,8 МДа и степень модификации 3,7%) растворяли в шприце в солевом растворе, содержащем 0,6% мас. лидокаина. Во втором шприце растворяли 0,45 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; молекулярная масса 1,2 МДа и степень модификации 3,7%) в 30 мл 25 мМ буфера PBS (который содержал 1,25 г маннита).

Шприцы, содержащие раствор HA-гидразида и раствор HA-альдегида, соединяли с помощью люэровского наконечника и энергично перемешивали их содержимое. Затем полученной однородной смесью наполняли стеклянные шприцы BD и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 мин. Шприцы с гелем помещали в печь при 40 °С.

Гель 2:

0,45 г модифицированной гидразидом HA (молекулярная масса 1,8 МДа и степень модификации 3,7%) растворяли в шприце в солевом растворе, содержащем 0,6% мас. лидокаина. Во втором шприце растворяли 0,45 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; молекулярная масса 1,2 МДа и степень модификации 3,7%) в 30 мл 3 мМ буфера PBS (без маннита).

Шприцы, содержащие раствор HA-гидразида и раствор HA-альдегида, соединяли с помощью люэровского наконечника и энергично перемешивали их содержимое. Затем полученной смесью наполняли стеклянные шприцы и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 мин. Шприцы с гелем помещали в печь при 40°С.

Результаты представлены на фиг. 3 и 4. Показано, что оба геля демонстрируют одинаковую и высокую теплостойкость.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая модифицированное производное гиалуроновой кислоты (варианты), способ получения модифицированного производного гиалуроновой кислоты, применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для эстетической медицины для обработки морщин и складок кожи, применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты для in vitro получения поперечно-сшитого гидрогеля, поперечно-сшитый гидрогель (варианты), способ получения поперечно-сшитого гидрогеля (варианты), набор для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля. Изобретение расширяет арсенал модифицированных производных гиалуроновой кислоты. 10 н. и 22 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл., 7 пр.

1. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты, в котором группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.

2. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 1, отличающееся тем, что ион щелочного металла представляет собой Na.

3. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 1 или 2, отличающееся тем, что степень модификации составляет от 1,0% до 20,0%, предпочтительно от 1,0% до 15,0%, более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, более предпочтительно от 2,0% до 6,9%, степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты, и/или тем, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.

4. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, иона щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.

5. Способ получения модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4, включающий следующие стадии:

a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH;

b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином;

c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом, предпочтительно периодатом, более предпочтительно периодатом натрия, для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом.

6. Способ по п. 5, дополнительно включающий одну или более следующих стадий:

d) необязательное прекращение реакции на стадии c), предпочтительно посредством добавления вицинального диола (1,2-диола), более предпочтительно этиленгликоля;

e) необязательная очистка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, предпочтительно посредством осаждения модифицированного производного гиалуроновой кислоты в органическом растворителе, предпочтительно этаноле, изопропаноле или их смеси, повторное растворение осадка в солевом растворе и повторное осаждение модифицированного производного гиалуроновой кислоты в указанном органическом растворителе;

f) необязательная сушка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного на стадии e).

7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 5,0 МДа, предпочтительно от 1,0 до 3,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 МДа, еще более предпочтительно от 1,1 до 1,9 МДа, еще более предпочтительно от 1,2 до 1,8 МДа, еще более предпочтительно от 1,3 до 1,7 МДа, еще более предпочтительно от 1,4 до 1,6 МДа и/или степень модификации от 5 до 25%, предпочтительно от 10 до 20%, степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в гиалуроновой кислоте, модифицированной глицерином,

и/или тем, что

(i) стадию c) проводят при температуре от 4 до 35°С, предпочтительно от 15 до 35°С, более предпочтительно от 20 до 30°С, еще более предпочтительно от 20 до 25°С, еще более предпочтительно примерно от 21 до 23°С, еще более предпочтительно примерно 22°С; и/или

(ii) стадию c) проводят на протяжении от 5 до 120 минут, предпочтительно от 5 до 65 минут, более предпочтительно от 10 до 60 минут, еще более предпочтительно от 10 до 50 минут, еще более предпочтительно от 10 до 40 минут, еще более предпочтительно от 10 до 30 минут, еще более предпочтительно от 10 до 20 минут; и/или

(iii) окислительный агент присутствует в количестве от 0,01 до 0,5 молярного эквивалента, предпочтительно от 0,01 до 0,3 молярного эквивалента, более предпочтительно от 0,04 до 0,3 молярного эквивалента, еще более предпочтительно от 0,04 до 0,1 относительно молярного количества дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; и/или

(iv) указанная гиалуроновая кислота, модифицированная глицерином, присутствует в количестве от 2 до 50 г/л, предпочтительно от 2 до 40 г/л, более предпочтительно от 3 до 38 г/л, более предпочтительно от 4 до 36 г/л.

8. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом по любому из пп. 5-7, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из H, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.

9. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 8, отличающееся тем, что ион щелочноземельного металла представляет собой Na.

10. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 8 или 9, отличающееся тем, что указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты

(i) имеет степень модификации от 1,0% до 20%, предпочтительно от 1,0% до 15,0%, более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, более предпочтительно от 2,0% до 6,9%, степень модификации определяют как количество групп CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты, и/или

(ii) имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа

и

необязательно дополнительно содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры

где R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, соли щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.

11. Применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для эстетической медицины для обработки морщин и складок кожи, включая межбровные морщины, носогубные складки, складки на подбородке, морщины марионетки, нижнюю часть овала лица, морщины на щеках, окологубные морщины и «гусиные лапки», атрофические рубцы, шрамы, виски, подкожное крепление бровей, жировые подушки на скулах и щеках, слезные борозды, нос, губы, щеки, подбородок, окологубную зону, подглазничную область и/или лицевую асимметрию.

12. Применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для in vitro получения поперечно-сшитого гидрогеля, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты.

13. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения, предпочтительно для лечения стрессового недержания мочи, сухости влагалища, везикоуретерального рефлюкса, недостаточности голосовых связок и/или медиализации голосовых связок.

14. Применение по любому из пп. 11-12 или модифицированное производное гиалуроновой кислоты для применения по п. 13, отличающиеся тем, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем второе полисахаридное производное предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, и при этом второй полисахарид более предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:

15. Применение по п. 14 или модифицированное производное гиалуроновой кислоты для применения по п. 14, отличающиеся тем, что

(i) альдегидная группа модифицированного производного HA и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при совместной инъекции модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в требуемое место тела субъекта, с образованием поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте, или

(ii) альдегидная группа модифицированного производного HA и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при приведении в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного, причем предпочтительно модифицированное производное HA и второе полисахаридное производное находятся в буферной среде, предпочтительно в физиологической буферной среде.

16. Поперечно-сшитый гидрогель, содержащий следующее структурное звено:

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.

17. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 16, отличающийся тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель представляет собой поперечно-сшитый гидрогель, полученный in vitro.

18. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 17, отличающийся тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновую кислоту, и/или тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит анестезирующий агент, предпочтительно лидокаин.

19. Поперечно-сшитый гидрогель, полученный посредством приведения в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 и второго полисахаридного производного, содержащего одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем указанное второе полисахаридное производное представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, причем указанный поперечно-сшитый гидрогель содержит следующее структурное звено:

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.

20. Поперечно-сшитый гидрогель по любому из пп. 16-19, отличающийся тем, что ион щелочного металла представляет собой Na.

21. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 19, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют in situ.

22. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 19, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют in vitro, причем указанное приведение в контакт предпочтительно осуществляют в буфере, предпочтительно физиологическом буфере.

23. Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля, включающий следующие стадии:

a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное;

b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; и

c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в требуемое место тела пациента с получением поперечно-сшитого геля в требуемом месте.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что на стадии a) первый раствор предшественника и второй раствор предшественника находятся в различных камерах многокамерного шприца, и смешивание на стадии b) происходит во время выдавливания из указанного многокамерного шприца.

25. Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля, включающий следующие стадии:

a) обеспечение буфера;

b) добавление модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 и добавление в буфер второго полисахаридного производного;

c) поперечное сшивание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в указанном буфере с получением поперечно-сшитого гидрогеля.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что стадия b) дополнительно включает добавление в буфер несшитого полисахарида, причем указанный несшитый полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту.

27. Способ по п. 25 или 26, дополнительно включающий добавление несшитого полисахарида к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному на стадии c).

28. Способ по любому из пп. 25-27, дополнительно включающий просеивание и дегазирование гидрогеля, полученного на стадии c).

29. Способ по любому из пп. 25-28, дополнительно включающий наполнение контейнера, предпочтительно шприца, более предпочтительно готового для применения шприца гидрогелем, полученным на стадии c).

30. Способ по п. 29, дополнительно включающий стерилизацию контейнера, содержащего гель.

31. Набор для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащий (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, который содержит модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, который содержит второе полисахаридное производное.

32. Набор по п. 31, дополнительно содержащий (iii) инструкции по применению.