СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОПЕРЕЧНО-СШИТОГО ГЕЛЯ Российский патент 2016 года по МПК C08J3/75 C08B37/00 A61K8/73 

Предметом настоящего изобретения является предложение способа получения гидрогелей на основе поперечно-сшитого полисахарида, и предпочтительно на основе гиалуроновой кислоты или одной из ее солей.

Являясь естественным компонентом кожи, гиалуроновая кислота известна своими вязкоупругими свойствами, а также своей очень большой склонностью поглощать воду. В большой степени эластичность кожи объясняется свойствами гиалуроновой кислоты. Благодаря таким свойствам, как биосовместимость, переносимость и отсутствие токсичности, на протяжении более чем десятилетия эта молекула находила применение в медицинских и косметических областях, и, в частности, для заполнения морщин. Таким образом, введение гидрогеля на основе поперечно-сшитого полисахарида в слой дермы в область морщин, нуждающуюся в обработке, помогает уменьшить или даже устранить локальное провисание в структуре дермы, т.е. морщину.

Как правило, полисахарид и, в частности, гиалуроновая кислота, используется в поперечно-сшитой форме, благодаря более высокой устойчивости данной формы к деградации и нагреву.

Такие гели на основе поперечно-сшитых полисахаридов могут быть получены с помощью различных способов получения. В этих способах обычно требуется две основных стадии, причем первая заключается в гидратировании полисахарида, о котором идет речь, для превращения его в водный гель, а вторая направлена на поперечное сшивание указанного геля в присутствии агента, который соответственно обычно приводит к образованию поперечных связей.

Как правило, общепринятые способы образования поперечных связей в гиалуроновой кислоте проводят при температуре около 40°C или даже 50°C, в течение менее 3 часов, тем самым делая возможным образование поперечных связей в полисахаридном геле удовлетворительным образом. Именно по этой причине этот способ получения широко используется в промышленности.

В качестве иллюстраций этих способов можно особенно упомянуть способы, описанные в США 2006/0105022, который включает применение смеси, содержащей по меньшей мере 10% гиалуроновой кислоты, сшивающий агент и воду, в кислотной или основной средах, в WO 2006/056204, который включает стадию обработки геля на основе поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты дивинилсульфоном, и в США 2007/0036745, в котором в результате получается вязкий гель, начиная с полимера гиалуронана, поперечно-сшитого дивинилсульфоном (DVS).

По очевидным причинам, актуальной задачей является улучшение механических свойств гидрогелей для применения в медицинских и косметических областях.

Целью настоящего изобретения, в особенности, является предложение способа получения поперечно-сшитых гелей, обладающих чрезвычайно благоприятными механическими свойствами.

Вопреки всем ожиданиям, обнаружили, что новый способ получения поперечно-сшитых гелей позволяет значительно улучшить свойства указанных гелей по сравнению со свойствами, проявляемыми гелями, полученными с помощью традиционного способа.

Таким образом, настоящее изобретение согласно первому из его аспектов относится к способу получения поперечно-сшитого геля на основе по меньшей мере одного полисахарида или одной из его солей, включающему по меньшей мере стадии, заключающиеся в:

a) получении водного геля, содержащего по меньшей мере один поперечно-несшитый полисахарид вместе с по меньшей мере одним бифункциональным или многофункциональным эпоксидным сшивающим агентом, при температуре ниже 35°C;

b) выдерживании смеси, полученной на стадии a), при температуре ниже 35°C в течение по меньшей мере одного часа;

c) индуцировании реакции поперечной сшивки смеси, полученной после стадии b), и, в случае необходимости;

d) восстановлении указанного выше образовавшегося поперечно-сшитого геля.

Точнее, на основе неожиданного наблюдения в настоящем изобретении установлено, что последовательное применение двух различных скоростей поперечной сшивки, причем первая является очень низкой, а вторая - значительно более высокой, позволяет получать гели на основе поперечно-сшитого полисахарида, обладающие вязкоупругими свойствами, значительно улучшенными по сравнению со свойствами гелей, полученных с помощью традиционных способов, предусматривающих использование одной скорости поперечной сшивки.

Как становится очевидным из Примера 3, приведенного ниже, новые вязкоупругие свойства, проявляемые поперечно-сшитыми гелями, полученными при осуществлении способа по настоящему изобретению, никоим образом не могут быть воспроизведены с гелем, полученным по традиционному способу поперечной сшивки, иными словами, используя для проведения указанной выше реакции поперечной сшивки одну скорость реакции, применяемую при температуре выше 40°C, даже когда данная одна скорость реакции поддерживается в течение длительного периода времени.

Согласно одному конкретному воплощению способ по настоящему изобретению может, кроме того, включать стадию e) остановки реакции поперечной сшивки, заключающуюся в том, чтобы помещать поперечно-сшитый гель в условия, благоприятные для остановки реакции его поперечной сшивки, при этом эту стадию возможно проводить перед, во время или после стадии восстановления d).

Согласно предпочтительному воплощению стадию e) выполняют перед стадией d).

Преимущественно, поперечно-сшитый гель, полученный при осуществлении способа согласно настоящему изобретению, представляет собой однофазный гель и, в частности, главным образом упругий вязкоупругий гель, иными словами, который обладает слабой или лишен текучести при отсутствии нагрузок, кроме собственной массы.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения данное изобретение относится к применению поперечно-сшитого геля, полученного при осуществлении способа, определенного выше, для длительного заполнения объемных дефектов кожи и особенно для заполнения морщин.

I) Способ

Способ по изобретению включает на первой стадии приготовление водного геля, содержащего по меньшей мере один полисахарид в поперечно-несшитой форме вместе с бифункциональным или многофункциональным эпоксидным сшивающим агентом.

Термин "поперечно-несшитый" в контексте настоящего изобретения означает водный полисахаридный гель, который не является поперечно-сшитым или сшит в незначительной степени, иными словами, гель, имеющий угол фазового сдвига 6 более 40°, оцененный в динамических реологических условиях при 1 Гц, под действием напряжения выше 1 Па.

В частности, водный гель, рассмотренный на стадии a), может быть получен заранее путем объединения в соответствующем сосуде:

(i) водной среды;

(ii) по меньшей мере одного полисахарида или одной из его солей, в поперечно-несшитой форме; и

(iii) по меньшей мере одного бифункционального или многофункционального эпоксидного сшивающего агента, и путем гомогенизации полученной таким образом смеси, причем порядок добавления вышеуказанных соединений (i), (ii) и (iii) в сосуд не имеет значения.

Согласно первому воплощению этот водный гель может быть образован путем помещения в сосуд водной среды и полисахарида, причем полученную таким образом смесь одновременно и/или впоследствии гомогенизируют, а затем путем добавления сшивающего агента с одновременной и/или последующей гомогенизацией.

Согласно второму воплощению данный водный гель может быть получен путем помещения в сосуд водной среды, полисахарида и сшивающего агента, причем полученную таким образом смесь в то же самое время и/или впоследствии гомогенизируют.

Данное второе воплощение является предпочтительным, поскольку стадию гомогенизации в этом случае проводят один раз.

Преимущественно, данная стадия образования водного геля может быть выполнена при температуре ниже 35°C, предпочтительно при температуре от 15 до 25°C и более предпочтительно при комнатной температуре.

Каким бы ни было рассматриваемое воплощение, образование водного геля, рассматриваемое на стадии a), включает проведение гомогенизации по меньшей мере один раз.

Целью этой операции, независимо от того, проводят ее в присутствии сшивающего агента или нет, в частности, является полная гидратация и гомогенизация полисахарида в водной среде и, в случае необходимости, сшивающего агента, с тем, чтобы помочь оптимизировать свойства предлагаемого поперечно-сшитого геля.

По этим причинам однородность поперечно-сшитого геля тесно зависит от однородности геля перед реакцией поперечной сшивки.

Гомогенизацию считают удовлетворительной, когда полученный раствор является однородным по цвету, без агломератов и однородным по вязкости. Гомогенизацию можно преимущественно выполнять в мягких условиях, с тем чтобы не допустить деградации полисахаридных цепей.

Эта стадия более важна, когда полисахарид имеет высокую молекулярную массу, поскольку гидратация такого соединения, как правило, приводит к образованию раствора с высокой вязкостью, в котором появление агломератов - обычное явление.

Продолжительность данной стадии гомогенизации зависит от природы полисахарида и, в частности, от его молекулярной массы и концентрации, от рабочих условий, в которых используют водную среду и гомогенизатор.

Регулирование времени гомогенизации, необходимого для получения достаточно однородного водного полисахаридного геля, находится в пределах общей квалификации специалиста в данной области техники.

Предпочтительно, стадия гомогенизации согласно настоящему изобретению может протекать в течение периода времени менее 200 минут, предпочтительно менее 150 минут или даже между 15 и 100 минутами.

Как следует из вышеизложенного, для водного геля стадии a) применяют реакции поперечной сшивки с двумя разными скоростями, одну за другой, причем они проиллюстрированы стадиями b) и c) способа по данному изобретению соответственно.

Целью поперечной сшивки является создание мостиков между полисахаридными цепями, в частности между цепями гиалуроновой кислоты, что позволяет получить из вязкого раствора плотную твердую трехмерную сеть.

i) Условия проведения стадии b)

Стадия b) включает в себя выдерживание смеси, полученной на стадии a), при температуре ниже 35°C в течение по меньшей мере одного часа;

Таким образом, стадия b), во внешних условиях, в которых ее проводят, совместима только с низкой скоростью поперечной сшивки.

Предпочтительно, стадию b) осуществляют при температуре в диапазоне от 15 до 25°C, и более предпочтительно при комнатной температуре.

Низкая скорость поперечной сшивки, рассмотренная на стадии b), может в частности характеризоваться скоростью исчезновения эпоксидного сшивающего агента в смеси, полученной на стадии a).

Таким образом, средняя скорость исчезновения эпоксидного сшивающий агента во время стадии b) ниже, чем 5 млн^-1/мин, предпочтительно ниже, чем 2 млн^-1/мин, при условии, что концентрация гиалуроновой кислоты составляет 20 мг/г.

Предпочтительно, стадия b) протекает в течение периода более одного часа, предпочтительно более двух часов.

Предпочтительно, стадия b) может быть проведена в течение периода времени от 1 до 2 часов 30 мин, и более предпочтительно от 1 часа 30 минут до 2 часов.

ii) Условия проведения стадии c)

Стадия c) включает в себя стимулирование реакции поперечной сшивки.

Таким образом, термин "стимулирование" в контексте настоящего изобретения следует понимать как значительное увеличение скорости реакции поперечной сшивки.

Особые условия, которые должны быть приняты для того, чтобы стимулировать реакцию поперечной сшивки, могут зависеть от природы полисахарида, его молекулярной массы, от водной среды и от природы сшивающего агента.

Как правило, это стимулирование может быть достигнуто путем приведения смеси, полученной на стадии b), в контакт с инициатором реакции, или путем стимулирующего фактора, такого как, например, нагрев или воздействие УФ-, или даже путем приведения вышеуказанной смеси в контакт с материалом каталитического типа.

Выбор такого инициатора реакции находится в пределах общей квалификации специалиста в данной области техники.

Таким образом, в качестве инициатора реакции может быть использовано:

- погружение сосуда, содержащего смесь, полученную на стадии b), в ванну, содержащую горячую жидкость;

воздействие на вышеуказанную смесь излучением с определенными длинами волн, например, УФ или микроволновым, или даже инфракрасным излучением;

- облучение с помощью ионизирующего излучения согласно способу, описанному в документе США 2008/0139796; и

- ферментативная поперечная сшивка.

В контексте настоящего изобретения данный инициатор реакции предпочтительно представлен повышением температуры, воздействующей на смесь, полученную на стадии b).

Особенно подходящая для стадии c) температура зависит от природы рассматриваемого полисахарида.

Если полисахаридом является гиалуроновая кислота, то наиболее подходящая для стадии c) температура находится в интервале между 35°C и 60°C, предпочтительно между 45 и 55°C, и более предпочтительно между 48 и 52°C.

В случае стадии b), описанной выше, быстрая скорость поперечной сшивки, рассмотренная на стадии c), может в частности отличаться скоростью исчезновения эпоксидного сшивающего агента в смеси, полученной на стадии a).

Таким образом, средняя скорость исчезновения сшивающего агента во время стадии c) выше, чем 5 млн^-1/мин, предпочтительно выше, чем 7 млн^-1/мин, при условии, что концентрация гиалуроновой кислоты составляет 20 мг/г.

Степень поперечной сшивки также зависит от времени, в течение которого происходит реакция поперечной сшивки, которой подвергают смесь, полученную на стадии b). Чем длительнее время реакции, тем выше степень поперечной сшивки, однако, оптимальный период времени не может быть превышен без риска деградации полисахарида.

Таким образом, стадия c) может быть проведена в течение периода времени в интервале между 30 и 300 минутами, предпочтительно между 100 и 200 минутами и более предпочтительно между 150 и 190 минутами.

Преимущественно, условия реакции поперечной сшивки регулируются с тем, чтобы максимально увеличивать эффективность поперечной сшивки, иными словами, чтобы получить максимально эффективную степень поперечной сшивки при минимальном количестве применяемого сшивающего агента.

Согласно одному особенно предпочтительному воплощению стадии поперечной сшивки b) и c) проводят в основной среде, при этом сосуд, содержащий смесь, полученную на стадии a), выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре, а затем помещают на термостатируемую баню, нагретую до температуры примерно 50-55°C, в течение по меньшей мере 1 часа и предпочтительно между 1 часом 30 минутами и 3 часами 30 минутами.

Как объяснялось выше, остановка реакции поперечной сшивки (стадия e)) может быть проведена до, во время или после стадии d) восстановления геля.

Такая стадия в способе по настоящему изобретению предусматривает помещение поперечно-сшитого геля или, в течение поперечной сшивки, даже сосуда, содержащего его, в условия, благоприятные для остановки реакции поперечной сшивки, или еще в условия, которые способны остановить формирование связей между различными полисахаридными цепями.

Согласно предпочтительному воплощению стадию e) проводят перед стадией d).

Например, в отношении температурных условий, которые будут применяться для стимулирования процесса поперечной сшивки, реакция поперечной сшивки может быть остановлена:

- путем простого перемещения сосуда из термостатируемой бани и его охлаждения до комнатной температуры;

- путем помещения сосуда на баню с холодной водой, предпочтительно в температуру, ниже комнатной, до тех пор, пока температура внутри вышеуказанного сосуда не станет близкой к комнатной температуре; или даже

- путем извлечения геля из вышеуказанного сосуда.

В случае, когда реакцию поперечной сшивки стимулируют излучением, ее останавливают путем прекращения действия излучения на вышеуказанный гель.

Согласно одному конкретному воплощению способ по данному изобретению может дополнительно включать по меньшей мере одну стадию, заключающуюся в пропускании смеси, полученной на стадии a), или даже полученной на стадии b), через по меньшей мере одно устройство, способное удерживать любую частицу с диаметром более 100 микрон.

Эта особая стадия, также называемая в остальной части описания "стадией экструзии", таким образом, протекает после стадии a) и перед стадией b), и/или после стадии b) и перед стадией c).

Как выяснится из примеров, приведенных ниже, благоприятный эффект, связанный со стадией экструзии, заключается в получении поперечно-сшитого геля, обладающего дополнительными улучшенными вязкоупругими свойствами.

Выбор типа экструдера находится в пределах общей квалификации специалиста в данной области техники.

Преимущественно, стадию экструзии проводят, используя по меньшей мере одно устройство, содержащее по меньшей мере один фильтр.

Специалист в данной области техники способен определять подходящие характеристики относительно пористости, геометрии, прочности и удерживающей способности такого фильтра, с тем, чтобы такой фильтр пропускал смесь, полученную на стадии a), или даже на стадии b), в то же время удерживая любые частицы с диаметром более 100 микрон.

В оставшейся части настоящего описания устройство, содержащее по меньшей мере один фильтр, используемый для выполнения стадии экструзии, может также обозначаться выражением «экструдер».

Преимущественно, стадию экструзии проводят с помощью по меньшей мере одного устройства, содержащего по меньшей мере один фильтр, имеющий пористость в диапазоне от 2 до 100 микрон, предпочтительно от 5 до 50 микрон, более предпочтительно от 8 до 30 микрон, в частности 10 микрон.

Преимущественно, линейная скорость экструзии смеси, полученной на стадии a) и/или b), через экструдер(ы) является низкой, с тем чтобы не допустить деградации цепей полисахарида во время их прохождения через него.

Таким образом, линейная скорость экструзии вышеуказанной смеси(ей), полученной на стадии a) и/или стадии b), через экструдер(ы) составляет от 1 до 100 см/мин, предпочтительно от 1 до 4 см/мин.

Согласно еще одному другому конкретному воплощению способ по изобретению может быть проведен, по меньшей мере частично, внутри специального сосуда, имеющего стенку, способную деформироваться, такого как, например, мешок.

Дело в том, что свойства способности к деформации такого сосуда и его герметичность позволяют выполнять различные стадии способа по изобретению, и особенно стадии гомогенизации и поперечной сшивки, в оптимальных условиях, которые приводят к получению даже более лучшего поперечно-сшитого геля, иными словами, геля, который обладает свойствами способности к инъекции, превосходящими свойства, проявляемые гелем, полученным согласно способу, предусматривающему использование традиционного сосуда типа бака или цистерны.

Поперечно-сшитый гель, полученный согласно способу по данному изобретению как описано выше, как правило, нельзя вводить напрямую, в частности, из-за его высокой концентрации полисахарида и/или возможного присутствия остатков сшивающего агента, или же из-за его физиологических и/или pH условий, несовместимых с использованием данного геля в областях применения, рассмотренных выше.

Кроме того, гель, полученный согласно способу по изобретению, может, в частности, обладать слишком высокой жесткостью для введения в связи с этим пациенту.

Поэтому для получения гидрогеля, пригодного для введения, может быть проведено несколько дополнительных стадий, известных специалистам в данной области техники.

В частности, стадия нейтрализации и набухания данного геля требуется для того, чтобы придать ему свои качества имплантата. При этом цепи полисахаридной сети растягиваются и гидратируются, в то время как pH доводят до pH дермы.

Для дополнительного улучшения качеств имплантата можно также проводить стадию защиты и повторного уплотнения геля согласно накопленному опыту специалиста в данной области техники. Гель должен быть физиологически приготовлен в виде препарата за счет присутствия солей в количествах, эквивалентных количествам вводимой среды.

Для даже более высокой чистоты, можно также проводить дополнительную стадию очистки.

И наконец, полученный таким образом гидрогель может быть использован для наполнения шприцов в контролируемых атмосферных условиях, причем вышеуказанные шприцы затем можно подвергать стадии стерилизации, предпочтительно стадии температурной стерилизации.

II) Полисахарид

Под термином "полисахарид" следует понимать любой полимер, состоящий из нескольких моносахаридов, связанных между собой гликозидными связями, и имеющий общую формулу: -[C_x(H₂O)_y)]n-.

Полисахарид согласно данному изобретению в частности выбирают, исходя из свойств, которыми желательно должен обладать поперечно-сшитый гель, полученный согласно описанию изобретения. В частности, такой полисахарид должен иметь хорошую биосовместимость.

Таким образом, физиологически приемлемый полисахарид или соль полисахарида могут быть природного или синтетического происхождения.

Полисахариды, пригодные для настоящего изобретения, могут в частности быть выбраны из следующих соединений: хондроитинсульфат, гепарин, гепарин сульфат, ксантан, каррагинан, гиалуроновая кислота, хитозан, целлюлоза и ее производные, альгинат, крахмал, декстран, пуллулан, галактоманнан и их биологически приемлемые соли.

Соль полисахарида в соответствии с данным изобретением, в частности, выбрана из физиологически приемлемых солей, таких как соль натрия, соль калия, соль цинка, соль серебра и их смеси, предпочтительно соль натрия.

Предпочтительно, полисахарид или соль полисахарида согласно изобретению имеет высокую молекулярную массу, предпочтительно молекулярную массу больше или равную 100000 Да, более предпочтительно больше или равную 1 МДа (или 1,10⁶ Да), или даже больше, чем 3 МДа (или 3,10⁶ Да), в зависимости от рассматриваемого применения.

Одним особенно предпочтительным полисахаридом является гиалуроновая кислота или одна из ее солей, предпочтительно гиалуронат натрия (NaHA).

Преимущественно, полисахарид может присутствовать в водном геле указанного выше полисахарида в поперечно-несшитой форме с содержанием, которое варьирует от 5 до 15 мас.%, предпочтительно с содержанием, выше чем 10 мас.%, относительно общей массы вышеуказанного водного геля.

Как упоминалось выше, смешивание на стадии a) способа по изобретению приводит к тому, что по меньшей мере один водный полисахаридный гель в поперечно-несшитой форме или одна из его солей объединены по меньшей мере с одним эпоксидным сшивающим агентом.

В настоящее время вышеуказанный водный полисахаридный гель как таковой можно получить, приводя заранее вышеуказанный полисахарид, или одну из его солей, в контакт с водной средой.

Под термином "водная среда" в контексте настоящего изобретения следует понимать любую жидкую среду, содержащую воду и обладающую способностью растворять полисахарид или одну из его солей.

Природа водной среды зависит, в частности, от типа предлагаемого сшивающего агента, но также и от типа используемого полимера.

В этой связи подходящая водная среда может быть либо кислой, либо основной.

Одна особенно предпочтительная водная среда представляет собой щелочную среду, предпочтительно гидроксид натрия (NaOH), в частности раствор гидроксида натрия, имеющий pH, больше чем 12.

III) Эпоксидный сшивающий агент

Под термином "сшивающий агент" следует понимать любое соединение, способное вызывать образование поперечных сшивок между различными полисахаридными цепями.

Выбор этого сшивающего агента для поперечной сшивки полисахарида, несомненно, находится в пределах общей квалификации специалиста в данной области техники.

Сшивающий агент согласно изобретению выбран из бифункциональных или многофункциональных эпоксидных сшивающих агентов, таких, как бутандиол диглицидиловый эфир (BDDE), диэпоксиоктан или 1,2-бис(2,3-эпоксипропил)-2,3-этилен и их смеси.

Предпочтительно, сшивающий агент согласно изобретению представляет собой бутандиол диглицидиловый эфир.

Регулирование количества сшивающего агента для проведения реакции поперечной сшивки также находится в пределах общей квалификации специалиста в данной области техники.

Согласно одному особенно предпочтительному воплощению в способе по изобретению используется гиалуроната натрия в щелочной среде с бутандиол диглицидиловым эфиром в качестве сшивающего агента.

На протяжении всего описания, в том числе в формуле изобретения, выражение "содержащий один" следует понимать как синоним выражения "содержащий по меньшей мере один", если не указано иначе.

Под выражениями "между… и …" и "в диапазоне от… до …" следует понимать, что границы диапазона включены в диапазон, если не указано иное.

Следующие примеры и Фигуры приведены в качестве не ограничивающей иллюстрации изобретения.

Фигуры:

- Фигура 1: иллюстрирует вязкоупругие свойства гелей гиалуроновой кислоты, оцененные с помощью их модуля упругости G' (в Па).

- Фигура 2: иллюстрирует изменение модуля упругости G' (в Па) гидрогелей, полученных на стадии поперечной сшивки, отличающейся первой стадией выдерживания смеси 12% водного геля гиалуроновой кислоты и BDDE в течение двух часов при комнатной температуре с последующей второй стадией инкубации вышеуказанной смеси при 52°C в течение различных промежутков времени.

- Фигура 3: иллюстрирует изменение модуля упругости G' (в Па) гидрогелей, полученных на стадии поперечной сшивки, отличающейся одной стадией инкубации смеси 12% водного геля гиалуроновой кислоты и BDDE при 52°C в течение различных промежутков времени.

Примеры:

Пример 1

Для каждого из поперечно-сшитых гелей, описанных ниже, использовали 10 г гиалуроновой кислоты (1,5 МДа), 73 г 1% гидроксида натрия и 1,2 г бутандиол диглицидилового эфира (BDDE).

Особые условия, применяемые для каждого геля, были следующими:

Продукт A (контроль)

Протокол получения был следующим:

1) гомогенизация при комнатной температуре смеси гиалуроновая кислота/1% гидроксид натрия в течение примерно 1 часа 30 минут с получением идеально однородного вязкого раствора;

2) добавление сшивающего агента (BDDE) и дополнительная гомогенизация при комнатной температуре в течение примерно 20 минут;

3) инкубация вязкого раствора смеси гиалуроновая кислота/1% гидроксид натрия и BDDE в течение 3 часов при 52°C; и

4) нейтрализация, набухание и гомогенизация полученного твердого вещества (раствор поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты) в подкисленном фосфатном буферном растворе с получением гидрогеля, содержащего 20 мг/г гиалуроновой кислоты с pH, значение которого близко к нейтральному.

Продукт Б (согласно изобретению)

Протокол был таким же, как протокол, описанный для продукта А, но его выполняли с промежуточной стадией между стадиями 2 и 3, в ходе которой смесь, полученную на стадии 2, выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов.

Эта промежуточная стадия также может быть обозначена в остальной части настоящего описания выражением "стадия покоя".

Общее время контакта "гиалуроновой кислоты/BDDE" перед инкубацией при 52°C таким образом составило примерно 2 часа 20 минут.

Продукт В (согласно изобретению)

Протокол был таким же, как протокол, описанный для продукта А, но его выполняли со стадией экструзии после стадии 2 добавления BDDE и гомогенизации в течение 15 минут с последующей промежуточной стадией, в ходе которой продукт Б выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем стадией инкубации 3 при 52°C в течение 3 часов.

Эту стадию экструзии выполняли с помощью сита с круглыми ячейками типа набора сеток в экструзионной головке, имеющего размер ячеек 10 микрон.

Общее время контакта гиалуроновой кислоты/BDDE перед инкубацией при 52°C снова составило примерно 2 часа 20 минут.

Все шприцы были заполнены продуктами А, Б и В. Вязкоупругие свойства этих трех продуктов измеряли, используя реометр (Haake RS6000) с системой «конус-плита» (1° угол конуса/35 мм диаметр плиты). Производили сканирование деформации, и измеряли модуль упругости G' (в Па) и угол фазового сдвига δ (в градусах°) под напряжением 5 Па.

На Фиг.1 ниже показаны измеренные значения модуля упругости G' (в Па). Для отображения значение угла фазового сдвига 6 (в°) приводится в верхней части каждого столбца, справа от значения G'.

Измеренное значение фазового сдвига крайне мало, что означает, что эти гели проявляют в основном упругий характер.

Результаты на Фиг.1, в частности результаты по продукту Б, показывают достоверное увеличение G', когда реакцию поперечной сшивки проводят посредством способа по изобретению, иными словами, с использованием двух различных скоростей для проведения реакции поперечной сшивки, одну за другой.

Этот эффект даже более выражен, когда стадию экструзии выполняют с помощью устройства, содержащего фильтр с пористостью 10 микрон.

Пример 2: Оценивание на различных стадиях количества сшивающего агента в геле гиалуроновой кислоты, подвергающемся способу по изобретению.

Несколько поперечно-сшитых гидрогелей получали параллельно, используя способ по изобретению, с использованием специального сосуда, а именно, поддающегося деформации мешка, как описано выше.

Таким образом, получали 12% раствор гиалуроновой кислоты в 1% NaOH. После гидратации гиалуроновой кислоты добавляли раствор BDDE, разбавленный в пять раз раствором 1% NaOH.

Общее количество используемого BDDE, таким образом, соответствовало теоретическому содержанию, эквивалентному 1,8 мг/г, в гидрогеле гиалуроновой кислоты с содержанием 20 мг/г.

Затем, из смеси, полученной выше, получали несколько фракций А, Б и В.

Фракция А соответствует гелю гиалуроновой кислоты, выдерживаемому в течение 1 часа при комнатной температуре (RT) перед стадией инкубации, описанной ниже.

Фракция Б соответствует гелю гиалуроновой кислоты, выдерживаемому в течение 2 часов при комнатной температуре перед стадией инкубации, описанной ниже.

И наконец, Фракция В соответствовала гелю гиалуроновой кислоты, выдерживаемому в течение 1 часа при комнатной температуре перед стадией инкубации, описанной ниже, причем эту стадию покоя, кроме того, объединяли со стадией экструзии через сито с размером ячеек 10 мкм.

После различных обработок, описанных выше, фракции А, Б и В инкубировали при 52°C в течение 3 часов.

Твердые вещества, полученные в указанном порядке после данной стадии инкубации (растворы поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты), затем подвергали нейтрализации, набуханию и гомогенизации в фосфатном буферном растворе с pH, равным 7,3, с тем, чтобы получить гидрогель с содержанием гиалуроновой кислоты 20 мг/г.

Для того чтобы контролировать количество сшивающего агента, потребляемого на различных стадиях способа по изобретению, проводили анализ BDDE на различных стадиях.

Таким образом, образцы T1 и T2 соответствуют образцам гелей, отобранным после выдерживания, перед стадией инкубации в течение 3 часов при 52°C, смесей гиалуроновая кислота/BDDE при комнатной температуре в течение 1 и 2 часов соответственно.

Затем образцы T1 и T2 подвергали таким же стадиям нейтрализации, набухания и гомогенизации, как стадии, описанные выше для фракций А, Б и В, с тем чтобы получить гидрогели с содержанием гиалуроновой кислоты 20 мг/г.

Образцы А, Б и В соответствовали образцам гелей, отобранным из соответствующих фракций после инкубации в течение 3 часов при 52°C и превращения в гидрогель с содержанием 20 мг/г.

Результаты

В таблице 1 представлены измеренные количества сшивающего агента и значения модуля упругости (G' в Па) для полученных гидрогелей.

Для отображения, значения комплексной вязкости |η|* и угла фазового сдвига δ также упомянуты.

Таблица 1 Образцы: BDDE (мг/г) G' (Па) |η|* δ(°) T1 1,53 NCO * (преимущественно вязкие растворы низкой упругости из-за отсутствия поперечной сшивки, δ>45°) T2 1,43 Фракция А (выдерживали при RT в течение 1 часа) 0,20 136 22 5 Фракция Б (выдерживали при RT в течение 2 часов) 0,17 174 28 5 Фракция В (выдерживали при RT в течение 1 ч, и стадия экструзии через фильтр с размером пор 10 мкм) 0,20 159 25 5 * NCO=не проводили

Следует отметить, что измеренные содержания остаточного BDDE соответствуют нестерилизованным и неочищенным гелям.

Измеренные содержания сшивающего агента (BDDE) в образцах T1 и T2 являются величиной того же порядка. Наблюдаемое небольшое уменьшение содержания BDDE по сравнению с теоретическим содержанием, указанным выше, объясняется низкой скоростью реакции поперечной сшивки, в зависимости от обстоятельств, связанно с деградацией BDDE из-за нестабильности эпоксидных функциональных групп.

Напротив, снижение содержания BDDE значительно усиливается после стадии инкубации при 52°C в течение 3 часов, таким образом, этот существенный расход BDDE соответствует быстрой скорости реакции поперечной сшивки.

Что касается механических свойств полученных гелей (фракции А, Б и В), стоит отметить, что (i) измеренный фазовый сдвиг крайне мал, означая, что эти гели имеют в основном упругий характер, (ii) самый высокий модуль упругости G' получен для геля, полученного из фракции Б, иными словами, со стадией выдерживания при комнатной температуре в течение 2 часов перед инкубацией при 52°C и (iii) фракция В, экструдированная перед поперечной сшивкой, имеет значительно повышенный модуль упругости G', по сравнению с таким же гидрогелем, но неэкструдированным (фракция А).

Таким образом, вышеуказанные пункты (ii) и (iii) подтверждают благоприятные эффекты, обусловленные использованием двух различных скоростей поперечной сшивки, одну за другой, для реакции поперечной сшивки, а также обусловленные стадией экструзии в контексте способа получения поперечно-сшитого геля по изобретению.

Пример 3:

Получали смесь водного полисахаридного геля/сшивающего агента, идентичную смеси, описанной выше в Примере 2. Затем проводили два испытания:

- В первом случае получали несколько фракций А, Б, В и Г из вышеуказанной смеси. Реакцию поперечной сшивки проводили, оставляя вышеуказанные фракции в течение 2 часов при комнатной температуре перед тем, как поместить их в 52°C в течение различных периодов времени.

- Во втором случае также получали несколько фракций А', Б', В' и Г. Эти фракции, в отличие от фракций А, Б, В и Г, сразу инкубировали при 52°C в течение различных периодов времени.

Периоды времени инкубации при 52°C для различных рассматриваемых фракций были следующими:

- Фракции А и А': 2 часа 40 минут

- Фракции Б и Б': 2 часа 50 минут

- Фракции В и В': 3 часа

- Фракции Г и Г': 3 часа 10 минут.

Поперечно-сшитые гели гиалуроновой кислоты, полученные после стадий инкубации, затем подвергали нейтрализации, затем набуханию и гомогенизации в фосфатном буферном (PB) растворе с pH 7,3 с тем, чтобы получить гидрогели гиалуроновой кислоты с содержанием 20 мг/г. На полученных таким образом гидрогелях проводили следующие определения характеристик и анализы.

Результаты

В таблице 2, приведенной ниже, представлены значения модуля упругости G' (в Па) полученных гидрогелей. Для отображения, также приведены значения комплексной вязкости |η|* и угла фазового сдвига δ.

Таблица 2   Амплитуда сканирования (конус/плита) τ=5 Па G' (Па) |η|* (Па·с) δ (°) А 174,5 27,9 5,1 Б 186,9 29,9 5,7 В 174,0 27,8 5,5 Г 152,2 24,3 4,8   А' 119,2 19,1 7,1 Б' 126,5 20,3 6,4 В' 125,8 20,1 6,3 Г' 122,7 19,6 5,7

На Фиг.2 и 3, приведенных ниже, проиллюстрированы результаты, указанные в Таблице 2, приведенной выше.

Оптимальная эффективность стадии инкубации при 52°C в отношении поперечной сшивки, в силу вышесказанного, наблюдается при примерно 3 часах с или без предварительной стадии выдерживания смеси водного полисахаридного геля/сшивающего агента при комнатной температуре.

Гидрогели, полученные способом с использованием стадии выдерживания при комнатной температуре в течение 2 часов перед стадией инкубации при 52°C, имеют вязкоупругие свойства, которые значительно лучше, чем максимальные значения, наблюдаемые для гидрогелей, полученных по протоколу, не предусматривающему стадию выдерживания при комнатной температуре.

Эти результаты показывают, что благоприятный эффект, обусловленный наличием стадии выдерживания в течение длительного времени смеси водного полисахаридного геля/сшивающего агента при комнатной температуре при проведении реакции поперечной сшивки, не может быть просто воспроизведен путем увеличения времени реакции поперечной сшивки при 52°C.

Это происходит потому, что оптимального G', измеренного для гидрогелей, полученных согласно способу поперечной сшивки по изобретению, никогда не достигали для гидрогелей, полученных согласно традиционному способу поперечной сшивки, независимо от продолжительности стадии инкубации при 52°C.

Изобретение относится к способу получения поперечно-сшитого геля полисахарида и применению его для длительного заполнения объемных дефектов кожи. В способе получают водный гель, содержащий полисахарид в поперечно-несшитой форме вместе с бифункциональным или многофункциональным эпоксидным сшивающим агентом, при температуре ниже 35°С. Выдерживают полученную смесь при температуре ниже 35°C в течение по меньшей мере одного часа. Стимулируют реакцию поперечной сшивки полученной смеси. Затем в случае необходимости восстанавливают образованный поперечно-сшитый гель. Изобретение обеспечивает получение гелей с улучшенными вязкоупругими свойствами. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Способ получения поперечно-сшитого геля по меньшей мере одного полисахарида или одной из его солей, включающий по меньшей мере следующие стадии:
a) обеспечения водного геля, содержащего по меньшей мере один полисахарид в поперечно-несшитой форме вместе с по меньшей мере одним бифункциональным или многофункциональным эпоксидным сшивающим агентом, при температуре ниже 35°С;
b) выдерживания смеси, полученной на стадии (а), при температуре ниже 35°С в течение по меньшей мере одного часа;
c) стимулирования реакции поперечной сшивки смеси, полученной на стадии (b), причем стадию (с) проводят при нагревании, при температуре между 35 и 60°С, и в случае необходимости;
d) восстановления указанного образовавшегося поперечно-сшитого геля.

2. Способ по п. 1, где полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту или одну из ее солей.

3. Способ по п. 1 или 2, где стадии (а) и (b) проводят при температуре в интервале от 15 до 25°С, и более предпочтительно при комнатной температуре.

4. Способ по п. 1, где стадию (b) проводят в течение времени, более продолжительного чем 1 час, предпочтительно более продолжительного чем 2 часа.

5. Способ по п. 1, где смесь, полученную на стадии (а), получают в подходящем сосуде, объединяя вместе:
i) водную среду;
ii) по меньшей мере один полисахарид или одну из его солей в поперечно-несшитой форме; и
iii) по меньшей мере один бифункциональный или многофункциональный эпоксидный сшивающий агент, и
гомогенизируя полученную таким образом смесь, причем порядок добавления вышеуказанных соединений (i), (ii) и (iii) в сосуд не имеет значения.

6. Способ по п. 5, где стадия гомогенизации протекает в течение периода времени менее 200 минут, предпочтительно менее 150 минут или даже между 15 и 100 минутами.

7. Способ по п. 1, где стадию (с) проводят при температуре между 45 и 55°С или даже между 48 и 52°С.

8. Способ по п. 1, где стадию (с) проводят в течение периода времени в интервале от 30 до 300 минут, предпочтительно от 100 до 200 минут и более предпочтительно от 150 до 190 минут.

9. Способ по п. 1, где сшивающий агент представляет собой бутандиол диглицидиловый эфир (BDDE).

10. Способ по п. 1, где полисахарид имеет молекулярную массу, большую или равную 1 МДа.

11. Способ по п. 1, где полисахарид присутствует в водном геле указанного полисахарида в поперечно-несшитой форме в количестве от 5 до 15 мас.%, предпочтительно выше 10 мас.%, относительно общей массы указанного водного геля.

12. Способ по п. 1, где используют гиалуронат натрия в щелочной среде и бутандиол диглицидиловый эфир (BDDE) в качестве сшивающего агента.

13. Способ по п. 1, где поперечно-сшитый гель представляет собой преимущественно упругий вязкоупругий однофазный гель.

14. Применение поперечно-сшитого геля, полученного при осуществлении способа по любому из пп. 1-13, для длительного заполнения объемных дефектов кожи, в частности для заполнения морщин.