СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК, ОРГАНОВ, ТКАНЕЙ И ОРГАНИЗМОВ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к криоконсервации клеток, органов, тканей, организмов и может быть использовано в медицине.

Известно большое количество способов (протоколов) криоконсервации клеток, органов, тканей, организмов. Описанные способы и методики отличаются друг от друга различиями концентрации добавляемых жидких криопротекторов, применением различных по составу криозащитных растворов и режимами замораживания биологических объектов. Основной характерной особенностью криозащитных соединений данного типа является жидкость, легко проникающая через мембраны клеток и способная к связыванию молекул вне- и внутриклеточной воды, со смещением точки замерзания раствора и препятствующая росту кристаллов льда внутри и снаружи клеток.

В медицинской и лабораторной практике используют около десятка веществ, обладающих криопротекторными свойствами:

1. проникающие: глицерин, пропиленгликоль, этиленгликоль, диметилсульфоксид (ДМСО);

2. непроникающие:

а. олигосахариды (наиболее часто

используют сахарозу и трегалозу)

b. высокомолекулярные соединения

(фиколл, альбумин, поливинилпирролидон).

Проникающие криопротекторы препятствуют формированию кристаллов льда за счет образования водородных связей с молекулами воды.

В целях исключения образования кристаллов льда используется метод витрификации биологических объектов, суть которого состоит в переводе внутриклеточных жидкостей в стекловидное состояние. Разрабатываются безопасные криопротекторы-витрификаторы, которые можно безопасно вводить в состав крови и любых других тканевых структур организма высших форм жизни.

В процессе кристаллизации воды происходит выталкивание всех инородных частиц, включая и ферментативные белки, из биологических структур клетки (так называемая зонная очистка (zone refining)), что нарушает ее нормальную работу.

Известно, что охлаждение приводит к гелеобразованию в протоплазме и мембранах клетки. Возникновение гель-фазы в структурах клетки при снижении температуры фиксирует ферментативные белки и оказывает надежную защиту от опасности каких-либо повреждений при любой глубине последующего охлаждения./ Научно-исследовательская разработка.«Сверхрезистентность», гл. 6, п. 6.3.2/Тимофеев Н.Н. физиолог, д.м.н., специалист в области авиационной и космической мeдицины./http://www.cnt.ru/~valakas/index.html,oпyбликoвaнo 2007 г.

Гели обладают способностью сохранять форму, прочность и при этом быть пластичными и упругими. Это свойство снижает термические напряжения при замораживании крупных биологических объектов.

Известно, что стандартно используемые жидкостные криопротекторы: ДМСО, полиэтиленкрахмал, глицерин (А.С. №1412039), пропиленгликоль, поливинилпирролидон, описанные в патентах (ЕА 009073 B1, RU 2283119, US 20050026133 А1) в недостаточной мере обеспечивают возложенные на них функции, в частности по защите клеток от образующихся при заморозке крупнокристаллических структур льда, которые, в конечном итоге, разрывают мембраны клеток или вытесняют последние, в результате зонной очистки, в гиперосмотические каналы, где клетки подвергаются сильной механической деформации и воздействию повышенных концентраций растворенных веществ, что, в конечном итоге, является причиной денатурации белков мембранных элементов клеток, снижая жизнеспособность клеточных культур при криоконсервации.

Высокая концентрации криопротекторов улучшает криозащитные свойства, но усиливает их токсическое действие на биологические объекты.

Известны изобретения: «СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК», патент RU 2 433 173С1 оп. 10.11.2011 г. и «Способ сохранения органов и тканей в составе целостного организма в жидкости при температурах ниже 0°С под давлением в среде инертного газа», патент RU 2 748 496 С1, оп. 26.05.2021. В них в качестве криопротектора используется газ ксенон. Установлено, что при охлаждении в биологическом объекте, насыщенном ксеноном, образуются клатраты, связывающие воду и препятствующие формированию кристаллического льда. Они содержат в себе только молекулы воды и ксенона, а соли, белки и другие компоненты клетки вытесняются в цитоплазму. Это приводит к «криоденатурации» и «криоповреждениям» составных частей клетки и является недостатком данного метода.

Современные криокомпозиции кроме криопротектора могут дополнительно содержать различные аминокислоты, витамины, антибиотики и неорганические соли, выполняющие защитные и вспомогательные функции при криозамораживании и хранении биологических объектов.

Ближайшим аналогом изобретения является патент RU 2748057 С2 «КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ КРИОКОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК HUTC» oп. 2021.05.19.

Данный способ криоконсервации включает: насыщение биологических объектов криопротекторами; охлаждение до температуры кристаллизации(близкой к 0°С); режим замораживания; дополнительное охлаждение до температуры хранения биологических объектов.

Недостатком данного изобретения является высокая токсичность криопротекторов. Это приводит к необходимости дополнительного введения защитных и вспомогательных веществ.

Задачей настоящего изобретения является снижение токсичности, уменьшение криоповреждений, снижение термических напряжений при замораживании крупных органов и организмов, замедление биологических процессов в процессе криоконсервации.

Технический результат достигается тем, что способ криоконсервации клеток, органов, тканей и организмов, включающий введение криопротектора в биологический объект, охлаждение, замораживание, дополнительное охлаждение до температуры хранения и последующее хранение замороженного объекта при низких температурах, отличается тем, что биологический объект до замораживания насыщают тяжелой водой.

Криопротекторы образуют более прочные водородные связи с молекулами тяжелой воды чем с обычной водой. Например, поскольку дейтерий (D) имеет массу, в два раза большую массы протия (¹Н) сила углерод-водородной связи C-D является более мощной, чем соответствующая связь С-¹Н и как следствие эффект работы криопротекторов более выражен.

Известно, что гели желатина, образованные в D2O, имеют большую жесткость, чем гели равной концентрации, образованные в Н2O и большую скорость гелеобразования. Гели, образованные в D2O, также имеют более высокие температуры плавления (Тm), чем соответствующие гели, образованные в Н20.

/ELSEVIER/FoodHydrocolloids/Volume 17, Issue 2, March 2003, Pages 207-210/Gelatingelsindeuteriumoxide/.

Таким образом, для достижения равного эффекта при криозамораживании требуется меньшее количество криопротекторов и снижается их токсичность, усиливается гелеобразование и, как следствие, уменьшаются криоповреждения, а также термические напряжения в крупных биологических объектах.

Токсичность тяжелой воды незначительна. При замещении 15% воды организма D20 животные и человек остаются здоровыми, и только при 20% отмечается возбуждение, т.е. количество дейтерия, требуемое для того, чтобы вызвать отравление, является крайне высоким.

Химические и биологические реакции в среде тяжелой воды проходят медленнее, чем в Н₂O. Данный феномен известен как кинетический изотопный эффект дейтерия (DKIE) и он может варьироваться от 1 до 30. Это дает дополнительное время для проведения операций по охлаждению и заморозке биологических объектов без осложнений, а так-же позволяет уменьшить количество защитных и вспомогательных веществ.

Снижении скорости биотрансформации в результате дейтерирования, это новое направление в разработке лекарственных средств. /«Влияние дейтерия на свойства фармацевтических субстанций (обзор)»/ А.В. Сыроешкин, Т.Е. Елизарова, Т.В. Плетенева, Е.В. Успенская, О.В. Левицкая, И.А. Злацкий, Т.В. Maксимова/https://doi.org/10.33380/2305-2066-2020-9-2-24-32. Опубликовано 2020 г.

Введение тяжелой воды в биологический объект может быть произведено различными способами: в организм-перорально; в отдельный орган-путем перфузии; в культуру клеток- смешиванием культуры клеток в культуральной среде с криопротектором, содержащим тяжелую воду.

В организм человека тяжелая вода может быть введена в виде жидкости или дейтерированных пищевых продуктов. «Способы и композиции для лечения артериальной гипертензии» / патент US 5223269 A, опубл. 1993-06-29.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к криоконсервации клеток животных и может быть использовано в медицине. Предложен способ криоконсервации включающий: охлаждение клеток до температуры от 0°С до +6°С, введение в них криопротекторов путем диффузии и выдержки при данной температуре. Клетки животных в процессе диффузии насыщают тяжёлой водой до концентрации от 5 до 20 об.% тяжёлой воды от общего количества воды в клетках. После выдержки клетки охлаждают до температуры от -7°С до -195,75°С и хранят при данной температуре. Преимуществом предложенного способа криоконсервации является уменьшение криоповреждений и увеличение выживаемости клеток.

Способ криоконсервации клеток животных, включающий введение в данные клетки криопротекторов путем диффузии и охлаждение клеток до температуры от 0°С до +6°С, дополнительное охлаждение до температуры от -7°С до -195,75°С и последующее хранение замороженных клеток при указанной температуре, отличающийся тем, что клетки перед дополнительным охлаждением насыщают тяжёлой водой путем диффузии до концентрации от 5 до 25 об.% тяжёлой воды от общего количества воды в клетках.