СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННЫХ СИМБИОТИЧЕСКИХ АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ. Российский патент 1998 года по МПК C12N1/04 C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии и микробной экологии, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биологии, научных исследованиях.

В настоящее время разработаны достаточно эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие у них сохранение жизнеспособности, генетической и фенотипической стабильности. Во всех случаях выбор способа консервирования конкретного объекта основывается на сохранении культурой жизнеспособности, морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности с учетом максимально возможного времени хранения культуры, а также надежности реализации данного метода консервации и требований по обслуживанию в течение длительного времени.

В последние годы в большинстве коллекций микроорганизмов используют методы лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации [1].

Метод лиофилизации заключается в высушивании культур под вакуумом при низких температурах (-20^o, -40^oC). Лиофилизированные культуры могут храниться в течение длительного времени, если их хранить без доступа кислорода, влаги и света при пониженных температурах. Лиофилизация обеспечивает для широкого круга микроорганизмов большую стабильность, чем общеизвестные способы высушивания и периодических пересевов. Метод лиофилизации удобен для практических целей, т.к. дает возможность иметь большое число ампул каждой культуры. Однако титр жизнеспособных клеток микроорганизмов в результате лиофилизации часто оказывается низким и довольно быстро падает при хранении даже при +4^oC. Кроме того, многие неспорообразующие микроорганизмы не переносят обычно используемые режимы лиофилизации и не могут храниться этим методом. Установлено также, что процесс лиофилизации приводит к отбору наиболее устойчивых клеток в культуре, которые могут и не обладать желаемыми свойствами.

Известны способы длительного хранения микроорганизмов при низких температурах - от -20 до -130^oC. Многие микроорганизмы могут храниться в холодильниках при температуре ниже -60^oC с сохранением высокого титра клеток. Однако в коллекциях микроорганизмов, в том числе международных, этот прием используется как один из этапов лиофилизации культур. Используется также метод низкотемпературного замораживания на носителях, что позволяет увеличить срок хранения микроорганизмов до 5 и более лет. Низкотемпературная консервация используется в последние годы для хранения микроорганизмов во все возрастающих масштабах в связи с наличием и доступностью низкотемпературных холодильников, способных надежно поддерживать низкие температуры в течение длительного времени. Однако время хранения биоматериала при этих температурах также ограничено. По данным Gibson L.F. и Khoury J.T. [2], время хранения разных видов бактерий в холодильнике при -70^oC колебалось в пределах 12-40 месяцев. Для хранения сложных по составу ассоциаций микроорганизмов этого времени недостаточно, так как микробиоценозы в отличие от культур бактерий, не могут периодически пересеваться, подращиваться, а следовательно, при таком способе хранения время от времени потребуется повторный забор микробиоценозов, что часто оказывается невозможным в связи с изменениями их состава во времени, связанными с неблагоприятными внешними и внутренними воздействиями, например, химиотерапией, радиационным воздействием, экологическими, возрастными факторами и т.п. Таким образом, при низкотемпературном хранении естественных микробиоценозов существует реальная опасность потери их в течение 2-4 лет, а возможно, и ранее.

Известен способ длительного хранения биоматериала в жидком азоте - криоконсервация. Криоконсервация предназначена для длительного сохранения биологических объектов. Время хранения в жидком азоте криоконсервированных микроорганизмов и других биологических объектов в стабильном и жизнеспособном состоянии практически не ограничено. В настоящее время отработаны режимы криоконсервации для целого ряда видов и штаммов микроорганизмов (универсальных способов криоконсервации нет).

Криоконсервация чистых культур микроорганизмов представляет собой технологический процесс, состоящий из нескольких основных этапов:
1. Приготовление клеточной суспензии.

2. Подготовка клеточных суспензий к консервации: внесение криопротекторов, стабилизирующих сред, осмотическое уравновешивание клеток с криопротекторами (от нескольких минут до нескольких часов при постоянной температуре).

3. Замораживание клеточной суспензии до заданной конечной температуры по разработанной программе с использованием оптимальных скоростей охлаждения.

4. Хранение криоконсервированных клеток в специальных емкостях (контейнерах), помещенных в хранилища с жидким азотом.

5. Отогрев. Размораживание проводят с учетом оптимальных скоростей оттаивания и обеспечением максимальной равномерности отогрева образца.

Однако, как было установлено, в процессе подготовки к криоконсервации и при замораживании-оттаивании клетки оказываются в условиях далеких от тех, в которых они функционируют, и подвергаются воздействию большого числа неблагоприятных факторов, которые могут вызвать необратимые повреждения клеточных структур и функций (криоповреждений), вплоть до гибели клеток.

В настоящее время криобиологи имеют в распоряжении достаточно большой арсенал способов, позволяющих снизить отрицательное действие криоконсервации, либо полностью избежать некоторые из них. К таким способам следует отнести правильный выбор оптимальных скоростей в режиме замораживания-оттаивания, использование криозащитных агентов (криопротекторов) и антиоксидантов, обеспечение репаративных процессов (коррекции криоповреждений) после низкотемпературной консервации, в том числе использование сред, состав которых обеспечивает возможность репаративных процессов после оттаивания, например, культивирование на богатых естественных средах.

На практике используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания конкретных объектов, поскольку криочувствительность клеток в большой степени зависит не только от физических, но и от морфофункциональных, физиологических, биохимических и других свойств клеток.

Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. К настоящему времени известно свыше 100 соединений в качестве криопротекторов (спирты, амины, аминокислоты и их амиды, оксиды, углеводы, белки, природные и искусственные полимеры, неорганические соли и др.). Однако все известные криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания удаляют криопротектор из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. Особенно это относится к микроорганизмам, которые в дальнейшем будут использованы в медицинских и пищевых целях, поскольку многие из криопротекторов токсичны для организма животных и человека. В качестве криопротекторов в микробиологии обычно используют 10, 15, 20% растворы глицерина; 5, 7.5 растворы диметилсульфоксида (ДМСО); 12, 24% растворы сахарозы, а также глицерин и ДМСО в сочетании с глюкозой или сахарозой.

В настоящее время криоконсервация (криоанабиоз) является наиболее перспективным методом долгосрочного хранения микроорганизмов. При криоконсервации удается получить высокий уровень жизнеспособных клеток, титр которых при длительном хранении в жидком азоте сохраняется на исходном уровне, что делает практически неограниченным возможное время хранения. Существенным преимуществом криоконсервации перед высушиванием и лиофилизацией является возможность сохранения высокой биохимической активности и генетической стабильности, что чрезвычайно важно для штаммов-продуцентов и перспективных для использования в биотехнологии.

Вместе с тем, сведения об использовании методов криоконсервации для длительного сохранения ассоциаций микроорганизмов (микробиоценозов) в доступной литературе отсутствуют. Вместе с тем известно, что в естественной среде обитания микроорганизмы существуют в виде симбиозов. Примером устойчивых природных симбиозов являются микробиоценозы слизистых и кожи человека, животных, птиц, микробиоценозы почвы, водоемов и т.п. До настоящего времени не существует коллекций микробиоценозов, подобно вышеописанным коллекциям микроорганизмов, хотя роль микробиоценозов в поддержании жизни в целом трудно переоценить. Не отработаны приемы консервации как простых, так и сложных микробиоценозов. Сложность этого заключается в том, что отдельные культуры, составляющие такие ассоциации, предъявляют широко различающиеся требования к условиям консервации.

В настоящее время установлено, что естественные симбиотические микробные ассоциации человека и животных включают в себя десятки и сотни видов микроорганизмов. Так, микрофлора кишечника на 90% представлена анаэробными микроорганизмами, которые различаются по морфологическим, функциональным и биохимическим свойствам. Для объективной оценки состояния естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов обычно определяют при микробиологических методах исследования количество грамположительных и грамотрицательных индикаторных бактерий - бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий, включая кишечные палочки, энтерококков.

Кроме того, в естественных условиях симбиотические ассоциации нередко загрязнены транзиторными бактериями, некоторые из которых обладают патогенным потенциалом и нежелательны для длительного сохранения. Такие бактерии совершенно недопустимы в составе естественных микробных ассоциаций, предназначенных, для использования в медицине и в пищевой промышленности и подлежат селективной деконтаминации.

Как показывают экспериментальные данные, жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация клеток в суспензии была высокой, порядка 10⁹ - 10¹¹ кл/мл. Уплотненные суспензии клеток имеют более высокий титр выживания, чем разбавленные, так как лизированные клетки и клеточные вещества могут выполнять криозащитную роль.

Известен способ длительного хранения естественных микробиоценозов кишечника мышей и крыс путем низкотемпературной консервации (3). Способ заключается в том, что мышей забивали, извлекали у них цекум (слепую кишку), помещали ее в анаэробные условия, с соблюдением асептики готовили гомогенизированную суспензию цекума с его содержимым в питательном бульоне, смешивали часть суспензии с 20% глицерола (криопротектором), разливали в бутыли (5 бутылей). По 1 бутыли с гомогенизированной суспензией с добавлением глицерола замораживали при температуре -20 и -70^oC соответственно и хранили при этих температурах в течение 12 месяцев. Одну порцию суспензии без добавления глицерола лиофилизировали и хранили в последующем при +4^oC, оставшиеся две бутыли суспензии без добавления глицерола замораживали и хранили при температуре -20 и 70^oC в течение 12 месяцев. Контроль жизнеспособности сохраняемого микробиоценоза осуществляли путем определения количества жизнеспособных аэробов, анаэробов и энтеробактерий до замораживания, через 2, 4, 6 и 12 месяцев хранения. Оптимальным методом оказалось хранение микробиоценозов при -70^oC с добавлением глицерола в качестве криопротективного агента. Аналогичные результаты получены при хранении микробиоценозов кишечника крыс и в виде гомогенизированной и негомогенизированной 1:4 водной суспензии фекалий крыс, 1:4 суспензии фекалий крыс в глицероле при температуре -20^oC, а также в виде 1: 4 гомогенизированной суспензии фекалий крыс с глицеролом при температуре -70^oC. Было установлено, что наибольшее число жизнеспособных клеток аэробов, анаэробов и энтеробактерий сохранялось при замораживании и хранении микробиоценозов в виде гомогенизированной суспензии фекалий крыс с 20% глицеролом при -70^oC. По мнению авторов, неизменность числа жизнеспособных клеток микроорганизмов до и после замораживания, а также в процессе хранения свидетельствует о полной сохранности микрофлоры.

Недостатком вышеописанного способа длительного хранения естественных микробиоценозов является то, что для забора биоматериала животных забивали. Кроме того, как указывалось выше, время хранения микробиоценозов при температуре -70^oC ограничивается несколькими годами. С учетом того, что одной из целей длительного сохранения естественных микробных ассоциаций человека и животных является использование длительно хранящихся микробиоценозов в качестве аутопробиотиков или пробиотиков для коррекции нарушенных микробиоценозов, сопутствующая патогенная и условно-патогенная микрофлора не должна быть сохранена при консервации. В описанном способе низкотемпературного хранения естественных микробиоценозов животных селективную деконтаминацию микробиоценозов не проводили.

Целью изобретения является длительное сохранение исходного состояния естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных, свободных от патогенной и условно-патогенной флоры.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника микробиоценозов используют суспензию содержимого толстой кишки человека или животных, подвергают ее селективной деконтаминации с последующей криоконсервацией и хранением в жидком азоте при температуре -196^oC, а в качестве криопротектора используют вещества муцин-полисахаридной природы.

Известно, что просветная и пристеночная микрофлора толстой кишки близки по своему составу. В клинической практике о количественном и функциональном состоянии естественных микробиоценозов толстой кишки человека судят по составу именно просветной микрофлоры. Из просветной микрофлоры толстой кишки человека выделены бифидобактерии и лактобациллы с широким спектром биологической активности, которые используют в качестве производственных штаммов для изготовления фармакопейных биологических препаратов. Эти препараты предназначены для лечения широкого спектра заболеваний, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника. Все это позволяет использовать в качестве источника естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов содержимое толстой кишки человека или животных.

Селективная деконтаминация должна обеспечивать освобождение микробной ассоциации от сопутствующей патогенной и условно-патогенной микрофлоры, не повреждая при этом естественные микробиоценозы. Поскольку способ селективной деконтаминации микробиоценозов является объектом самостоятельного изобретения, описание способа приведено в заявке на это изобретение.

Использование в качестве криопротектора веществ муцинполисахаридной природы, близких по составу к естественному гликокаликсу микробиоценоза, обеспечивает наиболее полное сохранение микроорганизмов различных видов, входящих в естественную симбиотическую ассоциацию. Такие криопротекторы нетоксичны для организма человека и животных, что исключает необходимость отмывания биоматериала от них после оттаивания образцов микробиоценозов. Последнее представляется чрезвычайно важным в связи с тем, что микробиоценозы человека подлежат использованию тотчас после оттаивания, в то время как микроорганизмы в монокультуре или смешанной культуре после оттаивания отмывают от криопротектора, помещают для подращивания в богатую питательную среду, а уже потом используют по назначению. Кроме того, отмывание клеточной суспензии небезразлично для сложных естественных микробиоценозов и может привести к их дезинтеграции.

Замораживание биоматериала до температуры -196^oC и хранение его при той же температуре в жидком азоте обеспечивает сохранность объекта в течение неограниченного периода времени.

Пример 1. Забор материала и подготовка его к криоконсервации.

Свежий биоматериал (фекалии) стерильной ложечкой помещают в одноразовый пластиковый стерильный контейнер или в стерильные пакетики из полиэтиленовой пленки, продувают их азотом для удаления воздуха, герметично закрывают и доставляют в транспортных контейнерах при температуре не выше +8^oC в лабораторию. Содержимое контейнера разводят в 10 раз свежередуцированным физиологическим раствором (0,86% NaCl) и получают густую суспензию клеток. Проводят селективную деконтаминацию биоматериала путем смешивания суспензии с деконтаминантом и выдержкой смеси при определенным временных и температурных условиях. Способ селективной деконтаминации биоматериала является самостоятельным объектом изобретения и описан в самостоятельной заявке на изобретение.

После завершения процесса деконтаминации в микробную суспензию в качестве криопротектора добавляют вещество муцинполисахаридной природы, например, муцин до концентрации 0,1%. Затем для осаждения крупных частиц фекалий суспензию разливают в пластмассовые пробирки по 1 мл и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Супернатант, содержащий клетки микрофлоры, сливают в один флакон, перемешивают встряхиванием. Из части полученной суспензии готовят разведения и высевают на питательные среды для подсчета жизнеспособных клеток индикаторных бактерий: бифидобактерий, лактобацилл, энтеробактерий, кишечных палочек, энтерококков, а также патогенных и условно-патогенных бактерий. Измеряют концентрацию микроорганизмов в камере Горяева с использованием конденсора темного поля. При подготовке суспензии вышеописанным способом концентрация микроорганизмов в супернатанте составляет 10^10-11 КОЕ/мл раствора. Суспензию криоконсервации в эпиндорфах или в виде гранул.

Пример 2. Криоконсервация биоматериала.

Способ 1. Замораживание в эпиндорфах.

Клеточную суспензию в объеме 1 мл с соблюдением асептики вносят в эпиндорфы, продувают азотом, запаивают и замораживают непосредственным погружением пробирок в жидкий азот (-196^oC). Скорость замораживания, измеренная между -10^oC и 80^oC, составляет 1000^oC/мин.

Способ 2. Замораживание в гранулах.

Готовят стерильный 10% раствор желатины на 0,86% NaCl. Суспензию микробных клеток смешивают с расплавленным 10% раствором желатины в отношении 1:1. Присутствие желатины в растворе позволяет формировать при замораживании желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Через подготовленный таким образом раствор с клетками продувают азот для создания анаэробных условий. Далее при помощи дозатора суспензию клеток раскапывают по 50 и/или 100 мкл на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на хранение в дьюары с жидким азотом (криохранилище). Скорость замораживания, измеренная между -10 и 80^oC, составляет 600^oC/мин.

Пример 3. Размораживание.

Оттаивание образцов замороженного способами 1 и 2 биоматериала осуществляют на водяной бане при температуре 37-38^oC, скорость оттаивания материала в эпиндорфах до 0^oC - 350-450^o/мин, в гранулах - 150^oC.

Пример 4. Оценка качества биоматериала после криоконсервации.

Оценку качества замороженного биоматериала через 1 год хранения после оттаивания проводят путем сравнительного определения количества жизнеспособных клеток индикаторных бактерий: бифидобактерий, лактобацилл, аэробных грамотрицательных бактерий, кишечных палочек и энтерококков в образцах до и после криоконсервации общепринятыми микробиологическими методами. Кроме того, проводят сравнительную оценку количества бактериодов и стафилококков.

Берут 1 г образца биоматериала. С соблюдением правил асептики гомогенизируют его в 9 мл среды Хенкса с добавлением 0,2% агара и 0,25 г/л цистеина. В этой же среде проводят серийные разведения с последующим высевом капельно на чашки или в пробирки с соответствующими твердыми и полужидкими средами.

Для подсчета общего числа аэробов и анаэробов проводят посев соответствующих десятикратных разведений биоматериала на тиогликолевую среду с 10% крови, аэробных грамотрицательных бактерий - на среду Плоскирева, кишечных палочек - на среду Эндо, лактобацилл - на плотную среду МРС с 10 г/л ацетата натрия, стафилококков - на желточно-солевой агар с 5% молока, энтерококков - на азидовую среду с 5% сыворотки, бифидобактерий - на полужидкую ТГС с 0.2 г/л азида натрия и 2% пропионата лития, бактероидов - на плотную среду ТГС с добавлением 10% крови, гентамицина и ванкомицина.

Посевы инкубируют 48 ч при 37^oC в аэробных и анаэробных условиях.

Результаты опыта представлены в таблице 1. Как следует из таблицы, получены практически идентичные результаты количественного содержания наиболее показательных для естественных микробных симбиотических ассоциаций толстого кишечника человека микроорганизмов до и через 1 год после криоконсервации.

В таблице 2 представлены результаты сравнительного количественного определения наиболее показательных для нормальной микрофлоры человека микроорганизмов до и после криоконсервации с использованием различных криопротекторов. Как видно из таблицы, отмечается некоторое снижение содержания энтеробактерий после криоконсервации с использованием в качестве криопротектора левана (на два порядка) и агарозы (на 1,5 порядка). При использовании муцина и желатины содержание микроорганизмов оставалось практически без изменений. Общее количество стафилококков, стрептококков, анаэробов, включая бифидобактерии, бактероиды и лактобациллы, практически не менялось.

Полученные результаты свидетельствуют, что криоконсервация фекалий в жидком азоте с криопротекторами белковополисахаридной природы позволяет сохранять жизнеспособность микроорганизмов, а тот факт, что соотношение индикаторных бактерий в этих условиях было близким таковому в нативном материале, говорит о сохранении естественных ассоциации практически в неизменном состоянии.

Таким образом, предлагаемые приемы длительного сохранения естественных микробных ассоциаций человека и животных позволяют практически полностью сохранять их жизнеспособность и неизменность на протяжении неопределенно длительного периода времени. Это представляет большой интерес не только с научной точки зрения, но и позволит решать многие практические задачи, стоящие перед медициной и биологией.

Список литературы.

1. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. //Сб. научн. трудов "Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы". АН СССР, Пущинский научн. центр. Институт биологической физики. Пущино, 1991, с.81-159.

2. Gibson L. F. и Khoury J.T. Storage and survival of bacteria by ultra-freeze //Letters Applied Microbiol. 1986. V.3. P.127-129.

3. J.P. Koopman and H.M. Kennis. Storage methods for the preservation of intestinal microflora from mice and rats. Z. Versuchstierkd. 30, 223-227 (1987).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии и микробной экологии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, биологии, научных исследованиях. Изобретение заключается в том, что в качестве источника микробиоценозов используют суспензию содержимого толстой кишки человека или животных, подвергают ее селективной деконтаминации. Микробную суспензию подвергают криоконсервации и хранению в жидком азоте при температуре -196^oC. В качестве криопротектора используют вещества белково-полисахаридной природы в концентрации до 0,1%. Предлагаемый прием длительного сохранения естественных микробных ассоциаций человека и животных позволяет практически полностью сохранять их жизнеспособность и неизменность на протяжении неопределенно длительного периода времени. Результаты количественного содержания наиболее показательных для естественных микробных симбиотических ассоциаций толстого кишечника человека микроорганизмов до и через 1 год после криоконсервации практически идентичны. 1. з.п. ф-лы. 2 табл.

1. Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных путем приготовления суспензии биоматериала с содержанием микроорганизмов не менее 10⁹ КОЕ/мл с последующим замораживанием и хранением, отличающийся тем, что в качестве источника естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов используют суспензию содержимого толстой кишки человека или животных, подвергают ее селективной деконтаминации, а замораживание осуществляют путем криоконсервации с последующим хранением при температуре - 196^oC. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве криопротектора используют вещества белково-полисахаридной природы, например муцин, леван, агароза, желатина.