Способ определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений Российский патент 2023 года по МПК G01N24/10 C08L7/00 

Способ относится к инструментальным методам физико-химического анализа и предназначен для определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений. Способ может быть использован для мониторинга накопления целевого продукта в растительных тканях в технологиях промышленного выращивания каучуконосных растений, а также при проведении научных исследований по культивированию растений, относящихся к нетрадиционным источникам натурального каучука.

Натуральный каучук (НК) - стратегически важное сырье, которое является необходимым компонентом резин для производства автомобильных и авиационных шин. Основным источником каучука в настоящее время является гевея бразильская однако в последние десятилетия ведутся широкие исследования по поиску альтернативных источников этого стратегически важного продукта. В качестве таких источников рассматриваются кустарник гуаюла (Parthenium argentatum) и близкие родственники одуванчика - корневые каучуконосы кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz), крым-сагыз (Taraxacum hybernum), тау-сагыз (Scorzonera tau-saghyz) и некоторые другие. Однако, для промышленного производства дикие формы корневых каучуконосов, в частности, кок-сагыза, являющегося источником не только каучука, но и инулина, малопродуктивны вследствие низкой скорости роста, сильной зависимости от природно-климатических и агротехнических условий выращивания, сложности технологий переработки и извлечения целевых продуктов. Ключевым направлением в решении проблем повышения продуктивности кок-сагыза по каучуку являются генно-инженерные исследования по модификации генома и селекционные работы с целью получения растений, которые могут обеспечить рентабельное промышленное производство. Активно разрабатываются технологии промышленного выращивания кок-сагыза в искусственных условиях, в частности, в аэропонных фитотронах.

Широкое проведение таких исследований обуславливает потребность в простых, воспроизводимых и точных методах определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений. Традиционно для этой цели используют гравиметрический метод, применение которого для определения смол и каучука в гуаюле описано, например, в работе [L.T. Black, G.E. Hamerstrand, В.А. Rasnik "Gravimetric analysis for determining the resin and rubber content of guayule". Rubber Chem. Technol. 1983, 56, 2. p. 367-371]. Метод включает высушивание каучуконосных тканей растений, их измельчение, последовательное удаление водорастворимых компонентов и продуктов, растворимых в полярных органических растворителях, извлечение каучука экстракцией неполярными растворителями с последующим высушиванием экстракта до постоянного веса остатка. Высушенная биомасса перед измельчением может дополнительно подвергаться глубокому замораживанию, см, например, [Б.Р. Кулуев, Н.Д. Минченков, Г.Р. Гумерова «Кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin): методы выделения каучука и перспективы использования биотехнологических подходов». Биотехнология и селекция растений. 2019, 2 (2), с. 33-42]. Количественное определение содержания каучука гравиметрическим методом требует значительного количества исходного материала для анализа, а также значительных затрат времени и реактивов, что ограничивает его использование для проведения массовых анализов в целях мониторинга накопления целевого продукта в процессе роста растений. Тем не менее, гравиметрический метод, позволяющий получать абсолютные значения количественного содержания каучука в тканях растений, остается незаменимым в качестве метода сравнения для оценки достоверности результатов, получаемых другими методами.

Современной альтернативой гравиметрическому методу являются методы инструментального физико-химического анализа, применение которых в научных исследованиях и в промышленных сельскохозяйственных технологиях активно разрабатывается в последние годы.

Известно применение низкопольной ЯМР-спектроскопии для количественного определения содержания каучука в тканях растений [US 10859650 В2, опубл. 08.12.2020]. Способ включает переведение каучука из тканей растения в раствор и сравнительный анализ интенсивности пиков спектров ЯМР исследуемого и стандартного образцов с заранее определенным содержанием каучука. Сложная процедура подготовки образца для анализа и относительно низкая чувствительность метода дают высокую погрешность, особенно, при анализе образцов с низким содержанием каучука.

Для анализа содержания каучука в растениях кок-сагыз описано применение масс-спектрометрических методов, основанных на определении продуктов пиролиза каучука, главным образом, изопрена и лимонена. [Y. Dong. Т. Xiang, et al. "Rapid Quantitative Determination of Isoprene Monomer in Living Taraxacum kok-saghyz by Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry" China Petroleum Processing and Petrochemical Technology 2020, 22, 2, p. 30-36] и [Y. Dong, T. Guo, et al. "Determination of Natural Rubber Content in Taraxacum Kok-Saghyz by Pyrolysis Gas Chromatography-Mass Spectrometry" China Petroleum Processing and Petrochemical Technology. 2022, 22, 3, p. 43-48]. При интерпретации результатов следует иметь в виду, что аналогичные продукты получаются при пиролизе низкомолекулярных каучуков, содержащихся в смолах, также присутствующих в тканях каучуконосных растений. Метод требует применения сложного оборудования и кропотливой предварительной подготовки образцов и не подходит для выполнения массовых серийных анализов.

В качестве способа, позволяющего определить содержание смол и каучука в тканях растений без предварительной длительной подготовки образца, предложено использовать портативный вариант ИК спектроскопии в ближнем ИК (БИК) диапазоне 800-2400 нм. В работе [М. Taurines, L. Brancheriau et al. "Determination of natural rubber and resin content of guayule fresh biomass by near infrared spectroscopy". Industrial Crops and Products. 2019, 134, p. 177-184] возможности способа продемонстрированы на примере анализа содержания каучука в ветвях кустарника гуаюла. Способ может быть использован для оценки содержания целевого продукта как в отдельных растениях, так и для оценки среднего содержания каучука и смол в растениях в масштабах всего поля, на основании относительно небольшой выборки - около 70 измерений, например, при исследовании влияния природно-климатических условий на накопление каучука в тканях растений или для определения оптимальной даты сбора урожая. С помощью переносного БИК-спектрометра возможно определение количественного содержания каучука непосредственно в полевых условиях с использованием сырых или высушенных веток гуаюлы, однако, по утверждению авторов, более высокую точность - до±0,3% получают при использовании для анализа порошкообразных проб, полученных измельчением высушенных каучук-содержащих тканей растений.

Настоящее изобретение решает проблему расширения арсенала технических средств, позволяющих с помощью современных инструментальных методов физико-химического анализа быстро и с высокой точностью определять количественное содержание каучука в тканях каучуконосных растений без его извлечения из каучук-содержащего биоматериала.

Проблема решена предлагаемым способом определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений, включающим приготовление порошкообразного образца из высушенной ткани растения и последующий анализ полученного образца с помощью инструментального метода физико-химического анализа, отличающимся тем, что в качестве указанного метода физико-химического анализа используют метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спинового зонда с применением в качестве спинового зонда нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила (ΤΕΜΠΟ), а количественное содержание каучука в образце определяют по значению величины интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ с использованием линейной зависимости интегральной интенсивности указанной компоненты спектра от количества каучука в пробе.

Радикал ΤΕΜΠΟ представляет собой доступный коммерческий продукт, характеризуется стабильностью при комнатной температуре, обладает высокой летучестью, позволяющей вводить его в исследуемое вещество из газовой фазы, молекула может легко внедряться в структуру исследуемого объекта. В качестве низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ используют первую из трех регистрируемых при развертке поля компонент, поскольку на нее не накладываются дополнительные нативные сигналы.

Технический результат изобретения - предложен новый, основанный на применении ЭПР-спектроскопии спинового зонда, способ определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений. Способ предполагает использование в качестве спинового зонда коммерчески доступного нитроксильного радикала ΤΕΜΠΟ и позволяет быстро определять содержание каучука в тканях растений без его выделения из каучук-содержащей биомассы.

Сущность изобретения поясняют следующие графические иллюстрации.

На Фиг. 1 показаны спектры ЭПР ΤΕΜΠΟ проб, содержащих различное количество каучука, полученных из образцов биомассы корня растения кок-сагыз, выращенного в условиях аэропонного фитотрона. Низкопольная компонента спектра выделена пунктиром. Масса пробы 7 мг.

На Фиг. 2 представлена зависимость интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ от количества каучука в пробе в диапазоне концентраций от 0 до 17,5 масс. %.

Метод ЭПР спинового зонда широко используется для исследования полимерных систем [Md. A. Uddin, Η. Yu, et al. "Recent progress in EPR study of spin labeled polymers and spin probed polymer systems" J. Polym. Sci., 2020, 58, p.1924-1948. DOI: 10.1002/pol.20200039]. Спектр ЭПР нитроксильного радикала предоставляет информацию о химических реакциях, локальной молекулярной подвижности, полярности, молекулярной организации исследуемой системы. В настоящем изобретении показана возможность применения метода для количественного определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений.

Предлагаемый способ основан на обнаруженном авторами факте избирательной сорбции стабильного нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила (ΤΕΜΠΟ) на частицах каучука, содержащегося в растительной биомассе. Было показано, что при введении радикала ΤΕΜΠΟ в порошок, полученный измельчением высушенной каучук-содержащей растительной ткани, получают спектры ЭПР, аналогичные спектрам, зарегистрированным ранее для радикала ΤΕΜΠΟ в эластомерах. Времена корреляции вращения нитроксильного радикала τ и константы сверхтонкого взаимодействия (СТВ) a_N, полученные авторами на образцах каучук-содержащей корневой биомассы растения кок-сагыз, составляют: τ=3,0×10^-10 с, a_N=15,5 Гс; значения для натурального каучука: τ=2,0×10^-10 с, a_N=15,4 Гс. [А.М. Вассерман, А.Л. Коварский. «Спиновые метки и зонды в физикохимии полимеров» Отв. ред. А.Л. Бучаченко АН СССР, Ин-т хим. физики. - М. Наука, 1986, 244 с.].

Показано, что радикал ΤΕΜΠΟ локализуется исключительно в каучуковых образованиях каучук-содержащей ткани. Факт избирательной сорбции радикала ΤΕΜΠΟ на частицах каучука подтверждается тем, что после удаления каучука из образца биомассы экстракцией неполярным растворителем в оставшемся материале спектры ЭПР ΤΕΜΠΟ не регистрируются.

Большое значение имеет степень измельчения высушенного биоматериала, взятого для анализа. Показано, что измельчение высушенной ткани до размеров примерно 20 мкм обеспечивает гомогенизацию образцов, достаточную для быстрого проникновения радикала ΤΕΜΠΟ в каучуковые образования растения. Чем больше каучука содержится в пробе, тем большее количество радикала проникает в образец из газовой фазы, тем больше интенсивность сигнала ЭПР. В качестве иллюстрации на Фиг. 1 сопоставлены спектры ЭПР ΤΕΜΠΟ одинаковых по массе проб, содержащих разное количество каучука, полученных из разных образцов высушенной измельченной ткани корней растения кок-сагыз.

Следует отметить, что степень измельчения исходного каучук-содержащего материала существенно важна и для получения корректных результатов традиционным гравиметрическим методом, на что авторы публикаций, описывающих весовое определение каучука в растительных тканях, обычно не обращают внимания. Метод спинового зонда позволяет контролировать полноту извлечения натурального каучука из растения. Например, было установлено, что при экстракции каучука из порошка с размером частиц примерно 150 мкм, заметное количество каучука остается в образце. Дополнительное диспергирование материала обеспечивает проникновение радикала в каучуковые образования, которые в частицах больших размеров могут быть заблокированы инулином и/или другими компонентами тканей растения, непроницаемыми для радикала.

Предлагаемый способ определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений основан на существовании линейной зависимости между величиной интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ и количественным содержанием каучука в пробе. Низкопольная компонента спектра ЭПР выделена пунктиром на Фиг. 1. Интегральную интенсивность а рассчитывают по формуле:

где I - интенсивность низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ, ΔН - ширина низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ.

Интегральная интенсивность пропорциональна количеству радикала, находящегося в каучуковых образованиях, и, соответственно, количеству каучука в образце. В качестве иллюстрации на Фиг. 2 показана полученная авторами калибровочная линейная зависимость интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ от количественного содержания каучука в эталонных пробах. Количество каучука в образцах, из которых приготовлены эталонные пробы, использованные для построения калибровочного графика, определено гравиметрическим методом. Линейная зависимость между величиной интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ и количественным содержанием каучука в пробе позволяет определить количество каучука в пробе тестируемого образца. Поскольку нулевому содержанию НК в пробе соответствует нулевая интенсивность сигнала низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ (калибровочный график проходит через 0), для его построения достаточно использовать один или два эталонных образца, концентрация каучука в которых, предпочтительно, приближена к предполагаемой концентрации каучука в тестируемом образце. При этом для получения корректных результатов в каждом эксперименте насыщение тестируемых и эталонных образцов радикалом ΤΕΜΠΟ проводят одновременно в одних и тех же условиях, спектры ЭПР всех образцов серии также должны быть записаны в одинаковых условиях.

Пробы для анализа готовят следующим образом.

Каучук-содержащий биоматериал высушивают при 60°С в сушильном шкафу в течение 15-16 часов, после чего измельчают до получения частиц размером примерно 20 мкм. Размер частиц контролируют, просеивая их через сито.

В ампулы для ЭПР анализа отбирают пробы полученных порошкообразных образцов. Оптимальное количество пробы, определяемое техническими характеристиками спектрометра, составляет 7 мг. Радикал ΤΕΜΠΟ вводят в пробы из газовой фазы при комнатной температуре. Для этого ампулы с пробами помещают в эксикатор, в котором находится примерно 10 мг радикала ΤΕΜΠΟ. Экспериментально показано, что при выбранных количествах компонентов время экспозиции, обеспечивающее получение наиболее точных и хорошо воспроизводимых результатов, составляет около 10 минут, при этом концентрация радикала ΤΕΜΠΟ в образцах не превышает 1×10^-5 М. Увеличение времени экспозиции приводит к превышению оптимальной концентрации и взаимодействию радикалов друг с другом, что может вызвать искажение формы спектра и внести ошибку при определении интенсивности сигнала. После введения радикала ампулы с образцами запаивают.

Для проведения измерений использован ЭПР-спектрометр Bruker ЕМХ (Германия). При записи спектров значение микроволновой мощности в резонаторе 2 мВ, амплитуда модуляции 0,5 Гс.

Содержание каучука в анализируемой пробе определяют из линейной зависимости между интегральной интенсивностью низкопольной компоненты спектра ЭПР ΤΕΜΠΟ и количеством каучука в пробе, полученной с использованием эталонной пробы с известным содержанием НК, определенным независимым способом. Ошибка определения интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра по трем последовательным измерениям для образца, содержащего 5,0% НК (0,35 мг в 7 мг образца), составляет 7,5%, что соответствует ошибке в абсолютном количестве каучука, равной ±0,03 мг.

Возможность применения предлагаемого способа продемонстрирована на примерах определения содержания каучука в корнях растений кок-сагыз, выращенных в разных условиях и имеющих различную концентрацию НК.

Пример 1. Определение содержания каучука в корнях растения кок-сагыз, выращенного в условиях аэропонного фитотрона в течение двух месяцев.

Корень растения массой 100 г высушивают в течение 16 часов при температуре 60°С в сушильном шкафу и измельчают на шаровой мельнице в течение 10 минут до получения порошкообразного образца со средним размером частиц примерно 20 мкм.

Гравиметрическое определение.

Навеску образца массой 0,3 г экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета в течение 3 часов при температуре 60°С.Каучук высаживают из экстракта трехкратным избытком этилового спирта, промывают водой, ацетонитрилом и этиловым спиртом и высушивают при температуре 60°С в течение суток до постоянного веса. Количество каучука в исследованном образце по результатам трех измерений составляет 42±3 мг (14,0±1% в расчете на сухой вес).

Определение предлагаемым способом.

Для определения количества каучука в исследуемом образце используют эталонный образец, содержание в котором каучука по результатам гравиметрического анализа составляет 17,5%. В ампулах для ЭПР-анализа взвешивают по 7 мг эталонного и тестируемого образцов, затем ампулы помещают на 10 минут в эксикатор, в котором находится примерно 10 мг радикала ΤΕΜΠΟ (Sigma-Aldrich), после чего ампулы запаивают и записывают спектры ЭПР. Определяют значения интенсивности I и ширины ΔH низкопольной компоненты спектра и по формуле (1) рассчитывают значения а (усл. ед.) интегральной интенсивности низкопольных компонент спектров ЭПР ΤΕΜΠΟ проб эталонного и тестируемого образцов. По величине а для эталонного образца строят проходящую через 0 калибровочную линейную зависимость, по которой далее определяют количественное содержание каучука в тестируемом образце. Полученное значение 1,026 мг (14,6 масс. %) совпадает в пределах ошибки эксперимента с результатом, полученным гравиметрическим методом.

Пример 2. Определение содержания каучука в корнях растения кок-сагыз, выращенного in vitro в течение двух месяцев.

Корень растения массой 30 г высушивают в течение 16 часов при температуре 60°С в сушильном шкафу и измельчают на шаровой мельнице в течение 10 минут до получения порошкообразного образца со средним размером частиц примерно 20 мкм.

Гравиметрическое определение.

Навеску образца массой 2 г экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета в течение 3 часов при температуре 60°С. Каучук высаживают из экстракта трехкратным избытком этилового спирта, промывают водой, ацетонитрилом и этиловым спиртом и высушивают при температуре 60°С в течение суток до постоянного веса. Количество каучука в исследованном образце по результатам трех измерений составляет 53,4±3,0 мг (2,67±0,15% в расчете на сухой вес).

Определение предлагаемым способом.

Для определения количества каучука в исследуемом образце используют эталонные образцы, содержание каучука в которых по результатам гравиметрического анализа составляет 1,3% и 2,8%. Приготовление проб для анализа, анализ ЭПР и обработку результатов проводят аналогично примеру 1. Полученное значение 0,195 мг (2,78%) НК, совпадает в пределах ошибки эксперимента с результатом, полученным гравиметрическим методом.

Предлагаемый метод прост в осуществлении, не требует большого количества исходного материала и может быть использован как в научных исследованиях, так и для мониторинга накопления каучука в тканях растений в процессе их промышленного выращивания в грунте или в искусственных условиях фитотрона.

Изобретение относится к инструментальным методам физико-химического анализа и представляет собой способ определения содержания натурального каучука в тканях каучуконосных растений с использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Способ включает приготовление порошкообразного образца из высушенной ткани растения со средним размером частиц около 20 мкм и последующий анализ полученного образца с помощью метода ЭПР спинового зонда с применением в качестве спинового зонда стабильного нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила (ТЕМПО). Количественное содержание каучука в образце определяют по значению величины интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР с использованием линейной зависимости интегральной интенсивности указанной компоненты спектра от количественного содержания каучука в пробе. Технический результат изобретения состоит в том, что предложен новый, основанный на применении ЭПР-спектроскопии спинового зонда, способ определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений. Способ предполагает использование в качестве спинового зонда коммерчески доступного нитроксильного радикала ТЕМПО и позволяет быстро определять содержание каучука в тканях растений без его выделения из каучуксодержащей биомассы. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Способ определения содержания каучука в тканях каучуконосных растений, включающий приготовление порошкообразного образца из высушенной ткани растения и последующий анализ полученного образца с помощью инструментального метода физико-химического анализа, отличающийся тем, что средний размер частиц в порошкообразном образце составляет около 20 мкм, а в качестве указанного метода используют метод электронного парамагнитного резонанса спинового зонда с применением в качестве спинового зонда нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксила, а количественное содержание каучука в образце определяют по значению величины интегральной интенсивности низкопольной компоненты спектра ЭПР с использованием линейной зависимости интегральной интенсивности указанной компоненты спектра от количественного содержания каучука в пробе.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный нитроксильный радикал вводят в тестируемый образец из газовой фазы при комнатной температуре.