Способ биопонного выращивания каучуконосных одуванчиков для получения высококачественного натурального каучука Российский патент 2024 года по МПК A01G22/00 A01G31/02 

Основой изобретения является способ биопонного выращивания каучуконосных одуванчиков с использованием нейтрального торфа в качестве субстрата, раствора 1/8 концентрации смеси Хогланда-Арнона в качестве минерального питания, с добавлением фитоспорина М и триходермы вириде на гидропонной установке с автополивом и искусственным освещением для получения высококачественного натурального каучука

Предшествующий уровень техники

Натуральный каучук (НК) представляет собой полимер, состоящий из цис-1,4-полиизопрена, является очень важным сырьем, используемым для производства более 50000 изделий (Panara et al., 2022) и особо ценится в таких отраслях, как транспорт, медицина и оборона (Cherian et al., 2019). Количество и относительная доля натурального каучука в резиновых изделиях увеличились за последние 35 лет. Так в 1981 г. на натуральный каучук приходилось 30% всего каучука (натурального и синтетического), используемого в мире, а к 2013 г. эта доля уже увеличилась до 42% (Ramirez-Cadavid et al., 2017). Это связано с тем, что натуральный каучук из растений превосходит каучук из нефти по нескольким параметрам: полимер натурального каучука имеет гораздо более высокую молекулярную массу по сравнению с синтетическим каучуком, а также устойчивое и возобновляемое производство растительного каучука считается более эффективным и экологичным, чем переработка невозобновляемой нефти (van Beilen et al., 2008; Nowicki et al., 2019). Натуральный каучук обладает превосходной эластичностью, липкостью, прочностью, термическими свойствами, эластичностью, сопротивлением истиранию и ударопрочностью по сравнению с синтетическим каучуком, что объясняется его уникальной молекулярной структурой и высокой молекулярной массой (>1 млн г/моль) (Salehi et al., 2021). Посадка самолета небезопасна с шинами из синтетического каучука, поэтому шины для самолетов чаще всего на 100% сделаны из натурального каучука. Грузовые шины на 90-100% состоят из НК, и даже в автомобильных шинах всегда содержится определенная доля натурального каучука (Salehi et al., 2021). По многочисленным литературным данным каучук способны синтезировать более 2500 видов двудольных растений (Cornish et al., 2016). Однако лишь несколько видов растений были признаны источником высококачественного каучука с большой молекулярной массой, которые можно использовать в производственных масштабах. Наиболее известные из них это гевея бразильская (Hevea brasiliensis Willd. ex A. Juss.) ), гваюла (Parthenium argentatum Grey), одуванчик кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin) (Nowicki et al., 2019; Kuluev et al., 2022). Менее известны произрастающие на Крымском полуострове одуванчик осенний (Taraxacum hybernum Stev.) и претендующий на статус вида - одуванчик Победимовой (Taraxacum pobedimovae Schischk), которые более известны под названиями буросемянная и розовосемянная формы крым-сагыза, соответственно (Kuluev et al., 2022; Fateryga et al., 2023). Поэтому термин «крым-сагыз» по сути относится к этим двум разным видам одуванчиков, и эта традиция сложилась еще с середины 20 века в СССР. В дальнейшем при использовании термина «крым-сагыз» будет иметься ввиду оба предполагаемых вида крымских каучуконосных одуванчиков - Т. hybernum и Т. pobedimovae. На сегодняшний день лишь Н. brasiliensis, культивируемое в основном в странах Азиатско-Тихоокеанского региона, является источником почти всего натурального каучука в мире (Ahrends et al., 2015). Однако спрос на натуральный каучук с каждым годом только растет. Так как урожай каучука сильно зависит от природных условий, то к проблемам изменения климата и опасного грибкового заболевания вызванного М. ulei добавляется нестабильность цен. Маловероятно, что выращивание гевеи можно и дальше расширить в достаточной степени, чтобы удовлетворить растущие глобальные потребности в натуральном каучуке, что связано как с экономическими, так и экологическими ограничениями (Luo et al., 2018). Исходя из понимания этих проблем, внедрение в производство альтернативных каучуковых культур, обеспечивающих географическое и генетическое разнообразие в мировых масштабах будут позитивно влиять на торговлю каучуком, одновременно снизив волатильность цен и обеспечив надежность поставок. К началу 21 века во многих экономически развитых странах мира была осознана важность поиска альтернативных источников натурального каучука. На первое место в этих поисках выходит Т. kok-saghyz, который уже успешно выращивался в промышленных масштабах в СССР и некоторых других странах в середине 20 века. В 21 веке во многих странах снова начался сбор ресурсов зародышевой плазмы и начаты фундаментальные исследования этого растения (Luo et al., 2017; Bari et al., 2022). Об актуальности альтернативных источников натурального каучука может также говорить то, что ряд шинных компаний заинтересовались и уже участвовали или участвуют в реализации проектов с одуванчиком кок-сагызом. Это такие известные фирмы, как American Sustainable Rubber, Bridgestone, Continental, Ford, Goodyear, KeyGene, Kultivat, Ling-long, NovaBioRubber, Sumitomo (Cherian et al., 2019). Корни кок-сагыза и крым-сагыза содержат от 3 до 28% натурального каучука (цис-1,4-полиизопрена) в пересчете на сухую массу с очень похожими по макромолекулярной структуре и составу характеристиками присущими для Н. brasiliensis (Krotkov, 1945; van Beilen, Poirier, 2007; Cornish et al., 2015; Kuluev et al., 2022). Тем не менее, кок-сагыз и крым-сагыз до сих пор не удается полноценно одомашнить и эти растения имеют несколько присущих им проблем, таких как потребность в постоянном увлажнении почвы во время прорастания и дальнейшего роста, очень медленная скорость роста, низкая конкурентоспособность с сорняками, значительный выход каучука только в период созревания, а для кок-сагыза еще и высокая степень гетерозиготности и самонесовместимость (Nowicki et al., 2019; Cherian et al., 2019). В умеренном климате большей части России также добавляется проблема короткого теплого периода без заморозков. По результатам наших опытов полевое выращивание кок-сагыза на территории России может быть эффективным лишь при использовании рассадного метода, то есть предварительного получения рассады в теплом помещении, но это экономически не выгодно. Минусами полевого возделывания также являются низкая всхожесть семян, неравномерное созревание семян и их потеря, сорняки, вредители, отсутствие специальной техники для посева, сбора семян и уборки корней. Минусом также является необходимость большого количества горючего нужного для полевых работ. Поэтому мы предлагаем технологию биопонного (гидропоника + торф + микроорганизмы) выращивания каучуконосных видов одуванчика, например, кок-сагыза и крым-сагыза. Таким образом, снимаются проблемы с сорняками, вредителями, непредсказуемостью погодных условий и необходимостью наличия специальной техники для сбора урожая, к тому же корни будут чистыми и не будут требовать этапа мойки. Подобные технологии на сегодняшний день разработаны для кок-сагыза в США и Германии на основе гидропоники, однако одуванчики при этом накапливали относительно мало каучука. Известен также способ аэропонного выращивания кок-сагыза (Патент RU 2779988 C1 от 16 сентября 2022). Нами ранее проведены работы как по гидропонному (Кулуев и др., 2017а), так и аэропонному выращиванию каучуконосных одуванчиков (Кулуев и др., 2017б). Однако в этих условиях одуванчики накапливали довольно мало каучука. Мы предлагаем комбинированную технологию выращивания каучуконосных одуванчиков совмещающую гидропонику и почвенное выращивание, которая позволяет накапливать каучук в корнях до 7,5% к сухой массе, что не уступает накоплению каучука в полевых условиях. По аналогии с выращиванием зеленых культур, данная технология наиболее близка к биопонике, поэтому и получила такое название. В нашей разработке предлагается использовать твердый грунт в виде нейтрального торфа, минеральные соли, биопрепараты фитоспорина М и триходермы вериде. Органические удобрения при этом не используются. Вместо кок-сагыза могут быть использованы и другие каучуконосные одуванчики, например в нашей разработке использованы два крымских вида, Т. pobedimovae, который также известен как розовосемянный крым-сагыз и Taraxacum hybernum, известный как буросемянный крым-сагыз. Видовая принадлежность данных крымских одуванчиков на данный момент исследуется группой исследователей под руководством А.В. Фатерыги (Fateryga et al., 2023).

Подробное описание изобретения

Семена каучуконосных одуванчиков: Т. kok-saghyz (кок-сагыз), Т. hybernum (буросемянная форма крым-сагыза), Т. pobedimovae (розовосемянная форма крым-сагыза) вначале следует замочить в чистой воде комнатной температуры в чашках Петри с фильтровальной бумагой и провести их стратификацию в бытовом холодильнике при температуре от +2 до +5°С в течение одной недели. При этом затапливать семена в воде нельзя, чтобы не лишать их доступа к кислороду. Эта процедура в 2-3 раза повышает всхожесть и дружность всходов. В нашем эксперименте также был использован козлобородник Tragopogon major, близкий к одуванчикам растение из семейства Астровых. Дальнейшее выращивание растений проводили в гидропонной установке МГУ-3-3/4 (Промгидропоника, Россия) с искусственным освещением (освещенность - 8000 люкс), в режиме 16 часов день / 8 часов ночь. Время выращивания растений от посева семян в грунт до сбора корней заняло 3 месяца. В качестве грунта использовали торф нейтрализованный Veltorf (Россия), который в ходе эксперимента ни разу не меняли и не обновляли. Семена после холодовой стратификации переносили по 4 штуки на каждый гидропонный сосуд объемом 300 мл. В системе автополива в качестве минерального питания во все периоды вегетации использовали раствор 1/8 концентрации смеси Хогланда-Арнона: Ca(NO₃)₂ × 4H₂O (0,6 мМ), KNO₃ (0,6 мМ), KH₂PO₄(0,1 мМ), MgSO₄ × 7H₂O (0,1 мМ), KCl (12 мкМ), Н₃ВО₃ (6 мкМ), MnCl₂ × 4H₂O (0,6 мкМ), ZnSO₄ × 7H₂O (0,4 мкМ), CuSO₄ × 5H₂O (0,35 мкМ), (NH₄)₆Mo₇O₂₄ × 4H₂O (0,01 мкМ), Co(NO₃)₂ * 6H₂O (0,02 мкМ), Fe-EDTA (10 мкМ), NaOH (25 мкМ). Настройки автополива были следующие: в первый месяц выращивания включение полива через каждые 6 часов (4 полива в сутки), во второй месяц - через каждые 8 часов (3 полива в сутки), в третий месяц - 1 полив в сутки. Каждый раз система автополива включалась только на 5 минут. Объем бака для питательной смеси - 90 литров. Таким образом создавались условия более близкие к природным, когда вначале имитируется дождливое начало лета, а в конце лета - уменьшение осадков. Еще более редкий полив приводит к постепенному увяданию листьев, поэтому автополив работал не менее 1 раза в сутки. Расход питательной смеси составил около 60 литров в месяц. В общем в ходе всего эксперимента было использовано 180 литров раствора 1/8 концентрации смеси Хогланда-Арнона, что эквивалентно 22,5 литрам однократного раствора смеси Хогланда-Арнона. Для защиты растений от фитопатогенов использовали коммерчески доступные препараты бактерий Bacillus subtilis (фитоспорин М универсальный, 10 г, «Башинком», Россия) и грибов Trichoderma viride (триходерма вериде, 30 г, «Ваше хозяйство», Россия). Эти биопрепараты добавляли в бак три раза за все время опыта (по 1 разу в месяц): в первый раз перед посевом семян в гидропонную систему - 10 г фитоспорина М (всю упаковку) и 15 г триходермы вериде (половина упаковки); во второй и третий раз добавляли по 5 г фитоспорина М (половину упаковки) и 7 г триходермы вериде (четверть упаковки). Согласно нашим предварительным исследованиям без использования этих биопрепаратов сеянцы могут погибнуть от грибковых заболеваний и в целом растут гораздо медленнее, набирают меньшую биомассу и меньшее количество каучука. В качестве контроля также выращивали кок-сагыз в почвенных условиях на универсальном грунте (Просто, Россия). Условия освещения как для биопоники, так и для почвы были идентичны, ручной полив почвенных растений осуществляли от начала до конца вегетации по 3 раза в неделю. Также трижды обрабатывали почвенные растения препаратами фитоспорина М и триходермы вериде в той же концентрации, что и гидропонные растения.

Семена анализируемых растений всходили в течение первых двух недель выращивания (Фиг. 1) и далее начинался интенсивный рост растений на биопонике (Фиг. 2). Оба вида крым-сагыза в первый месяц уступали в росте кок-сагызу. К концу второй недели в каждом сосуде проводили прореживание и оставляли только по одному растению. Через полтора месяца наблюдали интенсивный рост листвы кок-сагыза, к тому же некоторые растения начинали цвести (Фиг. 3). В то же время оба вида крым-сагыза к этому времени еще не цвели. Через два месяца (Фиг. 4) картина сильно не изменилась. Цветение буросемянного крым-сагыза началось на втором месяце вегетации (Фиг. 5) и до конца эксперимента эти растения дали довольно большое количество зрелых семян (Фиг. 6). С опозданием на 1 неделю зацвели также розовосемянные формы крым-сагыза (Т. pobedimovae). Кок-сагыз до конца вегетации цвел, однако семена не дал. Это связано с тем, что кок-сагыз перекрестно-опыляемое самонесовместимое растение, а искусственное переопыление мы не проводили. До конца эксперимента розовосемянная форма крым-сагыза дала гораздо меньше семян, чем буросемянная форма. Семена обеих форм крым-сагыза полученных на биопонике оказались зрелыми и показали высокую всхожесть, что связано с тем, что эти одуванчики размножаются через апомиксис. Таким образом, для получения зрелых семян лучшие результаты были получены для буросемянной формы крым-сагыза (Т. hybernum).

Через 3 месяца урожай корней был собран. Наибольшая сырая масса корней была характерна для кок-сагыза и козлобородника. Оба вида крым-сагыза лишь немного уступали по данному параметру. Почвенные растения кок-сагыза набирали очень маленькую сырую массу - примерно в 10 раз меньше, чем гидропонные варианты (Фиг. 7). Далее корни одуванчиков высушивали при комнатной температуре в течение 10 дней для измерения сухой массы и перевода каучука в коагулированное состояние, что необходимо для исключения потерь каучука при процедуре его выделения. По сухой массе были получены схожие данные. Самая большая сухая масса была характерна для козлобородника и кок-сагыза. Далее расположились Т. pobedimovae, и далее Т. hybernum (Фиг. 8). В почвенных условиях кок-сагыз набирал сухую массу в 8 раз меньше, чем в условиях биопоники. Причем для выращивания почвенных растений использовали сосуды объемом 1 литр, что примерно в 3 раза больше, чем сосуды у гидропонных растений. Несмотря на это, почвенные растения набирали гораздо меньшую массу корней, по сравнению с гидропонными. Далее с использованием метода гексановой экстракции проводили выделение каучука (Кулуев и др., 2019). Наибольшее содержание каучука на сухую массу корней было характерно для почвенных растений кок-сагыза. Из гидропонных растений больше всего каучука накапливали Т. pobedimovae (Фиг. 9), причем по этому показателю они лишь в 1,2 раза уступали почвенным кок-сагызам. Наименьшее содержание каучука было характерно для козлобородника. Далее была вычислена средняя масса каучука, получаемая от одного корня. По этому показателю лидером оказался Т. pobedimovae (Фиг. 10), что было почти в 6 раз выше, чем у почвенных растений кок-сагыза. Большой интерес также представляет определение выхода каучука на объем использованного грунта. По данному показателю лидером также оказалась розовосемянная форма крым-сагыза (Т. pobedimovae) (Фиг. 11). Таким образом, наибольшая эффективность по занимаемому объему (площади) при получении каучука была характерна для Т. pobedimovae. Для гидропонной системы это очень важный показатель, так как экономия площади и объемов будет удешевлять производство. На Фиг. 12 представлены фотографии срезов корней, на которых виден стекающий латекс, представляющий собой каучуковую эмульсию, а также фотографии самого каучука после процедуры выделения методом гексановой экстракции. Полученный в гидропонных условиях каучук по общему виду и эластичности не отличался от полученного в условиях почвы. Таким образом, разработанная нами технология позволяет производить высококачественный натуральный каучук исключительно из отечественного сырья в условиях России, а также других стран вне зависимости от условий климата. Преимуществами биопонной технологии выращивания является большая близость к природным условиям в отличие от гидропоники и аэропоники, что способствует большему накоплению каучука в корнях одуванчиков.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Сеянцы кок-сагыза через две недели после посева на грунт.

Фигура 2. А - кок-сагыз через 1 месяц после посева семян на грунт. Б - крым-сагыз (в ближнем блоке - розовосемянная, в дальнем блоке - буросемянная формы) через 1 месяц после посева семян на грунт.

Фигура 3. А - кок-сагыз через 1,5 месяца после посева семян на грунт. Б - крым-сагыз (в ближнем блоке - розовосемянная, в дальнем блоке - буросемянная формы) через 1,5 месяца после посева семян на грунт.

Фигура 4. А - кок-сагыз через 2 месяца после посева семян на грунт. Б - крым-сагыз (в ближнем блоке - розовосемянная, в дальнем блоке - буросемянная формы) через 2 месяца после посева семян на грунт.

Фигура 5. А - кок-сагыз через 2,5 месяца после посева семян на грунт. Б - крым-сагыз (в ближнем блоке - розовосемянная, в дальнем блоке - буросемянная формы) через 2,5 месяца после посева семян на грунт.

Фигура 6. А - кок-сагыз через 3 месяца после посева семян на грунт. Б - крым-сагыз (в ближнем блоке - розовосемянная, в дальнем блоке - буросемянная формы) через 3 месяца после посева семян на грунт.

Фигура 7. Сырая масса корней анализируемых растений к концу срока вегетации (через 3 месяца после посева). Т. kok-saghyz почва - растения кок-сагыза, выращенные в условиях почвы. Все остальные растения выращены в условиях биопоники.

Фигура 8. Сухая масса корней анализируемых растений к концу срока вегетации (через 3 месяца после посева). Т. kok-saghyz почва - растения кок-сагыза, выращенные в условиях почвы. Все остальные растения выращены в условиях биопоники.

Фигура 9. Содержание каучука на сухую массу корня.

Фигура 10. Масса каучука, получаемого из 1 корня.

Фигура 11. Масса каучука, получаемого на 100 мл грунта.

Фигура 12. А, Б - просачивание латекса из разрезанных корней, полученных на биопонике. В - растягивание каучука, выделенного из биопонных кок-сагызов. Г - шарик каучука, выделенного из корней биопонного кок-сагыза.

Список литературы

1. Кулуев Б.Р., Картуха А.И., Князев А.В., Фатерыга А.В., Чемерис А.В. Опыт выращивания Taraxacum hybernum (Asteraceae) // Растительные ресурсы. 2017. №4. С. 543-554.

2. Кулуев Б.Р., Бережнева З.А., Чемерис А.В. Гидропонное и аэропонное выращивание одуванчика Taraxacum kok-saghyz Rodin // Биомика. 2017. Т. 9. №2. С. 96-100.

3. Кулуев Б.Р., Минченков Н.Д., Гумерова Г.Р. Кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin): методы выделения каучука и перспективы использования биотехнологических подходов. Биотехнология и селекция растений. 2019;2(2). С. 33-43. DOI: 10.30901/2658-6266-2019-2

4. Ahrends, A.; Hollingsworth, P.M.; Ziegler, A.D.; Fox, J.M.; Chen, H.; Su, Y.; Xu J. Current trends of rubber plantation expansion may threaten biodiversity and livelihoods. Glob. Environ. Change, 2015, 34, 48-58.

5. Bari, G.; Gainullina, K.P.; Gumerova, G.R.; Uteulin, K.R.; Golovanov, Ya.; Chemeris, A.V.; Kuluev, B.R. Multilocus DNA polymorphism of some rubber-bearing dandelions (Taraxacum spp.) of Russia and Kazakhstan. Genet. Resour. Crop Evol. 2022, 69, 335-348.

6. Cherian, S.; Ryu, S.B.; Cornish, K. Natural rubber biosynthesis in plants, the rubber transferase complex, and metabolic engineering progress and prospects. Plant Biotechnol J. 2019, 17(11), 2041-2061.

7. Cornish, K.; Xie, W.; Kostyal, D.; Shintani, D.; Hamilton R.G. Immunological analysis of the alternate rubber crop Taraxacum koksaghyz indicates multiple proteins cross-reactive with Hevea brasiliensis latex allergens. J. Biotechnol. Biomater. 2015. 5, 201-207.

8. Cornish, K., Kopicky, S.L.; Mcnulty, S.K.; Amstutz, N.; Chanon, A.M.; Walker, S.; Kleinhenz, M.D.; Miller, A.R.; Streeter, J.G. Temporal diversity of Taraxacum kok-saghyz plants reveals high rubber yield phenotypes. Biodiversitas. 2016,17, 847-856.

9. Fateryga V.V., Kuluev B.R., Svirin S.A., Fateryga A.V. Lectotypification and the taxonomic status of Taraxacum pobedimovae. Turczaninowia. 2023. In press.

10. Krotkov, G. A review of literature on Taraxacum koksaghyz Rod. Bot. Rev. 1945. 11, 417-461.

11. Kuluev, В., Fateryga, A., Zakharova, E., Zakharov, V., Chemeris, A. Pinkish-achened form of Taraxacum hybernum Steven - a source of inulin and high molar mass natural rubber. Botany Letters. 2022. 170:2, 258-268.

12. Luo, Z.; Iaffaldano, B.J.; Zhuang, X.; Fresnedo-Ramirez, J.; Cornish, K. Analysis of the first Taraxacum kok-saghyz transcriptome reveals potential rubber yield related SNPs. Sci. Rep. 2017, 7(1), 9939.

13. Luo, Z.; Iaffaldano, B.J.; Zhuang, X. Variance, inter-trait correlation, heritability, and marker-trait association of rubber yield-related characteristics in Taraxacum kok-saghyz. Plant Mol. Biol. Rep. 2018, 36,576-587

14. Nowicki, M.; Zhao, Y.; Boggess, S.L.; Fluess, H.; Paya-Milans, M.; Staton, M.E.; Houston, L.C.; Hadziabdic, D.; Trigiano, R.N. Taraxacum kok-saghyz (rubber dandelion) genomic microsatellite loci reveal modest genetic diversity and cross-amplify broadly to related species. Scientific Reports. 2019. 9, 1915.

15. Panara, F.; Fasano, C; Lopez, L.; Porceddu, A.; Facella, P.; Fantini, E.; Daddiego, L.; Perrella G. Genome-wide identification and spatial expression analysis of histone modification gene families in the rubber dandelion Taraxacum kok-saghyz. Plants (Basel). 2022, 9, 11(16):2077.

16. Ramirez-Cadavid, D.; Cornish, K.; Michel F. Taraxacum kok-saghyz: compositional analysis of a feedstock for natural rubber and other products. Ind. Crop. Prod. 2017, 107, 624-640.

17. Salehi, M.; Cornish, K.; Bahmanka, M.; Naghavi, M.R. Natural rubber-producing sources, systems, and perspectives for breeding and biotechnology studies of Taraxacum kok-saghyz. Ind. Crop. Prod. 2021, 170, 113667.

18. van Beilen, J.B.; Poirier, Y. Production of renewable polymers from crop plants. Plant J. 2008, 54(4), 684-701.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии растений, в частности к биопонному выращиванию любых видов каучуконосных одуванчиков. В способе используют гидропонную установку с автополивом и искусственное освещение. В качестве субстрата используют нейтральный торф, а в качестве минерального питания используют раствор 1/8 концентрации смеси Хогланда-Арнона и добавляют фитоспорин М и триходерму вериде. Способ обеспечивает выращивание каучуконосных одуванчиков для получения высококачественного натурального каучука. 12 ил.

Способ биопонного выращивания каучуконосных одуванчиков для получения высококачественного натурального каучука, заключающийся в использовании гидропонной установки и искусственного освещения, отличающийся тем, что используют гидропонную установку с автополивом, в качестве субстрата используют нейтральный торф, в качестве минерального питания используют раствор 1/8 концентрации смеси Хогланда-Арнона и добавляют фитоспорин М и триходерму вериде.